CN113330023A - 体内具有crispr超级阻遏子的合成免疫调控 - Google Patents

体内具有crispr超级阻遏子的合成免疫调控 Download PDF

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Abstract

本文提供的是基于CRISPR的合成阻遏系统以及使用所述合成阻遏系统来治疗败血病、受试者中的不利免疫反应和华氏巨球蛋白血症的方法和组合物。

Description

体内具有CRISPR超级阻遏子的合成免疫调控
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年11月8日提交的美国临时申请No.62/757,679和2019年9月12日提交的美国临时申请No.62/899,584的优先权，这些申请中的每一个整体地并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是根据由美国国立卫生研究院授予的R01 EB024562和由DARPA授予的HR0011-16-23657在政府支持下做出的。政府拥有本发明的某些权利。
对经由EFS-WEB提交的序列表的引用
于2019年11月7日创建并经由EFS-Web以电子方式提交的大小为48.4kb的命名为“112624_01135_ST25.txt”的序列表的ASCII文本文件的内容通过引用整体地并入本文。
背景技术
与常见的基因递送方法相比较，腺相关病毒(AAV)载体由于其以高效率靶向各种组织类型的显著能力而拥有治疗基因递送的广泛潜力。AAV载体当前是临床中使用的普遍类型的DNA病毒。用AAV实现的转基因的长期稳定表达对于慢性疾病的治疗是必要的。然而，已经示出了AAV载体或所递送的转基因唤起适应性免疫反应，这导致针对表达病毒衣壳或转基因的细胞的抗体和细胞毒性T细胞反应的产生。随后，此适应性宿主免疫反应损害转基因的有效表达并且已在体内AAV介导的基因疗法中提出了主要挑战。
同时，成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas9系统正在通过促进基因编辑和基因调控来为基因疗法提供空前的机会。尽管是极有前途的，但是对包括潜在免疫反应和基因组特异性的临床转化来说，来自化脓链球菌的Cas9蛋白(Sp-Cas9)即迄今为止研究的CRISPR的最常见形式面临许多挑战。对人样本的最近研究暗示在被测患者的子集中预先存在针对Sp-Cas9的体液和细胞免疫反应，从而提出这样的观念，即Cas9蛋白也能够在新患者中引出细胞和体液免疫反应。此外，已经证明了Cas9表达在细胞内部的时间限制有益于降低CRISPR在基因组中的脱靶活性。总之，这些条证据暗示，用于按需调控CRISPR及其递送载体(包括AAV病毒)的不利后果的策略对临床转化的安全性将是极重要的。
发明内容
在第一方面中，本文提供的是一种用于体内阻遏髓样分化初级反应88(MyD88)表达的合成阻遏系统，该合成阻遏系统包含单个扩增子，该单个扩增子包含：(a)引导RNA(gRNA)，其包含(i)与MyD88的一部分互补的引导序列和(ii)对RNA结合蛋白特异性的适体靶位点；(b)对与一个或多个阻遏结构域融合的适体RNA结合蛋白进行编码的核苷酸序列；以及(c)对多功能Cas核酸酶进行编码的核苷酸序列；其中单个扩增子被包装在用于基于DNA的病毒递送的载体中。在一些实施方式中，gRNA引导序列的长度为14个核苷酸。在一些实施方式中，gRNA引导序列靶向在MyD88的TATA盒区域上游的100个碱基对(bp)内。在一些实施方式中，gRNA引导序列选自由SEQ ID NO：1-4组成的组。在一些实施方式中，适体靶位点是MS2适体靶位点并且RNA结合蛋白是噬菌体MS2外壳蛋白。在一些实施方式中，gRNA包含MS2适体靶位点并且引导序列的长度为14个核苷酸。
在一些实施方式中，阻遏结构域选自由以下项组成的组：Kruppel相关盒(KRAB)结构域、甲基-CpG(mCpG)结合结构域2(meCP2)、开关独立3转录调节子家族成员A(SIN3A)、组蛋白脱乙酰基酶HDT1(HDT1)、含甲基-CpG结合结构域的蛋白2(MBD2B)的n端截短、蛋白磷酸酶-1的核抑制因子(NIPP1)和异染色质蛋白1(HP1A)。在一些实施方式中，(b)的核苷酸对与至少两个阻遏结构域融合的MS2进行编码。在一些实施方式中，对与阻遏结构域融合的MS2进行编码的核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO：55、59、61和63组成的组的序列。
在一些实施方式中，系统包含对与适体RNA结合蛋白和阻遏结构域融合的多功能Cas核酸酶进行编码的核苷酸序列。在一些实施方式中，Cas核酸酶是金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶或化脓链球菌Cas9核酸酶。在一些实施方式中，载体是AAV2/1递送载体。
在第二方面中，本文提供的是一种药物组合物，该药物组合物包含本文描述的合成阻遏系统和药学上可接受的递送载体。
在第三方面中，本文提供的是一种治疗患有败血症的受试者的方法，该方法包括向患有败血症的受试者施用治疗有效量的包含本文描述的合成阻遏系统的组合物。在一些实施方式中，与免疫有关的标志物Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、fn-γ和Stat4的水平在施用之后在受试者中降低。在一些实施方式中，该方法附加地包括以下步骤：监测选自由Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、fn-γ和Stat4组成的组的至少一种与免疫有关的标志物的水平；以及向受试者施用附加剂量的合成阻遏系统组合物，直到至少一种与免疫有关的标志物的水平降低为止。在一些实施方式中，血清乳酸盐在施用之后在受试者中降低。
在第四方面中，本文提供的是一种在受试者中防止不利免疫反应的方法，该方法包括在向受试者施用基于AAV载体的基因疗法之前或与之同时地向受试者施用治疗有效量的包含本文描述的合成阻遏系统的组合物，其中选自由Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、fn-γ和Stat4组成的组的与免疫有关的标志物的水平在该受试者中相对于接受了基于AAV载体的基因疗法但确实未接受治疗合成阻遏系统组合物的受试者降低了。在一些实施方式中，受试者先前接受了至少一种基于AAV载体的基因疗法。在一些实施方式中，该方法附加地包括以下步骤：监测选自由Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、fn-γ和Stat4组成的组的至少一种与免疫有关的标志物的水平；以及向受试者施用附加剂量的合成阻遏系统组合物，直到至少一种与免疫有关的标志物的水平降低为止。
在第五方面中，本文提供的是一种在有需要的受试者中治疗华氏巨球蛋白血症的方法，该方法包括向患有华氏巨球蛋白血症的受试者施用治疗有效量的包含本文描述的合成阻遏系统的组合物。在一些实施方式中，该方法附加地包括向受试者施用包含被配置为在L265基因座处切割MyD88的gRNA和在L265基因座处对野生型MyD88的一部分进行编码的同源性定向修复模板的组合物，由此内源L265P突变体MyD88的水平在受试者中降低。
附图说明
图1A-1H示出了体外和体内基于CRISPR的靶向Myd88阻遏证明在调控宿主针对基于AAV的基因疗法的反应时的功效。(图1A)顶部：靶向到Myd88基因座的启动子的gRNA结合位点的示意表示；底部：小鼠神经母细胞瘤(N2A)细胞系用MyD88 gRNA对或模拟gRNA对照组以及Cas9核酸酶和MS2-KRAB或MS2-HP1aKRAB盒转染。转染后72小时，用脂多糖类(大肠杆菌LPS，血清型0111:B4)以10μg/ml的浓度处理细胞以诱导Myd88表达。(图1B)LPS处理后的Myd88表达mRNA水平的qRT-PCR分析。相对于接受非靶向Mockg RNA的细胞的表达水平量化倍数变化(N＝4次独立转染)。(图1C)涉及向Cas9核酸酶转基因小鼠眼眶后注射AAV-MyD88或Mock阻遏子的实验的简图。(图1D)眼眶后注射1E+12GC的AAV/Myd88或携带MS2-HP1a-KRAB或MS2-KRAB的AAV/Mock载体3周后Cas9转基因小鼠的肺、血液和骨髓中的Myd88表达水平的qRT-PCR分析(对于注射组N＝4-5，而对于未注射组N＝2)。倍数变化是相对于通用对照组的(图1E和图1F)。Icam-1(图1E)和Tnfα(图1F)mRNA的表达水平中的倍数变化是相对于通用对照组的。(对于注射组N＝4-5，而对于未注射组N＝2)。通用对照组是从确实未接受任何AAV注射的未注射小鼠收集的血液样本中的所需转录组的水平。**P<0.01和*P<0.05指示通过学生t-检验测量的统计显著性。(图1G)示出了从用Myd88-Ms2-HP1aKRAB治疗的小鼠收集的骨髓样本与从用Myd88-MS2-KRAB治疗的小鼠收集的骨髓样本之间的差异表达基因的显著性与表达的关系的火山图。虚线上方的点表示显著地(调整后的p值<0.05)向上和向下调节的基因。在存在MS2-HP1aKRAB的情况下高度向下调节的基因是免疫球蛋白重链和轻链的家族。(图1H)通过ELISA测量的抗AAV1 IgG2A抗体的分析，揭示了AAV1特异性抗体在Myd88预处理后被显著地阻遏。**P<0.01和*P<0.05指示通过学生t-检验测量的统计显著性。
图2A-2H示出了对宿主炎症反应的基于CRISPR的调控在LPS介导的败血病之后给与保护。(图2A)用于评估CRISPR介导的MyD88阻遏在败血病中的保护效应的实验的简图。经由眼眶后注射将1E+12GC的AAV载体注射到表达Cas9的小鼠并且大约3周以后，用LPS(5mg/kg)腹膜内治疗它们。在LPS注射后6小时，小鼠被处死。(图2B-2D)体内MyD88(图2B)、Tnfα(图2C)和Icam-1(图2D)表达在LPS注射之后相对于通用对照组的炎症基因qRT-PCR分析的内源阻遏(对于注射组N＝5-6，而对于未注射组N-＝2)。(图2E)使用多重ELISA测定来测量血浆和肺中的一小组炎性细胞因子；值在热图中被显示为实测浓度的以10为底的对数。(图2F)在LPS注射后6小时从小鼠收集的血浆样本中使L-乳酸盐循环(N＝4)。(图2G)在LPS注射后6小时对肝样本中的体内Myd88表达的qRT-PCR分析。相对于通用对照组量化倍数变化表达水平(对于注射组N＝4-6，而对于未注射组N＝2)。(图2H)胆固醇、HDL、LDL和ALT的血浆浓度(N＝3-4)。“通用对照组”是从确实未接受任何AAV注射的未注射小鼠采集的血液样本中的感兴趣转录组的水平。注意对于2B-D和2C，“未注射”小鼠的数据也在图1D-F中报告。**P<0.01和*P<0.05指示通过学生t-检验测量的统计显著性。
图3A-3B示出了体外适体介导的CRISPR阻遏。(图3A)阻遏子结构域向CRISPR复合物的适体介导的募集的简图。(图3B)HEK293FT细胞中的阻遏子结构域向CRISPR复合物的适体介导的募集之后的靶向基因的mRNA表达。相对于dCas9仅对照组量化倍数变化。N＝3个独立转染。
图4示出了对不同组织的AAV2/1向性的体内分析。经由眼眶后注射将AAV2/1-GFP递送给C57BL/6小鼠。通过qRT-PCR在不同组织中评估GFP表达。平均倍数变化表达水平被指示在每个组上方并且是相对于未注射小鼠而量化的(对于未注射组N＝3，而对于AAV-GFP组N＝4-6)。
图5A-5C示出了从用AAV-Myd88-MS2-HP1aKrab治疗的小鼠对用AAV-Myd88-MS2-Krab治疗的小鼠收集的骨髓样本的RNA-seq分析。(图5A)比较来自Myd88-MS2-HP1aKRAB对Myd88-MS2-KRAB的骨髓的两个复制品中的基因(每百万转录组的每千碱基片段读为FPKM)的表达的散点图。Myd88、Il1b、Icam1、Tnfa和Il6用红色突出显示并且与MyD88-MS2-KRAB比较在Myd88-Ms2-HP1a-KRAB组中向下调节最多的基因用青色突出显示。(图5B)比较从用AAV-Myd88-MS2-HP1aKrab治疗的小鼠对用AAV-Myd88-MS2-Krab治疗的小鼠收集的骨髓样本的GO富集直方图。GO富集分析中前20个显著地富集的项被显示。*证明padj值<0.05和显著性。注意，当使用HP1aKRAB时，与Myd88信号传导相关联的诸如细菌的防御反应的途径大多数被向下调节。(图5C)显示了在Myd88-MS2-HP1aKRAB对Myd88-MS2-KRAB的BM样本中比较的Reactome数据库中的前20个富集基因的Reactome富集条形图。*证明<0.05的显著性padj值和显著性。
图6示出了在LPS损伤之后一组与免疫有关的转录组的分析。在LPS注射之后相对于通用对照组量化的肺、血液和骨髓中的Ncf、Il6、Ifnγ和Il1βmRNA表达的qRT-PCR分析(对于注射组N＝5-6，而对于未注射组N＝2)。通用对照组是从未注射Cas9转基因小鼠收集的血液样本中的所需转录组的水平。*P<0.05；显著
图7示出了在LPS注射之后肺和骨髓中的一组与免疫有关的基因的水平的评估。肺和骨髓中的在LPS注射之后相对于通用对照组的体内CD68(Marcrophage标志物)、Infα、Infβ、CD4、Cxcl1和Stat4的qRT-PCR分析。(对于注射组N＝5-6，而对于未注射组N＝2)。“通用对照组”是从未注射Cas9转基因小鼠收集的血液样本中的感兴趣转录组的水平。*P<0.05；显著
图8A-8C示出了靶向Myd88基因座的不同区域的gRNA集的阻遏效率的评估。(图8A)靶向Myd88基因座的启动子的gRNA结合位点的示意表示。(图8B)N2A细胞用指示的gRNA和包括MS2-HP1aKRAB盒的CRISPR机制的其他组分转染。在转染3天后经由qRT-PCR分析Myd88阻遏的水平(N＝2)。倍数变化是相对于确实未接受任何gRNA(无引导)的组的。(图8C)在眼眶后注射AAV后3周的体内Myd88表达的qRT-PCR分析。相对于通用对照组量化基因表达倍数变化(对于注射组N＝4-6，而对于未注射组N＝2)。通用对照组是从未注射Cas9转基因小鼠收集的血液样本中的所需转录组的水平。注意对于(图8C)，AAV-Mock-MS2-HP1aKRAB和AAV-Myd88set1-MS2-HP1aKRAB数据也在图1D中报告。*P<0.05；显著
图9示出了在LPS损伤之后组织损坏的血清标志物的分析。血清血液尿素氮(BUN)即肾损伤的标志物在LPS损伤之后在血清中增加，并且Myd88阻遏防止了这种增加。LPS治疗和Myd88阻遏确实对血清脂肪酶水平没有任何显著影响，该血清脂肪酶水平通常指示胰腺的损伤。*P<0.05；显著
图10A-10C示出了Cxcr4的内源阻遏。(图10A)靶向Cxcr4基因座的启动子的gRNA结合位点的示意表示。(图10B)原始264.7细胞用AAV-CXCR4以及AAV-Cas9转导。转导后5天使用qRT-PCR来分析Cxcr4 mRNA的表达水平。相对于接受相同剂量的AAV-Mock的细胞的表达水平量化倍数变化。(N＝2)。(图10C)对Cas9转基因小鼠进行AAV注射后3周肺样本中的体内Cxcr4表达的qRT-PCR分析。相对于接受相同剂量的AAV-Mock的小鼠量化倍数变化表达水平。(N＝4)*P<0.05；显著。
图11示出了MS2-HP1aKRAB和Cas9-HP1aKRAB之间的差异。数据示出了使用Cas9加上MS2融合的Hp1a-Krab阻遏子和与HP1a-Krab融合的Cas9的类似阻遏水平。
图12示出了对野生型小鼠进行CRISPR递送之后的Myd88和下游细胞因子的阻遏。
图13示出了对注射有LPS的野生型小鼠进行CRISPR递送之后的Myd88和下游细胞因子的阻遏。
图14示出了具有靶向不同基因座的14nt对20nt gRNA引导序列的Cas9的阻遏效率的比较。数据示出了结合14nt gRNA或20nt gRNA使用Cas9+MS2-Hp1a-Krab阻遏子的类似阻遏水平。
图15示出了CRISPR递送后24小时体内Myd88表达的qRT-PCR分析。小鼠接受了2.5mg/kg LPS。LPS注射后两小时，小鼠接受了使用pepjet的CRISPR合成阻遏系统。Myd88表达的qRT-PCR分析示出了肺、肝和骨髓中的Myd88水平减小了。
图16示出了IDEXX肝板数据。小鼠接受了2.5mg/kg LPS。LPS注射后两小时，小鼠接受了使用pepjet的CRISPR合成阻遏系统。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，到好像每个单独的出版物、专利和专利申请被具体地且单独地指示要通过引用并入的相同程度。
具体实施方式
本公开描述了用于体内阻遏髓样分化初级反应88(MyD88)的表达的组合物和方法。本文描述的组合物和方法的使用有益于治疗或防止与腺相关病毒载体和CRISPR基因编辑构建体的施用相关联的免疫反应。此外，本文描述的组合物和方法可用于治疗或防止与败血病相关联的异常免疫反应中。
本文提供的CRISPR合成阻遏子系统被配置为抑制MyD88的转录。MyD88是先天和适应性免疫反应中的关键节点，从而作为包括Toll样受体(TLR)和白介素(IL)-1家族信号转导的许多信号传导途径的必要的衔接分子。使用多功能Cas核酸酶和gRNA适体来开发，合成阻遏子系统体内调控内源MyD88水平并且有助于靶细胞的先天和适应性免疫反应的免疫调控。例如，通过将多功能Cas核酸酶连同(i)与MyD88互补的gRNA-MS2适体结合靶复合物和(ii)与MS2连接的阻遏结构域一起引入到靶细胞中，合成阻遏子系统减少MyD88的转录并且向下调节与MyD88功能相关联并且参与针对异物如细菌和病毒的细胞免疫反应的信号传导途径。
因此，在一些方面中本文提供的是用于调控MyD88的体内表达的合成阻遏系统。在某些实施方式中，该系统包含：(a)引导RNA(gRNA)，其包含(i)与MyD88基因的至少一部分互补的长度为15或更少个核苷酸(nt)的引导序列和(ii)对RNA结合蛋白特异性的适体靶位点；(b)对与阻遏结构域融合的适体RNA结合蛋白进行编码的核苷酸序列；以及(c)对多功能Cas核酸酶进行编码的核苷酸序列。在一些实施方式中，gRNA核苷酸、阻遏结构域核苷酸和Cas核酸酶核苷酸包含单个扩增子。在某些实施方式中，单个扩增子被包装在用于基于DNA的病毒递送的载体中。
在优选的实施方式中，基于CRISPR的合成阻遏系统是单个扩增子，其能够被包装用于使用诸如外来体、病毒、病毒粒子、病毒样粒子或纳米粒子的递送载体体内递送到哺乳动物细胞中。在某些实施方式中，本文提供的是一种合成调节系统，其在单个扩增子中包含多功能Cas核酸酶，其在一些情况下与阻遏结构域融合，以及包含长度为14个核苷酸的引导序列的gRNA，其中该合成调节系统调控哺乳动物细胞中的切割和/或转录。
如本文所使用的，“引导RNA”(gRNA)是指包括与靶基因的至少一部分互补的引导序列以及提供次级结构和初级序列(例如，tracrRNA)以将Cas核酸酶募集到靶基因的支架序列的核苷酸序列。在一些实施方式中，gRNA包括次级结构元件，诸如但不限于发夹环、四环、茎环及它们的组合。gRNA序列和结构的变化是本领域中已知的。本领域的技术人员将认识到，gRNA序列的可变性耐受性适用于适合于所公开的合成阻遏系统的Cas9介导的阻遏。gRNA靶基因还包含紧接位于靶基因的靶位点下游的Protospacer相邻基序(PAM)。PAM序列的实例是已知的(参见例如Shah等人,RNA Biology 10(5):891-899,2013)。在一些实施方式中，PAM序列取决于架构中使用的Cas核酸酶的种类。
在一些实施方式中，gRNA的与靶基因的至少一部分互补的引导序列是约20个核苷酸(nt)的序列。在一些实施方式中，gRNA的与靶基因的至少一部分互补的引导序列是15或更少个核苷酸(nt)的截短引导序列。在一些实施方式中，gRNA包括15-nt引导序列、14-nt引导序列或13-nt引导序列。在不受任何特定机制、理论或动作模式束缚的情况下，本文描述的合成阻遏系统在核酸酶与具有14-nt引导序列而不是20-nt引导序列的gRNA结合时利用Cas核酸酶的消融。通过将Cas复合物募集到靶基因的靶位点但是抑制核酸酶活性，Cas复合物将不会切割靶基因，但是将抑制并阻遏靶基因的表达。阻遏结构域向停滞的Cas复合物的附加募集将扩增靶基因的阻遏。
在某些实施方式中，gRNA被配置为靶向一个或多个内源基因。作为实例，为了阻遏而靶向的内源基因能够包括但不限于生长因子、细胞因子、涉及同源性定向修复的基因、涉及非同源性末端接合(NHEJ)的基因、代谢酶、细胞周期进程酶以及涉及伤口愈合和组织修复的途径的基因。在优选的实施方式中，内源基因是MyD88。在一些实施方式中，gRNA被配置为靶向在MyD88的转录起始位点上游或下游的200个碱基对(bp)内。在一些实施方式中，gRNA被配置为靶向在MyD88基因中的TATA盒区域上游的100bp内。在一些实施方式中，gRNA的引导序列选自由SEQ ID NO：1-4组成的组。
为了改进系统的基因阻遏有效性和可扩展性，在一些情况下将引导RNA(gRNA)工程化为包含对RNA结合蛋白特异性的发夹适体靶位点。在一些情况下，适体靶位点被附到gRNA的四环和茎环。RNA识别基序是本领域中已知的，诸如但不限于某些蛋白质、MS2外壳蛋白、COM或PP7分别结合到的MS2结合基序、COM结合基序或PP7结合基序。在一些情况下，适体靶位点能够结合到二聚化MS2噬菌体外壳蛋白。PP7是噬菌体假单胞菌的RNA结合外壳蛋白。像MS2一样，它结合特定RNA序列和次级结构。PP7 RNA识别基序与MS2的RNA识别基序不同。因此，能够复用PP7和MS2以同时地在不同的基因组位点处介导不同的效应。
在一些实施方式中，在RNA Pol II启动子或RNA Pol III启动子的控制下表达gRNA。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地带有CMV增强子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子。在一些情况下，使用CRISPR反应性启动子。如本文所使用的，术语“CRISPR反应性启动子”包含真核启动子以及用于调节基因表达的合成基因调节装置和回路。在一些实施方式中，CRISPR反应性启动子包含RNA Pol II启动子或RNAPol III启动子。CRISPR反应性启动子可以是CRISPR可阻遏启动子(CRP)或CRISPR可激活启动子(CAP)。
已用于表达gRNA和短发夹RNA(shRNA)的标准Pol III启动子，诸如U6和H1，不允许对下游基因进行空间或时间控制。CRISPR gRNA的空间限制具有若干重要的好处，特别是关于人治疗：1)将gRNA表达限于感兴趣组织/细胞类型，这消除递送工具全身分配CRISPR编码盒的担忧；2)通过在生殖细胞中消除对CRISPR活性的担忧来避免种系突变；3)邻近或串扰细胞中的差异基因编辑/调控：通过根本不同的细胞类型特异性启动子的gRNA调节使得科学家能够调控根本不同的细胞类型中的不同基因集的表达。因此，在某些实施方式中，基于CRISPR的遗传回路被配置为使用细胞类型特异性启动子来驱动引导RNA(gRNA)的表达。在一些情况下，基于CRISPR的遗传回路被配置为包括内源或细胞类型特异性启动子代替合成启动子。例如，合成RNA Pol II或Pol III启动子能够与细胞类型或上下文特异性启动子交换并且与细胞内信号转导对接，从而实现细胞行为的多步感测和调控。在一些情况下，转录阻遏级联包含两个、三个或四个互连的CRISPR转录阻遏回路(与非逻辑门)。
启动子通常是发起对产物进行编码的核酸的转录的核酸的区域。启动子可以位于对产物进行编码的核酸的转录起始位点上游(例如，0bp到-100bp、-30bp、-75bp或-90bp)，或者转录起始位点可以位于启动子内。启动子的长度可以为100-1000个核苷酸碱基对或50-2000个核苷酸碱基对。在一些实施方式中，启动子的长度为至少2千个碱基(例如，2-5kb、2-4kb或2-3kb)。
在某些实施例中，能够使用Csy4核糖核酸内切酶介导的切割来调控来自RNA polII启动子的gRNA表达。在一些情况下，多个gRNA从由Csy4处理的单个编码区域串联放置。在一些情况下，通过使用修饰的U6驱动的14-nt gRNA盒来实现高开/关比，其中20-nt gRNA靶位点被插入在gRNA的U6启动子位点和主体两者内。此结构形成第二代删除开关，其使得在体外、在体内和离体表达20-nt gRNA时能够完全破坏14-nt gRNA盒。在一些情况下，此类删除开关被表达在体内，例如在基因疗法中作为频繁靶并为致耐受性免疫环境的组织中。适合于在本文描述的合成阻遏子系统中使用的Cas介导的删除开关的附加实施方式在PCT公开No.WO 2019/005856中有所描述，该公开通过引用整体地并入本文。
在一些情况下，对并入在gRNA中的适体靶位点特异性的RNA结合蛋白(例如，MS2、COM或PCP)与诸如例如Kruppel相关盒(KRAB)结构域的阻遏结构域融合。其他合适的阻遏结构域是本领域中已知的，包括但不限于Kruppel相关盒(KRAB)结构域、甲基-CpG(mCpG)结合结构域2(meCP2)、开关独立3转录调节子家族成员A(SIN3A)、组蛋白脱乙酰基酶HDT1(HDT1)、含甲基-CpG结合结构域的蛋白2(MBD2B)的n端截短、蛋白磷酸酶-1的核抑制因子(NIPP1)和异染色质蛋白1(HP1A)。在一些实施方式中，RNA结合蛋白与KRAB和至少一个附加阻遏结构域融合。在一些实施方式中，RNA结合蛋白MS2与KRAB和至少一个附加阻遏结构域融合。在一些实施方式中，MS2与KRAB和HP1A融合。在一些实施方式中，MS2与KRAB和MECP2融合。在一些实施方式中，MS2与MECP2、KRAB和MBD2B融合。在一些实施方式中，MS2与MBD2B和HP1A融合。在一些实施方式中，RNA结合蛋白-阻遏结构域融合由工程化核酸编码。
