ES2825999T3 - Un inhibidor negativo dominante del TNF-alfa para su uso en el tratamiento de trastornos neurológicos del SNC - Google Patents

Abstract

Un inhibidor negativo dominante de TNF-α que comprende una secuencia polipeptídica variante que es más del 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos del TNF-α humano de tipo silvestre y comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 cambios de aminoácidos con respecto al TNF-α de tipo silvestre, y en el que dichos cambios se seleccionan entre cambios en las posiciones 1, 21, 23, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 57, 65, 66, 67, 69, 75, 84, 86, 87, 91, 97, 101, 111, 112, 115, 140, 143, 144, 145, 146 y 147 de la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO. 3, en la que el inhibidor negativo dominante de TNF-α comprende sustituciones seleccionadas del grupo de sustituciones que consta de V1M, Q21C, Q21R, E23C, N30D, R310, R31I, R31D, R31E, R32D, R32E, R32S, A33E, N34E, N34V, A35S, D45C, L57F, L57W, L57Y, K65D, K65E, K65I, K65M, K65N, K65Q, K65T, K65S, K65V, K65W, G66K, G66Q, Q67D, Q67K, Q67R, Q67S, Q67W, Q67Y, C69V, L75E, L75K, L75Q, A84V, S86Q, S86R, Y87H, Y87R, V91E, I97R, I97T, C101 A, A111 R, A111E, K112D, K112E, Y115D, Y115E, Y115F, Y115H, Y1151, Y115K, Y115L, Y115M, Y115N, Y115Q, Y115R, Y115S, Y115T, Y115W, D140K, D140R, D143E, D143K, D143L, D143R, D143N, D143Q, D143S, F144N, A145D, A145E, A145F, A145H, A145K, A145M, A145N, A145Q, A145R, A145S, A145T, A145Y, E146K, E146L, E146M, E146N, E146R, E146S, y S147R de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 3, en el que el inhibidor negativo dominante de TNF-α inhibe el TNF-α soluble pero no inhibe la señalización por TNF-α transmembrana y se utiliza en el tratamiento de un paciente con un trastorno neurológico asociado con TNF-α elevado, en el que el inhibidor negativo dominante de TNF-α es para administración periférica en una cantidad terapéuticamente eficaz, y en el que dicha administración periférica proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor negativo dominante de TNF-α que contacta directamente con el SNC cruzando la barrera hematoencefálica, por lo que se trata a dicho paciente, en el que el trastorno neurológico se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), amiloidosis, accidente cerebrovascular, depresión y demencia, y en el que dicha amiloidosis se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal, y demencia por cuerpos de Lewy, en la que dicha variante comprende las sustituciones de aminoácidos V1M/R31C/C69 V/Y87H/C101 A/A145R.

Description

DESCRIPCIÓN

Un inhibidor negativo dominante del TNF-a para su uso en el tratamiento de trastornos neurológicos del SNC

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la administración periférica de un inhibidor de TNF-a, preferiblemente una proteína negativa dominante de TNF-a para el tratamiento de un trastorno neurológico asociado con TNF-a.

Antecedentes de la invención

El tratamiento de los trastornos neurológicos se complica por el hecho de que la mayoría de las causas subyacentes de los trastornos se localizan en el cerebro, que ha demostrado ser recalcitrante al tratamiento salvo por la complicada y arriesgada administración directa de un agente terapéutico en el cerebro. Actualmente se cree que la barrera hematoencefálica es un obstáculo insuperable que impide que las terapias administradas por vía periférica alcancen su objetivo en el cerebro.

La barrera hematoencefálica (BBB) es un sistema estructural compuesto por células endoteliales que funciona para proteger el sistema nervioso central (SNC) de sustancias nocivas en el torrente sanguíneo, tales como bacterias, macromoléculas (por ejemplo, proteínas) y otras moléculas hidrófilas, al limitar la difusión de tales sustancias a través de la BBE y hacia el líquido cefalorraquídeo (CSF) subyacente y el SNC. Por lo tanto, cumple una función importante. Sin embargo, también plantea un obstáculo importante para proporcionar compuestos terapéuticos al cerebro, dejando a quienes padecen trastornos neurológicos, incluidas enfermedades neurodegenerativas devastadoras, sin compuestos terapéuticos eficaces.

El tratamiento de enfermedades neurológicas se complica aún más por las complejas redes de señalización implicadas en la regulación neuronal. Por ejemplo, los compuestos terapéuticos que son inmunomoduladores eficaces en la periferia están contraindicadas para el tratamiento de trastornos neuroinflamatorios. Los inhibidores de TNF-a que se comercializan actualmente están etiquetados con una ADVERTENCIA DE CUADRO NEGRO que advierte específicamente contra el tratamiento de enfermedades neurológicas porque causan desmielinización y empeoran la afección.

Aunque se han realizado esfuerzos significativos para identificar terapias efectivas, hasta la fecha existe una escasez de tales terapias. Como tal, existe una necesidad significativa de desarrollar terapias efectivas para tratar trastornos neurológicos, tales como enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. El documento WO2006/113487 divulga un inhibidor negativo dominante de TNF-a, XPro1595 y su uso potencial para tratar trastornos mediados por TNF-a. El documento US2008/187509 divulga una composición farmacéutica que comprende XPro1595 y su suministro localizado de XPro1595 para tratar trastornos mediados por TNF-a. Brambilla et al., (Brain, vol. 134, No 9 2011-09, páginas. 2736-2754) discuten un modelo de ratón de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) al que se administró XPro1595. Taofik et al., (Brain, vol. 134, No. 92011-09, páginas 2722-2735) también utilizan un modelo de ratón EAE.

Resumen de la invención

En contraste con la administración intracraneal de un inhibidor de TNF-a para tratar trastornos neurológicos en la técnica anterior, en el presente documento se demuestra el hallazgo novedoso e inesperado de que ciertas proteínas negativas dominantes de TNF-a (DN-TNF) tienen efectos sobre el SNC y el cerebro cuando se administra periféricamente. En una realización, los efectos están mediados por el contacto directo del DN-TNF con el cerebro y/o el SNC cuando los agentes de DN-TNF cruzan la barrera hematoencefálica. Por consiguiente, en el presente documento se proporciona un DN-TNF para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurológica de acuerdo con las reivindicaciones. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para tratar a un paciente con una enfermedad neurológica que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor negativo dominante de TNF-a, en el que dicho inhibidor negativo dominante de TNF-a se administra periféricamente, es decir, no a través del cráneo o periespinalmente. Los ejemplos de rutas periféricas incluyen, pero no se limitan a, rutas enteral, tópica, subcutánea, intradérmica, inhalatoria, parenteral, intramuscular, mucosa, intranasal, oral, vaginal, rectal, intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intraósea, intratecal, intraperitoneal, intravesical e intravítrea.

En una realización, el trastorno neurológico está asociado con TNF-a. En otra realización, el trastorno neurológico se selecciona de una enfermedad neurodegenerativa, que puede estar asociada con neuroinflamación. En determinadas realizaciones, el trastorno neurodegenerativo inflamatorio se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrópica (ALS), amiloidosis y demencia. En una realización, el trastorno neurodegenerativo inflamatorio es amiloidosis seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal y demencia por cuerpos de Lewy. En una realización, el trastorno neurológico es cualquier trastorno caracterizado por un TNF-a elevado y puede incluir trastornos tales como accidente cerebrovascular, depresión, síndrome de estrés postraumático y lesión cerebral traumática.

Preferiblemente, el inhibidor negativo dominante de TNF-a es un polipéptido negativo dominante de TNF-a, que más preferiblemente comprende una secuencia variante relativa al TNF-a de tipo silvestre, y que puede estar PEGilado. Tal secuencia variante puede comprender las sustituciones de aminoácidos A145R/I97T o V1M/R31C/C69V/Y87H/C101A/A145R. En una realización preferida, el polipéptido de TNF-a inhibe el TNF-a soluble pero no inhibe la señalización de TNF-a transmembrana. En otra realización preferida, el polipéptido negativo dominante de TNF-a es XPro1595.

También se proporcionan en este documento métodos para prevenir la muerte neuronal, inhibir la activación de las células microgliales, inhibir la desmielinización y/o promover la remielinización en un paciente que lo necesite, comprendiendo cada método la administración periférica de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor negativo dominante de TNF-a. La invención se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A: muestra la secuencia de ácido nucleico del TNF-a humano (SEQ ID NO: 1). Se subrayan seis codones de histidina adicionales, ubicados entre el codón de inicio y el primer aminoácido.

La Figura 1B: muestra la secuencia de aminoácidos del TNF-a humano (SEQ ID NO: 2) con 6 histidinas adicionales (subrayadas) entre el codón de inicio y el primer aminoácido. Los aminoácidos cambiados en ejemplos de variantes de TNF-a se muestran en negrita.

La Figura 2: muestra las posiciones y cambios de aminoácidos en ciertas variantes de TNF-a.

En la Figura 3: EAE mejora mediante la inhibición del TNF soluble, pero no de TNF soluble ni de TNF transmembrana. En la Figura 4: Los inhibidores de TNF no alteran la extensión de la infiltración de células inflamatorias en la médula espinal en el pico de EAE.

En la Figura 5: La inhibición no selectiva del TNF exacerba y la inhibición selectiva del TNF soluble suprime los marcadores de inflamación en el SNC en el pico de EAE. Se realizó un análisis de inmunoensayo multiplex de 59 marcadores de proteínas clave en la médula espinal (A), el cerebro (B) y el suero (C) de ratones con EAE sin tratamiento previo y de tres grupos de tratamiento en el pico de la enfermedad. Se muestra la media para XPro1595 (triángulo verde) y etanercept (círculo rojo) (n = 3 ratones por grupo); para el grupo sin tratamiento previo (línea de puntos) y vehículo (cuadrado sin relleno) (n = 2 ratones por grupo).

En la Figura 6: El bloqueo de TNF soluble, pero no dl TNF soluble y TNF transmembrana, es suficiente para mantener la actividad de NF-kB y la expresión de otros mediadores neuroprotectores en la médula espinal durante la EAE. (A) Análisis de inmunotransferencia de SMI-32, expresión de proteína ácida fibrilar glial (GFAp ) y proteína básica de mielina (MBP) en extractos de médula espinal de ratones con EAE sin tratamiento previo y tratados en el pico de la enfermedad. (B) Análisis similar del inhibidor fosforilado de NF-kB (p-kB) y los niveles de proteína de la subunidad p65 NF-kB fosforilada (p-p65; punta de flecha) en extractos de médula espinal de ratones con EAE sin tratamiento previo y del día 22 de diferentes grupos de tratamiento (XPro1595, n = 4; etanercept, n = 4; vehículo, n = 3; sin tratamiento previo = 5). (C) FLIP, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y niveles de transcripción de ARN mensajero del receptor de CSF-1 en extractos de médula espinal de ratones con EAE en el pico y el día 39 después de la inmunización mediante reacción en cadena de la polimerasa RT semicuantitativa utilizando p-actina para normalización.

En la Figura 7: El TNF transmembrana media la neuroprotección en cocultivos de neuronas-astrocitos que depende del contacto entre los dos tipos de células. (A) muerte neuronal inducida por privación de glucosa en cocultivos de astrocitos-neuronas que se incubaron con XPro1595 (200 ng/mL), etanercept (100 ng/mL) o solución salina comenzando 4 h después del inicio de la privación de glucosa (GD). La muerte de neuronas se muestra como el porcentaje de células (muertas) positivas para azul tripáno (TB) respecto al número total de células en cada condición experimental. (B) Muerte neuronal inducida por privación de glucosa en cocultivos de astrocitos-neuronas que han sido pretratados durante 24 h con TNF humano (50 ng/mL) antes de la privación de glucosa e incubados con XProl595, etanercept o solución salina comenzando 4 h después del inicio de la privación de glucosa. (C) Muerte neuronal inducida por privación de glucosa en cocultivos de astrocitos-neuronas en los que los astrocitos fueron separados de las neuronas por Transwells, tratados con XPro1595, etanercept o solución salina comenzando 4 h después del inicio de la privación de glucosa.

En la Figura 8: La neuroprotección mediada por TNF transmembrana in vivo en EAE depende de la señalización neuronal de NF-kB. (A) Puntuaciones clínicas de EAE (media ± SMS) a lo largo del tiempo para ratones nlKKpKO tratados con XPro1595 (cuadrado relleno; n = 9) o vehículo (triángulo relleno; n = 10) y ratones IKKpF/F tratados con XPro1595 (cuadrado sin relleno; n = 9) o vehículo (triángulo sin relleno; n = 10). (B) Curva de supervivencia (Kaplan-Meier) que muestra la viabilidad de los ratones (grupos descritos en A) durante la progresión de la enfermedad. (C) Viabilidad neuronal en cocultivos de astrocitos-neuronas que fueron tratados previamente durante 2 h antes de la privación de glucosa con el inhibidor selectivo de IKKp, b Ms 34 5541 (25 pM) y luego tratados con XPro1595 (200 ng/mL) o etanercept (100 ng/mL) comenzando 4 h después de la privación de glucosa.

En la Figura 9: XPro1595 atraviesa la barrera hematoencefálica tanto en animales sin tratamiento como en animales tratados con cuprizona.

La Figura 10: Muestra la secuencia de aminoácidos del TNF-a humano (SEQ ID NO: 3).

Descripción detallada

En el presente documento se divulga el hallazgo de que los inhibidores de TNF-a divulgados en este documento (por ejemplo, proteínas negativas dominantes de TNF-a) cruzan la barrera hematoencefálica, lo que permite que dichos inhibidores se administren por vía periférica, es decir, no en forma intracraneal y/o periespinal. Además, en el presente documento se divulga el hallazgo de que si bien los inhibidores de TNF-a divulgados reducen la inflamación en el cerebro, algunos de estos inhibidores también pueden (1) inhibir la señalización de TNF-a soluble, pero no unido a la membrana, (2) proteger la mielinización de neuronas y/o (3) promover la remielinización de neuronas.

Por consiguiente, la presente divulgación aborda muchos de los problemas de la técnica anterior relacionados con el tratamiento de enfermedades neurológicas asociadas con TNF-a elevado, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neurodegenerativas inflamatorias. En primer lugar, permite por primera vez un método de tratamiento de un trastorno neurológico después de la administración periférica, en oposición a la intracraneal, de un DN-TNF terapéutico. También permite un tratamiento en el que se reduce la respuesta inflamatoria en el cerebro, pero se protege la mielinización de las neuronas. En algunas realizaciones, la remielinización de neuronas se promueve realmente después del tratamiento con los inhibidores de TNF-a descritos en este documento. Esto está en marcado contraste con los inhibidores de TNF-a disponibles comercialmente, que promueven la desmielinización de las neuronas dando como resultado un empeoramiento de los trastornos. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un método para tratar trastornos neurológicos caracterizados por TNF-a elevado y/o neuroinflamación en el que la mielinización de las neuronas está protegida y en algunas realizaciones se mejora. Por consiguiente, tales inhibidores de TNF-a pueden administrarse a un paciente que lo necesite, por ejemplo, un paciente con un trastorno neurológico, en el que dicha administración es por vía periférica, es decir, no intracraneal.

Inhibidores de TNF-a

Los inhibidores preferidos de TNF-a pueden ser proteínas negativas dominantes de TNF-a, denominadas en el presente documento como "DNTNF-a", "proteínas de DN-TNF-a", "variantes de TNF-a", "proteínas del TNF-a variantes", " variante de TNF-a", "TNF-a variante" y similares. Por "TNF-a variantes" o "proteínas de TNF-a" se entiende TNF-a o proteínas de TNF-a que difieren de la proteína de tipo silvestre correspondiente en al menos 1 aminoácido. Por lo tanto, una variante de TNF-a humano se compara con la SEQ ID NO: 1 (ácido nucleico que incluye codones para 6 histidinas), SEQ ID NO: 2 (aminoácido que incluye 6 histidinas en el terminal N) o la SEQ ID NO: 3 (amino ácido sin 6 histidinas en el terminal N). Las proteínas de DN-TNF-a se divulgan en detalle en la patente de los Estados Unidos No. 7,446,174. Como se usa en el presente documento, el TNF-a variante o las proteínas de TNF-a incluyen monómeros, dímeros o trímeros de TNF-a. Incluidas dentro de la definición de "TNF-a variante" están las variantes inhibidoras competitivas de TNF-a. Aunque ciertas variantes como se describen en el presente documento, un experto en la técnica entenderá que se pueden preparar otras variantes mientras se retiene la función de inhibir el TNF-a soluble pero no transmembrana.

Por lo tanto, las proteínas de la invención son antagonistas del TNF-a de tipo silvestre. Por "antagonistas del TNF-a de tipo silvestre" se entiende que la proteína de TNF-a variante inhibe o reduce significativamente al menos una actividad biológica del TNF-a de tipo silvestre.

En una realización preferida, la variante es un antagonista del TNF-a soluble, pero no antagoniza significativamente el TNF-a transmembrana, por ejemplo, la proteína de DN-TNF-a como se divulga en el presente documento inhibe la señalización por el TNF-a soluble, pero no el TNF-a transmembrana. Por "inhibe la actividad de TNF-a" y equivalentes gramaticales se entiende al menos una reducción del 10% en TNF-a soluble de tipo silvestre, más preferiblemente una reducción de al menos 50% en la actividad del TNF-a soluble de tipo silvestre, e incluso más preferiblemente, al menos un 90% de reducción en la actividad del TNF-a soluble de tipo silvestre. Preferiblemente, existe una inhibición de la actividad del TNF-a soluble de tipo silvestre en ausencia de señalización reducida por el TNF-a transmembrana. En una realización preferida, la actividad del TNF-a soluble se inhibe mientras que la actividad del TNF-a transmembrana se mantiene sustancial y preferiblemente por completo.

