CN117529331A - 用于治疗骨病症的Klotho分泌型剪接变体 - Google Patents

Abstract

本发明提供由序列SEQ ID NO:1组成的多肽，或其由与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的序列组成的变体，用于预防和/或治疗骨病症。本发明还提供用于所述用途的编码所述多肽的核酸序列、包含所述核酸序列的基因构建体、或包含所述基因构建体的表达载体。本发明的多肽、核酸序列、基因构建体或表达载体可以与至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起以药物组合物的形式施用。

Description

用于治疗骨病症的Klotho分泌型剪接变体

本申请要求于2021年5月21日提交的欧洲专利申请EP21382465的权益。

技术领域

本发明涉及医学领域，特别是涉及预防和/或治疗骨病症的医学方法。本发明的化合物特别可用于治疗与年龄相关的骨病症。

背景技术

由于现代社会老年人口比例不断增加，衰老标志和逆转方法的研究是非常活跃的研究领域。衰老被理解为一种逐渐退化的过程，成年后由于诸如表观遗传变化、线粒体功能、细胞间通讯和代谢途径等关键细胞成分的失调而导致组织功能障碍。这些改变是由于氧化应激和炎症、饮食和其他环境因素造成的，这些因素会产生累积性损害并增加死亡的可能性。

组织退化是与衰老相关的主要特征之一。骨骼组织在此期间特别发生变化，其特征是骨矿物质密度(BMD)逐渐丧失，以及骨成分的形状和结构发生变化。特别是，年龄已被证明会触发骨几何重塑，由于皮质内骨吸收和骨膜骨并置而导致髓质空间和皮质周界扩张。这种骨皮质扩张已在骨质疏松症症研究的人类和动物模型的长骨中得到描述，并被解释为在骨丢失症、小梁连接改变和低蛋白质摄入情况下增加骨强度的补偿机制。所有这些与年龄相关的骨骼组织变化都会导致骨质量下降，包括骨强度和灵活性下降，从而导致骨折发生率增加。

用于治疗与年龄相关的骨退行性变的主要药物之一是雌激素。然而，关于雌激素是否具有任何有益的长期作用存在一些争议。此外，雌激素可能具有增加各种类型肿瘤患病率的风险，如乳腺癌和子宫内膜癌。降钙素、具有维生素K的骨钙素或具有或不具有维生素D的高剂量膳食钙也被建议用于预防绝经后妇女的骨丢失症。然而，高剂量的钙通常会产生不良的胃肠道副作用，因此必须持续监测血清和尿钙水平。目前治疗骨质疏松症症的其他方法包括双磷酸盐、甲状旁腺激素、钙溶解剂、拟钙剂、他汀类药物、合成代谢类固醇、镧盐和锶盐以及氟化钠。然而，此类疗法常常与不期望的副作用相关。

Klotho蛋白因其多效性抗衰老保护作用并参与驱动与年龄相关的慢性疾病(如肾病、组织功能障碍、神经退行性疾病和癌症等)的途径而被认为是治疗各种与年龄相关的病症的目标候选者。

Klotho基因主要在肾脏和大脑脉络丛中表达，并提供两个主要转录本。全长mRNA转录135KDa的称为m-KL的单次跨膜蛋白，其由两个胞外结构域(KL1和KL2，分别为72KDa和60KDa)组成。细胞外结构域可以通过蛋白酶介导的脱落从膜上释放，产生可溶性、循环加工的Klotho(p-KL，130KDa)，其有时简称为可溶性Klotho。替代的mRNA剪接显示出过早的终止密码子，并生成仅包含KL1结构域和C末端额外15个氨基酸的分泌蛋白(s-KL，70KDa)。必须指出的是，虽然现有技术中有时使用相似的缩写(s-KL)来命名可溶性Klotho(其是跨膜Klotho的加工版本)和分泌型Klotho(其是剪接变体)，但这两种变体存在不同的结构。在本申请中，缩写s-KL仅用于指分泌型Klotho。

先前在Klotho缺失小鼠(即缺乏整个Klotho基因座的小鼠)中进行的研究报告了Klotho在维持骨结构方面的积极作用(Maruyama,N.,等,"Bone micro-fragility causedby the mimetic aging processes in alpha-klotho deficient mice:in situnanoindentation assessment of dilatational bands",Biomaterials,2015.第47卷,第62-71页)以及正常和疾病条件下的组成保护，直接通过FGF23信号传导，和间接通过调节离子转运蛋白的功能和减少细胞损伤。相反，低KL水平会产生骨质疏松症表型，其特征在于血离子失调、骨转换率低和抗骨折力降低(Kawaguchi,H.,等,"Independent impairment ofosteoblast and osteoclast differentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia"J Clin Invest,1999,第104(3)卷,第229-37页；Suzuki,H.,等,"Histological and elemental analyses of impaired bone mineralization inklotho-deficient mice"J Anat,2008.第212(3)卷,第275-85页)。

然而，现有技术中使用的基因改造小鼠模型不允许区分不同Klotho亚型的相对效果，最重要的是，它们从动物出生时就改变了Klotho水平，这可能会引起补偿效应的出现，使得难以就基于Klotho的治疗对成年小鼠的可能效用得出结论。

此外，最近有报道称，外源性Klotho给药会导致成年小鼠的低骨矿化，这阻碍了其在治疗任何骨病症中的应用(Minamizaki T.等,"Soluble Klotho causeshypomineralization in Klotho-deficient mice"J Endocrinol.,2018,第237(3)卷,第285-300页)。

因此，尽管迄今为止做出了努力，但仍然需要有效且安全的骨病症、特别是与年龄相关的骨病症的治疗。

发明内容

本发明人基于Klotho的特定剪接变体的施用开发了用于预防和/或治疗骨病症的新疗法。

如以下实施例所示，本发明人发现，在衰老加速倾向小鼠模型中施用Klotho分泌型剪接变体(s-KL)使得骨参数恢复至健康小鼠的值(参见表1)。

鉴于现有技术，本文报道的s-KL的作用是非常出乎意料的，因为之前已表明加工过的Klotho(p-KL，有时也称为可溶性Klotho或s-KL)的外源添加会导致动物的骨毒性(Minamizaki T.等，同上)。然而，本发明人惊奇地发现，与p-KL相比，分泌型Klotho(s-KL-70KDa，不要与可溶性Klotho-130KDa混淆)不会引起骨毒性(参见图1、2和3)。甚至更重要的是，s-KL改善了幼年动物和加速衰老小鼠的多个骨参数，其中某些甚至超过了对照小鼠中观察到的值(参见图3和表1)。

因此，本文提供的结果揭示了s-KL不显示主要Klotho变体在骨中的毒副作用，并且其甚至可用于治疗骨病症。

因此，在第一方面中，本发明提供了由序列SEQ ID NO:1组成的多肽，或其由与SEQID NO:1具有至少85％同一性的序列组成的变体，用于预防和/或治疗骨病症。

在第二方面中，本发明提供了编码如第一方面所限定的多肽或其变体的核酸序列，其用于预防和/或治疗骨病症。

在第三方面中，本发明提供了包含如第二方面所限定的核酸序列的基因构建体，其可操作地连接至表达启动子，其用于预防和/或治疗骨病症。

在第四方面中，本发明提供了包含如第三方面所限定的基因构建体的表达载体，其用于预防和/或治疗骨病症。

在第五方面中，本发明提供了用第二方面中限定的核酸序列、第三方面中限定的基因构建体或第四方面中限定的表达载体转化或转染的宿主细胞，其用于预防和/或治疗骨病症。

附图说明

图1显示了用空AAV、表达s-KL或p-KL的AAV处理的幼龄动物血清中磷酸盐(A)和钙(B)离子的生化分析。

图2显示了用空AAV、表达s-KL或p-KL的AAV处理的幼龄动物的骨组织中fgf23基因的表达。

图3显示用空AAV、表达s-KL或p-KL的AAV处理的幼年动物的骨皮质和小梁骨变量的MicroCT结果。“BV”是指骨量；“B.ar”指骨面积；“B.Pm”是指骨周长；“MMI极性”是指平均极惯性矩；“Tb.N”是指小梁数；“Tb.Th”是指小梁厚度，“Tb.sp”是指小梁间隙。

图4显示了用空AAV、表达s-KL或p-KL的AAV处理的幼年雄性(A和C)和雌性(B和D)中参与维生素D活化和降解的基因的表达(A和B)以及肾脏中离子通道基因的表达(C和D)。数据表示为相对于“空”处理动物的表达倍数变化。

图5显示了在用空AAV、表达s-KL或p-KL的AAV处理的幼年雄性(A)和雌性(B)中，不同KL亚型对代表不同骨细胞谱系的基因表达的影响。数据表示为相对于“空”处理动物的表达倍数变化。

图6显示了用空AAV、表达s-KL或p-KL的AAV处理的幼龄动物的骨皮质的microCT矿物质密度分析。y轴代表BMD(骨矿物质密度)。(A)雄性，(B)雌性。

图7显示了在用空AAV、表达s-KL或p-KL的AAV处理的幼龄动物中使用3点弯曲试验进行的骨折试验。(A)雄性，(B)雌性。

图8显示了经处理动物的肝脏(Lv)、海马(Hc)和皮质(Cx)组织中的KL亚型(m-KL和s-KL)mRNA表达水平。y轴代表相对于未处理动物的mRNA表达水平的倍数变化。

具体实施方式

除非另有说明，本申请中使用的所有术语应以其本领域已知的普通含义来理解。本申请中使用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，并且旨在统一地适用于整个说明书和权利要求书，除非另外明确阐述的定义提供了更广泛的定义。