在一些实施方式中，RNA结合蛋白和至少一个阻遏结构域与多功能Cas核酸酶融合。在一些实施方式中，多功能Cas核酸酶由工程化核酸编码。例如，在某些实施方式中，转录修饰子与多功能Cas核酸酶融合以实现位点特异性转录修饰。各种策略能够用于工程化此类融合分子。在一些情况下，转录调控因子直接与多功能Cas核酸酶融合。在其他情况下，调控因子与诸如MS2噬菌体外壳蛋白的另一RNA结合蛋白融合以便将调控因子募集到Cas/gRNA/DNA复合物。
在一些情况下，多功能Cas核酸酶与抑制阻遏结构域融合。在其他情况下，阻遏是在不使用任何阻遏结构域的情况下而不是通过Cas核酸酶介导的空间位阻来实现的。阻遏结构域能够包含与诸如例如Kruppel相关盒(KRAB)结构域的阻遏结构域融合的RNA结合蛋白(例如，MS2)。在本文中描述了其他合适的阻遏结构域。
优选地在单个扩增子中提供本文描述的合成阻遏系统的组分。然而，在一些情况下，组分可以具有两个或更多个多核苷酸序列的形式。在此类情况下，合成阻遏系统能够包括将包含基于CRISPR的合成阻遏系统的组分的三个盒引入到单个细胞中，其中第一盒包含对多功能Cas9核酸酶的多肽进行编码的核苷酸序列，第二盒包含gRNA构建体，而第三盒对RNA结合蛋白-阻遏结构域融合进行编码。在一些实施方式中，合成阻遏系统包括将包含基于CRISPR的合成阻遏系统的组分的两个盒引入到单个细胞中，其中第一盒包含对与阻遏结构域融合的多功能Cas9核酸酶的多肽进行编码的核苷酸，并且第二盒包含gRNA构建体。在一些实施方式中，一个或多个盒可以是在可诱导启动子的控制下。在一些情况下，将多功能Cas9核酸酶融合到报告多肽或其他感兴趣多肽(例如，治疗蛋白)将是有利的。报告多肽可以是诸如近红外荧光蛋白(iRFP)的荧光多肽(以监测Cas9蛋白动力学)。
在一些情况下，可诱导启动子的激活子由包含诸如在PCT公开No.WO 2019/005856中描述的那些的安全构建体的盒提供，该公开通过引用整体地并入本文。激活子能够介导或促进聚合酶机制向CRISPR-Cas复合物的募集。激活子可以是与诸如VP16转录激活结构域或VP64转录激活结构域的激活结构域融合的锌指蛋白。在某些实施方式中，诸如MS2的正交作用的蛋白结合RNA适体被用于激活子到CRISPR-Cas复合物的适体介导的募集。例如，MS2-VPR融合蛋白能够用于借助于激活子到CRISPR-Cas复合物的适体介导的募集来协助CRISPR-CAS/14-nt gRNA介导的基因激活。在存在诱导子的情况下，表达安全20nt gRNA，从而导致14nt gRNA盒的破坏。合成调节回路可以是工程化多核苷酸。
如本文所使用的，术语“工程化核酸”和“工程化多核苷酸”可互换地使用并且是指已使用本领域中已知的体外技术来设计和制造的核酸。在一些实施方式中，工程化多核苷酸，在本文中也称为回路，是未与生物体的基因组分离的核酸。在一些实施方式中，工程化多核苷酸被引入到细胞、多个细胞、器官或生物体以执行各种功能(例如，细胞的分化、作为细胞内的传感器、对细胞进行编程以作为传感器以及选择性基于细胞的疗法的递送)。
在一些实施方式中，工程化多核苷酸包含一种或多种启动子，诸如可诱导启动子、组成启动子或组织特异性或细胞类型特异性启动子。可诱导启动子允许调节基因表达并且能够通过外源供应的化合物、诸如温度的环境因素或特定生理状态(例如，急性期、细胞的特定分化状态)的存在或者仅在复制细胞时被调节。在一些情况下，细胞类型特异性启动子是生殖细胞特异性启动子，诸如例如磷酸甘油酸激酶2(Pgk2)启动子。可诱导启动子和可诱导系统是已知的并且可从包括但不限于Invitrogen、Clontech和Ariad的各种商业来源获得。已经描述了许多其他系统，并且许多其他系统能够由本领域的技术人员容易地选择。由外源供应的启动子调节的可诱导启动子的实例包括锌可诱导绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)可诱导小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统[WO 98/10088]、蜕皮激素昆虫启动子[No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)]、四环素可阻遏系统[Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)]、四环素可诱导系统[Gossen等人,Science,268:1766-1769(1995)，另外参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998)]、RU486-可诱导系统[Wang等人,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)和Wang等人,Gene Ther.,4:432-441(1997)]和雷帕霉素可诱导系统[Magari等人,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997)]。在这种上下文中可能有用的仍然其他类型的可诱导启动子是通过特定生理状态例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或者仅在复制细胞时调节的可诱导启动子。控制元件的非限制性实例包括启动子、激活子、阻遏子元件、绝缘子、沉默子、反应元件、内含子、增强子、转录起始位点、终止信号、连接子和聚(A)尾巴。在本文中设想了此类控制元件的任何组合(例如，启动子和增强子)。
在一些实施方式中，启动子是肺特异性启动子。合适的肺特异性启动子是本领域中已知的并且包括但不限于白蛋白启动子和人α-1抗胰蛋白酶启动子。在一些实施方式中，启动子是血液特异性启动子。在一些实施方式中，启动子是骨髓特异性启动子。在一些实施方式中，启动子是巨噬细胞特异性启动子，诸如CD11B。在一些实施方式中，启动子是B细胞特异性启动子，诸如CD19。在一些实施方式中，启动子是树突细胞特异性启动子，诸如CD11C。在一些实施方式中，启动子是T细胞特异性启动子，诸如CD4和CD8。
CRISPR系统属于具有不同重复模式、基因集和物种范围的不同类。CRISPR酶通常是I型或III型CRISPR酶。CRISPR系统有利地衍生自II型CRISPR系统。II型CRISPR酶可以是任何Cas酶。术语“Cas”和“CRISPR相关Cas”在本文可互换地使用。Cas酶可以是任何天然存在的核酸酶以及任何嵌合体、突变体、同源物或直系同源物。在一些实施方式中，CRISPR系统的一个或多个元件衍生自包含内源CRISPR系统的特定生物体，诸如化脓链球菌(SP)CRISPR系统或金黄色葡萄球菌(SA)CRISPR系统。CRISPR系统是II型CRISPR系统，并且Cas酶是Cas9或催化非活性的Cas9(dCas9)。Cas蛋白的其他非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4,Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、它们的同源物或它们的修饰版本。在Haft等人(2005)Computational Biology,PLoS Comput.Biol.1:e60中呈现了Cas蛋白家族的全面回故。迄今为止已描述了至少41个CRISPR相关(Cas)基因家族。
应理解，如本文所描述的CRISPR-Cas系统是非天然存在于细胞中，即被工程化或外源于细胞。已经在细胞中引入了如本文所指的CRISPR-Cas系统。用于在细胞中引入CRISPR-Cas系统的方法是本领域中已知的，并且在本文中别处进一步描述。根据本发明的包含CRISPR-Cas系统或已引入CRISPR-Cas系统的细胞包含或能够表达CRISPR-Cas系统的个别组分以建立能够修饰(诸如切割)靶DNA序列的功能CRISPR复合物。因此，如本文所指的，包含CRISPR-Cas系统的细胞可以是包含CRISPR-Cas系统的个别组分以建立能够修饰(诸如切割)靶DNA序列的功能CRISPR复合物的细胞。或者，如本文所指的，并且优选地，包含CRISPR-Cas系统的细胞可以是包含对CRISPR-Cas系统的个别组分进行编码的一个或多个核酸分子的细胞，该CRISPR-Cas系统能够在细胞中表达以建立能够修饰(诸如切割)靶DNA序列的功能CRISPR复合物。
在一些实施方式中，可以将如本文所描述的基于合成CRISPR的阻遏系统引入到生物系统(例如，病毒、原核或真核细胞、合子、胚胎、植物或动物，例如非人动物)中。原核细胞可以是细菌细胞。真核细胞可以是例如真菌(例如，酵母)、无脊椎动物(例如，昆虫、蠕虫)、植物、脊椎动物(例如，哺乳动物、禽类)细胞。哺乳动物细胞可以是例如小鼠、大鼠、非人灵长类动物或人细胞。细胞可以是任何类型、组织层、组织或起源器官的。在一些实施方式中，细胞可以是例如免疫系统细胞，诸如淋巴细胞或巨噬细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、上皮细胞或内皮细胞。细胞可以是细胞系的成员，该细胞系可以是能够在培养物中无限地增殖的永生化哺乳动物细胞系。
为了实现多个基因的内源阻遏，在多个gRNA中包含阻遏结构域。在一些情况下，gRNA还包含与某些蛋白质(分别为MS2外壳蛋白、COM或PCP)结合的一种或多种适体，诸如MS2、COM或PP7。阻遏结构域与适体结合蛋白融合，并且因此，将被募集到Cas9/gRNA复合物以实现内源基因的转录的阻遏。PP7是噬菌体假单胞菌的RNA结合外壳蛋白。像MS2一样，它结合特定RNA序列和次级结构。PP7 RNA识别基序与MS2的RNA识别基序不同。因此，能够复用PP7和MS2以同时地在不同的基因组位点处介导不同的效应。
在一些情况下，SMASh或另一降解/去稳定化结构域与本文描述的Cas9核酸酶或其他蛋白融合物融合。通常，去稳定化结构域是在不存在配体的情况下不稳定并降解、但是其稳定性通过与高亲和力细胞可渗透配体结合来挽救的小蛋白结构域。去稳定化结构域与感兴趣蛋白的遗传融合导致整个融合的降解。为去稳定化结构域添加配体保护融合体免于降解并且以这种方式，将配体相关稳定性添加到感兴趣蛋白。
在一些情况下，采用病毒或质粒载体系统来递送本文描述的基于合成CRISPR的阻遏系统。优选地，载体是病毒载体，诸如慢病毒或杆状病毒或优选腺病毒/腺相关病毒载体，但是递送的其他手段是已知的(诸如酵母系统、微囊泡、基因枪/将载体附着到金纳米粒子的手段)并且被提供。在一些实施方式中，这些病毒或质粒载体中的一种或多种可以经由脂质体、纳米粒子、外来体、微囊泡或基因枪来递送。在某些优选的实施方式中，基于CRISPR的阻遏系统或它们的组分(例如，gRNA)被包装以用于在一种或多种病毒递送载体中递送给细胞。合适的病毒递送载体包括但不限于腺病毒/腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和疱疹单形病毒1(HSV-1)载体。例如，能够将基于合成CRISPR的阻遏系统引入到一个或多个疱疹单形扩增子载体中。
在一些实施方式中，将基于合成CRISPR的阻遏系统引入到一种或多种AAV载体中。在一些实施方式中，AAV载体是AAV2/1载体。如本文所使用的，“AAV2/1载体”是指包括AAV2反向末端重复序列及AAV1 rep和cap基因的重组腺相关病毒载体。其他合适的AAV载体是本领域中已知的，诸如但不限于AAV1。
病毒载体和病毒粒子是用于基因疗法的常用病毒递送平台。因此，为了更快的临床转化，本文描述的基于CRISPR的遗传回路能够使用嵌入式删除开关来构建并且并入到疱疹单形扩增子载体中。优选地，单个运载体载体用于实现所有合成遗传组分到靶细胞的转染。在不束缚于任何特定理论或动作模式的情况下，据信通过添加仅切割20-nt gRNA来控制CRISPR功能性的能力由于gRNA的小DNA占位面积和病毒粒子的有限报酬负载能力而提供理想的安全删除开关机制。在一些情况下，疱疹单形病毒(HSV)递送系统被用于递送工程化多核苷酸。在其他情况下，非病毒粒子能够被用于递送。例如，CRISPR基因回路的受控空间转染和/或破坏是通过在具有大有效载荷容量(150kb)并且能够感染多个靶细胞的HSV-1扩增子载体中组装和包装所有基于CRISPR的遗传回路元件来实现的。
在另一方面中，本文提供的是共病毒策略，其中方法包括将两个AAV载体引入到单个细胞中。第一载体携带(i)对Cas9核酸酶的融合多肽进行编码的核苷酸序列，和(ii)被配置用于如本文所描述的基因调控的gRNA。在一些情况下，Cas9核酸酶与报告多肽融合。报告多肽可以是诸如近红外荧光蛋白(iRFP)的荧光多肽(以监测Cas9蛋白动力学)。第二载体是“安全载体”并且携带如PCT公开No.WO 2019/005856中所描述的20-nt可控gRNA，该公开通过引用整体地并入本文。为了确保由第一病毒携带的Cas9-iRFP融合多肽的表达仅在其中引入有两个AAV载体的细胞中发生，融合多肽的表达是在可诱导启动子的控制下。在一些情况下，可诱导启动子的激活子由安全病毒携带。激活子能够介导或促进Pol II机制到CRISPR-Cas复合物的募集。激活子可以是与诸如VP16转录激活结构域或VP64转录激活结构域的激活结构域融合的锌指蛋白。在某些实施方式中，诸如MS2的正交作用的蛋白结合RNA适体被用于激活子到CRISPR-Cas复合物的适体介导的募集。例如，第二病毒(安全病毒)能够携带借助于激活子到CRISPR-Cas复合物的适体介导的募集来协助CRISPR-CAS和14-ntgRNA介导的基因激活的MS2-VPR融合蛋白。在存在诱导子的情况下，表达安全20nt gRNA，从而导致14nt gRNA盒的破坏。
本文描述的基于CRISPR的遗传回路的应用包括但不限于用于治疗各种细胞类型的慢性和急性病症的基于体内CRISPR的精密基因疗法；CRISPR细胞分类器的平台能够被应用于各种细胞、组织或器官以进行各种治疗和/或预防应用；以及使用CRISPR激活子和阻遏子的内源基因的体内询问，包括CRISPR介导的内源基因激活。作为实例，治疗应用包括但不限于治疗受试者的败血病、预防或治疗受试者的免疫反应以及治疗华氏巨球蛋白血症。
在某些方面中，本文提供的是用于治疗败血病的方法、用于治疗或预防受试者的免疫反应的方法以及用于治疗华氏巨球蛋白血症的方法。本文描述的治疗或预防方法包括向有需要的受试者施用药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统或对本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统进行编码的多核苷酸和载体。如本文所使用的，术语“药物组合物”是指适合于向哺乳动物施用的化学或生物学组合物。此类组合物通常包括活性剂和药学上可接受的运载体。如本文所使用的，术语“药学上可接受的运载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散体介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。也能够将补充活性化合物并入到组合物中。适于此类治疗应用的组合物的实例包括用于肠胃外、皮下、经皮、皮内、肌内、冠状动脉内、心肌内、腹膜内、静脉内或动脉内(例如，可注射)或气管内施用的制剂，诸如无菌混悬剂、乳剂和气雾剂。在一些情况下，适于治疗应用的药物组合物可以与诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖等的一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或运载体混合。例如，能够将本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物作为包含运载体溶液的药物组合物施用于受试者。
制剂可以是为口服、直肠、鼻、全身、局部或透粘膜(包括颊、舌下、眼、阴道和直肠)和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、动脉内、皮内、腹膜内、鞘内、眼内和硬膜外)施用而设计或打算的。通常，水和非水液体或乳膏制剂通过肠胃外、口服或局部路线递送。在其他实施方式中，组合物可以作为适合于通过任何路线例如口服、局部、颊、舌下、肠胃外、气雾剂、诸如皮下积存或腹膜内或肌肉内积存的积存来施用的水或非水液体配方或固体配方而存在。在一些情况下，将药物组合物冻干。在其他情况下，取决于所需施用和制备的路线，如本文所提供的药物组合物含辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、调味剂、颜料等。可以根据常规药学实践(参见例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,20th edition,2000,ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)来配制药物组合物。对于静脉内施用，合适的运载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor
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(BASF，帕西帕尼，新泽西州，美国)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，用于肠胃外施用的组合物必须是无菌的并且应该被配制以易于注射。组合物在制造和储存的条件下应该是稳定的，并且必须避免受到诸如细菌和真菌的微生物污染。
在一些实施方式中，用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液能够包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整紧张性的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。pH能够用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱来调整。制剂能够被包封在由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。为了患者或治疗医师的方便，能够在含有用于治疗过程(例如，7天的治疗)的所有必要的设备(例如，药小瓶、稀释剂小瓶、注射器和针头)的试剂盒中提供配料配方。
能够通过将所需量的活性化合物与所需的上面枚举的成分的一种或组合一起并入在适当的溶剂中、然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入到无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含基本分散体介质和来自上面枚举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这能够从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何附加所需成分的粉末。
优选的路线可以随例如受试者的病理状况或年龄或受试者对疗法的反应或适于环境的反应而变化。配方也能够通过两种或更多种路线施用，其中递送方法是基本上同时的或者它们可以是基本上顺序的，而在将组合物施用于受试者的时间上有很少或没有重叠。
用于初始施用和另外剂量或者用于顺序施用的合适方式也是可变的，可以包括初始施用，后面是顺序施用，但是然而，可以由技术人员根据本公开、本文引用的文档和本领域中的知识探知。
在一些实施方式中，本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物是使用输注、局部应用、外科手术移植或植入来施用于有需要的受试者。在示例性实施方式中，施用是全身的。在此类情况下，能够在被适配用于静脉内施用于受试者的药物组合物中将本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物提供给有需要的受试者。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水缓冲液中的溶液。此类缓冲液和稀释剂的使用是本领域中公知的。在必要时，组合物也可以包含减轻注射位点的任何疼痛的局部麻醉剂。通常，成分被分开地供应或以单位剂量形式混合在一起，例如，作为诸如指示活性剂的量的安瓿瓶的密闭容器中冷冻保存的浓缩物。在组合物将通过输注施用的情况下，它能够用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶分配。在通过注射施用组合物的情况下，能够提供无菌注射用水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合成分。在一些情况下，在施用之前将本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物冻干。
在一个实施方式中，本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物通过静脉施用。例如，本技术的试剂可以经由快速静脉推注注射来施用。在一些实施方式中，本技术的试剂是作为恒定速率静脉内输注施用的。
本技术的试剂也可以口服、局部地、鼻内、肌内、皮下或透皮施用。在一个实施方式中，透皮施用是通过离子电渗疗法，其中带电的组合物通过电流跨皮肤递送。
其他施用路线包括颅内、脑室内或鞘内。脑室内是指施用到大脑的脑室系统中。鞘内是指施用到脊髓的蛛网膜下的空间中。因此，在一些实施方式中，脑室内或鞘内施用被用于影响中枢神经系统的器官或组织的那些疾病和状况。
对于全身、脑室内、鞘内、局部、鼻内、皮下或透皮施用，本技术的试剂的配方可以利用常规的稀释剂、运载体或赋形剂等，诸如本领域中已知用于递送本技术的试剂的那些。例如，配方可以包含以下项中的一种或多种：稳定剂、表面活性剂，例如非离子表面活性剂，以及任选地盐和/或缓冲剂。本技术的试剂可以以水溶液的形式或以冻干形式递送。
治疗有效量的本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物被施用于有需要的受试者。有效剂量或量是足以实现有益或所需的临床结果的量。关于本发明的方法，能够在一种或多种施用中施用的有效剂量或量是本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物的足以在被施用有试剂的受试者中引出治疗效果的量。本文描述的剂量范围是示例性的并且不旨在为限制性的。能够通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定本技术的试剂的剂量、毒性和治疗功效，例如，以用于确定LD50(50％的人群致死的剂量)和ED50(在50％的人群中治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数并且能够将它表达为LD50/ED50之比。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据能够用在配制用于在人中使用的剂量的范围中。此类化合物的剂量优选地位于包括具有很少或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。取决于所采用的计量形式和所利用的施用的路线，剂量可以在此范围内变化。对于本文描述的方法中使用的本技术的任何试剂，能够最初从细胞培养测定估计治疗有效的剂量。能够在动物模型中配制剂量以达到包括如在细胞培养中所确定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息能够用于更准确地确定在人中有用的剂量。血浆中的水平可以例如通过高性能液相色谱法来测量。
通常，足以达到治疗或预防效果的本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物的有效量的范围从约1x109基因组拷贝(GC)/千克(kg)体重到约1x1014GC/kg体重。在一些实施方式中，剂量范围将为每天约1x109GC/kg体重到每天约1x1014GC/kg体重。例如，能够每天、每两天或每三天或在每周、每两周或每三周1x109GC/kg体重到约1x1014GC/kg体重的范围内施用介于约1x109GC/kg体重与约1x1014GC/kg体重之间的剂量。在一个实施方式中，本技术的试剂的单剂量范围为1x109GC/kg体重到约1x1014GC/kg体重。示例性治疗方案要求每天施用一次或每周施用一次。在治疗应用中，有时需要以相对短的间隔使用相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止为止，或者直到受试者示出了疾病的症状的部分或完全缓解为止。此后，能够给患者施用预防性方案。优化剂量的时间表以维持靶组织处的治疗浓度，诸如通过每天或每周一次施用，但是还包括连续施用(例如，肠胃外输注或透皮应用)。
技术人员将领会，某些因素可以影响有效地治疗受试者所需要的剂量和时间，包括但不限于疾病或紊乱的严重性、先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及其他疾病的存在。此外，用治疗有效量的本文描述的治疗组合物治疗受试者能够包括单一治疗或一系列治疗。