Las proteínas del TNF tienen actividad modulada en comparación con las proteínas de tipo silvestre. En una realización preferida, las proteínas del TNF-a variantes exhiben una menor actividad biológica (por ejemplo, antagonismo) en comparación con el TNF-a de tipo silvestre, que incluye, entre otros, disminución de la unión a un receptor (p55, p75 o ambos), disminución de la activación y/o finalmente una pérdida de actividad citotóxica. Por "actividad citotóxica" en el presente documento se hace referencia a la capacidad de una variante de TNF-a para matar o inhibir selectivamente células. Se prefieren las proteínas del TNF-a variantes que exhiben menos del 50% de actividad biológica en comparación con las de tipo silvestre. Son más preferidas las proteínas del TNF-a variantes que exhiben menos del 25%, incluso más preferidas son las proteínas variantes que exhiben menos del 15%, y las más preferidas son las proteínas del TNF-a variantes que exhiben menos del 10% de una actividad biológica del TNF-a de tipo silvestre. Los ensayos adecuados incluyen, entre otros, ensayos de caspasa, ensayos de citotoxicidad de TNF-a, ensayos de unión de ADN, ensayos de transcripción (utilizando constructos informadores), ensayos de cromatografía de exclusión de tamaño y radiomarcaje/inmunoprecipitación) y ensayos de estabilidad (incluido el uso de ensayos de dicroísmo circular (CD) y estudios de equilibrio), de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica.

En una realización, al menos una propiedad crítica para la afinidad de unión de las proteínas de TNF-a variantes se altera cuando se compara con la misma propiedad de TNF-a de tipo silvestre y, en particular, se prefieren las proteínas del TNF-a variantes con afinidad de receptor alterada. Se prefieren particularmente los TNF-a variantes con afinidad alterada hacia la oligomerización del TNF-a de tipo silvestre. Por lo tanto, la invención proporciona proteínas del TNF-a variantes con afinidades de unión alteradas de manera que las proteínas del TNF-a variantes se oligomerizarán preferiblemente con TNF-a de tipo silvestre, pero no interactuarán sustancialmente con los receptores de TNF de tipo silvestre, es decir, p55, p75. "Preferiblemente" en este caso significa que dadas cantidades iguales de monómeros de TNF-a variantes y monómeros de TNF-a de tipo silvestre, al menos el 25% de los trímeros resultantes son trímeros mixtos de TNF-a de tipo variante y de tipo silvestre, con al menos aproximadamente 50% siendo el preferido, y al menos aproximadamente 80-90% siendo particularmente preferido. En otras palabras, es preferible que las proteínas de TNF-a variantes de la invención tengan una mayor afinidad por la proteína de TNF-a de tipo silvestre en comparación con las proteínas de TNF-a de tipo silvestre. Por "no interactuar sustancialmente con los receptores de TNF" se entiende que las proteínas del TNF-a variantes no podrán asociarse con los receptores p55 o p75 para activar significativamente el receptor e iniciar la ruta o rutas de señalización del TNF. En una realización preferida, se observa al menos una disminución del 50% en la activación del receptor, prefiriéndose más del 50%, 76%, 80-90%.

En algunas realizaciones, las variantes son antagonistas del TNF-a soluble y transmembrana. Sin embargo, como se describe en el presente documento, las proteínas de TNF-a variantes preferidas son antagonistas de la actividad del TNF-a soluble pero no afectan sustancialmente a la actividad del TNF-a transmembrana. Por lo tanto, una reducción de la actividad de los heterotrímeros para el TNF-a soluble es como se expuso anteriormente, con reducciones en la actividad biológica de al menos el 10%, siendo preferidas todas las reducciones del 25, 50, 75, 80, 90, 95, 99 o 100%. Sin embargo, algunas de las variantes descritas en este documento comprenden inhibición selectiva; es decir, inhiben la actividad del TNF-a soluble pero no inhiben sustancialmente el TNF-a transmembrana. En estas realizaciones, se prefiere que se mantenga al menos el 80%, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% de la actividad de TNF-a transmembrana. Esto también puede expresarse como una proporción; es decir, la inhibición selectiva puede incluir una proporción de inhibición de TNF-a soluble a transmembrana. Por ejemplo, se prefieren las variantes que dan como resultado una inhibición selectiva de al menos 10:1 de la actividad de TNF-a soluble a transmembrana, encontrando un uso particular en la invención con 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1 o más. Por lo tanto, una realización utiliza variantes, tales como mutantes dobles en las posiciones 87/145 como se describe en este documento, que inhiben sustancialmente o eliminan la actividad del TNF-a soluble (por ejemplo, intercambiando con el tipo silvestre homotrimérico para formar heterotrímeros que no se unen a receptores del TNF-a o que se unen pero no activan la señalización del receptor) pero no afectan significativamente (y preferiblemente no alteran en absoluto) la actividad del TNF-a transmembrana. Sin pretender imponer ninguna teoría, las variantes que presentan tal inhibición diferencial permiten la disminución de la inflamación sin la correspondiente pérdida de la respuesta inmune, o cuando se encuentran en el contexto de la célula apropiada, sin una correspondiente desmielinización de neuronas.

En una realización, la actividad biológica afectada de las variantes es la activación de la señalización del receptor por las proteínas de TNF-a de tipo silvestre. En una realización preferida, la proteína de TNF-a variante interactúa con la proteína de TNF-a de tipo silvestre de modo que el complejo que comprende el TNF-a variante y el TNF-a de tipo silvestre tiene una capacidad reducida para activarse (como se describió anteriormente para "inhibición sustancial"), y en realizaciones preferidas es incapaz de activar uno o ambos receptores de TNF, es decir, TNF-R p55 o TNF-R p75. En una realización preferida, la proteína de TNF-a variante es una proteína de TNF-a variante que funciona como un antagonista del TNF-a de tipo silvestre. Preferiblemente, la proteína de TNF-a variante interactúa preferiblemente con el TNF-a de tipo silvestre para formar trímeros mixtos con la proteína de tipo silvestre de manera que la unión al receptor no se produce de forma significativa y/o no se inicia la señalización de TNF-a. Por trímeros mixtos se entiende que los monómeros de las proteínas de TNF-a de tipo silvestre y variantes interactúan para formar TNF-a heterotrimérico. Los trímeros mixtos pueden comprender 1 proteína de TNF-a variante: 2 proteínas de TNF-a de tipo silvestre, 2 proteínas de TNF-a variantes:1 proteína de TNF-a de tipo silvestre. En algunas realizaciones, se pueden formar trímeros que comprenden sólo proteínas del TNF-a variantes.

Las proteínas antagonistas de TNF-a variantes de la invención son altamente específicas para el antagonismo de TNF-a en relación con el antagonismo de TNF-beta. Las características adicionales incluyen estabilidad mejorada, farmacocinética y alta afinidad por el TNF-a de tipo silvestre. Las variantes con mayor afinidad hacia el TNF-a de tipo silvestre pueden generarse a partir de variantes que exhiben antagonismo de TNF-a como se describió anteriormente.

De manera similar, las proteínas del TNF-a variantes, por ejemplo, se prueban y validan experimentalmente en ensayos in vivo e in vitro. Los ensayos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ensayos de actividad y ensayos de unión. Por ejemplo, los ensayos de actividad de TNF-a, tales como la detección de apoptosis a través de la actividad de caspasa, pueden usarse para cribar variantes de TNF-a que son antagonistas del TNF-a de tipo silvestre. Otros ensayos incluyen el uso del colorante verde Sytox para ácido nuclei

por TNF en una línea celular sensibilizada con Actinomicina-D. Como esta tinción se excluye de las células vivas, pero penetra en las células moribundas, este ensayo también se puede usar para detectar variantes de TNF-a que son agonistas de TNF-a de tipo silvestre. Por "agonistas de TNF-a de tipo silvestre" se entiende que la proteína de TNF-a variante mejora la activación de la señalización del receptor por proteínas de TNF-a de tipo silvestre. En general, no se prefieren proteínas de TNF-a variantes que funcionan como agonistas de TNF-a de tipo silvestre. Sin embargo, en algunas realizaciones, se prefieren proteínas de TNF-a variantes que funcionan como agonistas de la proteína de TNF-a de tipo silvestre. Un ejemplo de un ensayo de NF kappaB se presenta en el Ejemplo 7 de la patente de los Estados Unidos No. 7,446,174.

En una realización preferida, se determinan las afinidades de unión de las proteínas de TNF-a variantes en comparación con las proteínas de TNF-a de tipo silvestre para las proteínas receptoras de TNF-a y TNF de origen natural tales como p55 y p75. Los ensayos adecuados incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, comparaciones cuantitativas que comparan las constantes de unión cinética y de equilibrio, como se conoce en la técnica. Se describen ejemplos de ensayos de unión en el Ejemplo 6 de la patente de los Estados Unidos No. 7,446,174.

En una realización preferida, la proteína de TNF-a variante tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de TNF-a de tipo silvestre en al menos 1 aminoácido, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 aminoácidos todos contemplados, o más. Expresado como porcentaje, las proteínas del TNF-a variantes de la invención son preferiblemente más del 90% idénticas a las de tipo silvestre, contemplando más del 95, 97, 98 y 99%. Dicho de otra manera, basándose en la secuencia de TNF-a humano de la Figura 1B (SEQ ID NO: 2) excluyendo las 6 histidinas del terminal N, como se muestra en la Figura 10 (SEQ ID NO: 3), las proteínas de TNF-a variantes tienen al menos aproximadamente 1 residuo que difiere de la secuencia de TNF-a humano, con al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 residuos diferentes. Las proteínas de TNF-a variantes preferidas tienen de 3 a 8 residuos diferentes.

Un valor del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se determina por el número de residuos idénticos coincidentes dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es la que tiene los residuos más reales en la región alineada (se ignoran los huecos introducidos por WU-Blast-2 para maximizar la puntuación de alineación). De manera similar, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia del ácido nucleico" con respecto a la secuencia codificante de los polipéptidos identificados se define como el porcentaje de residuos nucleotídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos nucleotídicos en la secuencia codificante de la proteína del ciclo celular. Un método preferido utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 configurado con los parámetros predeterminados, con el intervalo de superposición y la fracción de superposición fijados en 1 y 0,125, respectivamente.

Las proteínas de TNF-a pueden fusionarse, por ejemplo, con otras proteínas terapéuticas o con otras proteínas tales como Fc o albúmina de suero con fines terapéuticos o farmacocinéticos. En esta realización, una proteína de TNF-a está operativamente unida a un compañero de fusión. El compañero de fusión puede ser cualquier fracción que proporcione un efecto terapéutico o farmacocinético pretendido. Los ejemplos de compañeros de fusión incluyen, pero no se limitan a, albúmina de suero humano, un agente terapéutico, un citotóxico o molécula citotóxica, un radionucleótido y un Fc, etc. Como se usa en el presente documento, una fusión de Fc es sinónimo de los términos "inmunoadhesina", "fusión de Ig ", "quimera de Ig" y "globulina receptora" como se usa en la técnica anterior (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14: 52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9: 195-200). Una fusión de Fc combina la región de Fc de una inmunoglobulina con la región de unión al objetivo de una proteína de TNF-a, por ejemplo. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,766.883 y 5,876.969.

En una realización preferida, las proteínas del TNF-a variantes comprenden residuos variantes seleccionados de las siguientes posiciones 21, 23, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 57, 65, 66, 67, 69, 75, 84, 86, 87, 91, 97, 101, 111, 112, 115, 140, 143, 144, 145, 146 y 147. Los aminoácidos preferidos para cada posición, incluidos los residuos de TNF-a humano, se muestran en la Figura 3. De este modo, por ejemplo, en la posición 143, los aminoácidos preferidos son Glu, Asn, Gln, Ser, Arg y Lys; etc. Los cambios preferidos incluyen: V1M, Q21 C, Q21 R, E23C, R31C, N34E, V91E, Q21R, N30D, R31C, R311, R31D, R31E, R32D, R32E, R32S, A33E, N34E, N34V, A35S, D45C, L57F, L57W, L57Y, K65D, K65E, K651, K65M, K65N, K65Q, K65T, K65S, K65V, K65W, G66K, G66Q, Q67D, Q67K, Q67R, Q67S, Q67W, Q67Y, C69V, L75E, L75K, L75Q, A84V, S86Q, S86R, Y87H, Y87R, V91E, I97R, I97T, C101A, A111 R, A111 E, K112D, K112E, Y115D, Y115E, Y115F, Y115H, Y115I, Y115K, Y115L, Y115M, Y115N, Y115Q, Y115R, Y115S, Y115T, Y115W, D140K, D140R, D143E, D143K, D143L, D143R, D143N, D143Q, D143R, D143S, F144N, A145D, A145E, A145F, A145H, A145K, A145M, A145N, A145Q, A145R, A145S, A145T, A145Y, E146K, E146L, E146M, E146N, E146R, E146S y S147R. Estos pueden realizarse individualmente o en combinación, siendo posible cualquier combinación. Sin embargo, como se describe en este documento, las realizaciones preferidas utilizan al menos 1 a 8, y preferiblemente más, posiciones en cada proteína de TNF-a variante.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona variantes de TNF-a seleccionadas del grupo que consiste en XENP268 XENP344, XENP345, XENP346, XENP550, XENP551, XENP557, XENP1593, XENP1594, y XENP1595 como se describe en el Ejemplo 3 de la patente de los Estados Unidos No. 7,662,367.

En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para formar un heterotrímero de TNF-a in vivo en un mamífero que comprenden administrar al mamífero una molécula de TNF-a variante en comparación con el correspondiente TNF-a de mamífero de tipo silvestre, en los que dicha variante de TNF-a está sustancialmente libre de actividad agonista.

En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona métodos de cribado de inhibidores selectivos que comprenden poner en contacto un agente candidato con una proteína de TNF-a soluble y ensayar la actividad biológica del TNF-a; poner en contacto un agente candidato con una proteína de TNF-a transmembrana y analizar la actividad biológica del TNF-a, y determinar si el agente es un inhibidor selectivo. El agente puede ser una proteína (incluidos péptidos y anticuerpos, como se describe en este documento) o moléculas pequeñas.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona proteínas del TNF-a variantes que interactúan con el TNF-a de tipo silvestre para formar trímeros mixtos incapaces de activar la señalización del receptor. Preferiblemente, se usan proteínas del TNF-a variantes con cambios de 1,2, 3, 4, 5, 6 y 7 aminoácidos en comparación con la proteína de TNF-a de tipo silvestre. En una realización preferida, estos cambios se seleccionan de las posiciones 1, 21, 23, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 57, 65, 66, 67, 69, 75, 84, 86, 87, 91, 97, 101, 111, 112, 115, 140, 143, 144, 145, 146 y 147. En un aspecto adicional, las proteínas del TNF-a variantes de origen no natural tienen sustituciones seleccionadas del grupo de sustituciones que consta de V1M, Q21C, Q21R, E23C, N34E, V91E, Q21R, N30D, R31C, R311, R31D, R31E, R32D, R32E, R32S, A33E, N34E, N34V, A35S, D45C, L57F, L57W, L57Y, K65D, K65E, K651, K65M, K65N, K65Q, K65T, K65S, K65V, K65W, G66K, G66Q, Q67D, Q67K, Q67R, Q67S, Q67W, Q67Y, C69V, L75E, L75K, L75Q, A84V, S86Q, S86R, Y87H, Y87R, V91E, I97R, I97T, C101A, A111R, All IE, K112D, K112E, Y115D, Y115E, Y115F, Y115H, Y115I, Y115K, Y115L, Y115M, Y115N, Y115Q, Y115R, Y115S, Y115T, Y115W, D140K, D140R, D143E, D143K, D143L, D143R, D143N, D143Q, D143R, D143S, F144N, A145D, A145E, A145F, A145H, A145K, A145M, A145N, A145Q, A145R, A145S, A145T, A145Y, E146K, E146L, E146M, E146N, E146R, E146S y S147R.

En otra realización preferida, las sustituciones pueden realizarse individualmente o en combinación, siendo posible cualquier combinación. Las realizaciones preferidas utilizan al menos una, y preferiblemente más, posiciones en cada proteína de TNF-a variante. Por ejemplo, las sustituciones en las posiciones 31, 57, 69, 75, 86, 87, 97, 101, 115, 143, 145 y 146 pueden combinarse para formar variantes dobles. Además, se pueden generar variantes de puntos triples, cuádruples, quíntuples y similares.

En un aspecto, la divulgación proporciona variantes de TNF-a que comprenden las sustituciones de aminoácidos A145R/I97T. En un aspecto, la invención proporciona variantes de TNF-a que comprenden las sustituciones de aminoácidos V1M, R31C, C69V, Y87H, C101A y A145R. En una realización preferida, esta variante está PEGilada.

En una realización preferida, la variante es XPro1595, una proteína PEGilada que comprende mutaciones V1M, R31C, C69V, Y87H, C101A y A145R con respecto a la secuencia humana de tipo silvestre.

Para los propósitos de la presente invención, las áreas de la molécula de TNF-a de tipo silvestre o natural que se van a modificar se seleccionan del grupo que consiste en el Dominio Grande (también conocido como II), el Dominio Pequeño (también conocido como I ), el bucle DE y la interfaz del trímero. El Dominio Grande, el Dominio Pequeño y el Bucle DE son los dominios de interacción del receptor. Las modificaciones se pueden realizar únicamente en una de estas áreas o en cualquier combinación de estas áreas. Las posiciones preferidas de Dominio Grande para variar incluyen: 21, 30, 31, 32, 33, 35, 65, 66, 67, 111, 112, 115, 140, 143, 144, 145, 146 y/o 147. Para el Dominio Pequeño, las posiciones preferidas para ser modificadas son 75 y/o 97. Para el Bucle DE, las modificaciones de posición preferidas son 84, 86, 87 y/o 91. La interfaz del Trímero tiene variantes dobles preferidas, incluidas las posiciones 34 y 91 también como en la posición 57. En una realización preferida, pueden combinarse sustituciones en dominios de trimerización y/o interacción de múltiples receptores. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, la sustitución simultánea de aminoácidos en los dominios grande y pequeño (por ejemplo, A145r e I97T), dominio grande y el bucle DE (A145R e Y87H), y el dominio grande y el dominio de trimerización (A145R y L57F). Los ejemplos adicionales incluyen todas y cada una de las combinaciones, por ejemplo, I97T y Y87H (dominio pequeño y bucle DE). Más específicamente, estas variantes pueden estar en forma de variantes de un solo punto, por ejemplo K112D, Y115K, Y115I, Y115T, A145E o A145R. Estas variantes de un solo punto pueden combinarse, por ejemplo, Y115I y A145E, o Y115I y A145R, o Y115T y A145R o Y115I y A145E; o cualquier otra combinación.