如本文所用，不定冠词“一个”和“一种”与“至少一个”或“一个或多个”同义。除非另有说明，本文使用的定冠词，例如“该”，也包括名词的复数。

如上所讨论的，在第一方面中，本发明提供了由序列SEQ ID NO:1组成的多肽，或由与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的序列组成的其变体，用于预防和/或治疗骨病症。

该方面还可以表述为如上所限定的多肽在制备用于预防和/或治疗骨病症的药物中的应用。本发明还涉及治疗和/或预防骨病症的方法，其包括向有需要的受试者(包括人)施用治疗有效量的如上限定的多肽以及药学上可接受的赋形剂或载体。

在本发明第一方面的一个更具体的实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述多肽由序列SEQ ID NO:1或其变体组成，所述变体由与SEQ ID NO:1具有至少85％、86％、87％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％同一性的序列组成。在更具体的实施方式中，所述多肽由序列SEQ IDNO:1或其变体组成，所述变体由与SEQ ID NO:1具有至少88％或98％同一性的序列组成。

在本发明第一方面的另一实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述多肽由序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2组成。

蛋白质变体是本领域技术人员充分理解的并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常属于三类中的一类或多类：取代、插入或缺失变体。

在本发明中，术语“同一性”是指当序列最佳比对时，两个序列中相同残基的百分比。如果在最佳比对中，第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据，则序列表现出关于该位置的同一性。同一性百分比决定了给定比对中指定长度上相同残基的数量。因此，两个序列之间的同一性水平或(“百分比序列同一性”)被测量为序列共享的相同位置的数量相对于所比较的位置的数量的比率(即，百分比序列同一性＝(同一性位置的数量/比较位置总数量)x 100)。缺口，即比对中残基存在于一个序列中但不存在于另一序列中的位置，被视为具有不相同残基的位置，并被计为比较位置。

作为说明，具有与参考氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少例如95％同一性的氨基酸序列的多肽意指所述多肽的氨基酸序列与参考序列相同，除了该多肽序列可以包括SEQID NO:1的参考氨基酸的每100个氨基酸中最多5个氨基酸改变。换句话说，为了获得与参考氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，可以将参考序列中最多5％的氨基酸残基删除或用另一种氨基酸取代，或者可以将参考序列中最多至总氨基酸残基的5％的氨基酸插入到参考序列中。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何位置，其单独散布在参考序列中的残基之间或者散布在参考序列内的一个或多个连续组中。

用于快速获得最佳比对和计算两个以上序列之间的同一性的许多数学算法是已知的并且被并入许多可用的软件程序中。出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性优选使用基于全局比对的算法来确定，如Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，优选在EMBOSS包的Needle程序中实现(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)；或使用默认设置的BLAST全局对齐工具(Altschul等,“Basic local alignment search tool”,1990,J.Mol.Biol,第215卷,第403-410页)。当所比较的序列长度基本相同时，也可以使用局部比对。

与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一个具有至少88％同一性百分比的多肽包括除了小鼠和人之外的哺乳动物的s-KL。

SEQ ID NO:1是α-klotho人基因可变剪接的转录本的氨基酸序列，其包含：大约重量为70kDa的KL1结构域序列，以及由m-KL转录本中未发现的15个氨基酸尾部组成的特异性分泌信号。α-klotho人类基因是位于Genome Reference Consortium维护的人类基因组组件GRCh38(24.12.2013)的第13号染色体NC_000013.11(33016063..33066145)中的基因。SEQ ID NO:1源自SEQ ID NO:3的相应cDNA，源自具有5012个碱基对的GenBank数据库登录号NM_004795，2014年5月3日的版本3的mRNA序列的可变剪接转录本。

SEQ ID NO:2是α-klotho小鼠基因可变剪接的转录本的氨基酸序列，其包含：大约重量为70kDa的KL1结构域序列，以及由m-KL转录本中未发现的15个氨基酸尾部组成的特异性分泌信号。α-klotho小鼠基因位于UCSC Genome Browser on Mouse2007年7月(NCBI37/mm9)小鼠基因组组件的第5号染色体(150,952,607-150,993,809)中的基因。SEQ ID NO:2源自SEQ ID NO:4的相应cDNA，进而源自具有5124个碱基对的GenBank数据库登录号NM_013823，2015年2月15日的版本2的mRNA序列的可变剪接转录本。

在本发明第一方面的另一实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述多肽变体由序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6组成。

在本发明第一方面的另一实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述多肽的长度等于或小于645个氨基酸、600个氨基酸或550个氨基酸。在更具体的实施方式中，所述多肽由序列SEQ ID NO:1或其变体组成，所述变体由与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的序列组成，并且长度等于或小于645个氨基酸、600个氨基酸或550个氨基酸。在具体实施方式中，所述多肽由序列SEQ ID NO:1或其变体组成，所述变体由与SEQ IDNO:1具有至少85％同一性的序列组成，并且所述变体的长度选自545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、584、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、和600个氨基酸，或545至600个氨基酸。

在本发明第一方面的一个实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述多肽是哺乳动物klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)。在更具体的实施方式中，所述多肽是人类s-KL。哺乳动物Klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)已在现有技术中公开(参见例如WO2017085317A1)。因此，本发明可特别配制为哺乳动物Klotho蛋白的分泌型剪接变体(s-KL)、特别是人s-KL，或编码其的核酸序列，用于预防和/或治疗骨病症。

术语“哺乳动物Klotho的分泌型剪接变体”缩写为“s-KL”，是指由选择性剪接的转录本产生的蛋白质，其产生由KL1结构域形成的蛋白质的截短形式(s-KL)，大约重量为70kDa，以及由m-KL转录本中未发现的15个氨基酸尾部组成的特异性分泌信号，因此也称为klotho、s-KL或klotho蛋白的分泌剪接变体。s-KL不同于其他形式的可溶性klotho，即p-KL、p-KL1和p-KL2。在本说明书中，m-KL代表全长跨膜形式；p-KL代表可溶性蛋白水解klotho，其由m-KL裂解产生；p-KL1和p-KL2分别代表由p-KL的KL1结构域和KL2结构域组成的可溶性klotho形式。m-KL来自编码单次跨膜蛋白的全长转录本，分子量约为130kDa(m-KL)。所述蛋白包含三个结构域：C端的短跨膜结构域、由两个约550个氨基酸的内部重复序列(分别称为KL1和KL2)组成的胞外结构域，以及由10个氨基酸组成的非常短的胞内结构域。跨膜形式的胞外结构域可以被金属蛋白酶ADAM10和ADAM17切割，产生另一种形式的约130kDa的可溶性Klotho(缩写为p-KL，表示蛋白水解的膜亚型)。此外，蛋白酶ADAM10和17的第二个识别位点位于KL1和KL2结构域之间，产生两种新的70kDa亚型，一种仅包含KL1结构域(与选择性剪接生成的亚型类似，但没有特定的氨基酸尾部)，另一个包含KL2结构域。然而，尚未在体内证明p-KL被蛋白水解为p-KL1和p-KL2。

如本文所用，“骨病症”是指特征在于骨量减少和/或骨结构改变，导致骨强度和弹性降低以及骨折可能性更高的疾病或病症。骨强度和弹性可以通过微型计算机断层扫描(micro-CT)或根据标准程序进行弯曲测试来测量。

在本发明第一方面的一个实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述骨病症是骨退行性变或骨丢失症。

如本文所用，“骨退行性变”是指骨骼质量的结构完整性改变的任何病症。如本文所用，术语“骨丢失症”是指骨骼质量减少的情况，例如骨密度的降低。

在本发明第一方面的一个实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述骨病症是年龄相关的骨退行性变或骨丢失症。

在本发明第一方面的另一实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述骨病症是骨质减少症和/或骨质疏松症。

在本发明第一方面的另一实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述骨病症由以下引起：软骨发育不全、锁骨颅骨发育不全、内生软骨瘤病、纤维性发育不全、戈谢病、低血磷性佝偻病、马凡氏综合征、多发性遗传性外生性骨疣、神经纤维瘤病、成骨不全、脆弱性骨硬化、硬化病变、假关节、化脓性骨髓炎、牙周病、抗癫痫药物引起的骨丢失症、原发性和继发性甲状旁腺功能亢进症、家族性甲状旁腺功能亢进综合征、失重引起的骨丢失症、男性骨质疏松症症、绝经后骨丢失症、骨关节炎、肾性骨营养不良、骨浸润性疾病、口腔骨丢失症、颌骨坏死、青少年佩吉特氏病、局限性吝状过骨症、代谢性骨病、肥大细胞增多症、镰状细胞性贫血/疾病、器官移植相关骨丢失症、肾移植相关骨丢失症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、癫痫、幼年关节炎、地中海贫血、粘多糖病、法布里病、特纳综合征、唐氏综合征、克氏综合征、麻风病、佩特兹病、青少年特发性脊柱侧凸、婴儿发病的多系统炎症性疾病、温彻斯特综合征、门克斯病、肝豆状核变性、缺血性骨病(如累-卡-佩三氏病、局限性游走性骨质疏松症)、贫血状态、类固醇引起的病症、糖皮质激素引起的骨丢失症、肝素引起的骨丢失症、骨髓疾病、坏血病、营养不良、缺钙、特发性骨质减少症或骨质疏松症症、先天性骨质减少症或骨质疏松症症、酗酒、慢性肝病、绝经后状态、慢性炎症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、炎症性结肠炎、克罗恩病、月经稀发、闭经、妊娠、糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状腺疾病、副甲状腺紊乱、库欣氏病、肢端肥大症、性腺功能减退症、固定或废用、反射性交感神经营养不良综合征、局部骨质疏松症症、骨软化症、与关节置换相关的骨丢失症、HIV相关的骨丢失症、与生长激素丢失相关的骨丢失症、与囊性纤维化相关的骨丢失症、纤维性发育不全、化疗相关的骨丢失症、肿瘤引起的骨丢失症、癌症相关的骨丢失症、激素消融性骨丢失症、多发性骨髓瘤、药物引起的骨丢失症、神经性厌食症、疾病相关的面部骨丢失症、疾病相关的头盖骨骨丢失症、疾病相关的颌骨骨丢失症、疾病相关的颅骨骨丢失症、或与太空旅行相关的骨丢失症。

