CN102166214B - 氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂在医学上的用途 - Google Patents
氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂在医学上的用途 Download PDFInfo
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Abstract
氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂在医学上的用途，一类氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂，作为免疫调节剂，具有以下分子结构式：
2-(4-(4-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-N-(4-苯基噻唑-2-基)乙酰胺一类氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂，可用于制备免疫抑制剂类药物，在治疗减低移植后排斥反应以及移植免疫耐受诱导和维持方面的应用，或用于作为抗炎药物，在治疗多种慢性炎症性疾病上的应用，或用于制备自身免疫治疗药物，在治疗多种自身免疫性疾病上的应用，或用于制备缺血再灌注损伤保护剂，在治疗缺血再灌注损伤类疾病上的应用，或用于制备内毒素血症和脓毒血症防治药物，用于内毒素血症和脓毒血症防治上的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一类氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂作为免疫调节剂医药和科研领域的应用，尤其是在抗移植排斥、抗自身免疫疾病、抗缺血再灌注损伤和抗慢性炎症反应、抗内毒素血症等方面的用途。
背景技术
在本发明提出之前，本领域的医学专家十分清楚，对机体免疫系统的抑制性调控是治疗多种疾病的关键，如治疗器官移植后排斥反应、自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病、缺血再灌注损伤等。而对免疫系统的调控可以从多方面入手的，而天然免疫反应作为近期研究的热点，是一个极佳的达成免疫抑制的方向。
机体免疫反应分为天然免疫和获得性免疫。其中，后者因为其特异性极强的识别功能和高效的反应效果一直以来被当作移植免疫的主要研究对象和干预标靶。传统免疫反应被认为是由获得性免疫系统的第一和第二刺激信号激活NF-κB，激活的NF-κB进入细胞核，启动转录，细胞合成和分泌各种炎性细胞因子，引发随后的一系列免疫反应。目前的抗排斥药物都是作用在获得性免疫系统上的。天然免疫一直被认为是机体的天然保护屏障，主要是抗击病毒细菌感染、外来生物入侵等，但最近几年大量的研究发现天然免疫系统在移植免疫、自身免疫性疾病和缺血损伤等方面发挥着极其重要的作用。天然免疫系统中又以Toll样受体(Tool-Like Receptor，TLR)发挥最主要的作用而最受关注，目前发现TLR有至少14个亚型，主要分布在APC等免疫细胞上，这些亚型除了TLR3以外，都要通过髓样分化蛋白(myeloid-differentation protein 88，MyD88)分子传递信号。大量的研究显示各种内源性和外源性的危险因子，刺激天然免疫系统的各个TLR，刺激信号经关键分子MyD88传导，最后也激活NF-κB，其后的免疫反应过程与前述的一样。
因此，简而言之，MyD88就是天然免疫的关键分子节点，阻断了MyD88就阻断了天然免疫系统的主要反应，进而产生相应的免疫抑制效果。如果能够用一种治疗药物对其进行干预和阻断，就能够阻断TLR途径的主要信号从而达成一系列的免疫调控，可以预见这是达成免疫治疗的一条极佳的方案。