Las posiciones variantes preferidas de doble punto incluyen 57, 75, 86, 87, 97, 115, 143, 145 y 146; en cualquier combinación. Además, se pueden generar variantes de doble punto que incluyen L57F y una de Y115I, Y115Q, Y115T, D143K, D143R, D143E, A145E, A145R, E146K o E146R. otras variantes dobles preferidas son Y115Q y al menos una de D143N, D143Q, A145K, A145R o E146K; Y115M y al menos una de D143N, D143Q, A145K, A145R o E146K; y L57F y al menos una de A145E o 146R; K65D y D143K o D143R, K65E y D143K o D143R, Y115Q y cualquiera de L75Q, L57W, L57Y, L57F, I97R, I97T, S86Q, D143N, E146K, A145R e I97T, A145R y Y87R o Y87H; N34E y V91E; L75E y Y115Q; L75Q y Y115Q; L75E y A145R; y L75Q y A145R.

Además, se pueden generar variantes de punto triple. Las posiciones preferidas incluyen 34, 75, 87, 91, 115, 143, 145 y 146. Ejemplos de variantes de punto triple incluyen V91E, N34E y una de Y115I, Y115T, D143K, D143R, A145R, A145E E146k y E146R. Otras variantes de punto triple incluyen l75E y Y87H y al menos una de Y115Q, A145R, también, L75K, Y87H y Y115Q. Son más preferidas las variantes de triple punto V91E, N34E y A145R o A145E.

Las proteínas de TNF-a variantes también pueden identificarse como codificadas por ácidos nucleicos de TNF-a variantes. En el caso del ácido nucleico, la homología global de la secuencia de ácido nucleico es proporcional a la homología de aminoácidos, pero tiene en cuenta la degeneración en el código genético y el sesgo de codones de diferentes organismos. Por consiguiente, la homología de la secuencia de ácido nucleico puede ser más baja o más alta que la de la secuencia de la proteína, prefiriéndose una homología más baja. En una realización preferida, un ácido nucleico de TNF-a variante codifica una proteína de TNF-a variante. Como apreciarán los expertos en la técnica, debido a la degeneración del código genético, se puede producir un número extremadamente grande de ácidos nucleicos, todos los cuales codifican las proteínas del TNF-a variantes de la presente invención. Por lo tanto, habiendo identificado una secuencia de aminoácidos particular, los expertos en la técnica podrían producir cualquier número de ácidos nucleicos diferentes, simplemente modificando la secuencia de uno o más codones de una manera que no cambie la secuencia de aminoácidos del TNF-a variante.

En una realización, la homología de ácidos nucleicos se determina mediante estudios de hibridación. Por lo tanto, por ejemplo, los ácidos nucleicos que se hibridan bajo un alto grado de rigurosidad con la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Figura 1A (SEQ ID NO: 1) o su complemento y codifica una proteína de TNF-a variante se considera un gen de TNF-a variante. Se conocen en la técnica condiciones de alta rigurosidad; véase, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, y Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean de aproximadamente 5 a 10 °C, menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica definida, pH y concentración de ácido nucleico) a la que el 50% de las sondas complementarias al objetivo hibridan con la secuencia objetivo en equilibrio (ya que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea menor que aproximadamente 1,0 M de ión sodio, típicamente una concentración de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de ión sodio (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos alrededor de 60 °C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. En otra realización, se utilizan condiciones de hibridación menos rigurosas; por ejemplo, pueden usarse condiciones de rigurosidad moderada o baja, como se conocen en la técnica; véase Maniatis y Ausubel, citado más arriba, y Tijssen, citado más arriba. Además, las variantes de ácido nucleico codifican variantes de la proteína de TNF-a que comprenden las sustituciones de aminoácidos descritas en este documento. En una realización, la variante de TNF-a codifica una variante de polipéptido que comprende las sustituciones de aminoácidos A145R/I97T. En un aspecto, la variante de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende las sustituciones de aminoácidos V1M, r 31C, C69V, Y87H, C101A y A145R, o 1, 2, 3, 4 o 5 de cualquiera de estas variantes de aminoácidos.

Las proteínas y ácidos nucleicos de TNF-a variantes de la presente invención son recombinantes. Como se usa en este documento, "ácido nucleico" puede referirse a ADN o ARN, o moléculas que contienen tanto desoxi ribonucleótidos como ribonucleótidos. Los ácidos nucleicos incluyen ADN genómico, ADNc y oligonucleótidos que incluyen ácidos nucleicos sentido y antisentido. Dichos ácidos nucleicos también pueden contener modificaciones en la cadena principal de ribosa-fosfato para aumentar la estabilidad y la vida media de tales moléculas en entornos fisiológicos. El ácido nucleico puede ser bicatenario, monocatenario o contener porciones de secuencia tanto bicatenaria como monocatenaria. Como apreciarán los expertos en la técnica, la descripción de una sola cadena ("Watson") también define la secuencia de la otra cadena ("Crick"); de este modo, la secuencia representada en la Figura 1A (SEQ ID NO: 1) también incluye el complemento de la secuencia. Por el término "ácido nucleico recombinante" se entiende un ácido nucleico, originalmente formado in vitro, en general, mediante la manipulación de ácido nucleico por endonucleasas, en una forma que normalmente no se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, un ácido nucleico de TNF-a variante aislado, en forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro ligando moléculas de ADN que normalmente no están unidas, se consideran ambos recombinantes para los propósitos de esta invención.

Por "vector" se entiende cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias de genes entre células. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales.

Se entiende que una vez que se produce un ácido nucleico recombinante y se reintroduce en una célula u organismo huésped, se replicará de forma no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, tales ácidos nucleicos, una vez producidos de forma recombinante, aunque posteriormente replicados de forma no recombinante, todavía se consideran recombinantes para los propósitos de la invención.

De manera similar, una "proteína recombinante" es una proteína elaborada usando técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describió anteriormente. Una proteína recombinante se distingue de una proteína de origen natural por al menos una o más características. Por ejemplo, la proteína puede aislarse o purificarse de algunas o todas las proteínas y compuestos con los que normalmente está asociada en su hospedador de tipo silvestre y, por lo tanto, puede ser sustancialmente pura. Por ejemplo, una proteína aislada no está acompañada de al menos parte del material con el que normalmente está asociada en su estado natural, constituyendo preferiblemente al menos aproximadamente el 0,5%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 5% en peso de la proteína total en una muestra determinada. Una proteína sustancialmente pura comprende al menos aproximadamente el 75% en peso de la proteína total, prefiriéndose al menos aproximadamente el 80% y siendo particularmente preferido al menos aproximadamente el 90%. La definición incluye la producción de una proteína de TNF-a variante de un organismo en un organismo o célula huésped diferente. Alternativamente, la proteína puede prepararse a una concentración significativamente más alta de la que se ve normalmente, mediante el uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresión, de modo que la proteína se produzca a mayores niveles de concentración. Además, todas las proteínas del TNF-a variantes descritas en el presente documento están en una forma que normalmente no se encuentra en la naturaleza, ya que contienen sustituciones, inserciones y eliminaciones de aminoácidos, prefiriéndose las sustituciones, como se analiza a continuación.

También se incluyen dentro de la definición de proteínas del TNF-a variantes de la presente invención las variantes de secuencia de aminoácidos de las secuencias variantes de TNF-a descritas en este documento y mostradas en las Figuras. Es decir, las proteínas de TNF-a variantes pueden contener posiciones variables adicionales en comparación con el TNF-a humano. Estas variantes se clasifican en una o más de tres clases: variantes de sustitución, de inserción o de eliminación.

Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales; las inserciones serán normalmente del orden de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, aunque pueden tolerarse inserciones considerablemente más grandes. Las eliminaciones varían de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos, aunque en algunos casos las eliminaciones pueden ser mucho más grandes.

Utilizando los ácidos nucleicos de la presente invención, que codifican una proteína de TNF-a variante, se elaboran diversos vectores de expresión. Los vectores de expresión pueden ser vectores extracromosómicos autorreplicantes o vectores que se integran en un genoma del huésped. Generalmente, estos vectores de expresión incluyen ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional unido operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína de TNF-a variante. El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

El ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una secuencia previa o líder secretora está operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente ligado a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción.

En una realización preferida, cuando la secuencia secretora endógena conduce a un bajo nivel de secreción de la proteína de origen natural o de la proteína de TNF-a variante, se desea un reemplazo de la secuencia líder secretora de origen natural. En esta realización, una secuencia líder secretora no relacionada está operativamente ligada a un ácido nucleico que codifica TNF-a variante que conduce a una mayor secreción de proteínas. Por lo tanto, se desea cualquier secuencia líder secretora que dé como resultado una secreción potenciada de la proteína de TNF-a variante, cuando se compara con la secreción de TNF-a y su secuencia secretora. Se conocen en la técnica secuencias líder secretoras adecuadas que conducen a la secreción de una proteína. En otra realización preferida, una secuencia líder secretora de una proteína natural o una proteína se elimina mediante técnicas conocidas en la técnica y la expresión posterior da como resultado la acumulación intracelular de la proteína recombinante.

Generalmente, "operativamente enlazado" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se realiza mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional. El ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional será generalmente apropiado para la célula huésped usada para expresar la proteína de fusión; por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y la traducción de Bacillus se usan preferiblemente para expresar la proteína de fusión en Bacillus. Se conocen en la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células huésped.

En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y detención de la transcripción, secuencias de inicio y detención de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. En una realización preferida, las secuencias reguladoras incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada de la transcripción. Las secuencias promotoras codifican promotores constitutivos o inducibles. Los promotores pueden ser promotores naturales o promotores híbridos. Los promotores híbridos, que combinan elementos de más de un promotor, también se conocen en la técnica y son útiles en la presente invención. En una realización preferida, los promotores son promotores fuertes, que permiten una alta expresión en células, particularmente en células de mamíferos, tales como el promotor de CMV, particularmente en combinación con un elemento regulador de Tet.

Además, el vector de expresión puede comprender elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación, lo que permite que se mantenga en dos organismos, por ejemplo, en células de mamífero o de insecto para la expresión y en un huésped procariota para la clonación y amplificación. Además, para integrar vectores de expresión, el vector de expresión contiene al menos una secuencia homóloga al genoma de la célula huésped, y preferiblemente dos secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. El vector de integración puede dirigirse a un locus específico en la célula huésped seleccionando la secuencia homóloga apropiada para su inclusión en el vector. Los constructos para integrar vectores son bien conocidas en la técnica.

Además, en una realización preferida, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células huésped transformadas. Los genes de selección son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula huésped utilizada. Un sistema de vector de expresión preferido es un sistema de vector retroviral tal como se describe generalmente en los documentos PCT/US97/01019 y PCT/US97/01048. En una realización preferida, el vector de expresión comprende los componentes descritos anteriormente y un gen que codifica una proteína de TNF-a variante. Como apreciarán los expertos en la técnica, todas las combinaciones son posibles y, en consecuencia, como se usa en el presente documento, la combinación de componentes, comprendida por uno o más vectores, que pueden ser retrovirales o no, se denomina en el presente documento una "composición de vector".

Se han utilizado varios vectores basados en virus para la administración de genes. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,576,201. Por ejemplo, los sistemas retrovirales son conocidos y generalmente emplean líneas de empaquetamiento que tienen un provirus defectuoso integrado (el "auxiliar") que expresa todos los genes del virus pero no puede empaquetar su propio genoma debido a una eliminación de la señal de empaquetamiento, conocida como la secuencia psi. Por lo tanto, la línea celular produce conchas virales vacías. Las líneas productoras pueden derivarse de las líneas de empaquetamiento que, además del auxiliar, contienen un vector viral, que incluye secuencias requeridas en cis para la replicación y empaquetamiento del virus, conocidas como repeticiones terminales largas (LTR). El gen de interés puede insertarse en el vector y empaquetarse en los caparazones virales sintetizados por el auxiliar retroviral. A continuación, el virus recombinante puede aislarse y administrarse a un sujeto (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,219,740). Los vectores retrovirales representativos incluyen, entre otros, vectores tales como los vectores LHL, N2, LNSAL, LSHL y LHL2 descritos en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,219,740, así como derivados de estos vectores. Los vectores retrovirales se pueden construir usando técnicas bien conocidas en el arte. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,219,740; Mann et al., (1983) Cell 33: 153-159.

Se han desarrollado sistemas basados en adenovirus para la administración de genes y son adecuados para la administración de acuerdo con los métodos descritos en este documento. Los adenovirus humanos son virus de ADN de doble cadena que ingresan a las células por endocitosis mediada por receptores. Estos virus son particularmente adecuados para la transferencia de genes porque son fáciles de cultivar y manipular y exhiben una amplia gama de huéspedes in vivo e in vitro.

Los adenovirus infectan células objetivo inactivas así como en replicación. A diferencia de los retrovirus que se integran en el genoma del hospedador, los adenovirus persisten extracromosómicamente, minimizando así los riesgos asociados con la mutagénesis por inserción. El virus se produce fácilmente con títulos altos y es estable, por lo que puede purificarse y almacenarse. Incluso en la forma de replicación competente, los adenovirus causan solo un nivel bajo de morbilidad y no están asociados con neoplasias malignas humanas. Por consiguiente, se han desarrollado vectores de adenovirus que hacen uso de estas ventajas. Para una descripción de los vectores de adenovirus y sus usos, véase, por ejemplo, Haj-Ahmad y Graham (1986) J. Virol. 57: 267-274; Bett et al., (1993) J. Virol. 67: 5911-5921; Mittereder et al., (1994) Human Gene Therapy 5: 717-729; Seth et al., (1994) J. Virol. 68: 933-940; Barr et al., (1994) Gene Therapy 1: 51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6: 616-629; Rich et al., (1993) Human Gene Therapy 4: 461-476.

En una realización preferida, los vectores virales usados en los métodos objetivo son vectores AAV. Por un "vector AAV" se entiende un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, que incluye, entre otros, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, etc. Vectores AAV típicos pueden tener uno o más de los genes de tipo silvestre de AAV suprimidos en su totalidad o en parte, preferiblemente los genes rep y/o cap, pero conservan secuencias de ITR flanqueantes funcionales. Las secuencias de ITR funcionales son necesarias para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión AAV. Un vector de AAV incluye al menos aquellas secuencias requeridas en cis para la replicación y empaquetamiento (por ejemplo, ITR funcionales) del virus. No es necesario que las ITR sean las secuencias de nucleótidos de tipo silvestre y pueden alterarse, por ejemplo, mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos, siempre que las secuencias proporcionen un rescate funcional, replicación y empaquetamiento. Para más información sobre varios serotipos de AAV, véase, por ejemplo, Cearley et al., Molecular Therapy, 16: 1710-1718, 2008.

Los vectores de expresión de AAV pueden construirse usando técnicas conocidas para proporcionar como componentes unidos operativamente en la dirección de la transcripción, elementos de control que incluyen una región de inicio de la transcripción, el ADN de interés y una región de terminación de la transcripción. Los elementos de control se seleccionan para que sean funcionales en una neurona talámica y/o cortical. Pueden incluirse elementos de control adicionales. El constructo resultante, que contiene los componentes enlazados operativamente, está unido (5' y 3') con secuencias ITR de AAV funcionales.

Por "repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociados" o "ITR de AAV" se entiende las regiones reconocidas en la técnica que se encuentran en cada extremo del genoma de AAV que funcionan juntas en cis como orígenes de la replicación del ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITR de AAV, junto con la región codificante rep de AAV, proporcionan la escisión y el rescate eficientes y la integración de una secuencia de nucleótidos interpuesta entre dos ITR flanqueantes en un genoma de células de mamífero.

Se conocen las secuencias de nucleótidos de las regiones ITR de AAV. Véase, por ejemplo, Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Berns, K. I. "Parvoviridae and their Replication" en Fundamental Virology, 2a edición, (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds) para la secuencia de AAV-2. Como se usa en este documento, un "AAV ITR" no necesita tener la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre representada, pero puede alterarse, por ejemplo, por la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos. Además, la ITR de AAV puede derivarse de cualquiera de varios serotipos de AAV, incluidos, entre otros, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, etc. Además, las ITR de 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de AAV no necesitan ser necesariamente idénticas o derivadas del mismo serotipo o aislado de AAV, siempre que funcionen de acuerdo con lo previsto, es decir, para permitir la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un genoma o vector de célula huésped, y para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen AAV Rep están presentes en la célula.

Las moléculas de ADN adecuadas para su uso en vectores de AAV incluirán, por ejemplo, un gen que codifica una proteína defectuosa o que falta en un sujeto receptor o un gen que codifica una proteína que tiene un efecto biológico o terapéutico deseado (por ejemplo, una enzima o un factor neurotrófico). El experto en la materia podrá determinar qué factor es apropiado en función del trastorno neurológico que se esté tratando.

La secuencia de nucleótidos seleccionada está operativamente ligada a elementos de control que dirigen la transcripción o expresión de la misma en el sujeto in vivo. Dichos elementos de control pueden comprender secuencias de control normalmente asociadas con el gen seleccionado. Alternativamente, se pueden emplear secuencias de control heterólogas. Las secuencias de control heterólogas útiles incluyen generalmente aquellas derivadas de secuencias que codifican genes de mamífero o virales. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano de SV40, el promotor LTR del virus del tumor mamario de ratón; promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (HSV), un promotor del citomegalovirus (CMV) tal como la región del promotor temprano inmediato del CMV (CMVIE), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotores sintéticos, promotores híbridos y similares. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de la metalotioneína murina, también encontrarán uso en el presente documento. Tales secuencias promotoras están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Stratagene (San Diego, CA).