在一些方面中，本文提供的是用于治疗受试者的败血症的方法。治疗败血症的方法包括向患有败血症或处于败血症风险下的受试者施用治疗有效量的本文描述并且对MyD88的阻遏特异性的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物。由于其在先天和适应性免疫中的作用，MyD88的阻遏将导致与败血病相关联的异常免疫反应减少。与治疗之前的与免疫有关的标志物的水平比较，用本文描述的组合物治疗的受试者可能在与免疫有关的标志物Icam-1、Tnfα、Ncf和Il6、Ifn-α、Ifn-β、Ifn-γ及Stat4的水平方面降低。在一些实施方式中，将与免疫有关的标志物Icam-1、Tnfα、Ncf和Il6、Ifn-α、Ifn-β、Ifn-γ及Stat4的水平与内部或外部对照组或参考标准进行比较。与治疗之前的细胞因子的水平比较，用本文描述的组合物治疗的受试者可能在肺和血清细胞因子的水平方面降低。与在治疗之前测量的水平比较，用本文描述的组合物治疗的受试者可能在血清乳酸水平方面降低。
在一些方面中，本文提供的是用于在接受腺相关病毒载体基因疗法或基于CRISPR的基因疗法的受试者中治疗或防止不利免疫反应的方法。在受试者中防止不利免疫反应的方法包括在向受试者施用AAV载体疗法之前向受试者施用治疗有效量的本文描述并且对MyD88的阻遏特异性的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物。可以在AAV载体疗法之前或与之同时施用本文描述的组合物。在一些实施方式中，受试者已接受或将接受AAV载体疗法治疗的多个疗程并且本文描述的组合物在AAV载体治疗之前、紧接其之后或与之同时地被施用。与在接受了AAV载体疗法但是未接受本文描述并且对MyD88的阻遏特异性的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物的受试者中观察到的与免疫有关的标志物的水平比较，用本文描述的组合物治疗的受试者可能在与免疫有关的标志物Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、Ifn-γ和Stat4的水平方面降低。与在接受了AAV载体疗法但是未接受本文描述并且对MyD88的阻遏特异性的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物的受试者中观察到的与免疫有关的标志物的水平比较，用本文描述的组合物治疗的受试者可能在肺和血液血清细胞因子的水平方面降低。
在一些实施方式中，治疗方法包括监测选自由Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、Ifn-γ和Stat4组成的组的至少一种与免疫有关的标志物的水平，以及向受试者重新施用本文描述并且对患者的MyD88特异性的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物，直到至少一种标志物的水平减小或返回到在受试者接受AAV载体治疗之前或在受试者患有败血症之前的水平。
在一些方面中，本文提供的是用于治疗华氏巨球蛋白血症的方法。华氏巨球蛋白血症是一种由未加抑制的淋巴细胞增殖和巨球蛋白产生表征的非霍奇金淋巴瘤。Myd88突变L265P通过NF-κB信号传导支持恶性生长并且其抑制与癌细胞的减小存活率相关联。用于在受试者中治疗华氏巨球蛋白血症的方法包括向有需要的受试者施用本文描述并且对MyD88的阻遏特异性的基于CRISPR的合成阻遏系统的组合物。在一些实施方式中，本文描述的基于CRISPR的合成阻遏系统阻遏内源突变体MyD88表达并且被设计为使用同源性定向修复(HDR)来矫正L265P突变。在一些实施方式中，组合物附加地包括对MyD88的L265基因座附近的Cas核酸酶切割特异性的gRNA并且包括对在L265基因座处正确的野生型序列进行编码的HDR模板。
为了可以更容易地理解本文提供的组合物、方法和系统，定义了某些术语：
如本说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用。除非另外陈述，否则在本文中对“或”的任何引用旨在包含“和/或”。
如本文所使用的术语“包含有”、“包含”和“由...组成”与“包括有”、“包括”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的，而且不排除附加非叙述的成员、元件或方法步骤。本文使用的措词和术语用于描述的目的，而不应该被认为是限制性的。“包括有”、“包含有”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变化的使用意在包含此后列举的项目和附加项目。在权利要求中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”的序数术语来修饰权利要求要素本身不表示一个权利要求要素对方法的行为被执行的另一或时间次序的任何优先权、优先或次序。序数术语仅仅用作将具有某个名称的一个权利要求要求与具有相同名称(但是用于序数术语的用途)的另一权利要求要素区分开以区分这些权利要求要素的标签。
如本文所使用的，术语“合成”和“工程化”可互换地使用并且是指已经由男人的手操纵的方面。
如本文所使用的，“修饰”(“修饰”)一个或多个靶核酸序列是指改变(一个或多个)靶核酸序列的全部或一部分并且包括切割、引入(插入)、替换和/或删除(去除)靶核酸序列的全部或一部分。能够使用本文提供的方法来完全地或部分地修饰靶核酸序列的全部或一部分。例如，修饰靶核酸序列包括用一个或多个核苷酸(例如，外源核酸序列)替换靶核酸序列的全部或一部分或者去除或删除靶核酸序列的全部或一部分(例如，一个或多个核苷酸)。修饰一个或多个靶核酸序列也包括将一个或多个核苷酸(例如，外源序列)引入或插入到一个或多个靶核酸序列中(内)。
除非另外定义，否则本公开中使用的所有术语，包括技术术语和科学术语，具有如由本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
尽管本描述涉及某些方面或实施方式，但是此类方面或实施方式在性质上是说明性的而非详尽的。在回故本公开后，本领域的普通技术人员将容易地认识和领会，许多其他可能的变化或替代配置或方面是可能的并且被设想在本公开的范围内。
实例1
本文描述的实施方式证明了使用基于CRISPR的合成阻遏系统来在体外和在体内阻遏内源MyD88表达。
本文描述的实施方式采用先前报告的CRISPR多功能性的观念(参见Dahlman,J.E.等人"Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9nuclease,"Nature biotechnology 33,1159(2015)和Kiani,S.等人"Cas9 gRNAengineering for genome editing,activation and repression,"Nature methods 12,1051(2015)，其中的每一个通过引用并入本文)。在单个Cas9蛋白的核酸酶依赖性和非依赖性功能之间切换的能力提供了将基因编辑与表观遗传操纵组合的令人兴奋的可能性。发明人先前曾报告了，从5’端截短引导RNA(gRNA)使得能够将核酸酶感受态Cas9蛋白应用于基因的转录调控。Liao等人最近证明了此系统在体内对基因的转录激活的效用。(Liao、H.-K.等人"In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigeneticmodulation,"Cell 171,1495-1507.e1415(2017))。然而，此构思对转录阻遏或同时DNA裂解/转录调控并在临床相关条件下的广泛效用仍有待检查。本公开描述了在基于CRISPR的体内疗法的安全和可控性的上下文中利用此观念的技术。
髓样分化初级反应88(MyD88)是先天和适应性免疫反应中的关键节点，从而作为包括Toll样受体(TLR)和白介素(IL)-1家族信号转导的许多信号传导途径的必要的衔接分子。考虑到MyD88信号传导在先天和适应性免疫中的中心作用，发明人着手确定发明人是否能够通过体内调节内源Myd88水平来实现合成免疫调控。
发明人先前报告了通过将一组调控因子直接融合到催化死亡的Cas9蛋白(MeCP2、MBD2或HP1a)在体内开发的增强基于CRISPR的转录阻遏子。发明人首先设计出实验来根据我们先前报告的候选物确定阻遏结构域，所述候选物可能在与MS2外壳蛋白(这里称为MS2)融合并且通过gRNA适体结合募集到CRISPR复合物时导致高效的转录阻遏(图3A)。对人胚胎肾293(HEK293FT)细胞中的靶基因集的定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析确立了MS2-HP1aKRAB[异染色质蛋白1(HP1a)-Krüppel相关盒(KRAB)]跨发明人测试的基因实现高效的阻遏(图3B)。
为了在体内翻译这些发现，发明人着手将核酸酶感受态化脓链球菌(Sp)-Cas9蛋白和截短14nt gRNA用于Myd88体内的转录阻遏。发明人首先检查了体内内源小鼠Myd88水平的MS2-HP1aKRAB介导的阻遏并且将效率与常用的基于KRAB的转录阻遏进行比较。发明人合理地设计了靶向在内源小鼠Myd88基因座中的TATA盒区域上游100bp内的两个14nt gRNA或者使用了先前报告的非靶向模拟gRNA作为对照组(图1A)。Myd88的qRT-PCR证明了gRNA的体外功能性以及MS2-HP1aKRAB在内源Myd88的阻遏中的优越性(图1B)。
为了在体内测试这些阻遏子，发明人实行通过在腺相关病毒(AAV)载体内包装gRNA和MS2阻遏盒来递送。AAV血清型已用于体内递送CRISPR，最常见的血清型是AAV9，其对许多实质细胞群具有高亲和力。这里，发明人采用了AAV2/1，其是由AAV2反向末端重复序列及AAV1 Rep和Cap基因组成的重组AAV载体。AAV1已示出在免疫系统的组分以及诸如树突细胞和内皮细胞的非实质细胞的转导中有效。此外，AAV1衣壳能够诱导MyD88信号传导作为在宿主中针对AAV的免疫途径的一部分。我们对AAV2/1组织亲和力的评估揭示了血液、肺和骨髓中的最高表达(图4)。随后，发明人执行AAV/Myd88 gRNA或对照AAV/Mock gRNA随MS2-HP1aKRAB或MS2-KRAB盒到Cas9核酸酶转基因小鼠的全身递送(图1C)。为了测试Myd88的CRISPR介导的转录阻遏是否能够对针对AAV的免疫反应产生生理相关效应，发明人具体地选取了表达Cas9的小鼠，因为它们使得我们能够消除与Cas9的递送相关联的潜在混杂效应。在注射之后三周，收集血液、肺和骨髓并且通过qRT-PCR来评估Myd88表达(图1D)。与未注射对照组比较，AAV载体递送跨本发明人测试的不同组织导致Myd88增加。与模拟gRNA治疗组比较，用CRISPR治疗以用HP1aKRAB阻遏内源Myd88导致血液(～84％)、肺(75％)和骨髓(63％)中的Myd88的水平显著降低，与AAV2/1对这些组织的高亲和力一致。单独施用KRAB结构域导致Myd88在肺(52％)、血液(59％)和骨髓(34％)中的阻遏不太显著，同时在被测动物当中变异性稍微较高(图1D和表1)。
表1：眼眶后注射AAV 3周后在肺、血液和骨髓中通过qRT-PCR评估Myd88、Icam-1和Tnfa的阻遏水平。相对于通用对照组量化基因表达倍数变化。阻遏水平被报告为每个基因的AAV-Myd88组的倍数变化除以AAV-Mock组的倍数变化的百分比。NC＝无变化
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为了评估阻遏在更改下游基因调节网络中的能力，发明人评价了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的水平，两个信号传导元素由MyD88信号传导途径直接调控。用MS2-HP1a-KRAB进行Myd88靶向导致跨多个组织的ICAM-1和TNFα表达的显著降低，然而用MS2-KRAB靶向不会导致类似的一致效应(图1E-1F和表1)。
为了与MS2-KRAB比较对MS2-HP1aKRAB系统的阻遏效率执行系统评估，发明人对用这些构建体治疗的小鼠的骨髓执行了下一代RNA测序。MS2-HP1aKRAB治疗的小鼠与MS2-KRAB治疗的小鼠比较表达了较低的MyD88水平(图5A)，其伴随有诸如Il1β的下游信号传导途径的变化。值得注意的是，GO富集分析揭示了Myd88-MS2-HP1aKRAB治疗的小鼠具有参与针对外来生物和细菌的免疫和防御反应的信号传导途径的显著向下调节，所述信号传导途径是与Myd88功能相关联的途径(图5B)。类似地，Reactome数据库将TLR途径揭示为在存在MS2-HP1aKRAB的情况下向下调节的高度重要的途径之一(图5C)。此证据表明在体内使用MS2-HP1a KRAB阻遏子对Myd88及其下游免疫途径的调控是最有效的。
有趣的是，对差异表达基因的火山绘图将免疫球蛋白G1和G2(Ighg1和Ighg2b)的重链及其他与免疫球蛋白有关的重链和轻链基因的恒定区域揭示为相对于KRAB用HP1aKRAB向下调节最大(图1G)。
现有研究证明了病毒DNA刺激TLR(即，TLR9)，其进而激活MyD88并且发起下游信号传导事件，从而导致针对AAV的适应性免疫和抗体产生。鉴于现有证据和所观察到的免疫球蛋白途径的阻遏，发明人问在Myd88阻遏组中的AAV特异性体液反应是否减小。发明人测量了针对AAV1衣壳的免疫球蛋白G(IgG)反应。与未注射对照组比较，发明人在AAV/Mock治疗的动物中检测到针对AAV1的血浆IgG2a水平的11倍增加。然而，接受了AAV/Myd88的那些人具有针对AAV-1的显著较低的(60％)血浆IgG2a(图1H)。这种发现呈现了用固有地适于执行并发基因编辑(核酸酶感受态CRISPR)的工具来针对AAV调控体液免疫(在当前基于AAV的基因疗法中存在重大挑战)的令人兴奋的机会。
在为MyD88的转录调控标识了更有效的CRISPR阻遏子后，发明人接下来问这种阻遏是否足以调控下游宿主反应并且当例如在败血病中存在扩增的系统转录反应时给与保护。由于抗药性的出现和患有慢性疾病的患者的渐高长寿，败血症是紧迫的医学问题。此外，由于败血病而导致的高死亡率仍然是在战场上创伤之后的医学挑战，从而突出对新颖预防策略的需要。
发明人用AAV/Myd88-Ms2-HP1aKRAB或AAV/Mock预治疗Cas9小鼠并且三周以后使它们经受全身脂多糖(LPS)(来自大肠杆菌0127:B8)治疗。在LPS治疗之后六小时，发明人收获了肺、血液和骨髓并且评估了Myd88和主要炎症细胞因子的转录水平(图2A)。与AAV/Mock治疗的小鼠比较，发明人观察到Myd88在肺(61％)、血液(80％)和骨髓(76％)中的显著阻遏(图2B)。响应于LPS，Myd88阻遏防止了诸如Icam-1、Tnfα、Ncf和Il6、Ifn-α、Ifn-β、Ifn-γ和Stat4的直接或间接在Myd88信号传导下游的各式各样炎症和与免疫有关的标志物的向上调节(图2C-2D、图6和图7)。使用定量基于ELISA的化学发光量测定对血清和肺细胞因子水平的分析揭示了Myd88阻遏的小鼠中的细胞因子水平较低(图2E)。附加地，当小鼠在LPS暴露之前用AAV/Myd88阻遏盒预治疗时，血清乳酸水平(与败血病和组织损坏相关联的全身标志物)显著地降低，从而指示减小的全身损伤(图2F)。
接下来，发明人通过靶向Myd88启动子的不同区域探索了Myd88阻遏水平。发明人构建了靶向在转录起始位点上游的100bp内的gRNA(集2)并且与先前gRNA集(集1)比较检测到优异的体外功效(图8A-8B)。令人惊讶地，当与先前gRNA集比较时，新的Myd88 gRNA在肝中导致优异的阻遏并且在血液、肺和骨髓中导致Myd88的显著但不太明显的阻遏(图8C)。在LPS损伤之后也观察到这个(图2G)，从而证明内源启动子内的gRNA靶位点的潜在器官和细胞类型特异性效应。接下来，发明人问这种基于CRISPR的MyD88阻遏是否足以在LPS诱导的损坏之后诱导病理生理相关的表型。对肝的全身炎症反应和组织损伤的血清标志物的分析表明了用CRISPR-Set 2预治疗减轻LPS注射的有害效应(图2H)。特别地，高密度脂蛋白(HDL)已示出在LPS治疗之后增加以消除全身LPS来保护组织免受损坏并且已与MyD88信号传导相关联。据此，发明人发现了LPS在模拟治疗组中而不是在MyD88阻遏下诱导了HDL、低密度脂蛋白(LDL)和胆固醇的升高。另外，MyD88阻遏抑制了丙氨酸转氨酶(ALT)、肝细胞损坏的标志物和血液尿素氮(BUN)、急性肾损伤的标志物的升高，这进一步表明Myd88阻遏能改善紧跟败血症之后的肝和全身组织损坏(图2H和图9)。最后，发明人示出了MS2-HP1aKRAB超级阻遏用于在体外和在体内合成控制诸如CXCR4的其他免疫相关基因座的可扩展性(图10A-10C)。
总之，发明人提供了用于针对内源Myd88使用新开发的基于CRISPR的转录超级阻遏子在体内合成控制免疫反应的组合物、系统和方法。发明人示出了此系统在调控下游信号传导的层时是有效的并且能够在体内产生可见的保护表型。此观念在使用已知来靶向体内较小的细胞群(例如非实质细胞)的不太常见的AAV血清型(AAV2/1)来递送的情况下是尤其有吸引力的。
发明人证明了，用AAV/CRISPR靶向Myd88基因座产生了针对AAV1的较少IgG2a并且调控了与关于在Myd88-/-动物中产生抗原特异性IgG2a反应的失败的现有报告一致的一般免疫球蛋白表达模式。附加地，示出了AAV-1能够靶向树突状细胞，并且这些细胞中的Myd88信号传导对针对AAV测定适应性免疫反应是重要的。鉴于基于AAV的临床基因疗法涉及的常见挑战，使用基于CRISPR的合成阻遏子来控制Myd88水平的能力具有重要意义，因为此途径已被证明为针对许多AAV血清型而非仅仅体内AAV2/1诱导体体液免疫的关键节点。在这种研究中采用核酸酶感受态Cas9和截短gRNA为对于靶向基因编辑同时应用CRISPR同时调控免疫反应打开了机会，这使CRISPR介导的基因阻遏变得优于先前使用的系统，诸如shRNAs。
此策略在针对(LPS)诱导的内毒素血症调控全身炎症反应时也是有效的。Myd88的CRISPR介导的内源阻遏防止了各式各样炎症标志物的向上调节并且给与了保护表型。此观念有望将基于CRISPR的转录调节用作为用于调控炎症状况并且保护免受败血病的可容易编程的工具。最后，在Myd88(L265P)中激活体细胞突变参与华氏巨球蛋白血症，即一种由未加抑制的淋巴细胞增殖和巨球蛋白产生表征的非霍奇金淋巴瘤。Myd88突变通过NF-κB信号传导来支持恶性生长并且其抑制作用与癌细胞的减小存活率相关联。如这种研究所示全身阻遏Myd88(和CXCR4)的能力因此能够为此组患者呈现令人兴奋的治疗机会。
方法
MS2融合阻遏子—为了构建MS2融合的转录阻遏子，从在我们的组中先前发布的载体扩增特定感兴趣结构域，随后将其克隆到pcDNA3-MS2-VP64主链(Addgene质粒ID：79371)10。pcDNA3-MS2-VP64载体用NotI和AgeI消化以去除VP64结构域，然后经由Gibson组装方法将经扩增的阻遏子克隆到此主链中。
U6-gRNA-MS2质粒—为了生成这些质粒，经由金门反应将gRNA的14bp或20bp间隔子插入到BbsI位点处的sgRNA-MS2克隆主链(Addgene质粒ID：61424)中。在下面列举了所有gRNA序列。
AAV载体—紧跟将gRNA克隆到U6-sgRNA-MS2主链之后，从此载体扩增U6-gRNA编码区域，并且使用金门反应将其插入在网关进入载体内。使用相同的方法，将阻遏子结构域和shef1a启动子克隆到网关进入载体中。所设计的安全开关sgRNA序列被合成为gblock(集成DNA技术)并且插入到用HindIII和SphI消化的网关进入载体(Addgene质粒ID#62084)中。经由LR反应(Invitrogen)将所有这些组分进一步亚克隆到AAV主链中制成了AAV载体。在下面列举了所有引物和gRNA序列。
AAV包装和纯化—构建的AAV载体被SmaI消化物消化以在病毒产生之前测试ITR区域的完整性。验证的AAV载体用于通过
Figure BDA0003151592740000221
Biotech,LLC来生成AAV2/1-Myd88、AAV2/1-CXCR4、AAV2/DJ-TTN、AAV2/DJ-Cas9和AAV2/1-Cas9。使用线性化亲本AAV载体来对照标准曲线以1.5E+13GC/ml经由实时SYBR Green PCR量化病毒滴度。
AVV2/1-Myd88(SEQ ID NO：64)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTTGATATCAACTTTGTATAGAAAAGTTTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCTGCGGGTCCTGCACTGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAAGCTTCGGGAGGGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGACCCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGACAACTTTGTATACAAAAGTTGAGGCTGGATCCCGGTACCCTCGACACCTGCTGACAGGTCCACCATGGGACCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGGCGGCCGCTGACTACAAGGATGACGACGATAAATCTAGAATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGATCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGGCGCCTGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCCACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAAGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACGAGGCCAGCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGTGGTGGAGGAAGTGGCGGGTCAGGGTCGAGCCCCAAGAAAAAACGGAAAGTGGAGGCATCAATGAAGGAGGGAGAAAACAACAAACCCAGGGAGAAAAGTGAAGGGAATAAGAGAAAAAGCTCCTTCTCTAACAGTGCAGACGATATCAAGTCCAAGAAAAAGCGGGAGCAGTCTAATGACATTGCTAGGGGCTTCGAGAGAGGACTGGAGCCAGAAAAAATCATTGGGGCAACCGACAGCTGCGGCGATCTGATGTTTCTCATGAAATGGAAGGACACAGATGAGGCCGACCTGGTGCTCGCCAAAGAAGCTAACGTGAAGTGTCCCCAGATCGTCATTGCTTTTTACGAGGAAAGGCTCACCTGGCACGCATATCCTGAGGATGCCGAAAACAAGGAGAAGGAATCAGCTAAGAGCTCGGGAGGTGGTTCGGGTGGCTCTGGATCAATGGACGCGAAATCACTTACGGCATGGTCGAGAACACTGGTTACGTTCAAGGACGTGTTTGTGGACTTTACACGTGAGGAGTGGAAATTGCTGGATACTGCGCAACAAATTGTGTATCGAAATGTCATGCTTGAGAATTACAAGAACCTCGTCAGTCTCGGATACCAGTTGACGAAACCGGATGTGATCCTTAGGCTCGAAAAGGGGGAAGAACCTTGGCTGGTATAGAAGAATTCGATCCCGCTTCAGTGCAGGTGAATTCTACCACCCAGCTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTAAGCTTGCCTCGAGCAGCGCTGCTCGAGAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