目前全世界成千上万的研究报告验证了此分子的重要性及阻断其后能达成的治疗效果，但都没有找到一种能对其进行抑制的药物。而其它的对MyD88分子的干涉途径如基因敲除等方法不能临床应用。
本发明设计人在TLR/MyD88方面所作的一系列前期研究，验证了TLR在移植免疫中起着重要作用，并通过对MyD88基因敲除小鼠的研究证实阻断MyD88分子能够诱导和维持移植免疫耐受，而在后期的相关研究中，本发明设计人通过与药学专业团队合作，制造合成并反复筛选获得了一类MyD88特异性抑制剂：一类氨基噻唑类小分子化合物(代号TJ-M2010)，此类小分子化合物由于结构上的活化位点与MyD88分子的关键活化位点相匹配而能特异性结合，故能够竞争性结合而抑制MyD88相应的信号传导。因此，将MyD88特异性抑制剂TJ-M2010应用于抗移植排斥、抗自身免疫疾病、抗缺血再灌注损伤和抗慢性炎症反应、抗内毒素血症等，开创了此类小分子物质的应用先河，为多种天然免疫相关性疾病找到了一种全新的药物治疗可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一类氨基噻唑类小分子化合物作为MyD88特异性抑制剂，并应用其对天然免疫中MyD88分子的抑制作用，治疗多种免疫相关性疾病。实现本发明的具体技术方案的基础在于，本发明首先提出将此类氨基噻唑类MyD88分子类似物作为抗移植排斥、抗自身免疫疾病、抗缺血再灌注损伤和抗慢性炎症反应、抗内毒素血症等应用，是利用其对天然免疫中MyD88分子的抑制作用。
本发明所述的MyD88蛋白由两个结构域组成：包括TIR(toll/IL-1recptor domain)域和DD域(death domain)，TIR域是MyD88发生自身同源二聚化的物质基础，进而活化下游的IRAK1或IRAK4等激酶。经过对MYD88的TIR域的拓扑结构学分析后，合成一类MyD88特异性抑制剂TJ-M2010。它们能特异性的结合在MyD88的TIR域，干扰MyD88的TIR域的功能，阻止MyD88形成同源二聚体，使MyD88不能活化，从而阻断MyD88通路转导，进而不能激活NF-κB，阻断了炎性反应，因而在相关的炎症及免疫疾病治疗方面有重要作用。
本发明所述的应用氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂的分子结构如下：
TJ-M2010-1
2-(4-(4-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-N-(4-苯基噻唑-2-基)乙酰胺
TJ-M2010-2
2-(4-(p-甲苯基)哌嗪-1-基)-N-(4-苯基噻唑-2-基)乙酰胺
TJ-M2010-3
2-(4-苯基哌嗪-1-基)-N-(4-苯基噻唑-2-基)乙酰胺
TJ-M2010-4
3-(4-(4-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-N-(4-苯基噻唑-2-基)丙酰胺
本发明MyD88特异性抑制剂TJ-M2010分子极小，结构稳定，可穿透细胞膜，并可同时在体内外应用。
本发明一类氨基噻唑类MyD88的特异性抑制剂TJ-M2010，作为NF-κB抑制剂，在制备免疫调节类药物上的应用。
本发明一类氨基噻唑类MyD88的特异性抑制剂TJ-M2010，作为免疫调节剂，在治疗减低移植后排斥反应以及移植免疫耐受诱导和维持方面的应用。
本发明一类氨基噻唑类MyD88的特异性抑制剂TJ-M2010，作为免疫调节剂，在治疗多种慢性炎症性疾病上的应用。例如慢性炎症性肠病、哮喘等。
本发明一类氨基噻唑类的特异性抑制剂TJ-M2010，作为免疫调节剂，在治疗多种自身免疫性疾病上的应用。例如I型糖尿病、多发性硬化症、红斑狼疮等。
本发明一类氨基噻唑类MyD88的特异性抑制剂TJ-M2010，作为免疫调节剂，在治疗缺血再灌注损伤类疾病上的应用。例如预防和治疗心梗后缺血再灌注损伤、断肢再植后缺血再灌注损伤、移植物术后的缺血再灌注损伤以及器官保存液、细胞保存液的制作等。
本发明一类氨基噻唑类MyD88的特异性抑制剂TJ-M2010，作为免疫调节剂，在治疗脓毒血症和内毒素血症方面的应用。