Una vez preparada, la proteína de TNF-a puede modificarse covalentemente. Por ejemplo, un tipo preferido de modificación covalente de TNF-a variante comprende unir el polipéptido TNF-a variante a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol ("PEG"), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. Estos polímeros no proteináceos también pueden usarse para mejorar la capacidad del TNF-a variante para interrumpir la unión del receptor y/o la estabilidad in vivo. En otra realización preferida, las cisteínas se diseñan en TNF-a variante o de tipo silvestre con el fin de incorporar (a) sitios de marcaje para la caracterización y (b) incorporar sitios de PEGilación. Por ejemplo, los marcadores que pueden usarse son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, biotina, etiquetas y marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína). Estos marcadores pueden usarse en varios ensayos como también son bien conocidos en la técnica para lograr la caracterización. Puede usarse una variedad de químicas de acoplamiento para lograr la PEGilación, como es bien conocido en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, las tecnologías de Shearwater y Enzon, que permiten la modificación en aminas primarias, que incluyen, pero no se limitan a, grupos lisina y el extremo terminal N. Véase, Kinstler et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 477-485 (2002) y M J Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 459­ 476 (2002).

En una realización preferida, los sitios óptimos de modificación química son 21, 23, 31 y 45, tomados solos o en cualquier combinación. En una realización aún más preferida, una variante de TNF-a de la presente invención incluye la mutación R31C.

En una realización preferida, la proteína de TNF-a variante se purifica o aísla después de la expresión. Las proteínas de TNF-a variantes pueden aislarse o purificarse de diversas formas conocidas por los expertos en la técnica, dependiendo de qué otros componentes estén presentes en la muestra.

Trastornos neurológicos

Como se divulga en el presente documento, cuando se administran periféricamente, las proteínas de DN-TNF-a pueden reducir la inflamación en el cerebro y, por lo tanto, pueden usarse para tratar trastornos neurológicos, particularmente aquellos caracterizados por TNF-a elevado. En una realización, las moléculas de DN-TNF-a divulgadas en el presente documento encuentran uso en el tratamiento de trastornos neurológicos, por ejemplo, reduciendo la inflamación en el cerebro, protegiendo la mielinización de neuronas y/o promoviendo la remielinización de neuronas. Por consiguiente, los trastornos neurológicos particularmente susceptibles de los métodos descritos en este documento incluyen enfermedades neurodegenerativas inflamatorias reconocidas en la técnica, que pueden resultar en la destrucción de la mielina o pueden incluir otros trastornos neurológicos que no se caracterizan necesariamente por la destrucción de la mielina pero que se caracterizan por niveles elevados de TNF-a.

En una realización, las enfermedades neurodegenerativas son un grupo de enfermedades tipificadas por el deterioro de las neuronas y/o su envoltura de mielina. Esta destrucción de neuronas eventualmente conduce a disfunciones y discapacidades. A menudo, la inflamación, que se cree que está mediada por células microgliales, es un componente de las enfermedades neurodegenerativas y se suma a la patogenia de la neurodegeneración. En conjunto, estas enfermedades comprenden las enfermedades neurodegenerativas inflamatorias reconocidas en la técnica. La neuroinflamación puede ocurrir años antes de cualquier pérdida considerable de neuronas en algunos trastornos neurodegenerativos. Por ejemplo, el 70% de las neuronas dopaminérgicas se pierden de la sustancia negra antes de que los pacientes comiencen a manifestar los signos clínicos de la enfermedad de Parkinson; véase, por ejemplo, Factor y Weiner (2008) Parkinson Desease: Diagnosis and Clinical Management. Muchos tipos diferentes de células inmunes, incluidos macrófagos, neutrófilos, células T, astrocitos y microglía, pueden contribuir a la patología de enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, como la esclerosis múltiple (MS), la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la demencia (incluidas, entre otras, enfermedades como la enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal, demencia relacionada con traumatismos (borrachera), demencia asociada al VIH y por cuerpos de Lewy), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedades priónicas, etc. Más específicamente, en la Ms , la lesión de la mielina está mediada por una respuesta inflamatoria y MS. La patogenia se agrava cuando los leucocitos se infiltran en el SNC.

En consecuencia, las enfermedades neurodegenerativas inflamatorias incluyen, pero no se limitan a: esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Parkinson, amiloidosis (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), demencia asociada al VIH, accidente cerebrovascular/isquemia cerebral, trauma de cabeza, lesión de la médula espinal, enfermedad de Huntington, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad; deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero, y preferiblemente en un ser humano.

La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad neurodegenerativa inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC) que afecta a aproximadamente 1,100,000 personas en todo el mundo, en particular afecta a adultos jóvenes. La MS se caracteriza patológicamente por la desmielinización del tejido neural, lo que clínicamente da como resultado una de las muchas formas de la enfermedad, que van desde patrones benignos a crónicos progresivos del estado patológico. Más específicamente, se han descrito cinco formas principales de esclerosis múltiple: 1) esclerosis múltiple benigna; 2) esclerosis múltiple remitente-recurrente (RRMS); 3) esclerosis múltiple secundaria progresiva (SPMS); 4) esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS); y 5) esclerosis múltiple progresiva con recaídas (PRMS). La esclerosis múltiple progresiva crónica es un término que se usa para referirse colectivamente a SPMS, PPMS y PRMS. Las formas recurrentes de esclerosis múltiple son SPMS con recaídas superpuestas, RRMS y PRMS.

A lo largo del curso de la enfermedad hay una destrucción progresiva de la envoltura de mielina que rodea a los axones. Dado que la mielina intacta es esencial para la preservación de la integridad axonal, la destrucción sistemática eventualmente conduce, clínicamente, a diversas disfunciones neurológicas que incluyen entumecimiento y dolor, problemas de coordinación y equilibrio, ceguera y deterioro cognitivo general.

La enfermedad de Parkinson, otra enfermedad neurodegenerativa inflamatoria, se caracteriza por trastornos del movimiento, que incluyen rigidez muscular y movimientos físicos lentos.

La amiloidosis se desarrolla cuando ciertas proteínas tienen una estructura alterada y tienden a unirse a cada acumulación en un tejido particular y bloquean el funcionamiento normal del tejido. Estas proteínas estructuradas alteradas se denominan amiloides. A menudo, la amiloidosis se divide en dos categorías: primaria o secundaria. Las amiloidosis primarias se producen por una enfermedad con una función inadecuada de las células inmunitarias. Las amiloidosis secundarias generalmente surgen de una complicación de algunas otras enfermedades infecciosas o inflamatorias crónicas. Ejemplos de estas incluyen la enfermedad de Alzheimer y la artritis reumatoide. El problema subyacente de la amiloidosis secundaria es la inflamación.

La enfermedad de Alzheimer es otro tipo de enfermedad neurodegenerativa inflamatoria. Está ejemplificado por el creciente deterioro del aprendizaje y la memoria, aunque la enfermedad puede manifestarse de otras formas que indiquen una capacidad cognitiva alterada. A lo largo de la enfermedad, la pérdida progresiva de neuronas y sinapsis en la corteza cerebral conduce a una gran atrofia del tejido neural. Aunque se desconoce la causa de la enfermedad de Alzheimer, muchos creen que la inflamación juega un papel importante y los estudios clínicos han demostrado que la inflamación contribuye considerablemente a la patogénesis de la enfermedad.

La esclerosis lateral amiotrófica es otro trastorno neurológico debilitante. En la ALS se ha sugerido un vínculo entre la inflamación y la enfermedad.

En una realización, el trastorno neurológico es cualquier trastorno caracterizado por TNF-a elevado y puede incluir trastornos tales como accidente cerebrovascular, depresión, síndrome de estrés postraumático y lesión cerebral traumática.

Métodos de tratamiento

Los términos "tratamiento", "tratar" y similares, como se usan en este documento, incluyen la mejora o eliminación de una enfermedad o afección una vez que se ha establecido o el alivio de los síntomas característicos de dicha enfermedad o afección. Un método como se divulga en el presente documento también puede usarse para, dependiendo de la condición del paciente, prevenir la aparición de una enfermedad o afección o de síntomas asociados con una enfermedad o afección, incluida la reducción de la gravedad de una enfermedad o afección o síntomas asociados con la misma antes de la aflicción con dicha enfermedad o afección. Tal prevención o reducción antes de la aflicción se refiere a la administración del compuesto o composición de la invención a un paciente que en el momento de la administración no padece la enfermedad o afección. "Prevenir" también abarca prevenir la recurrencia o la prevención de recaídas de una enfermedad o afección o de los síntomas asociados con la misma, por ejemplo, después de un período de mejora. En una realización, el método divulgado en el presente documento evita la destrucción de mielina después de la administración de una proteína de DN-TNF-a.

En una realización, una proteína de DN-TNF-a como se describe en el presente documento se administra periféricamente a un paciente que lo necesita para reducir la neuroinflamación y/o prevenir la destrucción adicional de mielina. En otra realización, una proteína de DN-TNF-a como se describe en el presente documento se administra periféricamente a un paciente que la necesita para promover la remielinización de neuronas. En otra realización, la administración periférica de una proteína de DN-TNF-a como se describe en este documento da como resultado una inflamación reducida en el cerebro.

Un inhibidor de TNF-a puede administrarse periféricamente a un paciente antes de que se destruya el 30%, más preferiblemente antes del 25% y lo más preferiblemente antes del 20% de la mielina y/o la función del paciente. En una realización preferida, el inhibidor de TNF-a puede administrarse periféricamente a un paciente cuando al menos el 85%, y más preferiblemente al menos el 90%, o más preferiblemente al menos el 95% -100% de la mielina y/o función del paciente permanece. En otra realización, la administración periférica de un inhibidor de TNF-a como se describe en este documento puede restaurar al menos el 25% o el 30% o el 40% o el 50% o el 60% o el 70% o el 80% o el 90%, o más de la cantidad total de desmielinización antes de la administración.

En una realización, el método de tratamiento incluye administrar una molécula de DN-TNF como se describe en el presente documento a un paciente que padece una enfermedad neurodegenerativa. Una vez tratado, se puede controlar al paciente para detectar mejoras midiendo una serie de biomarcadores, incluida la activación de células microgliales o lipopolisacárido (LPS) como se conoce en la técnica. Además, los niveles de proteína C reactiva pueden medirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica como una indicación de inflamación. Como se ha encontrado que estos marcadores están elevados en pacientes que padecen enfermedad neurodegenerativa inflamatoria, después del tratamiento con un DN-TNF como se describe en el presente documento, la activación microglial, los niveles de LPS o proteína C reactiva se reducen en comparación con los niveles previos al tratamiento.

En una realización, los métodos comprenden la administración periférica del DN-TNF para el tratamiento del trastorno neurológico, tal como una enfermedad neurodegenerativa inflamatoria. Por administración periférica se entiende una administración distinta de la administración dirigida al cerebro, por ejemplo administración por inyección u otra administración al paciente de una manera periférica, no por administración dirigida al cerebro. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que, a pesar de la presencia de la barrera hematoencefálica, la administración periférica del DN-TNF a un paciente que padece o es propenso a padecer una enfermedad neurodegenerativa inflamatoria dará lugar a dosis terapéuticamente eficaces del DN-TNF en el cerebro. En una realización, el DN-TNF-a cruza la barrera hematoencefálica y trata eficazmente el trastorno neurológico como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el DN-TNF cruza una barrera hematoencefálica competente, por ejemplo, una no caracterizada como "con fugas", tal como puede existir en algunas condiciones de neuroinflamación. Según sea necesario, esto se puede ensayar controlando los biomarcadores para la enfermedad neurodegenerativa inflamatoria o detección directa de DN-TNF en el cerebro, usando anticuerpos u otros ensayos como se conocen en la técnica.

Alternativamente, la activación de las células microgliales o la elevación de los niveles de lipopolisacáridos pueden monitorizarse en un paciente putativo antes de la administración de una molécula de DN-TNF como se describe en el presente documento. Cuando cualquiera de estos marcadores está elevado en comparación con un control sano, el paciente puede necesitar tratamiento con un DN-TNF como se describe en el presente documento, tal como XPro1595.

En una realización alternativa, el método comprende la administración tópica de variantes de DN-TNF como se describe en el presente documento a la piel para el tratamiento de trastornos cutáneos autoinmunes, incluida la psoriasis. En esta realización, el DN-TNF se puede formular como una loción o crema como se describe en el presente documento.

Tratamientos de combinación:

Los tratamientos que están disponibles actualmente para la MS incluyen acetato de glatirámero, interferón-p, natalizumab y mitoxantrona. En general, estos fármacos inhiben el sistema inmunológico de forma inespecífica y limitan sólo marginalmente la progresión general de la enfermedad (Lubetzki et al., (2005), Curr. Opin. Neurol. 18: 237­ 244). Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar estrategias terapéuticas para tratar mejor la MS. Como se describe en el presente documento, los DN-TNF que inhiben el TNF-a soluble pero no transmembrana encuentran uso en el tratamiento de la MS. Estas moléculas encuentran un uso particular cuando se combinan con las terapias para MS actualmente disponibles como se conocen en la técnica y como se describen en este documento. Por ejemplo, los DN-TNF, tales como XPro1595, pueden combinarse en un régimen terapéutico con acetato de glatirámero, interferónp, natalizumab y mitoxantrona u otras moléculas, tales como metil bardoxolona o variantes de las mismas.

Como otro ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (AD), se puede administrar una proteína de DN-TNF a un individuo en terapia de combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de la AD. Los agentes terapéuticos adicionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de acetilcolinesterasa, que incluyen, pero no se limitan a, Aricept (donepezilo), Exelona (rivastigmina), metrifonato y tacrina (Cognex); agentes antiinflamatorios no esteroides, que incluyen, pero no se limitan a, ibuprofeno e indometacina; inhibidores de ciclooxigenasa-2 (Cox2) tales como Celebrex; e inhibidores de la monoaminooxidasa, tales como Selegilene (Eldepryl o Deprenyl). Las dosis de cada uno de los agentes anteriores se conocen en la técnica. Por ejemplo, Aricept se administra generalmente a razón de 50 mg por vía oral por día durante 6 semanas y, si el individuo lo tolera bien, a 10 mg por día a partir de entonces.

En una realización, el tratamiento del DN-TNF en un régimen terapéutico en combinación con las terapias conjuntas como se describe en este documento da como resultado una eficacia sinérgica en comparación con cualquiera de los tratamientos solos. Por "sinérgico" se entiende que la eficacia es más que el resultado de la eficacia aditiva de los dos tratamientos solos.

En una realización, el tratamiento del DN-TNF en un régimen terapéutico incluye la combinación de moléculas antiinflamatorias esteroides, tales como, pero sin limitarse a, dexametasona y similares o moléculas antiinflamatorias no esteroides.

Además, el DN-TNF puede formularse solo como terapia tópica o usarse en combinación o tratarse en un régimen con corticosteroides para el tratamiento de trastornos cutáneos autoinmunes tales como psoriasis, eccema y quemaduras (incluidas las quemaduras solares). Por ejemplo, se pueden usar soluciones de baño y humectantes, aceite mineral y vaselina que pueden ayudar a calmar la piel afectada y reducir la sequedad que acompaña a la acumulación de piel en las placas psoriásicas formuladas con o en un régimen terapéutico con DN-TNF como se describe en el presente documento. Además, las cremas y ungüentos medicados que se aplican directamente a las placas psoriásicas pueden ayudar a reducir la inflamación, eliminar las escamas acumuladas, reducir la rotación de la piel y eliminar las placas de la piel afectada. Ungüentos y cremas que contienen carbón, alquitrán, ditranol (antralina), corticosteroides tales como desoximetasona (Topicort), fluocinonida, análogos de la vitamina D3 (por ejemplo, calcipotriol) y retinoides se utilizan cuando se combinan con DN-TNF para aplicación tópica en la piel para el tratamiento de los trastornos autoinmunitarios de la piel.

Formulaciones

Dependiendo de la forma de introducción, la composición farmacéutica se puede formular de diversas formas. La concentración de la proteína de TNF-a variante terapéuticamente activa en la formulación puede variar de aproximadamente 0.1 a 100% en peso. En otra realización preferida, la concentración de la proteína de TNF-a variante está en el intervalo de 0.003 a 1.0 molar, prefiriéndose dosis de 0.03, 0.05, 0.1, 0.2 y 0.3 milimoles por kilogramo de peso corporal.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una proteína de TNF-a variante en una forma adecuada para la administración a un paciente. En la realización preferida, las composiciones farmacéuticas se encuentran en una forma soluble en agua, tal como están presentes como sales farmacéuticamente aceptables, lo que significa que incluye sales de adición tanto de ácido como de base. "Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia biológica de las bases libres y que no son biológicamente o de otra manera indeseables, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido ptoluenosulfónico, ácido salicílico y similares. Las "sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables" incluyen las derivadas de bases inorgánicas tales como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Particularmente preferidas son las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más de los siguientes: proteínas portadoras tales como albúmina de suero; tampones tales como NaOAc; rellenos tales como celulosa microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes aglutinantes; edulcorantes y otros agentes saborizantes; agentes colorantes; y polietilenglicol. Los aditivos son bien conocidos en la técnica y se usan en una variedad de formulaciones. En una realización adicional, las proteínas del TNF-a variantes se añaden en una formulación micelar; véase la patente de los Estados Unidos No.

5,833,948. Alternativamente, se pueden emplear liposomas con las proteínas de TNF-a para administrar eficazmente la proteína. Se pueden administrar combinaciones de composiciones farmacéuticas. Además, las composiciones de TNF-a de la presente invención pueden administrarse en combinación con otros agentes terapéuticos, ya sea sustancialmente de forma simultánea o coadministrada, o en serie, según sea necesario.