AAV2/1-CXCR4(SEQ ID NO：65)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTTGATATCAACTTTGTATAGAAAAGTTTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCATAAAAGTCCGGTTGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCTCCGGTAACCACCAGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGACCCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGACAACTTTGTATACAAAAGTTGAGGCTGGATCCCGGTACCCTCGACACCTGCTGACAGGTCCACCATGGGACCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGGCGGCCGCTGACTACAAGGATGACGACGATAAATCTAGAATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGATCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGGCGCCTGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCCACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAAGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACGAGGCCAGCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGTGGTGGAGGAAGTGGCGGGTCAGGGTCGAGCCCCAAGAAAAAACGGAAAGTGGAGGCATCAATGAAGGAGGGAGAAAACAACAAACCCAGGGAGAAAAGTGAAGGGAATAAGAGAAAAAGCTCCTTCTCTAACAGTGCAGACGATATCAAGTCCAAGAAAAAGCGGGAGCAGTCTAATGACATTGCTAGGGGCTTCGAGAGAGGACTGGAGCCAGAAAAAATCATTGGGGCAACCGACAGCTGCGGCGATCTGATGTTTCTCATGAAATGGAAGGACACAGATGAGGCCGACCTGGTGCTCGCCAAAGAAGCTAACGTGAAGTGTCCCCAGATCGTCATTGCTTTTTACGAGGAAAGGCTCACCTGGCACGCATATCCTGAGGATGCCGAAAACAAGGAGAAGGAATCAGCTAAGAGCTCGGGAGGTGGTTCGGGTGGCTCTGGATCAATGGACGCGAAATCACTTACGGCATGGTCGAGAACACTGGTTACGTTCAAGGACGTGTTTGTGGACTTTACACGTGAGGAGTGGAAATTGCTGGATACTGCGCAACAAATTGTGTATCGAAATGTCATGCTTGAGAATTACAAGAACCTCGTCAGTCTCGGATACCAGTTGACGAAACCGGATGTGATCCTTAGGCTCGAAAAGGGGGAAGAACCTTGGCTGGTATAGAAGAATTCGATCCCGCTTCAGTGCAGGTGAATTCTACCACCCAGCTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTAAGCTTGCCTCGAGCAGCGCTGCTCGAGAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACG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AAV2/DJ-Cas9和AAV/2/1Cas9(SEQ ID NO：66)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCTCTAGAAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACATAAAACCGGTGCCACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAAGAATTCAGCGGCGCGCCTTCCCAAAACCCACCAAACTAAGTAACTGCTACTTCTCTCAGCAACACCAAGATCAATGAAAGAGGCAAGGTGGGTCTTCGAGAAGACCTGCTTAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGAAGCCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
用于内源靶阻遏的细胞培养—HEK293FT、Neuro-2a和原始264.7细胞系(购自ATCC)被维持在处于37℃和5％CO2的培养箱中具有10％胎牛血清(FBS-LifeTechnologies)、2mM谷氨酰胺、1.0mM丙酮酸钠(Life Technologies)和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)的Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM-Life Technologies)中。
体外培养细胞的转染—HEK293FT细胞在24孔板中每孔接种大约50,000个细胞并且次日转染。HEK293FT细胞用对gRNA(10ng)、dCas9(200ng)、MS2融合阻遏子(100ng)、嘌呤霉素抗性基因(50ng)和作为转染对照组(25ng)的增强蓝色荧光蛋白(EBFP)进行编码的质粒DNA共转染。聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)用于转染HEK293FT细胞。根据制造商的指令来制备转染复合物。在转染后24小时用0.5ug/ml嘌呤霉素(Gibco-life tech)处理细胞。转染72小时后收集细胞并且使用RNAeasy Plus微型试剂盒(Qiagen)从细胞收集总RNA。
Neuro-2a细胞在24孔板中每孔接种大约50,000个细胞并且次日转染。细胞用对gRNA(100ng)、Cas9核酸酶(70ng)和作为转染对照组(25ng)的EBFP及嘌呤霉素抗性基因(50ng)进行编码的质粒共转染。用脂转染胺LTX将质粒递送到Neuro-2a细胞。在转染后24小时用0.5ug/ml嘌呤霉素(Gibco-life tech)处理细胞。5天后，用浓度为10ug/ml的LPS处理细胞并且在5小时之后使用RNAeasy Plus微型试剂盒(Qiagen)从细胞收集总RNA。
对于CXCR4阻遏，原始264.7细胞在24孔板中每孔接种大约50,000个细胞并且次日转导。去除细胞培养基并且在250微升培养基中以1E+9GC/细胞向培养物添加AV。转导后12小时刷新培养基。5天后，以浓度为0.1ug/ml的LPS处理细胞5小时，然后使用RNAeasy Plus微型试剂盒(Qiagen)收集总RNA。
定量RT-PCR分析—细胞或组织裂解并且使用RNeasy Plus微型试剂盒(Qiagen)或trizol(Life Technologies)来提取RNA，然后使用高容量RNA到cDNA试剂盒(ThermoFisher)或iScript合成试剂盒(Bio-Rad)进行cDNA合成cDNA。使用SYBR Green PCR MasterMix(Thermo Fisher)来执行qRT-PCR。所有分析都被归一化为18s rRNA(ΔCt)并且对于体外实验针对未转染的对照组或仅Cas9组计算倍数变化，而对于体内实验(2-ΔΔCt)针对AAV-GFP注射组计算倍数变化。在下面列举了用于qPCR的引物序列。
用于组织中的AAV基因组拷贝的DNA分离和实时PCR—根据制造商的规程使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)来执行DNA与组织的分离。qPCR反应由来自每个样本的100ng模板DNA以及用于根据制造商的规程使用基于探针的qPCR预混液(IDT)进行病毒反向末端重复序列(ITR)的引物和探针组成。数据被归一化为小鼠Acvr2b对照基因。
基于ELISA的化学发光测定—在收获小鼠之后，收集血浆样本并将其等份存储在-80℃下。使用1x细胞裂解缓冲液(Cell Signaling)(100mg的组织与1ml的缓冲液之比)裂解肺样本，然后对经裂解的组织进行均质化和超声处理。遵循制造商的规程使用Q-PlexTM小鼠细胞因子–筛选(16-Plex)试剂盒(Quansys Biosciences)来执行测定。简要地，将样本或校准物添加到布署有捕获GMCSF、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12p70、IL-17、MCP-1、MIP-1α、RANTES和TNFα的分析物特异性抗体的96孔板的孔中。洗涤板并且添加生物素化分析物特异性抗体。在洗涤之后，添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SHRP)。紧跟附加洗涤之后，在添加化学发光底物情况下测量在阵列的每个位置上剩下的SHRP量。
抗体ELISA—稀释在每病毒粒子含有2x109个的1x包被缓冲液(13mM碳酸钠、35mM碳酸氢钠缓冲液，pH 9.2)中的五十微升AAV粒子被添加到
Figure BDA0003151592740000331
高蛋白结合96孔板(Greiner)中的每个孔。孔用1x Tris缓冲盐水+Tween-20(TBST，Bethyl)洗涤三次并且在室温下用1x Tris缓冲盐溶液+1％BSA(Bethyl)封闭1小时。孔用TBST洗涤三次。标准曲线是从10,000ng/ml AAV1抗体的浓度开始在TBST+1％BSA+1:500阴性对照组小鼠血清中以两倍稀释度使用纯化小鼠宿主IgG2a抗AAV1(Fitzgerald)抗体来生成的。标准品被添加到板，然后以1:500的稀释度添加到血清样本并且在室温下孵育1小时。孔用TBST洗涤四次，然后以1:500的浓度添加山羊抗小鼠HRP抗体并且在室温下孵育1小时。孔用洗涤缓冲液洗涤四次并且将TMB底物添加到孔。在发展标准曲线之后(15分钟)，通过添加0.18M H2SO4来终止反应。最后，使用酶标仪(BioTek)在450个波长处测量吸光度。吸光度结果被导出并在Excel中分析。
乳酸测定—使用EDTA涂层管来收集血液样本。将样本以1,000x g离心10分钟。收集血浆并将其存储在-80℃下。遵循制造商的规程(L-乳酸测定试剂盒，Cayman Chemicals)执行乳酸测定。简要地，通过添加0.5M MPA使样本脱蛋白。在使蛋白质沉淀之后，将上清液添加到碳酸钾并且在4℃下以10,000x g离心五分钟。样本被稀释四倍并添加到所指定的孔。接下来，将测定缓冲液辅因子混合物、荧光底物和酶混合物添加到每个孔。将板在室温下温育20分钟并且使用530-540nm的激发波长和585-595nm的发射波长来测量荧光。吸光度结果被导出并根据制造商的规程在Excel中分析。
注射LPS后的肝损伤检查—将血浆样本发送到IDEXX实验室以测量包括ALT、胆固醇、LDL、HDL、BUN和脂肪酶的一组组织损伤标志物。
动物—对动物的所有实验都由亚利桑那州立大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准并且已根据机构指南执行。每组对6-8周大的至少3只小鼠执行所有实验。在每个实验中包括雄性和雌性。在每个图例中指示每个组中的样本大小。所有小鼠被同样地处理。雄性C57BL/6小鼠(JAX库存编号：000664)被用于研究AAV2/1-GFP、对不同器官的嗜性和AAV-CRISPR激活实验。雄性和雌性Rosa26-Cas9敲除小鼠(JAX库存编号026179)被用于AAV-CRISPR阻遏实验。
眼眶后注射—通过静脉窦的眼眶后注射将AAV粒子递送给小鼠。用3％异氟烷麻醉动物并且用100微升的AAV溶液向左眼注射病毒粒子(对于对表达Cas9的小鼠的实验每小鼠1E11至1E12基因组拷贝，而对于C57BL/6小鼠总共为1.01E+12GC AAV-TTN和AAV-Cas9(100:1比率))。
组织收获—在注射后3周经由CO2吸入对小鼠实施安乐死。从肝、脾、肺、睾丸、骨髓和血液中取的组织样本被收集在RLT(Life Technologies)中或者速冻以进行RNA分析。
体内LPS诱导—对于LPS诱导，通过以50mg/ml的浓度腹膜内(i.p.)注射溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中的脂多糖(来自大肠杆菌0127:B8(Sigma-Aldrich，圣路易，MO，美国))来治疗小鼠。LPS注射后六小时经由CO2吸入对小鼠实施安乐死。
RNA测序和数据分析—使用RNeasy Plus微型试剂盒(Qiagen)来从小鼠骨髓样本中提取RNA，然后使用GLOBINclearTM试剂盒、小鼠/大鼠试剂盒(Thermofisher)来排除球蛋白mRNA。在Novogene Corporation Inc.执行非定向文库制备，然后使用具有配对末端150电泳(2×150碱基)的Illumina Nova Platform进行RNA测序。每样本覆盖范围为最少2500万次读取。然后使用STAR软件将FASTQ文件与小鼠基因组序列进行比对并且用IntegrativeGenomics Viewer(IGV)可视化唯一地映射的读取计数。基因表达水平通过映射的读取数来计算。根据每个样本的所有基因表达水平(RPKM或FPKM)，计算样本在各组之间的相关系数。从基因表达分析获得的读数计数被用于差异表达分析并且使用DESeq2 R包来对不同组执行差异表达分析。在所有比较组内，对log10(FPKM+1)个联合差异表达基因进行层次聚类分析。ClusterProfiler软件被用于富集分析，包括GO富集、DO富集、KEGG富集和Reactome富集。
统计分析—统计分析被包括在图例中。所有数据被呈现为均值±SEM或均值±SD。N＝用于体外实验的个别转染数并且N＝用于体内实验的动物数。使用prims 7软件(GraphPad)来执行统计分析。发明人执行了两尾学生t-检验。p<0.05的值被认为是显著的，被表达为*(p<0.05)、**(p<0.01)、***(p<0.001)或n.s。(不显著)。
表2：本文描述的gRNA内的14nt引导序列-5'-3'
小鼠 Myd88-1 GCCTAGTCCATCCA (SEQ ID NO：1)
小鼠 Myd88-2 CCACCGATCAAGGT (SEQ ID NO：2)
小鼠 Myd88-3 GCGAGCGTACTGGA (SEQ ID NO：3)
小鼠 Myd88-4 GTGGACGGCACCGG (SEQ ID NO：4)
小鼠 Mock AGCTTAGGGATAAC (SEQ ID NO：5)
小鼠 CXCR4-1 ATAAAAGTCCGGTT (SEQ ID NO：6)
小鼠 CXCR4-2 TCCGGTAACCACCA (SEQ ID NO：7)
表3：本文描述的gRNA内的20nt引导序列-5'-3'
Figure BDA0003151592740000351
Figure BDA0003151592740000361
表4：小鼠qPCR引物-5'-3'。IDTTMPRIMETIMETM预设计的qPCR引物和探针试剂盒可商购自在下面指出的靶，并且因此在本文中不单独地提供这些引物的序列。
Figure BDA0003151592740000362
Figure BDA0003151592740000371
表5：人qPCR引物-5'-3'
SEL1L-FW GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT (SEQ ID NO：47)
SEL1L-RV ATTCACTCCCCACCCTCTCT (SEQ ID NO：48)
NEAT1-FW AGGTCAGGCAGAGGAAGTCA (SEQ ID NO：49)
NEAT1-RV CTGCCTCCCGATACAACAAT (SEQ ID NO：50)
XIST-1-FW AGGTCAGGCAGAGGAAGTCA (SEQ ID NO：51)
XIST-1-RV CTGCCTCCCGATACAACAAT (SEQ ID NO：52)
SYVN1-FW ACCAGCATCCCTAGCTCAGA (SEQ ID NO：53)
SYVN1-RV TCCTCAGGCATCTCCTCTGT (SEQ ID NO：54)
MS2-krab-Mecp2(SEQ ID NO：55)、MS2(SEQ ID NO：56)、krab(SEQ ID NO：57)和Mecp2(SEQ ID NO：58)：
CCACCATGGGACCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGGCGGCCGCTGACTACAAGGATGACGACGATAAATCTAGAATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGATCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGGCGCCTGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCCACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACGAGGCCAGCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGTGGTGGAGGAAGTGGCGGGTCAGGGTCGTCCATGGACGCGAAATCACTTACGGCATGGTCGAGAACACTGGTTACGTTCAAGGACGTGTTTGTGGACTTTACACGTGAGGAGTGGAAATTGCTGGATACTGCGCAACAAATTGTGTATCGAAATGTCATGCTTGAGAATTACAAGAACCTCGTCAGTCTCGGATACCAGTTGACGAAACCGGATGTGATCCTTAGGCTCGAAAAGGGGGAAGAACCTTGGCTGGTATCGGGAGGTGGTTCGGGTGGCTCTGGATCAAGCCCAAAGAAGAAACGGAAGG TGGAAGCCTCAGTGCAGGTGAAAAGGGTGCTGGAAAAATCCCCCGGCAAACTCCTCGTGAAGATGCCCTTCCAGGCT TCCCCTGGCGGAAAAGGTGAAGGGGGTGGCGCAACCACATCTGCCCAGGTCATGGTCATCAAGCGACCTGGAAGGAA AAGAAAGGCCGAGGCTGACCCTCAGGCCATTCCAAAGAAACGGGGACGCAAGCCAGGGTCCGTGGTCGCAGCTGCAG CAGCTGAGGCTAAGAAAAAGGCAGTGAAGGAAAGCTCCATCCGCAGTGTGCAGGAGACTGTCCTGCCCATCAAGAAG AGGAAGACTAGGGAGACCGTGTCCATCGAGGTCAAAGAAGTGGTCAAGCCCCTGCTCGTGTCCACCCTGGGCGAAAA ATCTGGAAAGGGGCTCAAAACATGCAAGTCACCTGGACGGAAAAGCAAGGAGTCTAGTCCAAAGGGGCGCTCAAGCT CCGCTTCTAGTCCCCCTAAAAAGGAACACCATCACCATCACCATCACGCCGAGTCTCCTAAGGCTCCTATGCCACTG CTCCCACCACCTCCACCACCTGAGCCACAGTCAAGCGAAGACCCCATCAGCCCACCCGAGCCTCAGGATCTGTCCTC TAGTATTTGCAAAGAGGAAAAGATGCCCAGAGCAGGCAGCCTGGAGAGTGATGGCTGTCCAAAAGAACCCGCCAAGA CCCAGCCTATGGTGGCAGCCGCTGCAACTACCACCACAACCACAACTACCACAGTGGCCGAAAAATACAAGCATCGC GGCGAGGGCGAACGAAAGGACATTGTGTCAAGCTCCATGCCCAGACCTAACCGGGAGGAACCAGTCGATAGTAGGAC ACCCGTGACTGAGAGAGTCTCATGA
MS2-HP1A-krab(SEQ ID NO：59)、MS2(SEQ ID NO：56)、HP1A(SEQ ID NO：60)、krab(SEQ ID NO：57)
CCACCATGGGACCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGGCGGCCGCTGACTACAAGGATGACGACGATAAATCTAGAATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGATCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGGCGCCTGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCCACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACGAGGCCAGCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGTGGTGGAGGAAGTGGCGGGTCAGGGTCGTCCAGCCCCAAGAAAAAACGGAAAGTGGAGGCATCAATGAAGGAGGGAG AAAACAACAAACCCAGGGAGAAAAGTGAAGGGAATAAGAGAAAAAGCTCCTTCTCTAACAGTGCAGACGATATCAAG TCCAAGAAAAAGCGGGAGCAGTCTAATGACATTGCTAGGGGCTTCGAGAGAGGACTGGAGCCAGAAAAAATCATTGG GGCAACCGACAGCTGCGGCGATCTGATGTTTCTCATGAAATGGAAGGACACAGATGAGGCCGACCTGGTGCTCGCCA AAGAAGCTAACGTGAAGTGTCCCCAGATCGTCATTGCTTTTTACGAGGAAAGGCTCACCTGGCACGCATATCCTGAG GATGCCGAAAACAAGGAGAAGGAATCAGCTAAGAGCCTCGGGAGGTGGTTCGGGTGGCTCTGGATCAATGGACGCGAAATCACTTACGGCATGGTCGAGAACACTGGTTACGTTCAAGGACGTGTTTGTGGACTTTACACGTGAGGAGTGGAAATTGCTGGATACTGCGCAACAAATTGTGTATCGAAATGTCATGCTTGAGAATTACAAGAACCTCGTCAGTCTCGGATACCAGTTGACGAAACCGGATGTGATCCTTAGGCTCGAAAAGGGGGAAGAACCTTGGCTGGTATGA
MS2-Mecp2-krab-MBD2B(SEQ ID NO：61)、MS2(SEQ ID NO：56)、Mecp2(SEQ ID NO：58)、krab(SEQ ID NO：57)、MBD2B(SEQ DI NO：62)
CCACCATGGGACCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGGCGGCCGCTGACTACAAGGATGACGACGATAAATCTAGAATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGATCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGGCGCCTGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCCACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACGAGGCCAGCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGTGGTGGAGGAAGTGGCGGGTCAGGGTCGTCCAGCCCAAAGAAGAAACGGAAGGTGGAAGCCTCAGTGCAGGTGAAAA GGGTGCTGGAAAAATCCCCCGGCAAACTCCTCGTGAAGATGCCCTTCCAGGCTTCCCCTGGCGGAAAAGGTGAAGGG GGTGGCGCAACCACATCTGCCCAGGTCATGGTCATCAAGCGACCTGGAAGGAAAAGAAAGGCCGAGGCTGACCCTCA GGCCATTCCAAAGAAACGGGGACGCAAGCCAGGGTCCGTGGTCGCAGCTGCAGCAGCTGAGGCTAAGAAAAAGGCAG TGAAGGAAAGCTCCATCCGCAGTGTGCAGGAGACTGTCCTGCCCATCAAGAAGAGGAAGACTAGGGAGACCGTGTCC ATCGAGGTCAAAGAAGTGGTCAAGCCCCTGCTCGTGTCCACCCTGGGCGAAAAATCTGGAAAGGGGCTCAAAACATG CAAGTCACCTGGACGGAAAAGCAAGGAGTCTAGTCCAAAGGGGCGCTCAAGCTCCGCTTCTAGTCCCCCTAAAAAGG AACACCATCACCATCACCATCACGCCGAGTCTCCTAAGGCTCCTATGCCACTGCTCCCACCACCTCCACCACCTGAG CCACAGTCAAGCGAAGACCCCATCAGCCCACCCGAGCCTCAGGATCTGTCCTCTAGTATTTGCAAAGAGGAAAAGAT GCCCAGAGCAGGCAGCCTGGAGAGTGATGGCTGTCCAAAAGAACCCGCCAAGACCCAGCCTATGGTGGCAGCCGCTG CAACTACCACCACAACCACAACTACCACAGTGGCCGAAAAATACAAGCATCGCGGCGAGGGCGAACGAAAGGACATT GTGTCAAGCTCCATGCCCAGACCTAACCGGGAGGAACCAGTCGATAGTAGGACACCCGTGACTGAGAGAGTCTCATCGGGAGGTGGTTCGGGTGGCTCTGGATCAATGGACGCGAAATCACTTACGGCATGGTCGAGAACACTGGTTACGTTCAAGGACGTGTTTGTGGACTTTACACGTGAGGAGTGGAAATTGCTGGATACTGCGCAACAAATTGTGTATCGAAATGTCATGCTTGAGAATTACAAGAACCTCGTCAGTCTCGGATACCAGTTGACGAAACCGGATGTGATCCTTAGGCTCGAAAAGGGGGAAGAACCTTGGCTGGTATCGGGAGGTGGTTCGGGTGGCTCTGGATCATCCCCCAAAAAGAAACGCAAGGTGA GGCATCTGCTCGCTATCTCGGTAACACTGTCGATCTGTCATCATTCGATTTCCGCACTGGCAAGATGATGCCTTCTA AACTGCAGAAGAACAAACAGAGGCTGAGAAATGACCCACTCAACCAGAATAAGGGAAAACCCGATCTGAACACCACA CTCCCTATCCGGCAGACAGCTAGTATTTTCAAGCAGCCTGTGACTAAAGTCACCAACCACCCATCCAATAAGGTGAA ATCTGACCCACAGAGGATGAATGAGCAGCCCAGACAGCTGTTTTGGGAAAAGCGCCTGCAGGGTCTCTCTGCAAGTG ATGTGACAGAGCAGATCATTAAGACTATGGAACTGCCAAAAGGACTCCAGGGAGTGGGACCTGGGTCTAACGACGAG ACTCTGCTCTCAGCTGTCGCAAGCGCACTGCATACCAGCTCCGCACCCATCACAGGACAGGTGAGTGCCGCTGTCGA GAAGAACCCAGCCGTGTGGCTGAATACTTCACAGCCCCTCTGCAAGGCTTTCATCGTCACCGACGAGGATATTCGGA AGCAGGAGGAACGCGTGCAGCAGGTCCGAAAAATCCTGGAAGACGCTCTCATGGCAGATATTCTGAGCAGAGCAGCC GACACCGAGGAAATGGATATTGAGATGGACTCCGGGGATGAAGCCTGAA