在第一方面的一个具体实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，所述多肽用于预防、治疗和/或减少骨丢失症；预防、治疗和/或减少骨折；预防、治疗和/或减少骨脆性；增加骨量；增加骨骼结构的完整性；增加小梁厚度；增加骨矿物质密度；或其组合。

在本发明第一方面的一个具体实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，所述多肽与异源部分连接。

如本文所用，“异源部分”是指通过共价键或非共价键与多肽偶联的任何分子。在具体实施方式中，异源部分位于多肽的N-末端或C-末端。在具体实施方式中，异源部分位于多肽的N-末端和C-末端。

异源部分可以是例如促进多肽纯化的分子。在具体实施方式中，所述异源部分是肽。在更具体的实施方式中，异源部分是多组氨酸轨道。如本领域技术人员将理解的，有助于蛋白质纯化的小肽可以保留在最终化合物中而不影响其功能。

异源部分还可以是任何促进多肽吸收、转运和递送的媒介化剂。

由KL蛋白(如特别是s-KL)产生的这些多肽可以以蛋白的形式直接使用，或者它们(例如s-KL)可以通过基因治疗在目标组织的靶细胞内表达。为了这一目标，本发明在第二方面还提供了编码如第一方面所限定的多肽或其变体的核酸序列，其用于预防和/或治疗骨病症。

术语“编码多肽的核酸序列”尤其应理解为由编码所述多肽的mRNA的逆转录(RT-PCR)产生的cDNA序列。

该方面还可以表述为如上所限定的核酸序列在制备用于预防和/或治疗骨病症的药物中的应用。本发明还涉及治疗和/或预防骨病症的方法，其包括向有需要的受试者(包括人类)施用治疗有效量的如上所限定的核酸序列以及药学上可接受的赋形剂或载体。

在本发明第二方面的一个具体实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，所述核酸序列包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。在更具体的实施方式中，所述核酸序列由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4组成。

在本发明第二方面的一个更具体的实施方式中，可选地与下文提供的实施方式中的任一个组合，所述核酸序列由序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或其变体组成，所述变体由与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4具有至少85％、86％、87％、88％、88.5％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％同一性的序列组成。

在第三方面中，本发明提供了包含如第二方面所限定的核酸序列的基因构建体，其可操作地连接至表达启动子，其用于预防和/或治疗骨病症。

该方面还可以表述为如上所限定的基因构建体在制备用于预防和/或治疗骨病症的药物中的应用。本发明还涉及治疗和/或预防骨病症的方法，其包括向有需要的受试者(包括人类)施用治疗有效量的如上所限定的基因构建体以及药学上可接受的赋形剂或载体。

在第三方面的具体实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，可操作地连接的表达启动子选自由组成型表达启动子、诱导型启动子和神经元特异性表达启动子组成的组。在更具体的实施方式中，根据本发明的基因构建体包含巨细胞病毒中间早期(CMV IE)启动子、编码s-KL的序列(小鼠或人s-KL的cDNA)和聚腺苷酸化链(poly A)。在另一具体的实施方式中，根据本发明的基因构建体包含CAG启动子、编码s-KL的序列(小鼠或人s-KL的cDNA)和聚腺苷酸化链(poly A)。

在本发明第三方面的一个具体实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，所述基因构建体由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8组成。

所有这些基因构建体一旦进入细胞就能够表达目标蛋白质。

为了促进构建体的施用，本发明在第四方面还提供了表达载体，其包含如第三方面所限定的基因构建体并因此包含第二方面的编码第一方面的多肽的核酸序列，其可操作地连接至表达启动子，特别是组成型表达启动子，用于预防和/或治疗骨病症。

该方面还可以表述为如上所限定的表达载体在制备用于预防和/或治疗骨病症的药物中的应用。本发明还涉及治疗和/或预防骨病症的方法，其包括向有需要的受试者(包括人类)施用治疗有效量的如上所限定的表达载体以及药学上可接受的赋形剂或载体。

在本发明第四方面的一个具体实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，所述表达载体是病毒载体。

在本发明第四方面的一个具体实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，所述表达载体是腺相关病毒。在具体实施方式中，其是选自下组的血清型的腺相关病毒：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、PHPeB和9P31。在更具体的实施方式中，其是血清型AAV9的腺相关病毒。

在第一、第二、第三和第四方面的另一个实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，根据第一方面使用的多肽、根据第二方面使用的核酸序列、根据第三方面使用的基因构建体或根据第四方面使用的表达载体与至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起以药物组合物的形式施用。

表述“药物组合物”涵盖旨在用于人类以及用于非人类动物的组合物。本领域技术人员理解药物组合物必须包含治疗有效量的化合物。本文所用的表述“治疗有效量”是指当施用时足以预防所治疗的疾病的一种或多种症状的发展，或在某种程度上减轻所处理的疾病的一种或多种症状的多肽、核酸序列、基因构建体或表达载体的量。当然，根据本发明施用的化合物的具体剂量将由病例周围的具体情况确定，包括所施用的化合物、施用途径、所治疗的具体病症以及类似的考虑因素。

表述“药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体。每种组分在与药物组合物的其他成分相容的意义上必须是药学上可接受的。它还必须适合与人类和非人类动物的组织或器官接触，而不会产生过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，并具有合理的效益/风险比。

合适的药学上可接受的赋形剂的实例是溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，诸如通过产生任何不期望的生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，否则其用途被认为在本发明的范围内。

本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、大小和/或病症并且进一步取决于组合物的施用途径而变化。

用于制造药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂、和/或油。根据配制者的判断，组合物中可以存在赋形剂，如着色剂、包衣剂、甜味剂和调味剂。

含有本发明的蛋白质或核酸的药物组合物可以以任何剂型存在，例如固体或液体，并且可以通过任何合适的途径施用，例如，口服、肠胃外、直肠、局部、鼻内、眼内、腹腔内或舌下途径，其中它们将包括配制所需剂型所必需的药学上可接受的赋形剂，例如局部制剂(软膏剂、乳膏剂、脂质体凝胶、水凝胶等)、滴眼剂、气雾喷雾剂、可注射水凝胶、可注射溶液、渗透泵等。

示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉及其组合。

示例性的造粒剂和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮(交联聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(Veegum)、十二烷基硫酸钠、季铵化合物及其组合。

示例性的粘合剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然和合成树胶(例如阿拉伯树胶、海藻酸钠、角叉菜提取物、潘瓦胶、印度树胶、isapol外皮的粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝(Veegum)和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；海藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；乙醇及其组合。

示例性防腐剂可以包括抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和其他防腐剂。示例性的抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸油酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、单巯基甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和依地酸三钠。

示例性的缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、果糖酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、羟化钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏液、乙醇及其组合。

示例性的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石粉、麦芽、山萮酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、十二烷基硫酸镁、十二烷基硫酸钠及其组合。

在第一、第二、第三和第四方面的另一实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，所述药物组合物用于通过粘膜(例如，鼻、舌下、阴道、颊或直肠)、肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌肉内或动脉内注射，推注或输注)、口服、透皮或通过例如通过气溶胶的方式吸入。适合肠胃外施用(例如通过关节内、静脉内、肌内、皮内、腹腔内和皮下途径)的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，并且可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。注射液和悬浮液也可以由无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。在某些实施方式中，所述组合物通过注射施用，例如皮下、腹腔内、膀胱内、静脉内、脑室内，通过输注施用，例如使用储库或渗透微型泵或肌内施用。所述制剂可以单位剂量或多剂量密封容器提供，例如安瓿和小瓶。在更具体的实施方式中，所述药物组合物用于心室内施用或用于静脉内施用；甚至更具体是全身静脉内施用。

在第一、第二、第三和第四方面的另一个实施方式中，可选地与上文和下文提供的实施方式中的任一个组合，根据第一方面使用的多肽、根据第二方面使用的核酸序列、根据第三方面使用的基因构建体或根据第四方面使用的表达载体与另一种活性剂联合施用。与本发明的化合物联合施用的合适的活性剂是但不限于阿巴洛肽、阿屈膦酸盐、阿屈膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸、降钙素、狄诺塞麦、巴多昔芬、罗莫单抗、阿巴洛肽、雌激素、阿法骨化醇、雷奈酸锶、依托特明α、地波特明α、伊普黄酮、水合氯化铝、罗莫单抗、布洛舒单抗、钙、替鲁膦酸、依替膦酸、胆骨化醇、特立帕肽、阿巴洛肽、维生素D、雷洛昔芬及其混合物。

第一方面的实施方式也适用于本发明的第二、第三和第四方面。

因此，本发明人认识到，接受序列SEQ ID NO:1的多肽或其由与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的序列组成的变体的动物的肌肉骨骼系统相对于那些未接受多肽的动物得到增强。因此，还建议将多肽用于预防和/或治疗肌肉骨骼病症。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变体并不旨在排除其他技术特征、添加物、组分或步骤。此外，词语“包括”涵盖“由......组成”的情况。本领域技术人员在阅读说明书后将清楚本发明的附加目的、优点和特征，或者可以通过本发明的实践来了解本发明的附加目的、优点和特征。以下实施例和附图以说明的方式提供，并且它们不旨在限制本发明。与附图相关并置于权利要求中括号中的附图标记仅用于试图增加权利要求的可理解性，并且不应被解释为限制权利要求的范围。此外，本发明涵盖本文描述的特定和优选实施方式的所有可能的组合。