本发明的优越性在于，将一类新型自主合成的化合物TJ-M2010作为MyD88特异性抑制剂应用在实验中，充分证实了该在用于移植后抗排斥和诱导免疫耐受、治疗各种炎症反应、防治缺血再灌注损伤等方面具有明显的效果。将是一种有效的免疫抑制剂、或移植耐受诱导剂、或移植耐受维持剂、抗炎药物和免疫调节剂。该类新型化合物能够有效抑制CD80、CD86表达，从而阻止DC细胞的成熟。DC细胞成熟已被证明为多种自身免疫性疾病如自身免疫性心肌病、实验自身免疫性葡萄炎、I型糖尿病、多发性硬化症、红斑狼疮等发病的关键步骤之一。故该类MyD88抑制剂TJ-M2010可用于此类疾病的治疗。MyD88途径阻断可以明显起到对缺血再灌注损伤的保护作用，故此类MyD88抑制剂TJ-M2010可用于防止如心梗后缺血再灌注损伤、断肢再植后缺血再灌注损伤、移植物术后的缺血再灌注损伤、器官保存液、细胞保存液等许多方面起到重要作用。体外实验结果表明这类MyD88抑制剂TJ-M2010通过抑制该通路能有效减少移植物内炎症因子水平，说明其与炎症因子的产生密切相关，故可能成为各类炎症治疗的有效手段。
附图说明
图1心脏移植物生存曲线
图2皮肤移植物生存曲线图
图3TJ-M2010剂量相关地减少T细胞活化图
TJ-M2010抑制LPS、CpG引起的共刺激分子CD80的上调图
图4TJ-M2010减低糖尿病发生率曲线图
图5TJ-M2010影响移植受体体内淋巴细胞亚群柱状图
图6TJ-M2010改善小鼠肾脏IRI生存率生存曲线图
图7TJ-M2010保护小鼠肾脏IRI肾功能(血肌酐、尿素氮)图
图8TJ-M2010减弱CpG刺激DC活化引发的T细胞增殖流式图
图9TJ-M2010减少移植物内炎性因子实时定量PCR分析图(IL-1β，TNF-α，IL-6三种炎性因子相对水平)
图10TJ-M2010减少肺炎模型中炎性细胞渗出图
图11TJ-M2010减少肺炎模型中炎症因子渗出图
图12内毒素和脓毒血症致死实验生存曲线
附图1中Balb/c和C57b1/6为两种小鼠品系
分组：Ba1b/c心脏移植给C57b1/6为普通对照组，CMC溶媒对照组，C57b1/6到C57b1/6为同系对照图，TJ-M2010实验组
附图2中异基因皮肤移植对照组(文献报导排斥时间为8-10天)、单用TJ-M2010组、单用MR1组和联合用药组(TJ-M2010+MR1)
附图3(a)中，TJ-M2010剂量相关地减少T细胞活化；附图3(b)中，LPS、CPG、心肌组织匀浆溶媒刺激DC，TJ-M2010下调CD80的表达。附图3(c)为TJ-M2010剂量相关性下调DC表面CD 80表达，附图3(d)为TJ-M2010剂量相关性下调巨噬细胞表面CD80表达。
附图4中实验分组：MyD88KO NOD小鼠，MyD88KO/+NOD小鼠，NOD小鼠TJ-M2010用药组。
在附图5中，图5为不同移植组别受体脾脏内淋巴细胞亚群分析(同基因组，治疗组，对照组)，显示TJ-M2010治疗的移植受者体内CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例明显上调
附图6中分组：MYD88KO，TJ-M2010，CMC，Control对照各组8只
I/R对照组I/R CMC为溶媒对照组I/R TJ-M2010为实验组
附图10中a、b分别为支气管肺泡中细胞总数，中性粒细胞数
附图11中a为肺组织中髓过氧化酶活性，b为肺组织中白细胞介素-6浓度
附图12中a为内毒素血症致死实验生存曲线，b为脓毒血症致死实验生存曲线图。
具体实施方法
应用实例1：TJ-M2010用于移植后抗排斥反应和诱导移植免疫耐受。
1)TJ-M2010用于小鼠心脏移植模型
实验共分为四组，分别为：
空白对照组(不做任何处理，做心脏移植)、CMC组(溶媒对照组)、同系心脏移植组(理论上同系无排斥，长期存活)和TJ-M2010用药组(效果检测组)。具体处理方法如下：
空白对照组：取Ba1b/c小鼠心脏移植到C57b1/6小鼠腹腔，术后不做特殊处理；
