CN113813255B - 尿石素a及其衍生物在肿瘤免疫治疗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供尿石素A及其衍生物在肿瘤免疫治疗的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明通过研究发现，尿石素A及其衍生物能够促进CD8⁺T细胞及其他TCR通路介导激活的效应T细胞或人工制备的效应T细胞(包括但不限于CAR‑T，TCR‑T细胞)的效应功能从而提高肿瘤免疫治疗效果，从而有效扩宽了对于尿石素A的认识。尿石素A对于CD8⁺T细胞功能的调控也进一步揭示了菌群代谢产物与免疫系统的互作，为深入挖掘更多的调控免疫的代谢产物提供了理论基础，并为肿瘤患者提供了有前景的免疫治疗策略，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

尿石素A及其衍生物在肿瘤免疫治疗的应用

技术领域

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及尿石素A及其衍生物在肿瘤免疫治疗的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

大量研究表明微生物组可以影响癌症的发展。在包括癌症在内的多种疾病中，肠道微生物组的成分都发生了改变。临床前研究证明，调节肠道微生物组可以改善宿主对癌症治疗的反应性。此外，微生物制剂或相关产品治疗癌症有缩小肿瘤的潜力。此外，微生物组可以通过产生的代谢产物调节机体的免疫系统从而协同抑制癌症，是具有重要潜力的肿瘤联合治疗策略。挖掘更多的增强宿主抗肿瘤免疫功能的代谢产物将会为临床转化提供理论基础。

CD8⁺T细胞是执行抗原专一性杀伤肿瘤细胞的主要效应性细胞，有效增强CD8+T细胞抗肿瘤功能是治疗肿瘤的关键。最近的研究表明，肠道菌群能够直接影响癌症免疫治疗效果。然而，关于肠道菌群代谢物在调节癌症免疫治疗方面的研究非常少。乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐是主要的微生物代谢物，属于短链脂肪酸(SCFA)类。它们可以促进调节性T细胞(Treg Cell)扩增，改善效应T细胞的功能。但鲜有报道其它的菌群代谢物在调节肿瘤免疫中的应用。

尿石素A(CAS：1143-70-0)是来自石榴及坚果的一种天然代谢产物。石榴及坚果中的鞣花单宁(ellagitannins)被机体摄入后，就会在肠道中被肠道菌群转化称为尿石素A。尿石素A在小鼠肠道中最为丰富，而在人类中，不同来源的鞣花单宁会产生不同种类的尿石素，包括尿石素A，B和C。已有的研究表明尿石素A具有抗炎、抗增殖和抗氧化的特性，可诱导自噬和凋亡，抑制细胞周期进程，抑制DNA合成。但尿石素A对CD8⁺T细胞的功能调控及抗肿瘤的尚未有报道。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供尿石素A及其衍生物在肿瘤免疫治疗的应用。本发明通过研究发现，尿石素A及其衍生物能够促进CD8⁺T细胞及其他TCR通路介导激活的效应T细胞或人工制备的效应T细胞(包括但不限于CAR-T，TCR-T细胞)的效应功能从而提高肿瘤免疫治疗效果，从而有效扩宽了对于尿石素A的认识。基于上述研究成果，从而完成本发明。

本发明的第一个方面，提供尿石素A及其衍生物在如下a1)-a7)至少一种中的应用：

a1)促进TCR(T细胞受体)通路活化的产品；

a2)促进CD8⁺T细胞分泌细胞因子的产品；

a3)促进CD8⁺T细胞杀伤肿瘤细胞的产品；

a4)促进CAR-T细胞对于肿瘤细胞的效应功能的产品；

a5)增强过继回输T细胞治疗肿瘤效果的产品；

a6)直接促进抗肿瘤免疫的产品；

a7)促进PD1阻断治疗效果的产品。

其中，所述尿石素A的衍生物应做广义理解，即将尿石素A中的氢原子或原子团被其他原子或原子团取代而衍生的产物；进一步的，尿石素A的衍生物具有尿石素环状酯的化学基团的取代。需要说明的是，只要所述化学基团取代使得尿石素A衍生物的效力与尿石素A大致相当或者提高，都属于本发明的保护范围之内。