En una realización proporcionada en el presente documento, los anticuerpos, que incluyen pero no se limitan a anticuerpos monoclonales y policlonales, se generan contra proteínas del TNF-a variantes usando métodos conocidos en la técnica. En una realización preferida, estos anticuerpos anti-TNF-a variantes se utilizan para inmunoterapia. Por lo tanto, se proporcionan métodos de inmunoterapia. Por "inmunoterapia" se entiende el tratamiento de trastornos relacionados con TNF-a con un anticuerpo generado contra una proteína de TNF-a variante. Como se usa en este documento, la inmunoterapia puede ser pasiva o activa. La inmunoterapia pasiva, como se define en el presente documento, es la transferencia pasiva de anticuerpos a un receptor (paciente). La inmunización activa es la inducción de respuestas de anticuerpos y/o células T en un receptor (paciente). La inducción de una respuesta inmunitaria puede ser la consecuencia de proporcionar al receptor un antígeno de la proteína de TNF-a variante contra el que se generan anticuerpos. Como apreciará un experto en la técnica, el antígeno de la proteína de TNF-a variante puede proporcionarse inyectando un polipéptido TNF-a variante contra el cual se desea generar anticuerpos en un receptor, o contactando al receptor con un ácido nucleico que codifica la proteína de TNF-a variante capaz de expresar el antígeno de proteína de TNF-a variante, en condiciones para la expresión del antígeno de la proteína de TNF-a variante.

En otra realización preferida, un compuesto terapéutico se conjuga con un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo anti-proteína de TNF-a variante. El compuesto terapéutico puede ser un agente citotóxico. En este método, dirigir el agente citotóxico a tejido o células tumorales da como resultado una reducción en el número de células afectadas, reduciendo así los síntomas asociados con el cáncer y los trastornos relacionados con la proteína de TNF-a variante. Los agentes citotóxicos son numerosos y variados e incluyen, pero no se limitan a, fármacos o toxinas citotóxicas o fragmentos activos de tales toxinas. Las toxinas adecuadas y sus fragmentos correspondientes incluyen cadena A de difteria, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, curcina, crotina, fenomicina, enomicina y similares. Los agentes citotóxicos también incluyen radioquímicos elaborados conjugando radioisótopos con anticuerpos producidos contra proteínas del ciclo celular, o unión de un radionúclido a un agente quelante que se ha unido covalentemente al anticuerpo.

En una realización preferida, las proteínas del TNF-a variantes se administran como agentes terapéuticos y se pueden formular como se describió anteriormente. De manera similar, los genes del TNF-a variantes (que incluyen tanto la secuencia de longitud completa, las secuencias parciales o las secuencias reguladoras de las regiones codificantes de TNF-a variantes) pueden administrarse en aplicaciones de terapia génica, como se conoce en la técnica. Estos genes de TNF-a variantes pueden incluir aplicaciones antisentido, ya sea como terapia génica (es decir, para su incorporación al genoma) o como composiciones antisentido, como apreciarán los expertos en la técnica.

En una realización preferida, el ácido nucleico que codifica las proteínas del TNF-a variantes también puede usarse en terapia génica. En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en las células para lograr la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional en la que se logra un efecto duradero mediante un único tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos génicos, que implica la administración única o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente eficaz. Los ARN y ADN antisentido pueden usarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido cortos pueden importarse a células donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su absorción restringida por la membrana celular (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 4143-4146 (1986)). Los oligonucleótidos se pueden modificar para mejorar su absorción, por ejemplo, sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del huésped deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de genes in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y transfección mediada por liposomas-proteína de la cubierta viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11: 205-210 (1993)). En algunas situaciones, es deseable proporcionar a la fuente de ácido nucleico un agente que se dirija a las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etc. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis pueden usarse para dirigir y/o facilitar la absorción, por ejemplo, proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en el ciclo, proteínas que se dirigen a la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptores es descrita, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429 -4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 3410 - 3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de marcación genética y terapia génica, véase Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992).

En una realización preferida, los genes de TNF-a variantes se administran como vacunas de ADN, genes individuales o combinaciones de genes de TNF-a variantes. Las vacunas de ADN desnudo son generalmente conocidas en la técnica. Brower, Nature Biotechnology, 16: 1304-1305 (1998). Los métodos para el uso de genes como vacunas de ADN son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen la colocación de un gen de TNF-a variante o una porción de un gen de TNF-a variante bajo el control de un promotor para la expresión en un paciente que requiera de tratamiento. El gen de TNF-a variante usado para vacunas de ADN puede codificar proteínas de TNF-a variantes de longitud completa, pero más preferiblemente codifica porciones de las proteínas de TNF-a variantes que incluyen péptidos derivados de la proteína de TNF-a variante. En una realización preferida, se inmuniza a un paciente con una vacuna de ADN que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos derivadas de un gen de TNF-a variante. De manera similar, es posible inmunizar a un paciente con una pluralidad de genes de TNF-a variantes o porciones de los mismos como se define en el presente documento. Sin pretender imponer ninguna teoría, se induce la expresión del polipéptido codificado por la vacuna de ADN, las células T citotóxicas, las células T auxiliares y los anticuerpos, que reconocen y destruyen o eliminan las células que expresan las proteínas de TNF-a.

En una realización preferida, las vacunas de ADN incluyen un gen que codifica una molécula adyuvante con la vacuna de ADN. Tales moléculas adyuvantes incluyen citocinas que aumentan la respuesta inmunogénica al polipéptido TNF-a variante codificado por la vacuna de ADN. Los expertos en la técnica conocen adyuvantes adicionales o alternativos y encuentran uso en la invención.

Se contemplan composiciones farmacéuticas en las que se formulan una variante de TNF-a de la presente invención y uno o más agentes terapéuticamente activos. Las formulaciones de la presente invención se preparan para el almacenamiento mezclando la variante de TNF-a que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed., 1980, en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. La liofilización es bien conocida en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,215,743. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como histidina, fosfato, citrato, acetato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; edulcorantes y otros agentes saborizantes; rellenos tales como celulosa microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes aglutinantes; aditivos; agentes colorantes; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (p Eg ). En una realización preferida, la composición farmacéutica que comprende la variante de TNF-a de la presente invención puede estar en forma soluble en agua. La variante de TNF-a puede estar presente como sales farmacéuticamente aceptables, lo que pretende incluir sales de adición tanto de ácido como de base. "Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia biológica de las bases libres y que no son biológicamente o de otra manera indeseables, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares. Las "sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables" incluyen las derivadas de bases inorgánicas tales como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Particularmente preferidas son las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina. Las formulaciones que se utilizarán para la administración in vivo son preferiblemente estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril u otros métodos.

Liberación controlada

Además, se conocen en la técnica cualquiera de varios sistemas de administración y se pueden usar para administrar variantes de TNF-a de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, encapsulación en liposomas, micropartículas, microesferas (por ejemplo, microesferas de PLA/PGA) y similares. Alternativamente, puede usarse un implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas o fibras. Los sistemas de liberación sostenida pueden comprender un material polimérico o una matriz tal como poliésteres, hidrogeles, poli(alcohol vinílico), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT® y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. También es posible administrar un ácido nucleico que codifica el TNF-a de la presente invención, por ejemplo, mediante infección retroviral, inyección directa o recubrimiento con lípidos, receptores de superficie celular u otros agentes de transfección. En todos los casos, se pueden usar sistemas de liberación controlada para liberar el TNF-a en o cerca del lugar de acción deseado.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más de los siguientes: proteínas portadoras tales como albúmina de suero; tampones tales como NaOAc; rellenos tales como celulosa microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes aglutinantes; edulcorantes y otros saborizantes; agentes colorantes; y polietilenglicol. Los aditivos son bien conocidos en la técnica y se usan en una variedad de formulaciones. En una realización adicional, las proteínas del TNF-a variantes se añaden en una formulación micelar; véase la patente de los Estados Unidos No.

5,833,948. Alternativamente, se pueden emplear liposomas con las proteínas de TNF-a para administrar eficazmente la proteína. Se pueden administrar combinaciones de composiciones farmacéuticas. Además, las composiciones de TNF-a de la presente invención pueden administrarse en combinación con otros agentes terapéuticos, ya sea sustancialmente de forma simultánea o coadministrada, o en serie, según sea necesario. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más de los siguientes: proteínas portadoras tales como albúmina de suero; tampones tales como NaOAc; rellenos tales como celulosa microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes aglutinantes; edulcorantes y otros agentes saborizantes; agentes colorantes; y polietilenglicol. Los aditivos son bien conocidos en la técnica y se usan en una variedad de formulaciones. En una realización adicional, las proteínas del TNF-a variantes se añaden en una formulación micelar; véase la patente de los Estados Unidos No. 5,833,948. Alternativamente, se pueden emplear liposomas con las proteínas de TNF-a para administrar eficazmente la proteína. Se pueden administrar combinaciones de composiciones farmacéuticas. Además, las composiciones de TNF-a de la presente invención pueden administrarse en combinación con otros agentes terapéuticos, ya sea sustancialmente de forma simultánea o coadministrada, o en serie, según sea necesario.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de una proteína de DN-TNF divulgada en este documento incluyen polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. La proteína de DN-TNF se puede mezclar en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propelente que pueda ser necesario. Los polvos y aerosoles pueden contener, además de la proteína de DN-TNf , excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles pueden contener además propulsores habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano.

Métodos de administración

La administración de las proteínas del TNF-a variantes de la presente invención, preferiblemente en forma de una solución acuosa estéril, se realiza de forma periférica, es decir, no intracraneal, en una variedad de formas que incluyen, pero no se limitan a, por vía oral, por vía subcutánea, intravenosa, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal o intraocular. En algunos casos, por ejemplo, en el tratamiento de heridas, inflamación, etc., la proteína de TNF-a variante puede aplicarse directamente como una solución, ungüento, crema o aerosol. Las moléculas de TNF-a del presente documento también pueden administrarse mediante expresión bacteriana o fúngica en el sistema humano (por ejemplo, documento WO 04046346 A2,)

Subcutánea

La administración subcutánea puede ser preferible en algunas circunstancias porque el paciente puede autoadministrarse la composición farmacéutica. Muchas terapias de proteínas no son lo suficientemente potentes para permitir la formulación de una dosis terapéuticamente eficaz en el volumen máximo aceptable para la administración subcutánea. Este problema puede resolverse en parte mediante el uso de formulaciones de proteínas que comprenden arginina-HCl, histidina y polisorbato. Una variante de TNF-a de la presente invención puede ser más adecuada para la administración subcutánea debido, por ejemplo, a una potencia aumentada, una vida media en suero mejorada o una solubilidad mejorada.

Intravenosa

Como se conoce en la técnica, las terapias proteicas a menudo se administran mediante infusión intravenosa o bolo. Las variantes de TNF-a de la presente invención también se pueden administrar usando tales métodos. Por ejemplo, la administración puede ser por infusión intravenosa con cloruro de sodio al 0,9% como vehículo de infusión.

Inhalada

La administración pulmonar se puede lograr usando un inhalador o nebulizador y una formulación que comprende un agente aerosolizante. Por ejemplo, puede usarse la tecnología inhalable AERx® disponible comercialmente de Aradigm, o el sistema de administración pulmonar InhanceMR disponible comercialmente de Nektar Therapeutics. Las variantes de TNF-a de la presente invención pueden ser más adecuadas para la administración intrapulmonar. Las variantes de TNF-a de la presente invención también pueden ser más adecuadas para la administración intrapulmonar debido, por ejemplo, a una mejor solubilidad o un punto isoeléctrico alterado.

Administración oral

Además, las variantes de TNF-a de la presente invención pueden ser más adecuadas para la administración oral debido, por ejemplo, a una estabilidad mejorada al pH gástrico y una mayor resistencia a la proteólisis.

Transdérmica

Los parches transdérmicos pueden tener la ventaja añadida de proporcionar un suministro controlado de la proteína de DN-TNF al cuerpo. La disolución o dispersión de la proteína de DN-TNF en el medio adecuado puede producir tales formas de dosificación. Los potenciadores de la absorción también se pueden utilizar para aumentar el flujo de proteína de DN-TNF a través de la piel. Proporcionar una membrana de control de la velocidad o dispersar la proteína de DN-TNF en una matriz de polímero o gel puede controlar la velocidad de dicho flujo.

Intraocular

También se describen en el presente documento formulaciones oftálmicas, ungüentos para los ojos, polvos, soluciones y similares.

En una realización preferida, las proteínas de TNF-a variantes se administran como agentes terapéuticos y se pueden formular como se describió anteriormente. De manera similar, los genes de TNF-a variantes (que incluyen tanto la secuencia de longitud completa, las secuencias parciales o las secuencias reguladoras de las regiones codificantes de TNF-a variantes) pueden administrarse en aplicaciones de terapia génica, como se conoce en la técnica. Estos genes de TNF-a variantes pueden incluir aplicaciones antisentido, ya sea como terapia génica (es decir, para su incorporación al genoma) o como composiciones antisentido, como apreciarán los expertos en la técnica.

En una realización preferida, el ácido nucleico que codifica las proteínas del TNF-a variantes también se puede usar en terapia génica. En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en las células para lograr la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional en la que se logra un efecto duradero mediante un único tratamiento, y la administración de agentes terapéuticos génicos, que implica la administración única o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente eficaz. Los ARN y ADN antisentido pueden usarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido cortos pueden importarse a células donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su absorción restringida por la membrana celular (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 4143-4146 (1986). Los oligonucleótidos pueden modificarse para mejorar su absorción, por ejemplo, sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

Dosis

La dosificación se puede determinar dependiendo del trastorno tratado y el mecanismo de administración. Típicamente, una cantidad eficaz de las composiciones de la presente invención, suficiente para lograr un efecto terapéutico o profiláctico, varía de aproximadamente 0.00000l mg por kilogramo de peso corporal por día a aproximadamente 10,000 mg por kilogramo de peso corporal por día. De manera adecuada, los intervalos de dosificación son desde aproximadamente 0.0001 mg por kilogramo de peso corporal por día hasta aproximadamente 2000 mg por kilogramo de peso corporal por día. Un ejemplo de régimen de tratamiento implica la administración una vez al día o una vez a la semana o una vez al mes. Se puede administrar una proteína de DN-TNF en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser diarios, semanales, mensuales o anuales. Alternativamente, se puede administrar una proteína de DN-TNF como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del agente en el sujeto. La dosis y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos sujetos continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el sujeto muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, con la patente se puede administrar un régimen profiláctico.

Toxicidad. De forma adecuada, una cantidad eficaz (por ejemplo, dosis) de una proteína de DN-TNF descrita en el presente documento proporcionará un beneficio terapéutico sin causar una toxicidad sustancial al sujeto. La toxicidad del agente descrito en este documento se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, determinando la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) o la LD100 (la dosis letal para el 100% de la población). La relación de dosis entre efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosis que no sea tóxico para su uso en humanos. La dosis del agente descrito en este documento se encuentra adecuadamente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la dosis eficaz con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser escogidas por el médico particular en vista del estado del sujeto. Véase, por ejemplo, Fingl et al. En: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1 (1975).

Ejemplos

Ejemplo 1. El factor de necrosis tumoral transmembrana es neuroprotector

Animales: Se han descrito previamente ratones que contienen un alelo condicional de IkB quinasa p (IKKp) en el que el exón 3 del gen Ikbkb, que codifica el bucle de activación de IKKp, está flanqueado por sitios loxP (IKKpF/F) (Park et. al., Science 2002; 297: 2048-51; Li et al., J Immunol 2003; 170: 4630-7). Se generaron ratones con una eliminación selectiva de IKKp en neuronas del SNC (nlKKpKO) cruzando ratones IKKpF/F con ratones que expresan una recombinasa Cre dirigida por el promotor de calmodulina-quinasa IIa neuronal (CamklICre; Minichiello et al., Neuron 1999; 24: 401-24).

Inducción y evaluación experimental de encefalomielitis autoinmune: Se indujo EAE en ratones C57BL/6, IKKpF/F y nlKKpKO hembra mediante inyección subcutánea en la base de la cola de 30 |jg de la secuencia peptídica 35-33 de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina de rata (MOG35-55) disuelta en 100 jL de solución salina emulsionada en un volumen igual de adyuvante completo de Freund suplementado con 400 jg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco). Los ratones también recibieron una inyección intraperitoneal de 200 ng de toxina pertussis (Sigma-Aldrich) los días 0 y 2 después de la inmunización. Se trataron grupos de ratones con inyecciones subcutáneas dos veces por semana de XPro1595 (10 mg/kg; Xencor; Steed et al., Science 2003; 301: 1895-8), etanercept (10 mg/kg; Amgen; Murray y Dahl, Ann Pharmacother 1997 ; 31: 1335-8) o vehículo salino en protocolos profilácticos (a partir del día de la inmunización) o terapéuticos (a partir del inicio de los signos clínicos). Los ratones se evaluaron diariamente para detectar signos clínicos de enfermedad de acuerdo con la siguiente escala: 0, normal; 1, cola flácida; 2, debilidad de las patas traseras; 3, parálisis de las patas traseras; 4, debilidad de las extremidades anteriores; y 5, moribundo o muerto (0.5 gradaciones representan puntajes intermedios). Los animales moribundos se sacrificaron y se les dio una puntuación clínica de 5 durante los días restantes del experimento. A los ratones se les permitió acceso a comida y agua a voluntad durante todo el experimento.

Análisis histopatológico: los ratones se perfundieron transcardialmente con paraformaldehído al 4% helado en solución salina tamponada con fosfato bajo anestesia profunda. Los tejidos del SNC se procesaron de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Análisis de biomarcadores: el cerebro, la médula espinal y el suero de ratones representativos se diseccionaron y se congelaron en nitrógeno líquido. Los homogeneizados de tejido y el suero se analizaron mediante tecnología de elaboración de perfiles de analitos múltiples (Rules Based Medicine). Los tejidos se analizaron usando los inmunoensayos multiplex RodentMAP® v. 2.0. Los inmunoensayos basados en perlas se desarrollaron y optimizaron en Rules Based Medicine y se leyeron en un sistema Luminex 200 (Luminex). El panel contenía 59 biomarcadores, incluidas citocinas, quimiocinas y proteasas clave. Los marcadores no mostrados para la médula espinal frente al cerebro y el suero no pudieron analizarse en la médula espinal debido al material limitado.