MS2-MBD2B-HP1A(SEQ ID NO：63)、MS2(SEQ ID NO：56)、MBD2B(SEQ ID NO：62)、HP1A(SEQ ID NO：60)
CCACCATGGGACCTAAGAAAAAGAGGAAGGTGGCGGCCGCTGACTACAAGGATGACGACGATAAATCTAGAATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGATCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGGCGCCTGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCCACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACGAGGCCAGCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGTGGTGGAGGAAGTGGCGGGTCAGGGTCGTCCTCCCCCAAAAAGAAACGCAAGGTGGAGGCATCTGCTCGCTATCTCGGTAACACTGTCGATCTGTCATCATTCGATTTCCGCACTGGCAAGATGATGCCTTCTAAACTGCAGAAGAACAAACAGAGGCTGAGAAATGACCCACTCAACCAGAATAAGGGAAAACCCGATCTGAACACCACACTCCCTATCCGGCAGACAGCTAGTATTTTCAAGCAGCCTGTGACTAAAGTCACCAACCACCCATCCAATAAGGTGAAATCTGACCCACAGAGGATGAATGAGCAGCCCAGACAGCTGTTTTGGGAAAAGCGCCTGCAGGGTCTCTCTGCAAGTGATGTGACAGAGCAGATCATTAAGACTATGGAACTGCCAAAAGGACTCCAGGGAGTGGGACCTGGGTCTAACGACGAGACTCTGCTCTCAGCTGTCGCAAGCGCACTGCATACCAGCTCCGCACCCATCACAGGACAGGTGAGTGCCGCTGTCGAGAAGAACCCAGCCGTGTGGCTGAATACTTCACAGCCCCTCTGCAAGGCTTTCATCGTCACCGACGAGGATATTCGGAAGCAGGAGGAACGCGTGCAGCAGGTCCGAAAAATCCTGGAAGACGCTCTCATGGCAGATATTCTGAGCAGAGCAGCCGACACCGAGGAAATGGATATTGAGATGGACTCCGGGGATGAAGCCTCGGGAGGTGGTTCGGGTGGCTCTGGATCAAGCCCCAAGAAAAAACGGAAAG TGGAGGCATCAATGAAGGAGGGAGAAAACAACAAACCCAGGGAGAAAAGTGAAGGGAATAAGAGAAAAAGCTCCTTC TCTAACAGTGCAGACGATATCAAGTCCAAGAAAAAGCGGGAGCAGTCTAATGACATTGCTAGGGGCTTCGAGAGAGG ACTGGAGCCAGAAAAAATCATTGGGGCAACCGACAGCTGCGGCGATCTGATGTTTCTCATGAAATGGAAGGACACAG ATGAGGCCGACCTGGTGCTCGCCAAAGAAGCTAACGTGAAGTGTCCCCAGATCGTCATTGCTTTTTACGAGGAAAGG CTCACCTGGCACGCATATCCTGAGGATGCCGAAAACAAGGAGAAGGAATCAGCTAAGAGCTGA
序列表
<110> 代表亚利桑那州立大学的亚利桑那校董会
S·基亚尼
M·R·易卜拉欣哈尼
F·穆加达姆
<120> 体内具有CRISPR超级阻遏子的合成免疫调控
<130> 112624.01135
<150> US 62/757,679
<151> 2018-11-08
<150> US 62/899,584
<151> 2019-09-12
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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tccggtaacc acca 14
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<212> DNA
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ggcaggaaga gcagcggcga gg 22
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ggatactgac ccgaggacgc cg 22
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gggcgctggg ttcctggtga gt 22
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ggcaccggcg tctgaggtct c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggcgacaggg agggatgcgc gcc 23
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<212> DNA
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ggaagtggct agctcagggc ttc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggcagcgctt taagaactga a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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ggactgaaga tctctctgca ctt 23
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<220>
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ggccatattt cttactctct cg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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gcaggtagca aagtgacgcc ga 22
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<212> DNA
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caaccactac ctgagcaccc 20
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<212> DNA
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<400> 22
gtccatgccg agagtgatcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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gtgaggatat actgaaggag ctg 23
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<212> DNA
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<220>
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ctgtaaaggc ttctcggact c 21
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<212> DNA
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<223> 合成的
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cctgacattc ccaaagacaa agc 23
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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tctctcagca cagcatatgc ac 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 27
gaccatggct gggattcacc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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ccaagggagc ttcagggtca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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ggactttgga ttcccgcagg agaag 25
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<212> DNA
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<220>
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gctgcatcag acagccttgc aggtc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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caatttctca tgccgcacag 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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agctggaaga tcgaaagtcc g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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aggctgcccc gactacgt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
gactttctcc tggtatgaga tagcaaa 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
gctgcgtgaa cactatcctg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
aggtcgtact tctccattct gta 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
ggccgttctt agttggtgga gcg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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ctgaacgcca cttgtccctc 20
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
tgcggctccc tgtgtgt 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
tcttcctctg ttccttgggc tat 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
gctcagtcat cagcaactcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
tcacaggcga agtccatc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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gagagtcagc ggagttctc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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ctcacaggtc aaagtattgt tg 22
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<212> DNA
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<220>
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tcgctcaggg tcacaagaaa 20
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<212> DNA
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<220>
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catcagaggc aaggaggaaa ac 22
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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gtggctgttg gagtcggtat 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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attcactccc caccctctct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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aggtcaggca gaggaagtca 20
<210> 50
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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ctgcctcccg atacaacaat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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aggtcaggca gaggaagtca 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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ctgcctcccg atacaacaat 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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accagcatcc ctagctcaga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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tcctcaggca tctcctctgt 20
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<211> 1634
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
ccaccatggg acctaagaaa aagaggaagg tggcggccgc tgactacaag gatgacgacg 60
ataaatctag aatggcttct aactttactc agttcgttct cgtcgacaat ggcggaactg 120
gcgacgtgac tgtcgcccca agcaacttcg ctaacgggat cgctgaatgg atcagctcta 180
actcgcgttc acaggcttac aaagtaacct gtagcgttcg tcagagctct gcgcagaatc 240
gcaaatacac catcaaagtc gaggtgccta aaggcgcctg gcgttcgtac ttaaatatgg 300
aactaaccat tccaattttc gccacgaatt ccgactgcga gcttattgtt aaggcaatgc 360
aaggtctcct aaaagatgga aacccgattc cctcagcaat cgcagcaaac tccggcatct 420
acgaggccag ccccaagaag aagaggaagg tgagtggtgg aggaagtggc gggtcagggt 480
cgtccatgga cgcgaaatca cttacggcat ggtcgagaac actggttacg ttcaaggacg 540
tgtttgtgga ctttacacgt gaggagtgga aattgctgga tactgcgcaa caaattgtgt 600
atcgaaatgt catgcttgag aattacaaga acctcgtcag tctcggatac cagttgacga 660
aaccggatgt gatccttagg ctcgaaaagg gggaagaacc ttggctggta tcgggaggtg 720
gttcgggtgg ctctggatca agcccaaaga agaaacggaa ggtggaagcc tcagtgcagg 780
tgaaaagggt gctggaaaaa tcccccggca aactcctcgt gaagatgccc ttccaggctt 840
cccctggcgg aaaaggtgaa gggggtggcg caaccacatc tgcccaggtc atggtcatca 900
agcgacctgg aaggaaaaga aaggccgagg ctgaccctca ggccattcca aagaaacggg 960
gacgcaagcc agggtccgtg gtcgcagctg cagcagctga ggctaagaaa aaggcagtga 1020
aggaaagctc catccgcagt gtgcaggaga ctgtcctgcc catcaagaag aggaagacta 1080
gggagaccgt gtccatcgag gtcaaagaag tggtcaagcc cctgctcgtg tccaccctgg 1140
gcgaaaaatc tggaaagggg ctcaaaacat gcaagtcacc tggacggaaa agcaaggagt 1200
ctagtccaaa ggggcgctca agctccgctt ctagtccccc taaaaaggaa caccatcacc 1260
atcaccatca cgccgagtct cctaaggctc ctatgccact gctcccacca cctccaccac 1320
ctgagccaca gtcaagcgaa gaccccatca gcccacccga gcctcaggat ctgtcctcta 1380
gtatttgcaa agaggaaaag atgcccagag caggcagcct ggagagtgat ggctgtccaa 1440
aagaacccgc caagacccag cctatggtgg cagccgctgc aactaccacc acaaccacaa 1500
ctaccacagt ggccgaaaaa tacaagcatc gcggcgaggg cgaacgaaag gacattgtgt 1560
caagctccat gcccagacct aaccgggagg aaccagtcga tagtaggaca cccgtgactg 1620
agagagtctc atga 1634
<210> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
gcggccgctg actacaagga tgacgacgat aaatctagaa tggcttctaa ctttactcag 60
ttcgttctcg tcgacaatgg cggaactggc gacgtgactg tcgccccaag caacttcgct 120
aacgggatcg ctgaatggat cagctctaac tcgcgttcac aggcttacaa agtaacctgt 180
agcgttcgtc agagctctgc gcagaatcgc aaatacacca tcaaagtcga ggtgcctaaa 240
ggcgcctggc gttcgtactt aaatatggaa ctaaccattc caattttcgc cacgaattcc 300
gactgcgagc ttattgttaa ggcaatgcaa ggtctcctaa aagatggaaa cccgattccc 360
tcagcaatcg cagcaaactc cggcatctac gaggccagc 399
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<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
atggacgcga aatcacttac ggcatggtcg agaacactgg ttacgttcaa ggacgtgttt 60
gtggacttta cacgtgagga gtggaaattg ctggatactg cgcaacaaat tgtgtatcga 120
aatgtcatgc ttgagaatta caagaacctc gtcagtctcg gataccagtt gacgaaaccg 180
gatgtgatcc ttaggctcga aaagggggaa gaaccttggc tggta 225
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<220>
<223> 合成的
<400> 58
agcccaaaga agaaacggaa ggtggaagcc tcagtgcagg tgaaaagggt gctggaaaaa 60
tcccccggca aactcctcgt gaagatgccc ttccaggctt cccctggcgg aaaaggtgaa 120
gggggtggcg caaccacatc tgcccaggtc atggtcatca agcgacctgg aaggaaaaga 180