实施例

材料和方法

动物饲养

SAMR1(n＝9)和SAMP8(n＝29)雄性小鼠(7月龄)用于进行行为和分子分析。将动物随机分为三组：SAMR1对照(SR1“空”)(n＝9)、SAMP8对照(SP8“空”)(n＝9)均注射 AAV9“空”，SAMP8注射AAV9 s-KL(SP8 s-KL)(n＝11)并且SAMP8注射AAV9m-KL(SP8 m-KL)(n＝9)。对于幼鼠实验，32只C57BL/6J野生型小鼠(16只雄性和16只雌性)被随机分为三组：C57BL对照(n＝12)、C57BL s-KL(n＝10)和C57BL p-KL(n＝10)。

动物可以自由获取食物和水，并保持在标准温度条件(22±2℃)和12小时光/暗循环(300lux/0lux)下。AAV载体通过脑室内注射施用于7月龄的小鼠。通过腹腔内注射稀释于0.9％NaCl中的10mg/kg氯胺酮(Imalgene 500，Rhone-Merieux)和1mg/kg赛拉嗪(Rompun，Bayer)对动物进行深度麻醉。立体定位注射在距前囟的-0.2mm前后轴、-2mm背腹侧和+1mm中外侧坐标处进行。载体剂量为6μL中每只动物1x10¹¹个病毒基因组，使用超微型泵(WorldPrecision Instruments)以0.5μL/min的速度施用。在幼鼠实验中，施用额外AAV剂量。幼年动物尾静脉内注射4x10¹¹个病毒基因组载体，最终体积为200μL。

腺相关病毒(AAV)血清型9是通过Autònoma de Barcelona大学Unitat deProduccióde Vectors(UPV)的三重转染方法在HEK293细胞中产生的，遵循先前描述的方案(Piedra,J.等,"Development of a rapid,robust,and universal picogreen-basedmethod to titer adeno-associated vectors",Human Gene Therapy Methods,第26(1)卷,第35–42页)。简而言之，使用高盐溶液沉淀病毒载体，并用全能核酸酶(Benzonase)(Novagen)处理，然后用超速离心分离的碘克沙醇密度梯度(Axis-Shield PoC AS)进行纯化。使用Picogreen方法(Invitrogen)对载体浓度进行定量。

使用的载体是标准载体，其包含在CAG启动子(SEQ ID NO:7)控制下(对于老年小鼠)的用于表达鼠s-KL蛋白(SEQ ID NO:2)的鼠s-KL表达盒，在CMV启动子(SEQ ID NO:8)控制下(对于幼年小鼠)的用于表达鼠s-KL蛋白(SEQ ID NO:2)的鼠s-KL表达盒；出于比较目的，CMV启动子(SEQ ID NO:9)控制下的用于表达鼠m-KL(SEQ ID NO:11)的鼠m-KL表达盒，和不表达任何蛋白质的CMV启动子(SEQ ID NO:10)控制下的空表达盒。

RNA提取和基因表达分析

按照制造商的说明(Bioline试剂)使用TRIsure^TM试剂进行总RNA分离。使用TissueLyser LT样品破碎装置(QIAGEN)对样品进行均质化。RNA数量和纯度使用NanoDrop^TM1000分光光度计(Thermo Scientific)测量。RNA逆转录使用iScript^TMAdvancedcDNA合成试剂盒(Bio-rad)完成。在Autonòma de Barcelona大学分析和照片记录服务中心的Bio-Rad CFX-384PCR机上通过实时定量PCR(RT-qPCR)分析基因表达。每个反应包含25ngcDNA、7.5μL iTaqTM Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad)和0.2nM的引物浓度，反应终体积为15μL。使用的引物如下：

qPCR数据的分析按照ΔΔCt方法进行。通过减去每个实验Ct来标准化周期阈值(Ct)，其管家(HK)Ct的差异尊重HK的平均值。使用的HK基因是β-肌动蛋白和GAPDH。还分析了熔解曲线以确保独特的扩增子生成。每个样品(每组n＝6)至少进行重复测试，高于37个循环的Ct被认为未扩增。

生化研究

使用微量管(Sarstedt，德国)通过尾部剪断程序进行血液提取。将管在10000g下离心5分钟，分离血清并保存在-80℃下。使用奥林巴斯AU480分析仪(德国)测量血清中的离子浓度，并采用偶氮胂III法测定钙和磷钼酸盐(340nm)测定磷酸盐。

骨研究

分离灌注动物的右腿并置于PFA 4％溶液中保存。解剖胫骨，除去肌肉组织，并置于含有0.05％叠氮化钠(NaN₃)的PBS溶液中。MicroCT分析是通过Politècnica deCatalunya大学(UPC)de Recerca en Ciència i Enginyeria Multiescala de Barcelona中心(CRCEMB)的SkyScan 1272(Bruker)计算机显微断层扫描成像系统完成的。

使用NRecon v1.6(Bruker)程序重建图像，并使用CT-Analyser v1.13图像程序(Bruker)进行分析。通过手动选择目标体积(VOI)，使用100个切片进行骨皮质分析，二元阈值为50-255。分析的图像间隔从腓骨插入到胫骨上骨骺开始。对于骨小梁分析，使用20-255的二元阈值分析了150个切片。所有选定的图像间隔距股骨远端生长板到胫骨骨干开始100VOI。最后，使用CTVox v3.3程序(Bruker)获得骨骼的3D表示。

使用CT-Analyzer v1.13程序计算矿物质密度，用两个已知密度为0.25和0.75g/cm³的2mm直径羟基磷灰石模型(Bruker-MicroCT)校准骨吸光度。

骨折测试

将整个分离的骨头放置在连接到材料测试机的固定装置中并加载直至断裂。三点弯曲试验开始时，骨骼处于未变形状态(零位移)，加载点以较小的预载荷(<1N)与骨骼接触，以将骨骼保持在适当的位置。然后，随着施加的载荷(或力，F)和位移(d)的增加，加载点逐渐向下移动(1μm/s)，直至完全失效。测试过程中记录载荷和位移值并存储在数据文件中。

统计分析

使用GraphPad Prism ver.6(GraphPad软件)进行统计分析和图形表示。比较两组时，使用双尾未配对学生t检验和单向方差分析(ANOVA)分析组间的统计差异，必要时使用Tukey作为事后分析。数据表示为平均值的平均±标准误差(SEM)。当p值≤0.05并且通过Grubb检验检测到异常值并从分析中删除时，统计差异被接受。

结果

KL亚型对幼年WT动物矿物质代谢的影响

在表达p-KL的AAV处理幼鼠后1个月，与骨矿物质稳态相关的离子的血清水平发生变化(图1)。与“空”和s-KL处理的动物相比，用p-KL处理的C57BL/6J小鼠中检测到两种离子(磷酸盐和钙)显著减少。

FGF23是在骨组织骨细胞中表达的激素，它通过降低磷酸盐水平和促进维生素D降解来参与离子调节。根据生化结果，幼年动物中p-KL亚型的表达使骨骼中fgf23基因表达增加了4倍(图2)。相比之下，s-KL亚型没有改变fgf23表达，其mRNA水平与”空”组相当。

治疗两个月后对胫骨结构的MicroCT分析显示，p-KL治疗后一些皮质和小梁参数发生了强烈变化，但s-KL或”空”治疗的动物则没有变化(图3)。p-KL处理后观察到骨皮质体积和面积减少10％。仅使用p-KL亚型，骨皮质厚度(Cs.Th)也显著降低。p-KL治疗后，由于小梁数量显著减少(小梁损失44％)，小梁骨的骨量减少了47％。令人惊讶的是，用s-KL载体处理的动物的骨骼表现出骨皮质和小梁骨体积增加的趋势，与空白动物相比，小梁厚度显著增加。

如图4所示，p-KL的长期表达显著使雄性中的维生素D代谢失调，并且使肾脏中的重要离子通道显著失调，而s-KL不会诱导任何这些有害作用。

如图5所示，无论在雄性还是雌性中，p-KL的长期表达都使FGF23和骨特异性基因的表达显著失调，但s-KL没有表现出这种负面影响。

图6显示，p-KL的长期表达显著降低了骨矿物质密度，特别是在雌性中，而相反，s-KL表达没有降低，反而显著增加了雄性的骨矿物质密度。

如图7所示，p-KL的长期表达显著增加了骨脆性并降低了骨折抵抗力(雄性和雌性均如此)，而s-KL没有显示出任何这些有害影响。

AAV施用在SAMP8动物中有效表达KL

为了有效转导神经元和肝细胞类型，选择AAV血清型9(AAV9)作为基因治疗载体。生成了三种不同的AAV9载体，其含有用于产生分泌型(SEQ ID NO:7)和跨膜型(SEQ ID NO:9)Klotho亚型的表达载体以及空对照载体(SEQ ID NO:10)。如前所述，7月龄小鼠脑室内给药，治疗期为10周，在动物10月龄时完成实验(MassóA.等,"SecretedαKlotho isoformprotects against age-dependent memory deficits"Mol Psychiatry,2018,第23(9)卷,第1937-1947页)。通过对不同组织的RNA分析来评估AAV9介导的m-KL和s-KL表达的有效性。如图8所示，在所分析的不同区域注射AAV后，AAV9 s-KL和m-KL均介导强的αKlotho表达。载体表达与海马中KL蛋白的增加相关，海马中的KL蛋白由于其在学习和记忆形成中的重要性而受到特别关注。