CMC对照组：取Ba1b/c小鼠心脏移植到C57b1/6小鼠腹腔，术后心脏移植前第0天到第6天给予腹腔注射不含TJ-M2010的羧甲基纤维素钠(0.5％CMC)溶液，200μl。
同系心脏移植组：取C57b1/6小鼠心脏移植到同系C57b1/6小鼠腹腔，术后不做特殊处理；
TJ-M2010用药组：取Ba1b/c小鼠心脏移植到C57b1/6小鼠腹腔，术后心脏移植前第0天到第6天给予腹腔注射溶于CMC的TJ-M2010，150mg/kg。
所得到实验结果如生存曲线图(见附图1)所示，结果显示空白对照组和文献报道排斥时间基本一致，为8天左右；CMC溶媒对照组无差异；同系心脏移植组心脏长期存活，TJ-M2010用药组平均心脏移植物存活时间20天左右，较对照组有明显延长。
2)TJ-M2010联合共刺激分子抑制剂-抗CD154单抗(MR1)用于小鼠皮肤移植模型
实验分为5组：异基因皮肤移植对照组(文献报导排斥时间为8-10天)、单用TJ-M2010组、单用MR1组和联合用药组(TJ-M2010+MR1)。
具体处理方式如下：
异基因皮肤移植CMC对照组：取Ba1b/c小鼠皮肤移植到C57b1/6小鼠背部，术后第0-3，5，7，9，11，13，15天腹腔注射0.5％CMC200μl/天；同基因皮肤移植组：取取C57b1/6小鼠皮肤移植到C57b1/6小鼠背部，术后不做特殊处理。
单用TJ-M2010组：取Ba1b/c小鼠皮肤移植到C57b1/6小鼠背部，术后第0-3，5，7，9，11，13，15天分别腹腔注射溶于0.5％CMC的TJ-M2010，150mg/kg/d；
单用MR1组：取Ba1b/c小鼠皮肤移植到C57b1/6小鼠背部，术后第0，1，3，7，14天给予腹腔注射MR1，200μg/天；
联合用药组：取Ba1b/c小鼠皮肤移植到C57b1/6小鼠背部，术后术后第0-3，5，7，9，11，13，15天分别腹腔注射溶于0.5％CMC的TJ-M2010，150mg/kg/d，同时第0-3，5，7，9，11，13，15天给予腹腔注射MR1，200μg/天。
所得到实验结果如生存曲线图(见附图2)所示，异基因皮肤移植对照组移植物排斥时间为10天左右，和文献报导时间一致
单用TJ-M2010组和单用MR1组皮肤移植物排斥时间10天左右，无统计学差异，而联合用药组(TJ-M2010+MR1)皮肤移植物长期存活达150天(文献认为＞100天为移植物耐受)
可见TJ-M2010和MR1单用对耐受诱导无明显效果，但联合应用效果显著，能使及其难以诱导耐受的皮肤移植物长期存活。
以上实验结果直接和间接说明，MyD88抑制剂在用于移植后抗排斥和诱导免疫耐受具有明显的效果。将是一种特殊的免疫抑制剂、或移植耐受诱导剂(短期用药即可使极难移植成功的皮肤移植物长期存活)、或移植耐受维持剂(如可对抗病菌感染所诱发的排斥)。其独特的作用是目前的免疫抑制剂不可比拟和替代的。
应用实例2：MyD88抑制剂用于治疗自身免疫性疾病。
体外实验——细胞流式仪结果：证明MyD88抑制剂可阻止DC成熟，用于治疗自身免疫性疾病。
步骤：1.应用了TJ-M2010的BALB/c小鼠来源骨髓细胞，破红，2×106/ML密度RPMI1640培养基(加GM-CSF10ng/ml，IL-410ng/ml)
2.48小时去悬浮细胞，第六天收悬浮及半贴壁细胞
3.DCs加50mM TJ-M2010培养1小时，加入坏死心肌上清液，LPS(200ng/ml)，Poly I：C(20mg/ml)，CpG(10mg/ml)培养12小时
4.加流式抗体FITC标记抗CD80，CD86，上机检测
TJ-M2010抑制了RAW264.7细胞对TLR刺激物(LPS、CpG)引起的共刺激分子CD80的上调，说明TJ-M2010能够有效的阻断TLR信号通路，进而抑制了细胞的免疫反应。
附图3(c)、(d)实验过程如下：
Raw264.7：48孔板细胞数为9*105/孔，每孔1ml培养基体系，首先加入不同浓度梯度TJ-M2010预孵育2h，然后加入CPG，终浓度40ug/ml，37℃CO2培养箱孵育过夜(12h)。加流式抗体FITC标记抗CD80，CD86，上机检测；