aaggccgagg ctgaccctca ggccattcca aagaaacggg gacgcaagcc agggtccgtg 240
gtcgcagctg cagcagctga ggctaagaaa aaggcagtga aggaaagctc catccgcagt 300
gtgcaggaga ctgtcctgcc catcaagaag aggaagacta gggagaccgt gtccatcgag 360
gtcaaagaag tggtcaagcc cctgctcgtg tccaccctgg gcgaaaaatc tggaaagggg 420
ctcaaaacat gcaagtcacc tggacggaaa agcaaggagt ctagtccaaa ggggcgctca 480
agctccgctt ctagtccccc taaaaaggaa caccatcacc atcaccatca cgccgagtct 540
cctaaggctc ctatgccact gctcccacca cctccaccac ctgagccaca gtcaagcgaa 600
gaccccatca gcccacccga gcctcaggat ctgtcctcta gtatttgcaa agaggaaaag 660
atgcccagag caggcagcct ggagagtgat ggctgtccaa aagaacccgc caagacccag 720
cctatggtgg cagccgctgc aactaccacc acaaccacaa ctaccacagt ggccgaaaaa 780
tacaagcatc gcggcgaggg cgaacgaaag gacattgtgt caagctccat gcccagacct 840
aaccgggagg aaccagtcga tagtaggaca cccgtgactg agagagtctc a 891
<210> 59
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
ccaccatggg acctaagaaa aagaggaagg tggcggccgc tgactacaag gatgacgacg 60
ataaatctag aatggcttct aactttactc agttcgttct cgtcgacaat ggcggaactg 120
gcgacgtgac tgtcgcccca agcaacttcg ctaacgggat cgctgaatgg atcagctcta 180
actcgcgttc acaggcttac aaagtaacct gtagcgttcg tcagagctct gcgcagaatc 240
gcaaatacac catcaaagtc gaggtgccta aaggcgcctg gcgttcgtac ttaaatatgg 300
aactaaccat tccaattttc gccacgaatt ccgactgcga gcttattgtt aaggcaatgc 360
aaggtctcct aaaagatgga aacccgattc cctcagcaat cgcagcaaac tccggcatct 420
acgaggccag ccccaagaag aagaggaagg tgagtggtgg aggaagtggc gggtcagggt 480
cgtccagccc caagaaaaaa cggaaagtgg aggcatcaat gaaggaggga gaaaacaaca 540
aacccaggga gaaaagtgaa gggaataaga gaaaaagctc cttctctaac agtgcagacg 600
atatcaagtc caagaaaaag cgggagcagt ctaatgacat tgctaggggc ttcgagagag 660
gactggagcc agaaaaaatc attggggcaa ccgacagctg cggcgatctg atgtttctca 720
tgaaatggaa ggacacagat gaggccgacc tggtgctcgc caaagaagct aacgtgaagt 780
gtccccagat cgtcattgct ttttacgagg aaaggctcac ctggcacgca tatcctgagg 840
atgccgaaaa caaggagaag gaatcagcta agagcctcgg gaggtggttc gggtggctct 900
ggatcaatgg acgcgaaatc acttacggca tggtcgagaa cactggttac gttcaaggac 960
gtgtttgtgg actttacacg tgaggagtgg aaattgctgg atactgcgca acaaattgtg 1020
tatcgaaatg tcatgcttga gaattacaag aacctcgtca gtctcggata ccagttgacg 1080
aaaccggatg tgatccttag gctcgaaaag ggggaagaac cttggctggt atga 1134
<210> 60
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
agccccaaga aaaaacggaa agtggaggca tcaatgaagg agggagaaaa caacaaaccc 60
agggagaaaa gtgaagggaa taagagaaaa agctccttct ctaacagtgc agacgatatc 120
aagtccaaga aaaagcggga gcagtctaat gacattgcta ggggcttcga gagaggactg 180
gagccagaaa aaatcattgg ggcaaccgac agctgcggcg atctgatgtt tctcatgaaa 240
tggaaggaca cagatgaggc cgacctggtg ctcgccaaag aagctaacgt gaagtgtccc 300
cagatcgtca ttgcttttta cgaggaaagg ctcacctggc acgcatatcc tgaggatgcc 360
gaaaacaagg agaaggaatc agctaagagc 390
<210> 61
<211> 2351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
ccaccatggg acctaagaaa aagaggaagg tggcggccgc tgactacaag gatgacgacg 60
ataaatctag aatggcttct aactttactc agttcgttct cgtcgacaat ggcggaactg 120
gcgacgtgac tgtcgcccca agcaacttcg ctaacgggat cgctgaatgg atcagctcta 180
actcgcgttc acaggcttac aaagtaacct gtagcgttcg tcagagctct gcgcagaatc 240
gcaaatacac catcaaagtc gaggtgccta aaggcgcctg gcgttcgtac ttaaatatgg 300
aactaaccat tccaattttc gccacgaatt ccgactgcga gcttattgtt aaggcaatgc 360
aaggtctcct aaaagatgga aacccgattc cctcagcaat cgcagcaaac tccggcatct 420
acgaggccag ccccaagaag aagaggaagg tgagtggtgg aggaagtggc gggtcagggt 480
cgtccagccc aaagaagaaa cggaaggtgg aagcctcagt gcaggtgaaa agggtgctgg 540
aaaaatcccc cggcaaactc ctcgtgaaga tgcccttcca ggcttcccct ggcggaaaag 600
gtgaaggggg tggcgcaacc acatctgccc aggtcatggt catcaagcga cctggaagga 660
aaagaaaggc cgaggctgac cctcaggcca ttccaaagaa acggggacgc aagccagggt 720
ccgtggtcgc agctgcagca gctgaggcta agaaaaaggc agtgaaggaa agctccatcc 780
gcagtgtgca ggagactgtc ctgcccatca agaagaggaa gactagggag accgtgtcca 840
tcgaggtcaa agaagtggtc aagcccctgc tcgtgtccac cctgggcgaa aaatctggaa 900
aggggctcaa aacatgcaag tcacctggac ggaaaagcaa ggagtctagt ccaaaggggc 960
gctcaagctc cgcttctagt ccccctaaaa aggaacacca tcaccatcac catcacgccg 1020
agtctcctaa ggctcctatg ccactgctcc caccacctcc accacctgag ccacagtcaa 1080
gcgaagaccc catcagccca cccgagcctc aggatctgtc ctctagtatt tgcaaagagg 1140
aaaagatgcc cagagcaggc agcctggaga gtgatggctg tccaaaagaa cccgccaaga 1200
cccagcctat ggtggcagcc gctgcaacta ccaccacaac cacaactacc acagtggccg 1260
aaaaatacaa gcatcgcggc gagggcgaac gaaaggacat tgtgtcaagc tccatgccca 1320
gacctaaccg ggaggaacca gtcgatagta ggacacccgt gactgagaga gtctcatcgg 1380
gaggtggttc gggtggctct ggatcaatgg acgcgaaatc acttacggca tggtcgagaa 1440
cactggttac gttcaaggac gtgtttgtgg actttacacg tgaggagtgg aaattgctgg 1500
atactgcgca acaaattgtg tatcgaaatg tcatgcttga gaattacaag aacctcgtca 1560
gtctcggata ccagttgacg aaaccggatg tgatccttag gctcgaaaag ggggaagaac 1620
cttggctggt atcgggaggt ggttcgggtg gctctggatc atcccccaaa aagaaacgca 1680
aggtgaggca tctgctcgct atctcggtaa cactgtcgat ctgtcatcat tcgatttccg 1740
cactggcaag atgatgcctt ctaaactgca gaagaacaaa cagaggctga gaaatgaccc 1800
actcaaccag aataagggaa aacccgatct gaacaccaca ctccctatcc ggcagacagc 1860
tagtattttc aagcagcctg tgactaaagt caccaaccac ccatccaata aggtgaaatc 1920
tgacccacag aggatgaatg agcagcccag acagctgttt tgggaaaagc gcctgcaggg 1980
tctctctgca agtgatgtga cagagcagat cattaagact atggaactgc caaaaggact 2040
ccagggagtg ggacctgggt ctaacgacga gactctgctc tcagctgtcg caagcgcact 2100
gcataccagc tccgcaccca tcacaggaca ggtgagtgcc gctgtcgaga agaacccagc 2160
cgtgtggctg aatacttcac agcccctctg caaggctttc atcgtcaccg acgaggatat 2220
tcggaagcag gaggaacgcg tgcagcaggt ccgaaaaatc ctggaagacg ctctcatggc 2280
agatattctg agcagagcag ccgacaccga ggaaatggat attgagatgg actccgggga 2340
tgaagcctga a 2351
<210> 62
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
aggcatctgc tcgctatctc ggtaacactg tcgatctgtc atcattcgat ttccgcactg 60
gcaagatgat gccttctaaa ctgcagaaga acaaacagag gctgagaaat gacccactca 120
accagaataa gggaaaaccc gatctgaaca ccacactccc tatccggcag acagctagta 180
ttttcaagca gcctgtgact aaagtcacca accacccatc caataaggtg aaatctgacc 240
cacagaggat gaatgagcag cccagacagc tgttttggga aaagcgcctg cagggtctct 300
ctgcaagtga tgtgacagag cagatcatta agactatgga actgccaaaa ggactccagg 360
gagtgggacc tgggtctaac gacgagactc tgctctcagc tgtcgcaagc gcactgcata 420
ccagctccgc acccatcaca ggacaggtga gtgccgctgt cgagaagaac ccagccgtgt 480
ggctgaatac ttcacagccc ctctgcaagg ctttcatcgt caccgacgag gatattcgga 540
agcaggagga acgcgtgcag caggtccgaa aaatcctgga agacgctctc atggcagata 600
ttctgagcag agcagccgac accgaggaaa tgg 633
<210> 63
<211> 1595
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 63
ccaccatggg acctaagaaa aagaggaagg tggcggccgc tgactacaag gatgacgacg 60
ataaatctag aatggcttct aactttactc agttcgttct cgtcgacaat ggcggaactg 120
gcgacgtgac tgtcgcccca agcaacttcg ctaacgggat cgctgaatgg atcagctcta 180
actcgcgttc acaggcttac aaagtaacct gtagcgttcg tcagagctct gcgcagaatc 240
gcaaatacac catcaaagtc gaggtgccta aaggcgcctg gcgttcgtac ttaaatatgg 300
aactaaccat tccaattttc gccacgaatt ccgactgcga gcttattgtt aaggcaatgc 360
aaggtctcct aaaagatgga aacccgattc cctcagcaat cgcagcaaac tccggcatct 420
acgaggccag ccccaagaag aagaggaagg tgagtggtgg aggaagtggc gggtcagggt 480
cgtcctcccc caaaaagaaa cgcaaggtgg aggcatctgc tcgctatctc ggtaacactg 540
tcgatctgtc atcattcgat ttccgcactg gcaagatgat gccttctaaa ctgcagaaga 600
acaaacagag gctgagaaat gacccactca accagaataa gggaaaaccc gatctgaaca 660
ccacactccc tatccggcag acagctagta ttttcaagca gcctgtgact aaagtcacca 720
accacccatc caataaggtg aaatctgacc cacagaggat gaatgagcag cccagacagc 780
tgttttggga aaagcgcctg cagggtctct ctgcaagtga tgtgacagag cagatcatta 840
agactatgga actgccaaaa ggactccagg gagtgggacc tgggtctaac gacgagactc 900
tgctctcagc tgtcgcaagc gcactgcata ccagctccgc acccatcaca ggacaggtga 960
gtgccgctgt cgagaagaac ccagccgtgt ggctgaatac ttcacagccc ctctgcaagg 1020
ctttcatcgt caccgacgag gatattcgga agcaggagga acgcgtgcag caggtccgaa 1080
aaatcctgga agacgctctc atggcagata ttctgagcag agcagccgac accgaggaaa 1140
tggatattga gatggactcc ggggatgaag cctcgggagg tggttcgggt ggctctggat 1200
caagccccaa gaaaaaacgg aaagtggagg catcaatgaa ggagggagaa aacaacaaac 1260
ccagggagaa aagtgaaggg aataagagaa aaagctcctt ctctaacagt gcagacgata 1320
tcaagtccaa gaaaaagcgg gagcagtcta atgacattgc taggggcttc gagagaggac 1380
tggagccaga aaaaatcatt ggggcaaccg acagctgcgg cgatctgatg tttctcatga 1440
aatggaagga cacagatgag gccgacctgg tgctcgccaa agaagctaac gtgaagtgtc 1500
cccagatcgt cattgctttt tacgaggaaa ggctcacctg gcacgcatat cctgaggatg 1560
ccgaaaacaa ggagaaggaa tcagctaaga gctga 1595
<210> 64
<211> 6159
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgttgatat caactttgta tagaaaagtt ttcccatgat 180
tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac 240
tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta 300
gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa 360
gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacacct gcgggtcctg 420
cactgtttta gagctaggcc aacatgagga tcacccatgt ctgcagggcc tagcaagtta 480
aaataaggct agtccgttat caacttggcc aacatgagga tcacccatgt ctgcagggcc 540
aagtggcacc gagtcggtgc tttttttgaa ttctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 600
tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtatttccca 660
tgattccttc atatttgcat atacgataca aggctgttag agagataatt ggaattaatt 720
tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg 780
ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta tcatatgctt accgtaactt 840
gaaagtattt cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa aggacgaaac accgaagctt 900
cgggagggtt ttagagctag gccaacatga ggatcaccca tgtctgcagg gcctagcaag 960
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg gccaacatga ggatcaccca tgtctgcagg 1020
gccaagtggc accgagtcgg tgcttttttt gaattctgat gcggtatttt ctccttacgc 1080
atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg 1140
acccaagttt gtacaaaaaa gcaggctagg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac 1200
atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag 1260
aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga 1320
gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg 1380
gtttgccgcc agaacacagc ttaagcttgg taccgagctc ggatccacta gtaacggccg 1440
ccagtgtgct ggaattctgc agatatccat cacactggcg gccgctcgag catgcatcta 1500
gaggacaact ttgtatacaa aagttgaggc tggatcccgg taccctcgac acctgctgac 1560
aggtccacca tgggacctaa gaaaaagagg aaggtggcgg ccgctgacta caaggatgac 1620
gacgataaat ctagaatggc ttctaacttt actcagttcg ttctcgtcga caatggcgga 1680
actggcgacg tgactgtcgc cccaagcaac ttcgctaacg ggatcgctga atggatcagc 1740
tctaactcgc gttcacaggc ttacaaagta acctgtagcg ttcgtcagag ctctgcgcag 1800
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atgcaaagtc tcctaaaaga tggaaacccg attccctcag caatcgcagc aaactccggc 1980
atctacgagg ccagccccaa gaagaagagg aaggtgagtg gtggaggaag tggcgggtca 2040
gggtcgagcc ccaagaaaaa acggaaagtg gaggcatcaa tgaaggaggg agaaaacaac 2100
aaacccaggg agaaaagtga agggaataag agaaaaagct ccttctctaa cagtgcagac 2160
gatatcaagt ccaagaaaaa gcgggagcag tctaatgaca ttgctagggg cttcgagaga 2220
ggactggagc cagaaaaaat cattggggca accgacagct gcggcgatct gatgtttctc 2280
atgaaatgga aggacacaga tgaggccgac ctggtgctcg ccaaagaagc taacgtgaag 2340
tgtccccaga tcgtcattgc tttttacgag gaaaggctca cctggcacgc atatcctgag 2400
gatgccgaaa acaaggagaa ggaatcagct aagagctcgg gaggtggttc gggtggctct 2460
ggatcaatgg acgcgaaatc acttacggca tggtcgagaa cactggttac gttcaaggac 2520
gtgtttgtgg actttacacg tgaggagtgg aaattgctgg atactgcgca acaaattgtg 2580