Ensayos de cebado y proliferación de células T: las células T se cebaron in vivo mediante inmunización subcutánea de ratones C57BL/6 con 30 jg de péptido MOG35-55 disuelto en 100 jL de solución salina y emulsionado en un volumen igual de adyuvante completo de Freund (Sigma-Aldrich) suplementado con 400 jg de M. tuberculosis H37Ra (Difco). Los ganglios linfáticos de drenaje y los bazos se extrajeron 10 días después. Las células mononucleares aisladas se estimularon por triplicado a razón de 4 * 106 células/mL en placas de 96 pozos de fondo redondo (Costar) durante 72 h en RPMI 1640 (Biochrom) que contenía suero de ternero fetal inactivado por calor al 10%, 2-mercaptoetanol 50 jM y concentraciones crecientes de MOG35-55. Las células se pulsaron con [3H] timidina de 0.5 jC i (Amersham Radiochemicals)/5 x 105 células durante las últimas 16 h de cultivo, y se midió la incorporación de [3H] timidina mediante recuento de centelleo líquido (Wallac). Los resultados se expresan como un índice de estimulación del péptido MOG35-55 (relación entre los recuentos de radiactividad de las células cultivadas en presencia de péptido y las células cultivadas con medio solo).

Extracción y caracterización de células que se infiltran en el sistema nervioso central. Se aislaron esplenocitos y células mononucleares que se infiltran en la médula espinal de ratones en el pico de EAE y el día 35 después de la inmunización. Las células mononucleares de la médula espinal se aislaron mediante centrifugación en gradiente de Percoll como se conoce en la técnica. Para la detección de marcadores de superficie celular, las células se lavaron y fijaron en solución de paraformaldehído al 2% en solución salina tamponada con fosfato durante 15 min a temperatura ambiente y se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorocromo (anti-NKI.l, clon PK136; anti-CD11b/Mac1, clon M1/70; BD Biosciences). Para la detección del marcador de superficie CD4 y las citocinas intracelulares mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia, después del aislamiento, las células se reestimularon con 10 ng/mL de 12-miristato 13-acetato de forbol y 1 pg/mL de ionomicina en presencia de 5 pg/mL de brefeldina A (Sigma-Aldrich) durante 3 h antes de la fijación, como se indicó anteriormente. Las células se permeabilizaron con saponina al 0,5% p/v y se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorocromo (anti-CD4, clon L3T4; anti-IFN-y, clon XMG1.2; anti-IL-17, clon TC11-18H10; BD Biosciences). La adquisición y el análisis de datos se realizaron con un citómetro FACSCalibur y el software CellQuest (BD Biosciences).

Cultivos de neuronas/astrocitos y tratamientos experimentales: se prepararon cultivos de astrocitos a partir de tejidos corticales de los días 1-3 posnatales de ratones C57BL/6 mediante trituración mecánica suave. Las células se cultivaron en placas de 24 pozos recubiertas con poli-D-lisina (0.1 mg/mL) y laminina (20 pg/mL) en medio que contenía Medio Eagle modificado de Dulbecco que contenía 4.5 g/L de glucosa y suplementado con suero de ternero fetal al 10%, suero de caballo al 10%, glutamax 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 100 pM, 50 U/mL de penicilina y 50 pg/mL de estreptomicina. Se utilizó una capa confluente de astrocitos como capa alimentadora de neuronas corticales primarias. Se prepararon neuronas corticales a partir de ratones embrionarios del día 15 como se describió previamente (Nicole et al., J Neurosci 2001; 21: 3024-33), se sembraron en placa en la capa alimentadora de astrocitos y se usaron para experimentos que comenzaban los días 7 y 8 neuronales in vitro. La privación de glucosa se realizó como se describió previamente (Taoufik et al., J Neurosci 2007; 27: 6633-46). Se añadió TNF recombinante humano (R&D; 50 ng/mL), que señaliza selectivamente a través del receptor I de TNF murino y es suficiente para activar los astrocitos murinos, a los cocultivos 24 h antes del inicio y durante la privación de glucosa. Se añadió XPro1595 (Xencor; 200 ng/mL; Steed et al., 2003) o etanercept (Amgen; 100 ng/mL; Murray y Dahl, 1997) a los cocultivos 4 h después del inicio de la privación de glucosa. Se añadió BMS 345 541 (Merck; 25 pM) a los cocultivos 2 h antes de la privación de glucosa. Los cultivos mixtos se tiñeron con una solución de colorante azul tripano al 0.4% (Sigma) y las células se consideraron viables si excluían el colorante. Las células con morfología neuronal se contaron en 10 campos diferentes por pozo, en al menos tres cultivos separados por condición, mediante microscopía de contraste de fase (objetivo 40X).

Aislamiento de ARN y reacción semicuantitativa de cadena de la polimerasa con transcripción inversa. Se extrajo ARN total con TRIzol® (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la reacción semicuantitativa de cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), el ARN tratado con DNasa (Promega) se transcribió de forma inversa con la transcriptasa inversa M-MLV (Promega) y hexámeros aleatorios (Roche). Se utilizaron cebadores para la detección de la proteína inhibidora de FLICE (FLIP) (directo: 5'-GAA GAG TGT CTT GAT GAA GA-3' (SEQ ID NO: 4) e inverso: 5'-GAA AAG CTG GAT ATG ATA Gc-3' (SEQ ID NO: 5)), factor de crecimiento endotelial vascular (directo: 5'-GCG GGC TGC CTC GCA GTC-3' (SEQ ID NO: 6) e inverso: 5'-TCA CCG CCT TGG CTT GTC AC-3' (SEQ ID NO: 7)) y receptor del factor-1 estimulante de colonias (directo: 5'-GAC CTG CTC CAC TTC TCC AG-3' (SEQ ID NO: 8) e inverso: 5'-GGG TTC AGA CCA AGC GAG AAG-3' (SEQ ID NO: 9)). La p-actina de ratón se amplificó como un control de carga. El análisis densitométrico se realizó usando Image Quant 5.2 (Molecular Dynamics Storm Scanner 600) y se determinaron las intensidades de banda relativas.

Análisis de transferencia Western: se prepararon extractos de proteínas totales de la médula espinal de ratones seleccionados como se describió anteriormente (Taoufik et al., 2007). Se resolvieron treinta microgramos de extractos de proteínas totales en geles NuPAGE Novex Bis-Tris (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell). Las transferencias se probaron con anticuerpos contra la forma no fosforilada de neurofilamento-H (SMI-32) (1:400, Covance), proteína ácida fibrilar glial (1:1500, Chemicon), proteína básica de mielina (1:200, Chemicon), fosfo-kBa (1:500, Cell Signalling), fosfo-p65 (1:250, Cell Signalling) y caspasa 3 (1:2000, Santa Cruz). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron IgG anti-ratón y anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:2000 hasta 1:5000, Jackson Immunoresearch Laboratories). La unión del anticuerpo se detectó usando el sistema de detección ECL Plus (Amersham Pharmacia). Para normalizar el contenido de proteínas, las membranas se separaron y se volvieron a analizar con anticuerpo anti-p-tubulina (1:1000, Pharmingen).

Análisis estadístico: se realizaron análisis estadísticos con Sigma Stat 2.0 para Windows. Todos los datos se dan como media ± SMS. Para comparar las puntuaciones clínicas entre los grupos de ratones tratados en cada momento y los cambios neuropatológicos (inflamación, desmielinización, distrofia axónica y pérdida de axones), se realizó la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. Para el análisis de biomarcadores, se realizó la prueba t de Student. Para los análisis semicuantitativos de proteínas y RT-PCR, se realizó una medición de la intensidad de la banda con ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics Storm Scanner 600) y se expresó como intensidad de píxeles por unidad de área. Los valores se normalizaron usando los valores de p-actina o p-tubulina, respectivamente, y se compararon usando ANOVA de una vía seguida de la prueba t de Bonferroni para comparaciones por pares. Para la viabilidad celular, se utilizó ANOVA en intervalos seguido de la prueba t de Bonferroni para comparaciones por pares. El análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia y las respuestas proliferativas de los esplenocitos y las células de los ganglios linfáticos se analizaron mediante la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. P <0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados: la inhibición del factor de necrosis tumoral soluble, pero el factor de necrosis tumoral no soluble y transmembrana, protege a los ratones contra la encefalomielitis autoinmune experimental

Se indujo EAE en ratones hembra C57BL/6 mediante inmunización con péptido MOG35-55 y se ensayaron los efectos de la inyección subcutánea dos veces por semana de XPro1595 (10 mg/kg), o etanercept (10 mg/kg) o de vehículo salino tanto en protocolos profilácticos (a partir del día de la inmunización) como terapéuticos (a partir de la aparición de los signos clínicos). Ambos inhibidores se han caracterizado previamente para mostrar una potencia y eficacia equivalentes en un modelo murino de infección por artritis reumatoide por Listeria monocytogenes (Zalevsky et al., J Immunol 2007; 179: 1872-83). XPro1595 proporcionó beneficios clínicos significativos en comparación con el control tanto en protocolos terapéutico (Figura 3A y Tabla 1) como profiláctico (Figura 3B y Tabla 1), demostrando efectos promotores de enfermedades del TNF soluble. Por el contrario, la inhibición tanto del TNF soluble como del TNF transmembrana con etanercept no proporcionó ningún beneficio en comparación con los controles en ninguno de los protocolos de tratamiento e incluso agravó la enfermedad. La comparación entre los dos grupos de tratamiento mostró que los ratones tratados con etanercept mostraron defectos clínicos significativamente mayores en comparación con los ratones tratados con XPro1595 (Figura 3A y B; Tabla 1), lo que indica que el TNF transmembrana ejerce efectos beneficiosos significativos en EAE. Los ratones tratados profilácticamente con XPro1595 o etanercept mostraron un retraso significativo en el inicio de la enfermedad (Figura 3B y Tabla 1), lo que confirma un papel de avance de la enfermedad del TNF soluble.

Tabla 1. Incidencia, severidad clínica y tasa de mortalidad de EAE indujo MOG^35-55 en ratones tratados con vehículo, XPro1595 y etanercept________________________________________________________________________________ Ratones Incidencia Día de Puntuación Puntuación Puntuación Tasa de (%) inicio, máxima, clínica con el acumulada (hasta el mortalidad media media primer pico, día después de la (%) SEM SEM media SEM inmunización) Terapéutico

Experimento 1

Vehículo 8/8 (100) 14.75+0.79 8+0.33a 2.57+0.39 614(53) 3/8 (38) XPro1595 6/9 (67) 15.8+3.07 3.44+0.95b 2.31+0.54b 343(53) 2/6 (33.3) Etanercept 8/8 (100) 15.68+0.99 4.57+0.28 2.93+0.41 836(51) 5/8 (62.5) Experimento 2

Vehículo 10/10 (100) 10.6+0.73 4+0.2 3.1+0.38 832(39) 3/10 (30) XPro1595 10/10 (100) 11.2+0.51 2.79+0.18 2.25+0.13b 565(39) 0/10 (0) Etanercept 10/10 (100) 19.7+0.21 4+0.32 3.1+0.27 737(39) 3/10 (30) Profiláctico

Vehículo 10/10 (100) 11.3+0.48a 3.4+0.38 2.85+0.38 754(41) 1/10 (10) XPro1595 10/10 (100) 17.2+1.21 4+0.47 2.7+0.33 671(41) 3/10 (30) Etanercept 10/10 (100) 15.33+0.44 4.25+0.15 3.56+0.15 698(41) 2/10 (20) a P<0.05 para comparación entre ratones tratados con vehículo o XPro1595

b P<0.05 para comparación entre ratones tratados con XPro1595 o Etanercept

c P<0.05 para comparación entre ratones tratados con vehículo o XPro1595 y vehículo o Etanercept

Las secciones de médula espinal tomadas en el pico de enfermedad en el grupo de vehículo (Figura 4) y el día 35 después de la inmunización con péptido MOG, cuando el bloqueo de TNF soluble con XPro1595 proporcionó la máxima protección, mostraron niveles equivalentes de infiltración de células inflamatorias y tamaño de lesión similar en los diferentes grupos de tratamiento en ambos puntos de tiempo, medido en el pico por inmunotinción para CD3 (Figura 4A, D y G) y el día 35 después de la inmunización por tinción con hematoxilina y eosina. El área de daño estructural local en las lesiones, medida por la tinción con azul rápido de Luxol para la desmielinización (Figura 4B, E y H) y el número de axones distróficos inmunoteñidos con proteína precursora amiloide en la columna anterior (Figura 4C, F e I ), también fue similar en las muestras tratadas con XPro1595 en comparación con las muestras tratadas con vehículo en ambos puntos de tiempo. Sorprendentemente, el daño de la mielina y los axones se redujo en las muestras tratadas con etanercept en comparación con las muestras tratadas con vehículo en el pico (Figura 4b , C, H e I), pero no en el día 35 después de la inmunización, a pesar de que estos ratones presentaron las puntuaciones clínicas más graves. Estos resultados revelaron una disociación entre los efectos de los inhibidores de TNF sobre la enfermedad clínica y sobre las lesiones inflamatorias tempranas de la médula espinal, e indican que el beneficio terapéutico de la inhibición del TNF soluble es al menos parcialmente independiente de los niveles de infiltración inicial del SNC por células inflamatorias.

El bloqueo del factor de necrosis tumoral no compromete las respuestas de las células T efectoras específicas de MOG35-55

Se examinó a continuación si el bloqueo de TNF afectaba las respuestas inmunitarias analizando las respuestas de células T primarias a MOG35-55 en ratones que tenían TNF soluble, o TNF soluble y TNF transmembrana bloqueados. No se detectaron diferencias significativas en las respuestas de proliferación de memoria de los esplenocitos o del drenaje de las células de los ganglios linfáticos a MOG35-55 o la maduración de las células T efectoras CD4+ IFN-Y+ y CD4+ IL-17+ en el bazo entre los diferentes grupos de tratamiento. También se compararon las respuestas secundarias de las células T a MOG35-55 en esplenocitos y células mononucleares infiltrantes de la médula espinal aisladas de ratones en las fases pico y crónica de EAE. Nuevamente, no se detectaron diferencias en los esplenocitos o células T CD4+ IFN-Y+ infiltrantes del SNC, células CD11b o NK1.1+ entre los grupos de tratamiento, excepto por un aumento en los esplenocitos CD4+ IFN-Y+ en ratones tratados con XPro1595 frente a los tratados con vehículo en su punto máximo. Por lo tanto, las respuestas inmunitarias globales no se ven afectadas por ninguno de los inhibidores de TNF.

La inhibición del factor de necrosis tumoral soluble, factor de necrosis tumoral no soluble y transmembrana, reduce la producción de mediadores proinflamatorios y quimiocinas en el sistema nervioso central

Para explorar los mecanismos que podrían mediar las diferencias en la puntuación clínica entre los grupos de tratamiento, se realizó un análisis amplio de biomarcadores en ratones sin tratamiento previo y ratones con EAE tratados con vehículo o bloqueadores de TNF, en el momento del pico de la enfermedad en el grupo de vehículo. Se utilizó un panel de biomarcadores estándar de Rules Based Medicine para evaluar cuantitativamente la expresión de 59 marcadores de proteínas clave en extractos y suero de todo el cerebro y la médula espinal. Muchas moléculas proinflamatorias y quimiotácticas mostraron sobrerregulación en la médula espinal (Figura 5A) y el cerebro (Figura 5B) pero no el suero (Figura 5C) de EAE tratada con vehículo en comparación con ratones sin tratamiento previo con patrones de expresión similares, aunque la amplitud de efectos fue mayor en la médula espinal. En particular, un gran número de estas moléculas son productos de macrófagos/microglia activados (MPO, MCP-1/CCL2, RANTES, IL-1, KC/GRO/CXCL1; Muhagishi et al., J Neuroimmunol 1997; 77: 17-26; Filipovic et al., Dev Neurosci 2003; 25: 279-90; Simi et al., Biochem Soc Trans 2007; 35: 1122-6; Gray et al., Brain Pathol 2008; 18: 86-95) y astrocitos (MCP-1, MCP-3/CCL7, IP-10, RANTES, KC/GRO; Ransohoff et al., FASEB J 1993; 7: 592-600; Mihagishi et al., J Neuroimmunol 1997; 77: 17-26; Omari et al., Glia 2006 ; 53: 24-31; Thompson y Van Eldik Brain Res 2009; 1287: 47-57) en condiciones de inflamación; varios son mediadores clave de EAE (MPO, MCP-1, IL-6; Eugster et al., Eur J Immunol 1999; 29: 626-32; Mahad y Ransohoff Semin Immunol 2003; 15: 23-32; Chen et al., Brain 2008; 131: 1123-33) y están sobrerregulados en los tejidos de la esclerosis múltiple (MPO, MCP-1, KC/GRO; Filipovic et al.; Mahad y Ransohoff; Omari et al .; Gray et al.). Curiosamente, la inhibición de TNF soluble y TNF transmembrana por etanercept potenció aún más la expresión de varios de estos mediadores en la médula espinal (Figura 5A) y el cerebro (Figura 5B) en comparación con ratones con EAE tratados con vehículo. Por el contrario, la inhibición selectiva del TNF soluble por XPro1595 generalmente redujo la expresión en relación con los ratones tratados con vehículo tanto en la médula espinal (Figura 5A) como en el cerebro (Figura 5B). Estos resultados muestran que el TNF transmembrana actúa para subregular la producción de mediadores proinflamatorios dentro de los tejidos del SNC durante la EAE, mientras que el TNF soluble aumenta su expresión.