DC：48孔板，细胞数为1*106/孔，每孔1ml培养基体系，首先加入不同浓度梯度TJ-M2010预孵育2h，然后加入LPS，终浓度1ug/ml，37℃CO2培养箱孵育过夜(12h)。加流式抗体FITC标记抗CD80，CD86，上机检测以上二图中可见TJ-M2010对DC和巨噬细胞表面CD80表达起一浓度相关性抑制。
附图3：TJ-M2010抑制LPS、CpG引起的共刺激分子CD80/CD86的上调
以上检测结果说明MyD88抑制剂可降低CD80表达，从而阻止DC细胞的成熟。DC细胞成熟已被证明为多种自身免疫性疾病如自身免疫性心肌病、实验自身免疫性葡萄炎、I型糖尿病、多发性硬化症、红斑狼疮等发病的关键步骤之一。故MyD88抑制剂可用于此类疾病的治疗。
体内试验：应用MyD88-/-以及TJ-M2010对构建I型糖尿病模型的影响
实验步骤：
1.实验分组：MyD88KO NOD小鼠，MyD88KO/+NOD小鼠，NOD小鼠TJ-M2010用药组
2.用药组：抗原注射前1天，第0-3，5，7，9，11，13，15天分别腹腔注射溶于0.5％CMC的TJ-M2010，150mg/kg/d
3.各组均腹腔注射分支杆菌抗原并持续监测其浓度
4.清洁级饲养观察30周，取尾静脉血，测非空腹血糖，连续2次所测血糖≥22mmol/L为糖尿病建模标准
所得I型糖尿病发生率曲线见附图4：
结果显示：MyD88KO杂合子组随着时间延长I型糖尿病发生逐渐增加，而MyD88KO纯合子组无I型糖尿病发生，TJ-M2010组I型糖尿病发生率与MyD88KO纯合子组相当，说明MyD88通路与I型糖尿病的发生有必然的联系，阻断其通路能减少糖尿病的发生，因此小分子MyD88抑制剂TJ-M2010可能成为I型糖尿病的有效防治方法。
应用实例3：MyD88抑制剂用于预防和治疗缺血再灌注损伤。
体外实验：对接受抗原(同基因，异基因)刺激的受体脾脏内淋巴细胞亚群分析及同时接受过TJ-M2010治疗的受者体内CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例流式检测
实验步骤：
1、取不同组别(同基因，异基因抗原刺激)受体脾脏，碾磨分离淋巴细胞
2、加流式抗体APC标记的IFN-γ和APC标记的IL-17，APC标记的CD25和PE标记的Foxp3
3、上流式细胞仪分析不同移植组别受体脾脏内淋巴细胞亚群和TJ-M2010治疗的移植受者体内CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例
见附图5，结果显示TJ-M2010治疗的移植受者体内CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例明显上调，而IFN-γ和IL-17明显低于CMC对照组。
通过应用MyD88抑制剂TJ-M2010后，对移植受体脾脏内淋巴细胞亚群分析和CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例的检测发现TJ-M2010的应用通过上调CD4+CD25+Foxp3+T细胞而改变受体小鼠的移植耐受状态。而大量文献表明调节性T细胞可以通过其免疫抑制作用调节炎症的发展，炎症因子，促炎症因子的释放与缺血再灌注时细胞因子的交联，从而出现损伤，因此，TJ-M2010的应用通过抑制TLR信号，抑制NF-κB活化，减少炎症因子(IFN-γ和IL-17)的表达，从而减轻损伤。
体内实验部分：
MyD88途径阻断减轻肾脏缺血再灌注损伤实验：
实验步骤：
1.分组：普通C57b1/6组(Control)，CMC溶媒组，MYD88KO组，TJ-M2010组各组8只做缺血再灌注处理：麻醉，血管夹阻断左侧肾脏，置温箱31°，80min后开放并切除右侧肾脏，关腹。24小时取血用于BUN，Cr检测。