KL处理逆转老化SAMP8胫骨中观察到的结构变化

KL处理对胫骨长骨微观结构的影响如表1所示：

表1

数据表示为平均值±SD。^a SAMR1和SAMP8“空”之间的统计学差异p<0.05。^bSAMP8“空”和处理过的SAMP8之间的统计学差异p<0.05。

SAMP8“空”小鼠的中胫骨骨皮质呈现直径扩张(表1)。与SAMR1皮质区域相比，这相当于SAMP8的周长扩大了5％，皮质区域扩大了16％。SAMP8髓质空间的周长和内皮质面积也分别增加了6％和17％。值得注意的是，Klotho处理显著阻止了皮质扩张，其参数与SAMR1动物相当(表1)。有趣的是，与m-KL相比，s-KL处理检测到骨膜和内皮质周长有更大的减少。此外，确定骨强度和弹性的其他重要参数，如骨长度、皮质厚度或骨矿物质密度，在SAMP8和SAMR1小鼠之间或处理后没有改变。与SAMR1相比，SAMP8模型中的小梁骨体积百分比(BV/TV)减少，这与应变相关的骨丢失症相一致，这一特征不受KL处理的影响(表1)。

分泌型KL处理的效果仅在SAMP8小鼠中可检测到，因为与对照SR1动物相比，用s-KL处理的SAMR1动物在分析的皮质或小梁参数中没有显示出变化。通过3点弯曲断裂试验评估检测到的结构改变与骨强度的相关性。观察到KL处理在压力下骨可塑性增加的趋势。

引用列表

Minamizaki T.等,"Soluble Klotho causes hypomineralization in Klotho-deficient mice"J Endocrinol.,2018,第237(3)卷,第285-300页。

Maruyama,N.等,"Bone micro-fragility caused by the mimetic agingprocesses in alpha-klotho deficient mice:in situ nanoindentation assessmentof dilatational bands",Biomaterials,2015.第47卷,第62-71页。

Kawaguchi,H.,等,"Independent impairment of osteoblast and osteoclastdifferentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia"J ClinInvest,1999,第104(3)卷,第229-37页。

Suzuki,H.,等,"Histological and elemental analyses of impaired bonemineralization in klotho-deficient mice"J Anat,2008.第212(3)卷,第275-85页。

Matsumura等,“Identification of the human klotho gene and its twotranscripts encoding membrane and secreted Klotho protein”,Biochem BiophysRes Commun-1998,第242卷,第626-630卷。

Altschul等,“Basic local alignment search tool”,1990,J.Mol.Biol,第215卷,第403-410页。

MassóA.等,"SecretedαKlotho isoform protects against age-dependentmemory deficits"Mol Psychiatry,2018,第23(9)卷,第1937-1947页。

Piedra,J.等,"Development of a rapid,robust,and universal picogreen-based method to titer adeno-associated vectors",Human Gene Therapy Methods,第26(1)卷,第35–42页。

序列表

<110> 巴塞罗那自治大学；巴塞罗纳大学；瓦尔德西布伦大学医院基金会研究所；加泰罗尼亚调研高等研究学院

<120> 用于治疗骨病症的Klotho分泌型剪接变体

<130> P5814PC00

<150> EP21382465

<151> 2021-05-21

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 549

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro Pro Ser

1 5 10 15

Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg

20 25 30

Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Val Ser Arg Pro

35 40 45

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly

50 55 60

Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp

65 70 75 80

Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His

85 90 95

Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly

100 105 110

Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser

115 120 125

Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu Gly Val

130 135 140

Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly

145 150 155 160

Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu

165 170 175

Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr

180 185 190

His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala

195 200 205

Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe

210 215 220

Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro

225 230 235 240

Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly

245 250 255

Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu

260 265 270

Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro

275 280 285

Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn

290 295 300

Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp

325 330 335

Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe

340 345 350

Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala

355 360 365

Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro His Met

370 375 380

Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu Ser Trp

385 390 395 400

Ile Asp Leu Glu Phe Asn His Pro Gln Ile Phe Ile Val Glu Asn Gly

405 410 415

Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr Met Tyr

420 425 430

Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Lys Leu Asp

435 440 445

Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp Gly Phe

450 455 460

Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp

465 470 475 480

Phe Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala Leu Phe

485 490 495

Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro Glu Asn

500 505 510

Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly Val Val

515 520 525

Asp Asn Tyr Ile Gln Val Ser Gln Leu Thr Lys Pro Ile Ser Ser Leu

530 535 540

Thr Lys Pro Tyr His

545

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

Met Leu Ala Arg Ala Pro Pro Arg Arg Pro Pro Arg Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Ala Leu Arg Ala Arg Cys

20 25 30

Leu Ser Ala Glu Pro Gly Gln Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ala

35 40 45

Arg Ala Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Leu His Asp Thr Phe Pro

50 55 60

Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly

65 70 75 80

Gly Trp Arg Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr

85 90 95

His His Ser Gly Ala Ala Pro Ser Asp Ser Pro Ile Val Val Ala Pro

100 105 110

Ser Gly Ala Pro Ser Pro Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Val Ala Ser

115 120 125

Asp Ser Tyr Asn Asn Val Tyr Arg Asp Thr Glu Gly Leu Arg Glu Leu

130 135 140

Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro

145 150 155 160

Asn Gly Thr Ala Gly Thr Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg

165 170 175

Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr

180 185 190

Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Gly Gly

195 200 205

Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu

210 215 220

Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp

225 230 235 240

Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala

245 250 255

Pro Gly Val Arg Gly Ser Ser Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn

260 265 270

Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe

275 280 285

Arg Pro Thr Gln Gly Gly Arg Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp

290 295 300

Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp Tyr Asn Ile Arg Glu Cys Gln Lys

305 310 315 320

Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Ile Phe Ile Asp

325 330 335

Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Leu Leu Pro

340 345 350

Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Arg Leu Ile Arg Gly Thr Ala Asp Phe

355 360 365

Phe Ala Leu Ser Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Asn Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu

385 390 395 400

Ser Trp Ile Asp Leu Glu Tyr Asn His Pro Pro Ile Phe Ile Val Glu

405 410 415

Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr

420 425 430

Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Arg

435 440 445

Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp

450 455 460

Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr

465 470 475 480

Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala

485 490 495

Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Asp Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro

500 505 510

Glu Asn Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly

515 520 525

Val Val Asp Asn Tyr Val Gln Leu Ser Pro Leu Thr Lys Pro Ser Val

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Pro His

545 550

<210> 3

<211> 1650

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

atgcccgcca gcgccccgcc gcgccgcccg cgtccaccgc cgccgtcgct gtcgctgctg 60

ctggtgctgc tgggcctggg cggacgacgc ctgcgtgcgg agccgggcga cggcgcgcag 120

acctgggccc gtgtctcgcg gcctcctgcc cccgaggccg cgggcctctt ccagggcacc 180

ttccccgacg gcttcctctg ggccgtgggc agcgccgcct accagaccga gggcggctgg 240

cagcagcacg gcaagggtgc gtccatctgg gacacgttca cccaccaccc cctggcaccc 300

ccgggagact cccggaacgc cagtctgccg ttgggcgccc cgtcgccgct gcagcccgcc 360

accggggacg tagccagcga cagctacaac aacgtcttcc gcgacacgga ggcgctgcgc 420

gagctcgggg tcactcacta ccgcttctcc atctcgtggg cgcgagtgct ccccaatggc 480

agcgcgggcg tccccaaccg cgaggggctg cgctactacc ggcgcctgct ggagcggctg 540

cgggagctgg gcgtgcagcc cgtggtcacc ctgtaccact gggacctgcc ccagcgcctg 600

caggacgcct acggcggctg ggccaaccgc gccctggccg accacttcag ggattacgcg 660

gagctctgct tccgccactt cggcggtcag gtcaagtact ggatcaccat cgacaacccc 720

tacgtggtgg cctggcacgg ctacgccacc gggcgcctgg cccccggcat ccggggcagc 780

ccgcggctcg ggtacctggt ggcgcacaac ctcctcctgg ctcatgccaa agtctggcat 840

ctctacaata cttctttccg tcccactcag ggaggtcagg tgtccattgc cctaagctct 900

cactggatca atcctcgaag aatgaccgac cacagcatca aagaatgtca aaaatctctg 960

gactttgtac taggttggtt tgccaaaccc gtatttattg atggtgacta tcccgagagc 1020

atgaagaata acctttcatc tattctgcct gattttactg aatctgagaa aaagttcatc 1080

aaaggaactg ctgacttttt tgctctttgc tttggaccca ccttgagttt tcaacttttg 1140

gaccctcaca tgaagttccg ccaattggaa tctcccaacc tgaggcaact gctttcctgg 1200

attgaccttg aatttaacca tcctcaaata tttattgtgg aaaatggctg gtttgtctca 1260

gggaccacca agagagatga tgccaaatat atgtattacc tcaaaaagtt catcatggaa 1320

accttaaaag ccatcaagct ggatggggtg gatgtcatcg ggtataccgc atggtccctc 1380

atggatggtt tcgagtggca cagaggttac agcatcaggc gtggactctt ctatgttgac 1440

tttctaagcc aggacaagat gttgttgcca aagtcttcag ccttgttcta ccaaaagctg 1500

atagagaaaa atggcttccc tcctttacct gaaaatcagc ccctagaagg gacatttccc 1560

tgtgactttg cttggggagt tgtcgacaac tacattcaag taagtcagct gacaaaacca 1620

atcagcagtc tcaccaagcc ctatcactag 1650

<210> 4

<211> 1653

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 4

atgctcgccc gcgcccctcc tcgccgcccg ccgcggctgg tgctgctccg tttgctgttg 60

ctgcatctgc tgctgctcgc cctgcgcgcc cgctgcctga gcgctgagcc gggtcagggc 120

gcgcagacct gggctcgctt cgcgcgcgct cctgccccag aggccgctgg cctcctccac 180

gacaccttcc ccgacggttt cctctgggcg gtaggcagcg ccgcctatca gaccgagggc 240

ggctggcgac agcacggcaa aggcgcgtcc atctgggaca ctttcaccca tcactctggg 300

gcggccccgt ccgactcccc gatcgtcgtg gcgccgtcgg gtgccccgtc gcctcccctg 360

tcctccactg gagatgtggc cagcgatagt tacaacaacg tctaccgcga cacagagggg 420

ctgcgcgaac tgggggtcac ccactaccgc ttctccatat cgtgggcgcg ggtgctcccc 480

aatggcaccg cgggcactcc caaccgcgag gggctgcgct actaccggcg gctgctggag 540

cggctgcggg agctgggcgt gcagccggtg gttaccctgt accattggga cctgccacag 600

cgcctgcagg acacctatgg cggatgggcc aatcgcgccc tggccgacca tttcagggat 660

tatgccgagc tctgcttccg ccacttcggt ggtcaggtca agtactggat caccattgac 720

aacccctacg tggtggcctg gcacgggtat gccaccgggc gcctggcccc gggcgtgagg 780

ggcagctcca ggctcgggta cctggttgcc cacaacctac ttttggctca tgccaaagtc 840

tggcatctct acaacacctc tttccgcccc acacagggag gccgggtgtc tatcgcctta 900

agctcccatt ggatcaatcc tcgaagaatg actgactata atatcagaga atgccagaag 960

tctcttgact ttgtgctagg ctggtttgcc aaacccatat ttattgatgg cgactaccca 1020

gagagtatga agaacaacct ctcgtctctt ctgcctgatt ttactgaatc tgagaagagg 1080

ctcatcagag gaactgctga cttttttgct ctctccttcg gaccaacctt gagctttcag 1140

ctattggacc ctaacatgaa gttccgccaa ttggagtctc ccaacctgag gcagcttctg 1200

tcttggatag atctggaata taaccaccct ccaatattta ttgtggaaaa tggctggttt 1260

gtctcgggaa ccaccaaaag ggatgatgcc aaatatatgt attatctcaa gaagttcata 1320

atggaaacct taaaagcaat cagactggat ggggtcgacg tcattgggta caccgcgtgg 1380

tcgctcatgg acggtttcga gtggcatagg ggctacagca tccggcgagg actcttctac 1440

gttgactttc tgagtcagga caaggagctg ttgccaaagt cttcggcctt gttctaccaa 1500

aagctgatag aggacaatgg ctttcctcct ttacctgaaa accagcccct tgaagggaca 1560

tttccctgtg actttgcttg gggagttgtt gacaactacg ttcagctgag tcctttgaca 1620

aaacccagtg tcggcctctt gcttcctcac taa 1653

<210> 5

<211> 534

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Pro Ala Ser Ala Pro Pro Arg Arg Pro Arg Pro Pro Pro Pro Ser

1 5 10 15

Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Leu Gly Gly Arg Arg Leu Arg

20 25 30

Ala Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Val Ser Arg Pro

35 40 45

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly

50 55 60

Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp

65 70 75 80

Gln Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His

85 90 95

Pro Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly

100 105 110

Ala Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser

115 120 125

Tyr Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu Gly Val

130 135 140

Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly

145 150 155 160

Ser Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu

165 170 175

Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr

180 185 190

His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala

195 200 205

Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe

210 215 220

Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro

225 230 235 240

Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly

245 250 255

Ile Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu

260 265 270

Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro

275 280 285

Thr Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn

290 295 300

Pro Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp

325 330 335

Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe

340 345 350

Thr Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala

355 360 365

Leu Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro His Met

370 375 380

Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu Ser Trp

385 390 395 400

Ile Asp Leu Glu Phe Asn His Pro Gln Ile Phe Ile Val Glu Asn Gly

405 410 415

Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr Met Tyr

420 425 430

Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Lys Leu Asp

435 440 445

Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp Gly Phe

450 455 460

Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp

465 470 475 480

Phe Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala Leu Phe

485 490 495

Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro Glu Asn

500 505 510

Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly Val Val

515 520 525

Asp Asn Tyr Ile Gln Val

530

<210> 6

<211> 536

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

Met Leu Ala Arg Ala Pro Pro Arg Arg Pro Pro Arg Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Ala Leu Arg Ala Arg Cys

20 25 30

Leu Ser Ala Glu Pro Gly Gln Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ala

35 40 45

Arg Ala Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Leu His Asp Thr Phe Pro

50 55 60

Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly

65 70 75 80

Gly Trp Arg Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr

85 90 95

His His Ser Gly Ala Ala Pro Ser Asp Ser Pro Ile Val Val Ala Pro

100 105 110

Ser Gly Ala Pro Ser Pro Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Val Ala Ser

115 120 125

Asp Ser Tyr Asn Asn Val Tyr Arg Asp Thr Glu Gly Leu Arg Glu Leu

130 135 140

Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro

145 150 155 160

Asn Gly Thr Ala Gly Thr Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg

165 170 175

Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr

180 185 190

Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Gly Gly

195 200 205

Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu

210 215 220

Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp

225 230 235 240

Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala

245 250 255

Pro Gly Val Arg Gly Ser Ser Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn

260 265 270

Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe

275 280 285

Arg Pro Thr Gln Gly Gly Arg Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp

290 295 300

Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp Tyr Asn Ile Arg Glu Cys Gln Lys

305 310 315 320

Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Ile Phe Ile Asp

325 330 335

Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Leu Leu Pro

340 345 350

Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Arg Leu Ile Arg Gly Thr Ala Asp Phe

355 360 365

Phe Ala Leu Ser Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Asn Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu

385 390 395 400

Ser Trp Ile Asp Leu Glu Tyr Asn His Pro Pro Ile Phe Ile Val Glu

405 410 415

Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr

420 425 430

Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Arg

435 440 445

Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp

450 455 460

Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr

465 470 475 480

Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala

485 490 495

Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Asp Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro

500 505 510

Glu Asn Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly

515 520 525

Val Val Asp Asn Tyr Val Gln Val

530 535

<210> 7

<211> 3683

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 基因构建体

<400> 7

ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420

cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 480

tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 540

gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 600

cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg 660

gagtcgctgc gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 720

ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 780

gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 840

ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 900

gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 960

ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1020

gtgccccgcg gtgcgggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg 1080

ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct 1140

ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg 1200

gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg 1260

cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt 1320

cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga 1380

cttcctttgt cccaaatctg tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct 1440

agcgggcgcg gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt 1500

cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg 1560

gacggctgcc ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc 1620

ggctctagag cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc 1680

aacgtgctgg ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattgattaa ttcgagcgaa 1740

cgcgtcgagt cgctcggtac gatttaaatt gaattggcct cgagcgcaag cttgagctag 1800

cctcgacctc gagacgcgtg atatcggatc cactagtcca gtgtggtgga attcgccgcc 1860

accatgctag cccgcgcccc tcctcgccgc ccgccgcggc tggtgctgct ccgtttgctg 1920

ttgctgcatc tgctgctgct cgccctgcgc gcccgctgcc tgagcgctga gccgggtcag 1980

ggcgcgcaga cctgggctcg cttcgcgcgc gctcctgccc cagaggccgc tggcctcctc 2040

cacgacacct tccccgacgg tttcctctgg gcggtaggca gcgccgccta tcagaccgag 2100

ggcggctggc gacagcacgg caaaggcgcg tccatctggg acactttcac ccatcactct 2160

ggggcggccc cgtccgactc cccgatcgtc gtggcgccgt cgggtgcccc gtcgcctccc 2220

ctgtcctcca ctggagatgt ggccagcgat agttacaaca acgtctaccg cgacacagag 2280

gggctgcgcg aactgggggt cacccactac cgcttctcca tatcgtgggc gcgggtgctc 2340

cccaatggca ccgcgggcac tcccaaccgc gaggggctgc gctactaccg gcggctgctg 2400

gagcggctgc gggagctggg cgtgcagccg gtggttaccc tgtaccattg ggacctgcca 2460

cagcgcctgc aggacaccta tggcggatgg gccaatcgcg ccctggccga ccatttcagg 2520

gattatgccg agctctgctt ccgccacttc ggtggtcagg tcaagtactg gatcaccatt 2580

gacaacccct acgtggtggc ctggcacggg tatgccaccg ggcgcctggc cccgggcgtg 2640

aggggcagct ccaggctcgg gtacctggtt gcccacaacc tacttttggc tcatgccaaa 2700

gtctggcatc tctacaacac ctctttccgc cccacacagg gaggccgggt gtctatcgcc 2760

ttaagctccc attggatcaa tcctcgaaga atgactgact ataatatcag agaatgccag 2820

aagtctcttg actttgtgct aggctggttt gccaaaccca tatttattga tggcgactac 2880

ccagagagta tgaagaacaa cctctcgtct cttctgcctg attttactga atctgagaag 2940

aggctcatca gaggaactgc tgactttttt gctctctcct tcggaccaac cttgagcttt 3000

cagctattgg accctaacat gaagttccgc caattggagt ctcccaacct gaggcagctt 3060

ctgtcttgga tagatctgga atataaccac cctccaatat ttattgtgga aaatggctgg 3120

tttgtctcgg gaaccaccaa aagggatgat gccaaatata tgtattatct caagaagttc 3180

ataatggaaa ccttaaaagc aatcagactg gatggggtcg acgtcattgg gtacaccgcg 3240

tggtcgctca tggacggttt cgagtggcat aggggctaca gcatccggcg aggactcttc 3300

tacgttgact ttctgagtca ggacaaggag ctgttgccaa agtcttcggc cttgttctac 3360

caaaagctga tagaggacaa tggctttcct cctttacctg aaaaccagcc ccttgaaggg 3420

acatttccct gtgactttgc ttggggagtt gttgacaact acgttcagct gagtcctttg 3480

acaaaaccca gtgtcggcct cttgcttcct cactaagggc cgcttccctt tagtgagggt 3540

taatgcttcg agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa 3600

tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca 3660

ttataagctg caataaacaa gtt 3683

<210> 8

<211> 2494

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 基因构建体

<400> 8

ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctgcgatcgc ccgccccgtt 540

gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctctctggct 600

aactagagaa cccactgctt actggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac 660