La inhibición del factor de necrosis tumoral soluble, factor de necrosis tumoral no soluble y transmembrana, mantiene la expresión de proteínas neuroprotectoras en la médula espinal

El análisis de inmunotransferencia y densitometría de lisados de médula espinal total de ratones EAE sin tratamiento previo y tratados en el pico de la enfermedad para las proteínas marcadoras de células del SNC mostró que los niveles de la forma no fosforilada de neurofilamento-H (SMI-32), un marcador de neurodegeneración, y la proteína ácida fibrilar glial, un marcador de astrocitosis, fueron significativamente sobrerregulados tanto en tejido tratado con vehículo como tratado con TNF soluble más bloqueador de TNF soluble más TNF transmembrana (etanercept) en comparación con el tejido sin tratamiento previo (Figura 6A). Por el contrario, los tejidos tratados con bloqueador de TNF soluble (XPro1595) no mostraron cambios en los niveles de SMI-32 en comparación con el tejido no tratado y una sobrerregulación más pequeña de la proteína ácida fibrilar glial en comparación con el tejido tratado con vehículo y etanercept (Figura 6A). Los niveles de proteína básica de mielina se redujeron notablemente en los tejidos de todos los grupos de tratamiento en comparación con los no tratados, aunque este cambio fue de nuevo menos severo en los tejidos tratados con XPro1595 en comparación con los tejidos tratados con vehículo y etanercept (Figura 6A).

A continuación se analizaron las formas fosforiladas del inhibidor de NF-kB, que se degrada liberando así NF-kB activo, y de la subunidad p65 de NF-kB, que es inducida específicamente por TNF y asociada con neuroprotección mediada por TNF. Los niveles tanto del inhibidor fosforilado de NF-kB como de la subunidad p65 NF-kB fosforilada se redujeron significativamente en los tratados con vehículo y etanercept en comparación con la médula espinal sin tratamiento previo, lo que implica niveles más bajos de actividad de NF-kB. Sin embargo, el bloqueo de la actividad del TNF soluble con el tratamiento con XPro1595 mantuvo los niveles de fosforilación de estas proteínas cerca de los del tejido no tratado (Figura 6B). Esto muestra que el TNF soluble contribuye a la pérdida de la actividad de NF-kB de la médula espinal y que el TNF transmembrana tiene un efecto opuesto durante la EAE. A continuación se comparó la expresión de las proteínas neuroprotectoras inducidas por NF-kB FLIP y el factor de crecimiento endotelial vascular, y del receptor para el factor 1 estimulante de colonias, CSF-1R, mediante RT-PCR semicuantitativa del ARN total aislado en el pico y el día 39 después de la inmunización (Figura 6C). La expresión de FLIP se redujo significativamente en la médula espinal tratada con vehículo en ambos puntos de tiempo de EAE en comparación con tejido sin tratamiento previo (Figura 6C). Por el contrario, su expresión se conservó en la médula tratada con XPro1595 y etanercept, lo que demuestra que el TNF soluble contribuye a la pérdida de expresión de FLIP inducida por EAE. El análisis por pares entre los grupos de tratamiento en cada momento mostró que el bloqueador de TNF soluble XPro1595 era más eficaz que etanercept para mantener los niveles de FLIP en la médula espinal durante la EAE, lo que indica que el TNF transmembrana es suficiente para esto. La expresión del factor de crecimiento endotelial vascular no se alteró en la médula espinal tratada con vehículo durante la EAE en comparación con el tejido no tratado (Figura 6C). Sin embargo, el análisis por pares entre los grupos en cada punto de tiempo mostró una marcada sobrerregulación de la expresión en los tejidos tratados con XPro1595 en ambos puntos de tiempo, y en los tejidos tratados con etanercept en el pico, mostrando que el TNF soluble inhibe la inducción del factor de crecimiento endotelial vascular durante la EAE y que XPro1595 bloquea con mayor eficacia esta inhibición (Figura 6C). La expresión del receptor del factor 1 estimulante de colonias se indujo en la médula espinal durante la EAE independientemente del tratamiento, aunque XPro1595 mejoró aún más su expresión el día 39 después de la inmunización (Figura 6C). Estos resultados muestran que la inhibición del TNF soluble y el mantenimiento del TNF transmembrana con XPro1595 apoya la expresión de moléculas neuroprotectoras en la médula espinal durante la EAE.

El factor de necrosis tumoral transmembrana media la neuroprotección contra la privación de glucosa en cocultivos de neuronas y astrocitos

Para examinar si los efectos protectores del TNF transmembrana en EAE incluyen la supervivencia mejorada de neuronas, se estudiaron los efectos del bloqueo de TNF en cocultivos de astrocitos-neuronas sometidos a muerte inducida por privación de glucosa, un modelo de daño neuronal isquémico que tiene relevancia para la esclerosis múltiple (Lassmann J Neurol Sci 2003; 206: 187-91). Los astrocitos se incluyeron como fuente de TNF transmembrana murino y TNF soluble. Como se mostró anteriormente en cultivos de neuronas corticales casi puros (<5% de astrocitos; Taoufik et al., 2007), la privación de glucosa indujo la muerte de neuronas que se cultivaron en contacto directo con astrocitos, y esto fue inhibido por el bloqueo de t Nf soluble (XPro1595), pero no el bloqueo de TNF soluble más TNF transmembrana (etanercept) comenzando 4 h después del inicio de la privación de glucosa (Figura 7A y B). La viabilidad de los astrocitos no se vio afectada por la privación de glucosa. Para activar los astrocitos e inducir la producción de TNF transmembrana, se trataron previamente los cocultivos astrocitos-neuronas con TNF humano durante 24 h antes de la privación de glucosa, condiciones que inducen una fuerte neuroprotección en cultivos neuronales casi puros (Taoufik et al., 2007). Estas condiciones redujeron significativamente la muerte neuronal inducida por privación de glucosa, y esta protección fue inhibida por etanercept pero no por XPro1595, lo que indica que está mediada por TNF transmembrana. Un papel neuroprotector del TNF transmembrana inducido se confirmó además por el hallazgo de que los cultivos tratados con XPro1595 mostraron menos muerte neuronal después del pretratamiento con TNF humano (Figura 7B). Sin embargo, cuando se cultivaron neuronas con astrocitos separados de ellas por Transwells, el bloqueo de TNF soluble (XPro1595) comenzando 4 h después del inicio de la privación de glucosa fue ineficaz para proteger las neuronas contra la muerte inducida por privación de glucosa (Figura 7C). Esto muestra que la neuroprotección del TNF transmembrana depende del contacto astrocito-neurona y que los astrocitos son la fuente de TNF transmembrana neuroprotector en estas condiciones. El análisis de inmunotransferencia y densitometría para el inhibidor fosforilado de NF-kB y la subunidad p65 NF-kB fosforilada de NF-kB mostró que, como en la médula espinal con EAE, sus niveles se mantuvieron en cultivos de astrocitos-neuronas tratados con XPro1595, pero no tratados con etanercept desafiados con privación de glucosa cuando se midieron 24 h después de la privación de glucosa. Los niveles de caspasa 3 activa (subunidad p20) también se redujeron significativamente en células tratadas XPro1595 comparado con las células tratadas con etanercept a las 12 h después de la privación de glucosa.

La protección mediada por el factor de necrosis tumoral transmembrana en la encefalomielitis autoinmune experimental depende de la actividad neuronal de NF-kB

La siguiente prueba fue si la neuroprotección mediada por TNF transmembrana a través de la señalización de NF-kB en neuronas puede ser un mecanismo de la eficacia clínica de XPro1595 in vivo en el modelo de EAE. En un estudio anterior, se mostró que la IKKp neuronal, que fosforila y media la degradación de IkB, activando así NF-kB (Ghosh y Karin 2002), es suficiente para mediar la neuroprotección y la supresión de la inflamación del SNC en EAE. En el presente documento, si probó si XPro1595 era capaz de ejercer sus efectos terapéuticos en ratones IKKp condicionales que carecen selectivamente de IKKp en neuronas que expresan CamklI en el cerebro y la médula espinal (nlKKpKo). De manera similar a los resultados en ratones C57BL/6 de tipo silvestre, los ratones IKKpF/F de control, en los que el exón 3 del gen Ikbkb está flanqueado por sitios loxP pero no eliminado por Cre recombinasa, se protegieron de los síntomas clínicos de EAE durante la fase crónica por administración de XPro1595 (Figura 8A). Por el contrario, la administración de XPro1595 no proporcionó protección en ratones nlKKpKO, y la enfermedad siguió un curso no remitente severo en los grupos tratados con vehículo y XPro1595 hasta el último punto de tiempo estudiado (Figura 8A). También se observaron efectos beneficiosos de XPro1595 en ratones IKKpF/F, pero no nlKKpKO, sobre la supervivencia de los animales (Figura 8B). De acuerdo con estos resultados, un inhibidor selectivo de IKKp, BMS 345 541, abolió los efectos neuroprotectores de XPro1595 contra la privación de glucosa en cocultivos neuronaastrocitos (Figura 8C), posiblemente a través de la inhibición combinada de la activación de astrocitos (y por lo tanto la producción beneficiosa de TNF transmembrana) y neuroprotección. En general, estos resultados muestran que los efectos terapéuticos del bloqueador de TNF soluble XPro1595 en EAE dependen directamente de la actividad neuronal de NF-kB, y sugieren que el TNF transmembrana es un mediador neuroprotector que envía señales a través de NF-kB neuronal para inducir tolerancia del SNC y posiblemente también reparación durante la fase crónica de EAE.

Ejemplo 2: Administración periférica de DN-TNF XPro1595 en un modelo de rata AAV-Asyn de la enfermedad de Parkinson

Se usaron inyecciones intranigrales de rAAV para sobreexpresar A-syn humano en neuronas DA para lograr un mal manejo patológico de A-syn que da como resultado una muerte celular DA significativa en SN. Un segundo grupo de animales recibirá rAAV-GFP como control negativo. Tres días después de las inyecciones de AAV, estos dos grupos se dividirán adicionalmente para recibir la administración periférica de DN-TNF XPro1595 o tampón de formulación. Para evaluar hasta qué punto la neutralización de solTNF en la periferia atenúa la neuroinflamación central y la degeneración de las neuronas DA nigrales, se evaluará el rendimiento motor de las ratas semanalmente durante 4 semanas, después de lo cual se extraerán cerebros para análisis inmunohistológicos para estimaciones estereológicas del número de neuronas DA nigrales, activación de la vía de la microglía y del TNF e infiltración de células T. Los perfiles de expresión de citocinas y quimiocinas también se analizarán en un momento intermedio.

Cirugía: dos grupos de ratas (n = 40x2) recibirán inyecciones unilaterales de 2 pL bajo guía estereotáxica de título alto que codifica rAAV para rAAV-GFP o rAAV-wt-a-syn en la SN derecha (AP: -5.3 mm, ML: -2.1 mm con respecto al bregma, DV: -7.,2 mm ventral con respecto a la duramadre). Tres días después de la cirugía, la mitad de los animales comenzará a recibir inyecciones subcutáneas dos veces por semana de XPro1595 (10 mg/kg) y la otra mitad con tampón de formulación como control. La dosificación se basa en Tmáx. (suero) para dosis sc de aproximadamente 18 horas en ratas.

Sacrificio de animales y procesamiento de tejidos: se sacrificarán 6 animales de cada grupo a las 4 semanas y 8 por grupo a las 9-10 semanas después de la inyección de rAAV. Los animales se anestesiarán profundamente y se perfundirán con paraformaldehído al 4%. Los cerebros serán recolectados y crioseccionados en un micrótomo de congelación para análisis inmunohistoquímico. Para los análisis de citocinas a las 4 semanas, se sacrificarán 6 ratas por grupo y se microdiseccionarán rápidamente la SN y los cuerpos estriados y se mantendrán a -80 °C hasta el análisis.

Prueba de comportamiento. Se probará el rendimiento motor de los animales a las 4 y 8 semanas utilizando el cilindro y la prueba de pasos; se ha demostrado que las ratas inyectadas con rAAV-Asyn presentan déficits motores en ambas tareas (Romero-Ramos, no publicado).

Activación de la vía de la microglía y el TNF. La inmunohistoquímica para los marcadores microgliales (Ibal, CD68 y MHCII) y la activación de la vía del TNF (fosfo-FADD, fosfo-TRADD) se realizará a nivel del cuerpo estriado y SN y se analizará mediante microscopía de inmunofluorescencia por un investigador que no conoce el historial de tratamiento. La evaluación del número de células se realizará mediante cuantificación estereológica imparcial de las células Iba1 en el costado inyectado con AAV-Syn (o AAV-GFP) y comparación con el sitio contralateral no inyectado. Además, la infiltración de células T se analizará mediante inmunotinción de células CD8+ y CD4+.

Número de neuronas DA Nigrales. La inmunohistoquímica para el marcador dopaminérgico (tirosina hidroxilasa) y el marcador panneuronal (NeuN) se realizará a nivel de la Sn . La evaluación de la pérdida de células se realizará mediante una cuantificación estereológica imparcial de las neuronas DA restantes en la SN frente al sitio no inyectado.

Perfil del factor inflamatorio. La SN y los cuerpos estriados disecados a las 4 semanas se aislarán y se obtendrá el ARNm para los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de citocinas/quimiocinas (Rat Inflammatory Cytokines & Receptors PCR Array, SABiosciences). La validación de genes desregulados se realizará mediante PCR en tiempo real.

Ejemplo 3: Administración periférica de DN-TNF XPro1595 en modelo de rata 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson

Se usarán inyecciones unilaterales de 6-OHDA para inducir la degeneración retrógrada de neuronas DA nigrales en ratas adultas jóvenes. Un segundo grupo de animales recibirá una lesión simulada (solución salina) como control negativo. Tres días después de las inyecciones estriatales, estos dos grupos se dividirán adicionalmente para recibir la administración periférica de DN-TNF XPro1595 o tampón de formulación. Para evaluar hasta qué punto la neutralización de solTNF en la periferia atenúa la neuroinflamación central y la degeneración de las neuronas DA nigrales, se evaluará el rendimiento motor de las ratas semanalmente durante 4 semanas, después de lo cual se extraerán cerebros para análisis inmunohistológicos para estimaciones estereológicas del número de neuronas DA nigrales, activación de la vía de la microglía y del TNF e infiltración de células T. Los perfiles de expresión de citocinas y quimiocinas también se analizarán en un momento intermedio.

Cirugía: dos grupos de ratas (n = 40x2) recibirán inyecciones unilaterales de 4 pL de 6-OHDA (20 pg) bajo guía estereotáxica utilizando protocolos publicados (Harms et al., 2011) a una velocidad de 0.5 pL/minuto en el cuerpo estriado derecho (AP: -1.0 mm, mL: -3.0 mm en relación con el bregma, DV: -4.5 mm ventral en relación con la duramadre). Tres días después de la cirugía, la mitad de los animales en los grupos de 6-OHDA y con lesiones simuladas comenzarán a recibir inyecciones subcutáneas dos veces por semana de XPro1595 (10 mg/kg) y la otra mitad recibirá tampón de formulación como control negativo. La dosificación se basa en Tmáx. (suero) para dosis sc de aproximadamente 18 horas en ratas.

Sacrificio de animales y procesamiento de tejidos: se sacrificarán 6 animales de cada grupo a las 2 semanas (final de la fase aguda de la muerte celular nigral) y 8 por grupo a las 5 semanas (final de la fase progresiva de la muerte celular nigral) después de inyecciones estriatales de 6-OHDA (o solución salina). Los animales se anestesiarán profundamente y se perfundirán con paraformaldehído al 4%. Los cerebros serán recolectados y crioseccionados en un micrótomo de congelación para análisis inmunohistoquímico. Para los análisis de citocinas a las 5 semanas, se sacrificarán 6 ratas por grupo y se microdiseccionarán rápidamente la SN y los cuerpos estriados y se mantendrán a -80 °C hasta el análisis.

Prueba de comportamiento: Se probará el rendimiento motor de los animales cada dos semanas durante 5 semanas, utilizando el cilindro y la prueba de pasos; nuestro laboratorio ha demostrado previamente que ambas pruebas se ven afectadas en el modelo de rata 6-OHDA (Harms et al., 2011).

Activación de la microglía: La inmunohistoquímica para los marcadores microgliales (Ibal, CD68 y MHCII) y la activación de la vía del TNF (fosfo-FADD, fosfo-TRADD) se realizará a nivel del cuerpo estriado y SN y se analizará mediante microscopía de inmunofluorescencia por un investigador sin conocer el historial de tratamiento. La evaluación del número de células se realizará mediante una cuantificación estereológica imparcial de las células Ibal+ en el lado inyectado con 6-OHDA (o solución salina) y comparación con el sitio contralateral no inyectado. Además, la infiltración de células T se analizará mediante inmunotinción de células CD8+ y CD4+.

Número de neuronas DA nigrales: La inmunohistoquímica para el marcador dopaminérgico (tirosina hidroxilasa) y el marcador panneuronal (NeuN) se realizará a nivel de la SN. La evaluación de la pérdida de células se realizará mediante una cuantificación estereológica imparcial de las neuronas DA restantes en la SN frente al sitio no inyectado.

Perfil de factor inflamatorio: La SN y los cuerpos estriados disecados a las 4 semanas se aislarán y se obtendrá el ARNm para los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de citocinas/quimiocinas (Rat Inflammatory Cytokines & Receptors PCR Array, SABiosciences). La validación de genes desregulados se realizará mediante PCR en tiempo real.

Ejemplo 4: Administración periférica de DN-TNF XPro1595 en el modelo de la SOD1 murino de ALS

Sujetos: Los modelos animales de enfermedades neurológicas hereditarias han avanzado significativamente nuestra comprensión de la patogénesis molecular y son muy prometedores para el desarrollo de posibles estrategias terapéuticas para el traslado a los pacientes. El desarrollo de ratones transgénicos que expresan SOD1 humana G93A como modelo de ratón para la enfermedad humana se ha considerado un gran avance para el desarrollo de terapias para la ALS. Los ratones transgénicos con SOD1 G93A desarrollan debilidad progresiva de las extremidades posteriores, atrofia muscular y secuelas neuropatológicas similares a las observadas en pacientes con ALS tanto esporádica como familiar. La médula espinal del ratón con SOD1 G93A muestra astrogliosis reactiva progresiva, atrofia neuronal marcada, pérdida neuronal y presencia de cuerpos de inclusión ubiquinados prominentes a los 90 días de edad. Además, el rendimiento motor se deteriora a medida que avanza la enfermedad. El modelo de ratón con SOD1 G93A ha jugado un papel destacado en el estudio de la progresión de la enfermedad y especialmente en la prueba de posibles agentes terapéuticos, esto último en parte porque estos animales tienen una vida útil más corta de aproximadamente 126 días.