tatcgaaatg tcatgcttga gaattacaag aacctcgtca gtctcggata ccagttgacg 2640
aaaccggatg tgatccttag gctcgaaaag ggggaagaac cttggctggt atagaagaat 2700
tcgatcccgc ttcagtgcag gtgaattcta ccacccagct taagcttggt accgagctcg 2760
gatccactag taacggccgc cagtgtgctg gaattctgca gatatccatc acactggcgg 2820
ccgctcgagc atgcatctag aggtacccag ctttcttgta caaagtggta agcttgcctc 2880
gagcagcgct gctcgagaga tctacgggtg gcatccctgt gacccctccc cagtgcctct 2940
cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt gtcctaataa aattaagttg 3000
catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg gggtggaggg gggtggtatg 3060
gagcaagggg caagttggga agacaacctg tagggcctgc ggggtctatt gggaaccaag 3120
ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaatctcc gcctcctggg ttcaagcgat 3180
tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg attccaggca tgcatgacca ggctcagcta 3240
atttttgttt ttttggtaga gacggggttt caccatattg gccaggctgg tctccaactc 3300
ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc tcccaaattg ctgggattac aggcgtgaac 3360
cactgctccc ttccctgtcc ttctgatttt gtaggtaacc acgtgcggac cgagcggccg 3420
caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 3480
gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 3540
cgagcgcgca gctgcctgca ggggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc 3600
ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa 3660
gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 3720
ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 3780
ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 3840
aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 3900
gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 3960
cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 4020
attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 4080
cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc 4140
agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 4200
ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 4260
catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg 4320
tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 4380
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 4440
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 4500
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 4560
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 4620
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 4680
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 4740
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 4800
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 4860
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 4920
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 4980
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 5040
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact 5100
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 5160
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 5220
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 5280
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 5340
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta 5400
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 5460
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 5520
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 5580
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 5640
agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 5700
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 5760
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 5820
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 5880
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 5940
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 6000
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 6060
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 6120
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgt 6159
<210> 65
<211> 6158
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgttgatat caactttgta tagaaaagtt ttcccatgat 180
tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac 240
tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta 300
gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa 360
gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacacca taaaagtccg 420
gttgttttag agctaggcca acatgaggat cacccatgtc tgcagggcct agcaagttaa 480
aataaggcta gtccgttatc aacttggcca acatgaggat cacccatgtc tgcagggcca 540
agtggcaccg agtcggtgct ttttttgaat tctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 600
gtgcggtatt tcacaccgca tacgtcaaag caaccatagt acgcgccctg tatttcccat 660
gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataattg gaattaattt 720
gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg 780
gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg 840
aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca cctccggtaa 900
ccaccagttt tagagctagg ccaacatgag gatcacccat gtctgcaggg cctagcaagt 960
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttgg ccaacatgag gatcacccat gtctgcaggg 1020
ccaagtggca ccgagtcggt gctttttttg aattctgatg cggtattttc tccttacgca 1080
tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcgga 1140
cccaagtttg tacaaaaaag caggctaggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca 1200
tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga 1260
aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag 1320
ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg 1380
tttgccgcca gaacacagct taagcttggt accgagctcg gatccactag taacggccgc 1440
cagtgtgctg gaattctgca gatatccatc acactggcgg ccgctcgagc atgcatctag 1500
aggacaactt tgtatacaaa agttgaggct ggatcccggt accctcgaca cctgctgaca 1560
ggtccaccat gggacctaag aaaaagagga aggtggcggc cgctgactac aaggatgacg 1620
acgataaatc tagaatggct tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa 1680
ctggcgacgt gactgtcgcc ccaagcaact tcgctaacgg gatcgctgaa tggatcagct 1740
ctaactcgcg ttcacaggct tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga 1800
atcgcaaata caccatcaaa gtcgaggtgc ctaaaggcgc ctggcgttcg tacttaaata 1860
tggaactaac cattccaatt ttcgccacga attccgactg cgagcttatt gttaaggcaa 1920
tgcaaagtct cctaaaagat ggaaacccga ttccctcagc aatcgcagca aactccggca 1980
tctacgaggc cagccccaag aagaagagga aggtgagtgg tggaggaagt ggcgggtcag 2040
ggtcgagccc caagaaaaaa cggaaagtgg aggcatcaat gaaggaggga gaaaacaaca 2100
aacccaggga gaaaagtgaa gggaataaga gaaaaagctc cttctctaac agtgcagacg 2160
atatcaagtc caagaaaaag cgggagcagt ctaatgacat tgctaggggc ttcgagagag 2220
gactggagcc agaaaaaatc attggggcaa ccgacagctg cggcgatctg atgtttctca 2280
tgaaatggaa ggacacagat gaggccgacc tggtgctcgc caaagaagct aacgtgaagt 2340
gtccccagat cgtcattgct ttttacgagg aaaggctcac ctggcacgca tatcctgagg 2400
atgccgaaaa caaggagaag gaatcagcta agagctcggg aggtggttcg ggtggctctg 2460
gatcaatgga cgcgaaatca cttacggcat ggtcgagaac actggttacg ttcaaggacg 2520
tgtttgtgga ctttacacgt gaggagtgga aattgctgga tactgcgcaa caaattgtgt 2580
atcgaaatgt catgcttgag aattacaaga acctcgtcag tctcggatac cagttgacga 2640
aaccggatgt gatccttagg ctcgaaaagg gggaagaacc ttggctggta tagaagaatt 2700
cgatcccgct tcagtgcagg tgaattctac cacccagctt aagcttggta ccgagctcgg 2760
atccactagt aacggccgcc agtgtgctgg aattctgcag atatccatca cactggcggc 2820
cgctcgagca tgcatctaga ggtacccagc tttcttgtac aaagtggtaa gcttgcctcg 2880
agcagcgctg ctcgagagat ctacgggtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc 2940
ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc 3000
atcattttgt ctgactaggt gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg 3060
agcaaggggc aagttgggaa gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc 3120
tggagtgcag tggcacaatc ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt 3180
ctcctgcctc agcctcccga gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa 3240
tttttgtttt tttggtagag acggggtttc accatattgg ccaggctggt ctccaactcc 3300
taatctcagg tgatctaccc accttggcct cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc 3360
actgctccct tccctgtcct tctgattttg taggtaacca cgtgcggacc gagcggccgc 3420
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 3480
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 3540
gagcgcgcag ctgcctgcag gggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg 3600
gtatttcaca ccgcatacgt caaagcaacc atagtacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 3660
cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 3720
cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 3780
tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 3840
aaaacttgat ttgggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 3900
ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 3960
actcaaccct atctcgggct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta 4020
ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac 4080
gtttacaatt ttatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca 4140
gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc 4200
cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc 4260
atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt 4320
catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 4380
ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 4440
ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 4500
cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 4560
ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 4620
tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 4680
cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 4740
actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 4800
aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 4860
tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 4920
ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 4980
tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 5040
gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 5100
gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 5160
tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg 5220
gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat 5280
ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 5340
gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 5400
aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 5460
ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 5520
ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 5580
tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 5640
gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 5700
agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 5760
taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 5820
gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 5880
gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 5940
caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 6000
aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 6060
tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 6120
acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgt 6158
<210> 66
<211> 7499
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggcctct agaaatgtag tcttatgcaa tactcttgta 180
gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg 240
tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac 300
gggtctgaca tggattggac gaaccactga attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa 360
gtgcctagct cgatacataa aaccggtgcc accatgtacc catacgatgt tccagattac 420
gcttcgccga agaaaaagcg caaggtcgaa gcgtccgaca agaagtacag catcggcctg 480
gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc gtgatcaccg acgagtacaa ggtgcccagc 540
aagaaattca aggtgctggg caacaccgac cggcacagca tcaagaagaa cctgatcgga 600
gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc gaggccaccc ggctgaagag aaccgccaga 660
agaagataca ccagacggaa gaaccggatc tgctatctgc aagagatctt cagcaacgag 720
atggccaagg tggacgacag cttcttccac agactggaag agtccttcct ggtggaagag 780
gataagaagc acgagcggca ccccatcttc ggcaacatcg tggacgaggt ggcctaccac 840
gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga aagaaactgg tggacagcac cgacaaggcc 900
gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc cacatgatca agttccgggg ccacttcctg 960
atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc gacgtggaca agctgttcat ccagctggtg 1020
cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac cccatcaacg ccagcggcgt ggacgccaag 1080
gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc agacggctgg aaaatctgat cgcccagctg 1140
cccggcgaga agaagaatgg cctgttcggc aacctgattg ccctgagcct gggcctgacc 1200
cccaacttca agagcaactt cgacctggcc gaggatgcca aactgcagct gagcaaggac 1260
acctacgacg acgacctgga caacctgctg gcccagatcg gcgaccagta cgccgacctg 1320
tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc atcctgctga gcgacatcct gagagtgaac 1380
accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc tctatgatca agagatacga cgagcaccac 1440
caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg cggcagcagc tgcctgagaa gtacaaagag 1500
attttcttcg accagagcaa gaacggctac gccggctaca ttgacggcgg agccagccag 1560
gaagagttct acaagttcat caagcccatc ctggaaaaga tggacggcac cgaggaactg 1620
ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg cggaagcagc ggaccttcga caacggcagc 1680
atcccccacc agatccacct gggagagctg cacgccattc tgcggcggca ggaagatttt 1740
tacccattcc tgaaggacaa ccgggaaaag atcgagaaga tcctgacctt ccgcatcccc 1800
tactacgtgg gccctctggc caggggaaac agcagattcg cctggatgac cagaaagagc 1860
gaggaaacca tcaccccctg gaacttcgag gaagtggtgg acaagggcgc ttccgcccag 1920
agcttcatcg agcggatgac caacttcgat aagaacctgc ccaacgagaa ggtgctgccc 1980
aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc gtgtataacg agctgaccaa agtgaaatac 2040
gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc ctgagcggcg agcagaaaaa ggccatcgtg 2100
gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg accgtgaagc agctgaaaga ggactacttc 2160
aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa atctccggcg tggaagatcg gttcaacgcc 2220
tccctgggca cataccacga tctgctgaaa attatcaagg acaaggactt cctggacaat 2280
gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc gtgctgaccc tgacactgtt tgaggacaga 2340
gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat gcccacctgt tcgacgacaa agtgatgaag 2400
cagctgaagc ggcggagata caccggctgg ggcaggctga gccggaagct gatcaacggc 2460
atccgggaca agcagtccgg caagacaatc ctggatttcc tgaagtccga cggcttcgcc 2520
aacagaaact tcatgcagct gatccacgac gacagcctga cctttaaaga ggacatccag 2580
aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc ctgcacgagc acattgccaa tctggccggc 2640
agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag acagtgaagg tggtggacga gctcgtgaaa 2700
gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc gtgatcgaaa tggccagaga gaaccagacc 2760
acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag agaatgaagc ggatcgaaga gggcatcaaa 2820
gagctgggca gccagatcct gaaagaacac cccgtggaaa acacccagct gcagaacgag 2880
aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg cgggatatgt acgtggacca ggaactggac 2940
atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac catatcgtgc ctcagagctt tctgaaggac 3000
gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga agcgacaaga accggggcaa gagcgacaac 3060
gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg aagaactact ggcggcagct gctgaacgcc 3120
aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat ctgaccaagg ccgagagagg cggcctgagc 3180
gaactggata aggccggctt catcaagaga cagctggtgg aaacccggca gatcacaaag 3240
cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg aacactaagt acgacgagaa tgacaagctg 3300
atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag tccaagctgg tgtccgattt ccggaaggat 3360
ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac aactaccacc acgcccacga cgcctacctg 3420
aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa aagtacccta agctggaaag cgagttcgtg 3480
tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg aagatgatcg ccaagagcga gcaggaaatc 3540
ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac agcaacatca tgaacttttt caagaccgag 3600
attaccctgg ccaacggcga gatccggaag cggcctctga tcgagacaaa cggcgaaacc 3660
ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat tttgccaccg tgcggaaagt gctgagcatg 3720
ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag gtgcagacag gcggcttcag caaagagtct 3780
atcctgccca agaggaacag cgataagctg atcgccagaa agaaggactg ggaccctaag 3840
aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctattctg tgctggtggt ggccaaagtg 3900
gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt gtgaaagagc tgctggggat caccatcatg 3960
gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc gactttctgg aagccaaggg ctacaaagaa 4020
gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct aagtactccc tgttcgagct ggaaaacggc 4080
cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa ctgcagaagg gaaacgaact ggccctgccc 4140
tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc agccactatg agaagctgaa gggctccccc 4200
gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg gaacagcaca agcactacct ggacgagatc 4260
atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga gtgatcctgg ccgacgctaa tctggacaaa 4320
gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat aagcccatca gagagcaggc cgagaatatc 4380
atccacctgt ttaccctgac caatctggga gcccctgccg ccttcaagta ctttgacacc 4440
accatcgacc ggaagaggta caccagcacc aaagaggtgc tggacgccac cctgatccac 4500
cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg atcgacctgt ctcagctggg aggcgacagc 4560
cccaagaaga agagaaaggt ggaggccagc taagaattca gcggcgcgcc ttcccaaaac 4620
ccaccaaact aagtaactgc tacttctctc agcaacacca agatcaatga aagaggcaag 4680
gtgggtcttc gagaagacct gcttaataaa agatctttat tttcattaga tctgtgtgtt 4740
ggttttttgt gtggcggccg caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc 4800
gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc 4860
gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca ggggcgcctg atgcggtatt 4920
ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc 4980
gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 5040
acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 5100
cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc 5160
tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc 5220
gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 5280
cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg 5340
gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 5400
gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc 5460
tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg 5520
ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 5580
gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg 5640
cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt 5700
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 5760
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 5820
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 5880
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 5940
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 6000
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 6060
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 6120
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 6180
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 6240
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 6300
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 6360
tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 6420
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 6480
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggaagccg 6540
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 6600
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 6660
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 6720
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 6780
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 6840
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 6900
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 6960
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 7020
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 7080
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 7140
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 7200
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 7260
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 7320
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 7380
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 7440
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgt 7499

Claims (22)

1.一种用于体内表达髓样分化初级反应88(MyD88)表达的合成阻遏系统，所述合成阻遏系统包含单个扩增子，所述单个扩增子包含：
(a)引导RNA(gRNA)，其包含(i)与MyD88的一部分互补的引导序列和(ii)对RNA结合蛋白特异性的适体靶位点；
(b)对与一个或多个阻遏结构域融合的所述适体RNA结合蛋白进行编码的核苷酸序列；以及
(c)对多功能Cas核酸酶进行编码的核苷酸序列；
其中所述单个扩增子被包装在用于基于DNA的病毒递送的载体中。
2.根据权利要求1所述的合成阻遏系统，其中所述gRNA引导序列的长度为15或更少个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的合成阻遏系统，其中所述gRNA引导序列靶向在MyD88的TATA盒区域上游的100个碱基对(bp)内。
4.根据权利要求1所述的合成阻遏系统，其中gRNA引导序列选自由SEQ ID NO：1-4组成的组。
5.根据权利要求1所述的合成阻遏系统，其中所述适体靶位点是MS2适体靶位点并且所述RNA结合蛋白是噬菌体MS2外壳蛋白。
6.根据权利要求5所述的合成阻遏系统，其中所述gRNA包含所述MS2适体靶位点并且所述引导序列的长度为15或更少个核苷酸。
7.根据权利要求5所述的合成阻遏系统，其中所述阻遏结构域选自由以下项组成的组：Kruppel相关盒(KRAB)结构域、甲基-CpG(mCpG)结合结构域2(meCP2)、开关独立3转录调节子家族成员A(SIN3A)、组蛋白脱乙酰基酶HDT1(HDT1)、含甲基-CpG-结合域的蛋白2(MBD2B)的n端截短、蛋白磷酸酶1的核抑制因子(NIPP1)和异染色质蛋白1(HP1A)。
8.根据权利要求7所述的合成阻遏系统，其中(b)的核苷酸对与至少两个阻遏结构域融合的MS2进行编码。
9.根据权利要求8所述的合成阻遏系统，其中对与阻遏结构域融合的MS2进行编码的所述核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO：55、59、61和63组成的组的序列。
10.根据权利要求1所述的合成阻遏系统，其中所述系统包含对与所述适体RNA结合蛋白融合的多功能Cas核酸酶进行编码的核苷酸序列和阻遏结构域。
11.根据权利要求1所述的合成阻遏系统，其中所述Cas核酸酶是金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶或化脓链球菌Cas9核酸酶。
12.根据权利要求1所述的合成阻遏系统，其中所述载体是AAV2/1递送载体。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1所述的合成阻遏系统和药学上可接受的递送载体。
14.一种治疗患有败血症的受试者的方法，包括向所述患有败血症的受试者施用治疗有效量的根据权利要求13所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中与免疫有关的标志物Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、Ifn-γ和Stat4的水平在施用之后在所述受试者中降低。
16.根据权利要求14所述的方法，附加地包括以下步骤：监测选自由Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、fn-γ和Stat4组成的组的至少一种与免疫有关的标志物的水平；以及向所述受试者施用附加剂量的所述合成阻遏系统组合物，直到所述至少一种与免疫有关的标志物的水平降低为止。
17.根据权利要求14所述的方法，其中血清乳酸盐在施用之后在所述受试者中降低。
18.一种在受试者中防止不利免疫反应的方法，所述方法包括在向所述受试者施用基于AAV载体的基因疗法之前或与之同时地向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求13所述的组合物，其中选自由Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、fn-γ和Stat4组成的组的与免疫有关的标志物的水平在所述受试者中相对于接受了所述基于AAV载体的基因疗法但确实未接受所述治疗合成阻遏系统组合物的受试者降低了。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试者先前接受了至少一种基于AAV载体的基因疗法。
20.根据权利要求18所述的方法，附加地包括以下步骤：监测选自由Icam-1、Tnfα、Ncf、Il6、Ifn-α、Ifn-β、fn-γ和Stat4组成的组的至少一种与免疫有关的标志物的水平；以及向所述受试者施用附加剂量的所述合成阻遏系统组合物，直到所述至少一种与免疫有关的标志物的水平降低为止。
21.一种在有需要的受试者中治疗华氏巨球蛋白血症的方法，所述方法包括向患有华氏巨球蛋白血症的受试者施用治疗有效量的根据权利要求13所述的组合物。
22.根据权利要求21所述的治疗方法，附加地包括向所述受试者施用包含被配置为在L265基因座处切割MyD88的gRNA和在L265基因座处对野生型MyD88的一部分进行编码的同源性定向修复模板的组合物，由此内源L265P突变体MyD88的水平在所述受试者中降低。
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