2.TJ-M2010组和CMC组，术前1天和手术当天分别腹腔注射溶于0.5％CMC的TJ-M2010，150mg/kg/d；CMC组：0.5％CMC溶液，200μl。
3.观察小鼠生存时间，做生存曲线。血标本送病理科做BUN，Cr检测。
4.结果显示TJ-M2010显著提高小鼠肾脏IRI后生存率，而且对肾功能有很好的保护效果。
结果见附图6和附图7。
由以上实验可见MyD88途径阻断可以明显起到对缺血再灌注损伤的保护作用，故MyD88抑制剂可用于防止如心梗后缺血再灌注损伤、断肢再植后缺血再灌注损伤、移植物术后的缺血再灌注损伤、器官保存液、细胞保存液等许多方面起到重要作用。
应用实例4：MyD88抑制剂用于治疗慢性炎症性疾病。
体外实验：TJ-M2010减弱CpG刺激DC活化引发的T细胞增殖及移植物内炎性因子实时定量PCR分析
实验步骤：
1、取Ba1b/c小鼠股骨，分离骨髓细胞，加入GMS-CSF和IL-4细胞因子，培养骨髓源性DC
2、培养至第六天，吹打细胞，分离未成熟DC。离心，1640培养基重悬。
3、加入丝裂霉素(使终浓度达50μg/ml)，37℃水浴，15min。1640洗一次，计数。
4、取C57b1/6小鼠脾脏，利用小鼠淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞，并计数。
5、取C57b1/6小鼠脾脏淋巴细胞标记CFSE。
6、Ba1b/c来源的DC与C57b1/6小鼠淋巴细胞做混合淋巴细胞培养。并分组如下：
空白组：在混合培养的过程中不加CPG及TJ-M2010。
对照组：在混合培养的过程中加CPG而不加TJ-M2010。
实验组1：在混合培养的过程中同时加CPG及TJ-M2010，其中TJ-M2010的量为10μM。
实验组2：在混合培养的过程中同时加CPG及TJ-M2010，其中TJ-M2010的量为20μM。
实验组3：在混合培养的过程中同时加CPG及TJ-M2010，其中TJ-M2010的量为40μM。
1、培养至第三天，收集细胞，流式检测C57b1/6小鼠淋巴细胞增殖情况。
流式结果见附图7
结果显示：随着TJ-M2010量的增加，T细胞增殖(CD44为其表面标志)呈下降趋势
说明TJ-M2010可减弱CpG刺激DC活化引发的T细胞增殖
实时定量PCR步骤：1.从接受抗原(同基因，异基因)刺激的受体用TRIzol法抽提总RNA
2.逆转录为cDNA，两步法RT-PCR
3.做标准曲线对比得出IL-1β，TNF-α，IL-6相对水平
附图九为移植物内炎性因子(IL-1β，TNF-α，IL-6)实时定量PCR分析
结果显示：心脏移植物内炎症因子水平TJ-M2010组明显比对照组低，有显著统计学差异
体外实验结果表明MyD88抑制剂TJ-M2010通过抑制该通路能有效减少移植物内炎症因子水平(IL-1β，IL-6较CMC异基因移植组明显降低)，说明其与炎症因子的产生密切相关，故可能成为各类炎症治疗的有效手段。
体内试验：
MyD88途径阻断降低小鼠气管炎症反应
方法与步骤：
1.动物分组：C57b1/6(B6)NaCl(200μl滴鼻)组，C57b1/6(B6)BLM组和TJ-M2010BLM组(第0-3，5，7，9，11，13，15天分别腹腔注射溶于0.5％CMC的TJ-M2010，150mg/kg/d)。
2.BLM(博来霉素)滴鼻制作肺炎模型：40μl氯胺酮甲苯噻嗪气道麻醉，鼻腔滴入法BLM硫酸盐(300μg or 15mg/kg)
3.支气管肺泡灌洗液(BAL)收集细胞及细胞因子：切开气管，插入塑料套管，37℃，0.3mlPBS灌洗，抽吸灌洗液(回抽达95％以上)，重复10次。灌洗液分两部分：一部分用于细胞因子检测(600g离心10min收集上清存放-80℃用于检测)一部分用于细胞计数(连同下层0.4ml重悬)4℃计数
4.肺匀浆检测组织内细胞及因子：BAL后，取整肺，搅碎，离心取上清-80℃存放用于MPO的检测