ccaagctggc tagaatgctc gcccgcgccc ctcctcgccg cccgccgcgg ctggtgctgc 720

tccgtttgct gttgctgcat ctgctgctgc tcgccctgcg cgcccgctgc ctgagcgctg 780

agccgggtca gggcgcgcag acctgggctc gcttcgcgcg cgctcctgcc ccagaggccg 840

ctggcctcct ccacgacacc ttccccgacg gtttcctctg ggcggtaggc agcgccgcct 900

atcagaccga gggcggctgg cgacagcacg gcaaaggcgc gtccatctgg gacactttca 960

cccatcactc tggggcggcc ccgtccgact ccccgatcgt cgtggcgccg tcgggtgccc 1020

cgtcgcctcc cctgtcctcc actggagatg tggccagcga tagttacaac aacgtctacc 1080

gcgacacaga ggggctgcgc gaactggggg tcacccacta ccgcttctcc atatcgtggg 1140

cgcgggtgct ccccaatggc accgcgggca ctcccaaccg cgaggggctg cgctactacc 1200

ggcggctgct ggagcggctg cgggagctgg gcgtgcagcc ggtggttacc ctgtaccatt 1260

gggacctgcc acagcgcctg caggacacct atggcggatg ggccaatcgc gccctggccg 1320

accatttcag ggattatgcc gagctctgct tccgccactt cggtggtcag gtcaagtact 1380

ggatcaccat tgacaacccc tacgtggtgg cctggcacgg gtatgccacc gggcgcctgg 1440

ccccgggcgt gaggggcagc tccaggctcg ggtacctggt tgcccacaac ctacttttgg 1500

ctcatgccaa agtctggcat ctctacaaca cctctttccg ccccacacag ggaggccggg 1560

tgtctatcgc cttaagctcc cattggatca atcctcgaag aatgactgac tataatatca 1620

gagaatgcca gaagtctctt gactttgtgc taggctggtt tgccaaaccc atatttattg 1680

atggcgacta cccagagagt atgaagaaca acctctcgtc tcttctgcct gattttactg 1740

aatctgagaa gaggctcatc agaggaactg ctgacttttt tgctctctcc ttcggaccaa 1800

ccttgagctt tcagctattg gaccctaaca tgaagttccg ccaattggag tctcccaacc 1860

tgaggcagct tctgtcttgg atagatctgg aatataacca ccctccaata tttattgtgg 1920

aaaatggctg gtttgtctcg ggaaccacca aaagggatga tgccaaatat atgtattatc 1980

tcaagaagtt cataatggaa accttaaaag caatcagact ggatggggtc gacgtcattg 2040

ggtacaccgc gtggtcgctc atggacggtt tcgagtggca taggggctac agcatccggc 2100

gaggactctt ctacgttgac tttctgagtc aggacaagga gctgttgcca aagtcttcgg 2160

ccttgttcta ccaaaagctg atagaggaca atggctttcc tcctttacct gaaaaccagc 2220

cccttgaagg gacatttccc tgtgactttg cttggggagt tgttgacaac tacgttcagc 2280

tgagtccttt gacaaaaccc agtgtcggcc tcttgcttcc tcactaaggg ccgcttccct 2340

ttagtgaggg ttaatgcttc gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 2400

cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 2460

atttgtaacc attataagct gcaataaaca agtt 2494

<210> 9

<211> 4071

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 基因构建体

<400> 9

ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctgcgatcgc ccgccccgtt 540

gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt 600

gaaccgtcag atcactagaa gcttgatatc gaattcgccc ttgataatca ttgctcgtgg 660

ggcggcggga gcgggggtgg gcaccgcgta gggagggcgg cggggcgcgg gcatataggg 720

gcgcggcgcg gtgccctccc ggctcccgca gcatgctagc ccgcgcccct cctcgccgcc 780

cgccgcggct ggtgctgctc cgtttgctgt tgctgcatct gctgctgctc gccctgcgcg 840

cccgctgcct gagcgctgag ccgggtcagg gcgcgcagac ctgggctcgc ttcgcgcgcg 900

ctcctgcccc agaggccgct ggcctcctcc acgacacctt ccccgacggt ttcctctggg 960

cggtaggcag cgccgcctat cagaccgagg gcggctggcg acagcacggc aaaggcgcgt 1020

ccatctggga cactttcacc catcactctg gggcggcccc gtccgactcc ccgatcgtcg 1080

tggcgccgtc gggtgccccg tcgcctcccc tgtcctccac tggagatgtg gccagcgata 1140

gttacaacaa cgtctaccgc gacacagagg ggctgcgcga actgggggtc acccactacc 1200

gcttctccat atcgtgggcg cgggtgctcc ccaatggcac cgcgggcact cccaaccgcg 1260

aggggctgcg ctactaccgg cggctgctgg agcggctgcg ggagctgggc gtgcagccgg 1320

tggttaccct gtaccattgg gacctgccac agcgcctgca ggacacctat ggcggatggg 1380

ccaatcgcgc cctggccgac catttcaggg attatgccga gctctgcttc cgccacttcg 1440

gtggtcaggt caagtactgg atcaccattg acaaccccta cgtggtggcc tggcacgggt 1500

atgccaccgg gcgcctggcc ccgggcgtga ggggcagctc caggctcggg tacctggttg 1560

cccacaacct acttttggct catgccaaag tctggcatct ctacaacacc tctttccgcc 1620

ccacacaggg aggccgggtg tctatcgcct taagctccca ttggatcaat cctcgaagaa 1680

tgactgacta taatatcaga gaatgccaga agtctcttga ctttgtgcta ggctggtttg 1740

ccaaacccat atttattgat ggcgactacc cagagagtat gaagaacaac ctctcgtctc 1800

ttctgcctga ttttactgaa tctgagaaga ggctcatcag aggaactgct gacttttttg 1860

ctctctcctt cggaccaacc ttgagctttc agctattgga ccctaacatg aagttccgcc 1920

aattggagtc tcccaacctg aggcagcttc tgtcttggat agatctggaa tataaccacc 1980

ctccaatatt tattgtggaa aatggctggt ttgtctcggg aaccaccaaa agggatgatg 2040

ccaaatatat gtattatctc aagaagttca taatggaaac cttaaaagca atcagactgg 2100

atggggtcga cgtcattggg tacaccgcgt ggtcgctcat ggacggtttc gagtggcata 2160

ggggctacag catccggcga ggactcttct acgttgactt tctgagtcag gacaaggagc 2220

tgttgccaaa gtcttcggcc ttgttctacc aaaagctgat agaggacaat ggctttcctc 2280

ctttacctga aaaccagccc cttgaaggga catttccctg tgactttgct tggggagttg 2340

ttgacaacta cgttcaagtg gacactactc tctctcagtt tactgacccg aatgtctatc 2400

tgtgggatgt gcatcacagt aagaggctta ttaaagtaga cggggttgta gccaagaaga 2460

gaaaacctta ctgtgttgat ttctctgcca tccggcctca gataacctta cttcgagaaa 2520

tgcgggtcac ccactttcgc ttctccctgg actgggccct gatcttgcct ctgggtaacc 2580

agacccaagt gaaccacacg gttctgcact tctaccgctg catgatcagc gagctggtgc 2640

acgccaacat cactccagtg gtggccctgt ggcagccagc agccccgcac caaggcctgc 2700

cacatgccct tgcaaaacat ggggcctggg agaacccgca cactgctctg gcgtttgcag 2760

actacgcaaa cctgtgtttt aaagagttgg gtcactgggt caatctctgg atcaccatga 2820

acgagccaaa cacacggaac atgacctatc gtgccgggca ccacctcctg agagcccatg 2880

ccttggcttg gcatctgtac gatgacaagt ttagggcggc tcagaaaggc aaaatatcca 2940

tcgccttgca ggctgactgg atagaaccgg cctgcccttt ctctcaaaat gacaaagaag 3000

tggccgagag agttttggaa tttgatatag gctggctggc agagcctatt tttggttccg 3060

gagattatcc acgtgtgatg agggactggc tgaaccaaaa aaacaatttt cttttgccct 3120

atttcaccga agatgaaaaa aagctagtcc ggggttcctt tgacttcctg gcggtgagtc 3180

attacaccac cattctggta gactgggaaa aggaggatcc gatgaaatac aacgattact 3240

tggaggtaca ggagatgact gacatcacat ggctcaactc tcccagtcag gtggcagtgg 3300

tgccttgggg gctgcgcaaa gtgctcaact ggctaaggtt caagtacgga gacctcccga 3360

tgtatgtgac agccaatgga atcgatgatg acccccacgc cgagcaagac tcactgagga 3420

tctattatat taagaattat gtgaatgagg ctctgaaagc ctacgtgttg gacgacatca 3480

acctttgtgg ctactttgcg tattcactta gtgatcgctc agctcccaag tctggctttt 3540

atcgatatgc tgcgaatcag tttgagccca aaccatctat gaaacattac aggaaaatta 3600

ttgacagcaa tggcttcctg ggttctggaa cactgggaag gttttgtcca gaagaataca 3660

ctgtgtgcac cgaatgtgga ttttttcaaa cccggaagtc tttgctggtc ttcatctcgt 3720

ttcttgtttt tacttttatt atttctcttg ctctcatttt tcactactcc aagaaaggcc 3780

agagaagtta taagtaatgt gaacgtctgc ctggccattc gctttgggat caagatgtac 3840

acgccgtcag ccgtttgcac ctctctgtgt tgtgagccgc attccacaca tttcgattct 3900

agagcggccg cttcccttta gtgagggtta atgcttcgag cagacatgat aagatacatt 3960

gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt 4020

tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt t 4071

<210> 10

<211> 1157

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 基因构建体

<400> 10

ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctgcgatcgc ccgccccgtt 540

gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt 600

gaaccgtcag atcactagaa gctttattgc ggtagtttat cacagttaaa ttgctaacgc 660

agtcagtgct tctgacacaa cagtctcgaa cttaagctgc agtgactctc ttaaggtagc 720

cttgcagaag ttggtcgtga ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt 780

aaggagacca atagaaactg ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg 840

cacctattgg tcttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt 900

tcaattacag ctcttaaggc tagagtactt aatacgactc actataggct agcctcgacc 960

tcgagacgcg tgatatcgga tccgtcgacg cggccgcttc cctttagtga gggttaatgc 1020

ttcgagcaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt 1080

gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa 1140

gctgcaataa acaagtt 1157

<210> 11

<211> 1014

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 11

Met Leu Ala Arg Ala Pro Pro Arg Arg Pro Pro Arg Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Leu His Leu Leu Leu Leu Ala Leu Arg Ala Arg Cys