En el presente estudio, los ratones G93A con SOD1 y los controles de compañeros de camada se crían a partir de colonias existentes en el Bedford VA Medical Hospital. Los ratones macho g 93A con SOD1 se aparean con hembras B6SJL y la descendencia se genotipifica por PCR usando ADN de cola. El número de transgenes de SOD1 se evalúa mediante PCR para garantizar que el número de copias del transgén permanezca constante. Los ratones se alojan en jaulas con microaisladores en instalaciones de barrera completas, y todos los estudios se realizan en estas instalaciones. Se mantiene un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y los animales tienen libre acceso a alimentos y agua. Se seleccionarán ratones de control y transgénicos de la misma edad (± 2 días) y de la misma generación 'f de entre múltiples camadas para formar cohortes experimentales (n = 20 por grupo). Se utilizarán criterios estandarizados de edad y parentesco para colocar ratones individuales en grupos/cohortes experimentales. Se utilizarán ratones de tipo silvestre para estudios iniciales de toxicidad, tolerabilidad y farmacocinética, y ratones con ALS para estudios de tolerabilidad de un mes.

Tolerabilidad, dosificación y farmacocinética: El intervalo de dosis tolerable y la LD50 para DN-TNF XPro1595 se determinarán en ratones de tipo silvestre aumentando la dosis dos veces al día una vez con cada inyección. La vía de administración será vía administración ip. Un objetivo es seleccionar un intervalo de dosis para el estudio de eficacia comenzando diez veces por debajo de la dosis máxima tolerada. Los estudios farmacocinéticos iniciales (pK) se llevarán a cabo administrando a los animales una dosis única, sacrificándolos después de 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h y 12 h, y diseccionando los cerebros y las médulas espinales y determinando la concentración del fármaco en el tejido objetivo. El nivel de fármaco en estado estacionario se determina en animales que habían sido dosificados durante 1 semana antes del sacrificio. El intervalo de niveles de dosificación de 0.01,0.1 y 1 mg/kg una vez al día se administrará durante la vida de los ratones G93A.

Farmacología del comportamiento. Las pruebas de comportamiento para los ratones transgénicos G93A con SOD1 se realizarán durante la fase ligera del ciclo diurno, ya que estos ratones son suficientemente activos durante ese tiempo. Las medidas se tomarán durante 30 minutos después de 10 minutos de aclimatación a la caja (Unidad Opto-Varimex, Columbus Instruments, Columbus, Ohio, EE. UU.). Se controlarán los recuentos de la actividad del movimiento horizontal y vertical y se evaluará el análisis cuantitativo de la actividad locomotora (tiempos de reposo y deambulación). La caja de campo abierto se limpiará antes de probar cada ratón. Cada 30 minutos de prueba se analizará como tres períodos de intervalos de 10 minutos para estudiar la influencia de la novedad y el comportamiento medido. Los ratones se codificarán y los investigadores no conocerán el genotipo y el análisis. Las pruebas se realizarán en la semana 4 y se realizarán cada dos semanas hasta que los ratones ya no puedan participar.

Estudios de eficacia: La eficacia se medirá utilizando criterios de valoración que indiquen claramente la función neuroprotectora. Estos incluyen la mejora de los cambios degenerativos en la médula espinal, la mejora de la función motora y la supervivencia prolongada. Algunas cohortes de ratones se sacrificarán en un punto de tiempo predeterminado (120 días) para un examen neuropatológico, mientras que otras se sacrificarán en la etapa terminal de la enfermedad utilizando criterios para la eutanasia. Las últimas cohortes serán seguidas temporalmente para análisis de comportamiento y supervivencia.

Supervivencia: Los ratones se observarán tres veces al día (por la mañana, al mediodía y al final de la tarde) durante todo el experimento. Los ratones serán sacrificados cuando la progresión de la enfermedad sea lo suficientemente severa como para que no puedan iniciar el movimiento y enderezarse después de presionar suavemente durante 30 segundos.

Pesos corporales:. Los ratones se pesarán dos veces por semana a la misma hora todos los días. La pérdida de peso es una medida sensible de la progresión de la enfermedad en ratones transgénicos G93A con SOD1 y de la toxicidad en ratones transgénicos y de tipo silvestre.

Pruebas motoras/comportamiento: Se utilizarán métodos cuantitativos para probar la función motora, incluida la barra rotatoria y el análisis del comportamiento en campo abierto. El deterioro de la función motora es una medida sensible del inicio y la progresión de la enfermedad. Las pruebas de comportamiento para los ratones transgénicos G93A con SOD1 se realizarán durante la fase ligera del ciclo diurno, ya que estos ratones son suficientemente activos durante ese tiempo. Las mediciones se realizarán durante 30 minutos después de 10 minutos de aclimatación a la caja (Unidad Opto-Varimex, Columbus Instruments, Columbus, Ohio, EE. UU.). Se controlarán los recuentos de la actividad del movimiento horizontal y vertical y se evaluará el análisis cuantitativo de la actividad locomotora (tiempos de reposo y deambulación). La caja de campo abierto se limpiará antes de probar cada ratón. Cada 30 minutos de prueba se analizará como tres períodos de intervalos de 10 minutos para estudiar la influencia de la novedad y el comportamiento medido. Los ratones se codificarán y los investigadores no conocerán el genotipo y el análisis. Las pruebas comenzarán en la semana 4 y se realizarán cada dos semanas hasta que los ratones ya no puedan participar.

Neuropatología: Las cohortes seleccionadas (n = 10) de ratones G93A con SOD1 tratados y no tratados serán sacrificados a los 120 días para el aislamiento y análisis del tejido de la médula espinal. Para este propósito, los ratones serán profundamente anestesiados y perfundidos transcardialmente con paraformaldehído tamponado al 4% en el momento deseado. Estos estudios se realizarán de forma ciega, para evitar sesgos en la interpretación de los resultados. Los cerebros se pesarán, se seccionarán en serie a 50 pm y se teñirán para determinar la morfología cuantitativa (violeta de cresilo) para determinar la atrofia macroscópica e identificar la pérdida de neuronas ventrales y la astrogliosis. Las muestras/secciones restantes de tejido se almacenarán para uso futuro. La estereología se utilizará para cuantificar la atrofia macroscópica del cuerno ventral, la atrofia neuronal y la pérdida neuronal. Las muestras/secciones de tejido restantes se almacenarán para análisis mecanicistas prospectivos según sea necesario.

Se generarán y analizarán conjuntos de datos para cada medida clínica y neuropatológica. Los efectos sobre el comportamiento y la neuropatología se compararán en los grupos de tratamiento y control. Los efectos dependientes de la dosis se evaluarán en cada grupo de tratamiento mediante múltiples pruebas de ANOVA de dos caras. Las comparaciones múltiples en los mismos grupos objetivo se abordarán post hoc. El análisis de Kaplan-Meier se utilizará para la función de supervivencia y comportamiento.

Cuantificación neuronal: Se utilizarán secciones seriadas de tejido de la médula espinal lumbar (n = 20) de los segmentos de la médula espinal L3-L5 para las áreas macroscópicas de la médula espinal y el análisis neuronal. Las áreas macroscópicas de las secciones de la médula espinal se cuantificarán a partir de cada cohorte experimental utilizando NIH Image. De las mismas secciones, el cuerno ventral estará delimitado por una línea desde el canal central lateralmente y circunscribiendo el vientre de la materia gris. Se realizarán recuentos neuronales absolutos de neuronas positivas para Nissl en los cuernos ventrales de la médula espinal lumbar. Solo se contarán aquellas neuronas con núcleo. Todos los recuentos se realizarán con el experimentador (JM) que no conoce las condiciones del tratamiento. Los recuentos se realizarán utilizando Imagen J (NlH) y se verificarán manualmente y los datos representan el número neuronal promedio de las secciones utilizadas.

Ejemplo 5: Administración periférica de DN-TNF XPro1595 en un modelo 3xTgAD de la enfermedad de Alzheimer

Los ratones 3xTgAD tienen un origen genético mixto 129/C57BL6 y serán generados. Los animales serán alojados en instalaciones de clima controlado libres de patógenos y se les permitirá tener comida y agua a voluntad.

Se inyectarán a los ratones 0.25 mg/kg (7.5 x 105 unidades de endotoxina UE/kg LPS (de Escherichia coli 0111: B4; 3.0 x 106 UE/mg, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) o un volumen equivalente de solución salina estéril (B.

BraunMedical Inc., Bethlehem, PA) por vía intraperitoneal (ip) dos veces por semana durante 4 semanas. Estos dos grupos de ratones se dividirán para recibir la administración periférica de DN-TNF XPro1595 o tampón de formulación. Para evaluar hasta qué punto la neutralización de solTNF en la periferia previene la aceleración de patología similar a la AD inducida por inflamación sistémica crónica en ratones 3xTgAd, los ratones se evaluarán para especies inmunorreactivas derivadas de APP intraneuronales 6E10 y C9.

Cultivos microgliales primarios de ratones 3xTgAD: se aislarán células microgliales primarias de crías de ratón 3xTgAD del día 1 postnatal (P1) y se cultivarán como se describió previamente (Saura et al., 2003). La cuantificación de la microglía activada se realizará contando el número de microglías primarias que se tiñeron de manera brillante positiva para CD45 en 10 campos por pozo en 3 pozos separados para cada condición de tratamiento. El número total de microglia se cuantificará contando todas las células teñidas positivas para CD45 (fuerte y débilmente); estos recuentos se compararán con el número total de núcleos contrateñidos con Hoechst 33258).

Inmunohistoquímica/inmunocitoquímica de fluorescencia: se realizará inmunohistoquímica en secciones de cerebro como se describió previamente (McCoy et al., 2006). Se incubarán criosecciones de 10 pm con el clon 6E10 de ratón anti-Ap humano (Chemicon Temecula, CA, 1:3000). La inmunorreactividad se visualizó usando un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor, anti-ratón 488 de cabra (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA, 1:1000). Las secciones se contrateñirán con el colorante nuclear Hoechst 33258 (bisbenzimida, 1:20,000). La inmunocitoquímica se realizará como se describió anteriormente (McCoy et al., 2006). Las células se incubarán con anti-NFKB p65 Re1a de conejo (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1:200) o anti-CD45 de rata para visualizar la microglía (Serotec, 1:500). La inmunorreactividad se visualizará usando anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (anti-conejo 594 de cabra o anti-rata 594 de cabra, 1:1000) seguido de contratinción nuclear como anteriormente.

Inmunohistoquímica/inmunocitoquímica de campo claro: las secciones de cerebro en los portaobjetos se teñirán usando un protocolo previamente publicado (Frank et al., 2003). El desenmascaramiento del epítopo requerido para la tinción con APP anti-Ap (6E10), específico de Ap40 o Ap42 y tinción con APP del terminal N consiste en una breve incubación en ácido fórmico al 88% (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Se incubarán criosecciones de 30 pm con el clon 6E10 anti-Ap humano de ratón (1:1000), anti-Ap40 humano de conejo (Chemicon, 1:100), anti-Ap40 de ratón (Mab 13.1.1, 1:500, (Das et al., 2003; Kim et al., 2007), anti-Ap42 humano de conejo (Invitrogen, 1:100), anti-Ap42 de ratón (Mab 2.1.3, 1:500, (Das et al., 2003; Kim et al., 2007), anti-APP de conejo (C9, 1:500, (Kimberly et al., 2005), anti-GFP de pollo (Chemicon, 1:500), anti-CD68 de ratón de rata (Serotec, 1:500), o anti-CD45 de ratón de rata (Serotec, 1:500), anti-APP de ratón (22C11, 1:100, Chemicon). A continuación, las secciones se incubarán con anticuerpos secundarios biotinilados (anti-ratón de caballo, anti-conejo de cabra, anti-pollo de cabra, o anti-cabra de conejo, Vector Laboratories, Burlingame, CA, 1:1000) seguido de incubación con neutravidina-HRP (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). La inmunorreactividad se visualizará mediante reacción con diaminobenzidina (DAB) con sulfato de níquel (para producir un producto de reacción azul púrpura) o sin sulfato de amonio y níquel (para producir un producto de reacción marrón).

Microscopía confocal de inmunofluorescencia: se sacrificarán ratones 3xTg-AD de 6 meses de edad mediante sobredosis de Euthasol y perfusión cardíaca con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0.01 M. Los cerebros se extraerán rápidamente, se fijarán posteriormente en paraformaldehído al 4% (pH-7.4) durante 48 horas y se cortarán en secciones coronales de 50 Pm de grosor utilizando un Vibratome. Para examinar el Ap intraneuronal, las secciones se marcarán doblemente con el anticuerpo monoclonal 6E10 (Covance, Emeryville, CA) y un anticuerpo policlonal dirigido contra el extremo terminal C de la proteína precursora amiloide (APP) (Invitrogen). Los anticuerpos primarios se aplicarán durante la noche a 4 °C y los siguientes enjuagues se detectarán con Alexa 555 anti-ratón (Invitrogen, 1:200, rojo) y Alexa 488 anti-conejo (Invitrogen, 1:200, verde). Después del enjuague, las secciones se montarán en portaobjetos y se cubrirán con un cubreobjetos con Fluoromount-G (Southern Biotech). La especificidad de todos los anticuerpos primarios se confirmará mediante transferencia Western y también mediante la omisión del anticuerpo primario, que no debe demostrar tinción. 6E10 reconoce los aminoácidos 1-16 dentro de la secuencia de Ap y, por lo tanto, también puede reconocer la APP de longitud completa o el p-CTF de APP. Por lo tanto, se utilizará microscopía confocal de doble etiqueta para identificar Ap interneuronal (solo rojo) frente a inmunorreactividad de APP o p-CTF de longitud completa (superposición de rojo y verde), o a-CTF (solo verde). Las secciones inmunofluorescentes se visualizarán utilizando un sistema de imágenes confocales Bio-Rad 2100 equipado con láseres de Argón, HeNe y Diodo Rojo (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Para evitar un sangrado inespecífico, cada línea láser se excitará y detectará de forma independiente mediante el modo de luz estroboscópica lambda. Todas las imágenes representan cortes Z confocales únicos o apilamientos Z. Se realizará un análisis de Kruskal-Wallis para evaluar la significancia entre las condiciones experimentales.

Análisis estereológico: se realizarán análisis estereológicos para estimar el número de células positivas para amiloide utilizando el módulo de fraccionamiento óptico del software Stereoinvestigator (MicroBrightField, Williston, VT). Los contornos se trazarán alrededor del hipocampo, la corteza y la amígdala con el aumento de un objetivo de 2X, de acuerdo con lo delineado por el atlas del cerebro del ratón (Paxinos, 2001). Las células positivas para Ap (inmunorreactivas para 6E10) se contarán con un objetivo de inmersión en aceite 60X utilizando marcos de conteo aleatorios y sistemáticos (tamaño: 50 pm * 50 pm) con un diseccionador óptico de 18 pm, zonas de protección superior e inferior de 2 pm en una cuadrícula de 430 pm * de 280 pm.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor negativo dominante de TNF-a que comprende una secuencia polipeptídica variante que es más del 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos del TNF-a humano de tipo silvestre y comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 cambios de aminoácidos con respecto al TNF-a de tipo silvestre, y en el que dichos cambios se seleccionan entre cambios en las posiciones 1, 21, 23, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 57, 65, 66, 67, 69, 75, 84, 86, 87, 91, 97, 101, 111, 112, 115, 140, 143, 144, 145, 146 y 147 de la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO. 3, en la que el inhibidor negativo dominante de TNF-a comprende sustituciones seleccionadas del grupo de sustituciones que consta de V1M, Q21C, Q21R, E23C, N30D, R310, R31I, R31D, R31E, R32D, R32E, R32S, A33E, N34E, N34V, A35S, D45C, L57F, L57W, L57Y, K65D, K65E, K65I, K65M, K65N, K65Q, K65T, K65S, K65V, K65W, G66K, G66Q, Q67D, Q67K, Q67R, Q67S, Q67W, Q67Y, C69V, L75E, L75K, L75Q, A84V, S86Q, S86R, Y87H, Y87R, V91E, I97R, I97T, C101 A, A111 R, A111E, K112D, K112E, Y115D, Y115E, Y115F, Y115H, Y1151, Y115K, Y115L, Y115M, Y115N, Y115Q, Y115R, Y115S, Y115T, Y115W, D140K, D140R, D143E, D143K, D143L, D143R, D143N, D143Q, D143S, F144N, A145D, A145E, A145F, A145H, A145K, A145M, A145N, A145Q, A145R, A145S, A145T, A145Y, E146K, E146L, E146M, E146N, E146R, E146S, y S147R de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO. 3, en el que el inhibidor negativo dominante de TNF-a inhibe el TNF-a soluble pero no inhibe la señalización por TNF-a transmembrana y se utiliza en el tratamiento de un paciente con un trastorno neurológico asociado con TNF-a elevado, en el que el inhibidor negativo dominante de TNF-a es para administración periférica en una cantidad terapéuticamente eficaz, y en el que dicha administración periférica proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor negativo dominante de TNF-a que contacta directamente con el SNC cruzando la barrera hematoencefálica, por lo que se trata a dicho paciente, en el que el trastorno neurológico se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), amiloidosis, accidente cerebrovascular, depresión y demencia, y en el que dicha amiloidosis se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal, y demencia por cuerpos de Lewy, en la que dicha variante comprende las sustituciones de aminoácidos V1M/R31C/C69 V/Y87H/C101 A/A145R.

2. El inhibidor negativo dominante de TNF-a para uso de la reivindicación 1, en el que dicho inhibidor negativo dominante de TNF-a está PEGilado.

3. El inhibidor negativo dominante de TNF-a para uso de la reivindicación 1, en el que dicho inhibidor negativo dominante de TNF-a es XPro1595.

4. El inhibidor negativo dominante de TNF-a para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que después de dicha administración, la activación de la célula microglial se reduce en comparación con la activación antes de la administración.

5. El inhibidor negativo dominante de TNF-a para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha secuencia polipeptídica variante es al menos un 95% idéntica al TNF-a de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3).