5.肺MPO活性检测：盐水经右心充分灌洗肺脏，肺匀浆，离心去上清，1mlPBS(含0.5％HTAB，5mM EDTA)重悬沉淀。离心，50μl上清加入试管(200μlPBS-HTAB-EDTA，2mlHBSS，100μl二盐酸邻联茴香胺(1.25mg/ml)，100μl H2O20.05％)，15min，37°C漩涡水箱，100μl NaN31％中止反应，460nm检测MPO吸光度值。
6.细胞计数：MG-1L染色4min，95％GS-500染色8min，涂片计数
7.因子检测：IL-6水平用ELISA检测
8.统计学分析：U检验分析统计学差异
附图9：显示MYD88-/-小鼠在支气管炎发生过程中募集中性粒和淋巴细胞减少
实验分组：B6NaCL组，B6BLM组和TJ-M2010BLM组(n＝4)
在TJ-M2010组支气管肺泡中性粒细胞募集明显减少。
a图显示第1，7，11天的细胞总数，WT小鼠和TJ-M2010BLM组有统计学差异；
b图显示WT小鼠支气管肺泡中性细胞24h达峰，持续7天，11天恢复，而TJ-M2010组明显募集减少
附图11图显示TJ-M2010BLM组减轻BLM诱导的肺炎症反应，表现为炎症细胞及炎症因子的减少。
a图肺组织中MPO因子(第7天检测)的减少
b图分别显示24h肺组织中IL-6的减少
从炎症细胞的募集到炎症因子的释放两个方面的实验可以看出TJ-M2010BLM组明显减轻BLM引起的肺炎症反应，从而证明TJ-M2010的抗炎效果。
以上实验说明MyD88途径阻断可降低炎症反应。因此MyD88抑制剂可用于治疗多种慢性炎症性疾病，如慢性炎症性肠病、哮喘等。
应用实例5：MyD88抑制剂用于治疗内毒素血症以及脓毒血症
第一部分：观察MyD88抑制剂对内毒素血症小鼠死亡率的影响。小鼠随机分为2组：溶剂对照组(Vehicle)和实验组(TJ-M2010防治组)，各20只。其中TJ-M2010防治组给予TJ-M2010(0.5％CMC溶剂，25mg/ml)灌胃，剂量为250mg/kg(200μL每只)；溶剂对照组给予0.5％CMC灌胃，200μL每只。每天一次，连续灌胃三天。第三天灌胃后1小时后予LPS腹腔注射，每十二小时观察存活情况，观察三天。观察得到的生存曲线情况如图12(a)
如图所示，所用的两种MyD88抑制剂能有效延迟内毒素致死事件，降低内毒素的致死率。
第二部分：观察MyD88抑制剂对脓毒症小鼠死亡率的影响。小鼠随机分成：假手术组、模型组、MyD88抑制剂治疗组。除假手术组只做开腹后缝合以外，对脓毒症模型组和MyD88抑制剂治疗组小鼠施行盲肠结扎穿孔术(CLP)，复制脓毒症小鼠模型。术后1h，分别予以0.5％CMC200μL或TJ-M2010灌胃250mg/kg(200μL)，1次/12h，连续4次。术后每12h观察各组小鼠生存率一次，连续观察72h。所得观察生存率情况如图12(b)。
如图可见，MyD88抑制剂TJ-M2010对小鼠脓毒症死亡时间和最终死亡率有比较明显改善作用。
Claims (1)
1.一类氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂，作为免疫调节剂，具有以下分子结构式：
TJ-M2010-1
2-(4-(4-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-N-(4-苯基噻唑-2-基)乙酰胺
TJ-M2010-2
2-(4-(p-甲苯基)哌嗪-1-基)-N-(4-苯基噻唑-2-基)乙酰胺
TJ-M2010-4
3-(4-(4-甲氧苯基)哌嗪-1-基)-N-(4-苯基噻唑-2-基)丙酰胺
其特征在于：一类氨基噻唑类MyD88特异性抑制剂，可用于制备免疫抑制剂类药物，在治疗减低移植后排斥反应以及移植免疫耐受诱导和维持方面的应用，或用于作为抗炎药物，在治疗多种慢性炎症性疾病上的应用，或用于制备自身免疫治疗药物，在治疗多种自身免疫性疾病上的应用，或用于制备缺血再灌注损伤保护剂，在治疗缺血再灌注损伤类疾病上的应用，或用于制备内毒素血症和脓毒血症防治药物，用于内毒素血症和脓毒血症防治上的应用。
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