20 25 30

Leu Ser Ala Glu Pro Gly Gln Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ala

35 40 45

Arg Ala Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Leu His Asp Thr Phe Pro

50 55 60

Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly

65 70 75 80

Gly Trp Arg Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr

85 90 95

His His Ser Gly Ala Ala Pro Ser Asp Ser Pro Ile Val Val Ala Pro

100 105 110

Ser Gly Ala Pro Ser Pro Pro Leu Ser Ser Thr Gly Asp Val Ala Ser

115 120 125

Asp Ser Tyr Asn Asn Val Tyr Arg Asp Thr Glu Gly Leu Arg Glu Leu

130 135 140

Gly Val Thr His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro

145 150 155 160

Asn Gly Thr Ala Gly Thr Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg

165 170 175

Arg Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr

180 185 190

Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Gly Gly

195 200 205

Trp Ala Asn Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu

210 215 220

Cys Phe Arg His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp

225 230 235 240

Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala

245 250 255

Pro Gly Val Arg Gly Ser Ser Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn

260 265 270

Leu Leu Leu Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe

275 280 285

Arg Pro Thr Gln Gly Gly Arg Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp

290 295 300

Ile Asn Pro Arg Arg Met Thr Asp Tyr Asn Ile Arg Glu Cys Gln Lys

305 310 315 320

Ser Leu Asp Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Ile Phe Ile Asp

325 330 335

Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Leu Leu Pro

340 345 350

Asp Phe Thr Glu Ser Glu Lys Arg Leu Ile Arg Gly Thr Ala Asp Phe

355 360 365

Phe Ala Leu Ser Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro

370 375 380

Asn Met Lys Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu

385 390 395 400

Ser Trp Ile Asp Leu Glu Tyr Asn His Pro Pro Ile Phe Ile Val Glu

405 410 415

Asn Gly Trp Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr

420 425 430

Met Tyr Tyr Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Arg

435 440 445

Leu Asp Gly Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp

450 455 460

Gly Phe Glu Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr

465 470 475 480

Val Asp Phe Leu Ser Gln Asp Lys Glu Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala

485 490 495

Leu Phe Tyr Gln Lys Leu Ile Glu Asp Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro

500 505 510

Glu Asn Gln Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly

515 520 525

Val Val Asp Asn Tyr Val Gln Val Asp Thr Thr Leu Ser Gln Phe Thr

530 535 540

Asp Pro Asn Val Tyr Leu Trp Asp Val His His Ser Lys Arg Leu Ile

545 550 555 560

Lys Val Asp Gly Val Val Ala Lys Lys Arg Lys Pro Tyr Cys Val Asp

565 570 575

Phe Ser Ala Ile Arg Pro Gln Ile Thr Leu Leu Arg Glu Met Arg Val

580 585 590

Thr His Phe Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala Leu Ile Leu Pro Leu Gly

595 600 605

Asn Gln Thr Gln Val Asn His Thr Val Leu His Phe Tyr Arg Cys Met

610 615 620

Ile Ser Glu Leu Val His Ala Asn Ile Thr Pro Val Val Ala Leu Trp

625 630 635 640

Gln Pro Ala Ala Pro His Gln Gly Leu Pro His Ala Leu Ala Lys His

645 650 655

Gly Ala Trp Glu Asn Pro His Thr Ala Leu Ala Phe Ala Asp Tyr Ala

660 665 670

Asn Leu Cys Phe Lys Glu Leu Gly His Trp Val Asn Leu Trp Ile Thr

675 680 685

Met Asn Glu Pro Asn Thr Arg Asn Met Thr Tyr Arg Ala Gly His His

690 695 700

Leu Leu Arg Ala His Ala Leu Ala Trp His Leu Tyr Asp Asp Lys Phe

705 710 715 720

Arg Ala Ala Gln Lys Gly Lys Ile Ser Ile Ala Leu Gln Ala Asp Trp

725 730 735

Ile Glu Pro Ala Cys Pro Phe Ser Gln Asn Asp Lys Glu Val Ala Glu

740 745 750

Arg Val Leu Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu Ala Glu Pro Ile Phe Gly

755 760 765

Ser Gly Asp Tyr Pro Arg Val Met Arg Asp Trp Leu Asn Gln Lys Asn

770 775 780

Asn Phe Leu Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp Glu Lys Lys Leu Val Arg

785 790 795 800

Gly Ser Phe Asp Phe Leu Ala Val Ser His Tyr Thr Thr Ile Leu Val

805 810 815

Asp Trp Glu Lys Glu Asp Pro Met Lys Tyr Asn Asp Tyr Leu Glu Val

820 825 830

Gln Glu Met Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn Ser Pro Ser Gln Val Ala

835 840 845

Val Val Pro Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu Asn Trp Leu Arg Phe Lys

850 855 860

Tyr Gly Asp Leu Pro Met Tyr Val Thr Ala Asn Gly Ile Asp Asp Asp

865 870 875 880

Pro His Ala Glu Gln Asp Ser Leu Arg Ile Tyr Tyr Ile Lys Asn Tyr

885 890 895

Val Asn Glu Ala Leu Lys Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ile Asn Leu Cys

900 905 910

Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser Leu Ser Asp Arg Ser Ala Pro Lys Ser Gly

915 920 925

Phe Tyr Arg Tyr Ala Ala Asn Gln Phe Glu Pro Lys Pro Ser Met Lys

930 935 940

His Tyr Arg Lys Ile Ile Asp Ser Asn Gly Phe Leu Gly Ser Gly Thr

945 950 955 960

Leu Gly Arg Phe Cys Pro Glu Glu Tyr Thr Val Cys Thr Glu Cys Gly

965 970 975

Phe Phe Gln Thr Arg Lys Ser Leu Leu Val Phe Ile Ser Phe Leu Val

980 985 990

Phe Thr Phe Ile Ile Ser Leu Ala Leu Ile Phe His Tyr Ser Lys Lys

995 1000 1005

Gly Gln Arg Ser Tyr Lys

1010

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 寡聚

<400> 12

ctgccccatt gacaaaaggc 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 寡聚

<400> 13

ctcaccgtcg gtcatcagc 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 寡聚

<400> 14

gcacagttta cgttgccgac 20

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 寡聚

<400> 15

cgttagcaat ccgcaagca 19

Claims (15)

1.由序列SEQ ID NO:1组成的多肽或由与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的序列组成的其变体，应用于预防和/或治疗骨病症。

2.如权利要求1所述应用的多肽，其中，所述骨病症是骨退行性变和/或骨丢失症。

3.如权利要求1至2中任一项所述应用的多肽，其中，所述骨病症是年龄相关的骨退行性变和/或骨丢失症。

4.如权利要求1至3中任一项所述应用的多肽，其中，所述骨病症是骨质减少症和/或骨质疏松症。

5.如权利要求1至4中任一项所述应用的多肽，其中，所述多肽由序列SEQ ID NO:1或其变体组成，所述变体由与SEQ ID NO:1具有至少88％同一性的序列组成。

6.如权利要求1至5中任一项所述应用的多肽，其中，所述多肽由序列SEQ ID NO:1或其变体组成，所述变体由与SEQ ID NO:1具有至少98％同一性的序列组成。

7.如权利要求1至5中任一项所述应用的多肽，其中，所述多肽由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2组成。

8.编码权利要求1至7中任一项所限定的多肽或其变体的核酸序列，其用于预防和/或治疗骨病症。

9.包含可操作地连接至表达启动子的权利要求8所限定的核酸序列的基因构建体，其用于预防和/或治疗骨病症。

10.包含权利要求9所限定的基因构建体的表达载体，其用于预防和/或治疗骨病症。

11.如权利要求10所述应用的表达载体，其是病毒载体。

12.如权利要求11所述应用的表达载体，其是选自由AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、PHPeB和9P31组成的组中的血清型的腺相关病毒。

13.权利要求1至7中任一项所述应用的多肽、权利要求8所述应用的核酸序列、权利要求9所述应用的基因构建体、或权利要求10至12中任一项所述应用的表达载体，其与至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起以药物组合物的形式施用。

14.如权利要求13所述应用的多肽、核酸序列、基因构建体或表达载体，其中，所述药物组合物用于心室内施用或用于静脉内施用。

15.权利要求1至7中任一项所述应用的多肽、权利要求8所述应用的核酸序列、权利要求9所述应用的基因构建体、或权利要求10至12中任一项所述应用的表达载体，其与另一种活性剂联合施用。