比如，在本发明的一个具体实施方式中，所述尿石素环状酯可以被环状醚替代；所述尿石素环状醚包括一个或多个取代基。在其他实施方案中，所述环状醚取代基可独立地选自卤基、胺、经取代的胺、羟基和具有一个或两个独立地选自O、N或S的杂原子的C5或C6杂环。再比如，尿石素环状酯可以被环状烯基替代或者非环状桥替代。

a2)中，所述细胞因子包括但不限于IFN-γ，颗粒酶B(Granzyme B)，CD107A和IL-2。

a1)-a7)中，所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。

a7)中，所述PD1阻断治疗采用PD-1/PD-L1抑制剂，如抗PD-1/PD-L1抗体。

同时，需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。

本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可用于治疗恶性瘤。可用本发明的药物治疗的恶性瘤的实例包括实体瘤和血液瘤。实体瘤可以是乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头和颈、肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤(如黑色素瘤)、输尿管、阴道和外阴的肿瘤。恶性瘤包括遗传性癌症，例如视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤(Wilms tumor)。此外，恶性瘤包括在所述器官中的原发性肿瘤及在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。血液瘤可以是侵略性和无痛形式的白血病和淋巴瘤，即非霍奇金病、慢性和急性髓样白血病(CML/AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、霍奇金病、多发性骨髓瘤和T-细胞型淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合征、浆细胞瘤、类肿瘤综合征和未知原发部位的癌症及AIDS相关的恶性瘤。

本发明的第二个方面，提供一种组合物，所述组合物其活性成分至少尿石素A及其衍生物，以及如下任意一种或多种：

b1)T细胞；

b2)免疫检查点抑制剂；

所述b1)中，所述T细胞为效应T细胞，进一步的，所述T细胞包括TCR通路介导激活的效应T细胞，如CD8⁺T细胞、CD4⁺Th1和Th17细胞等；或者人工制备的效应T细胞，如CAR-T细胞、TCR-T细胞等。

所述b2)中，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1/PD-L1抑制剂，如抗PD-1/PD-L1抗体。

本发明的第三个方面，提供上述组合物在如下任意一种或多种中的应用：

c1)促进TCR通路活化或制备促进TCR通路活化的产品；

c2)促进CD8⁺T细胞分泌细胞因子或制备促进CD8⁺T细胞分泌细胞因子的产品；

c3)促进CD8⁺T细胞杀伤肿瘤细胞或制备促进CD8⁺T细胞杀伤肿瘤细胞的产品；

c4)促进CAR-T细胞对于肿瘤细胞的效应功能或制备促进CAR-T细胞对于肿瘤细胞的效应功能的产品；

c5)增强过继回输T细胞治疗肿瘤效果或增强过继回输T细胞治疗肿瘤效果的产品；

c6)直接促进抗肿瘤免疫或制备直接促进抗肿瘤免疫的产品；

c7)促进PD1阻断治疗效果或制备促进PD1阻断治疗效果的产品。

所述产品可以为药物或者实验试剂，从而可供基础研究使用。

根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

优选的，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

优选的，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

优选的，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。

本发明的第四个方面，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述尿石素A及其衍生物或上述组合物。

其中，所述肿瘤治疗可以为肿瘤免疫治疗。所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次报道了尿石素A及其衍生物对CD8⁺T细胞及其他TCR通路介导激活的效应T细胞(包括但不限于CD4⁺Th1、Th17细胞)或人工制备的效应T细胞(包含但不限于CAR-T、TCR-T细胞)的调控作用及其在肿瘤免疫治疗中的应用，为肠道菌群代谢物的抗肿瘤应用提供理论基础。

上述技术方案首次表明尿石素A及其衍生物能够促进CD8⁺T细胞及其他TCR通路介导激活的效应T细胞或人工制备的效应T细胞(包含但不限于CAR-T，TCR-T细胞)的效应功能从而提高肿瘤免疫治疗效果，从多方面验证了尿石素A的抗肿瘤免疫功能，拓宽了对于尿石素A的认识。

尿石素A对于CD8⁺T细胞功能的调控也进一步揭示了菌群代谢产物与免疫系统的互作，为深入挖掘更多的调控免疫的代谢产物提供了理论基础，并为肿瘤患者提供了有前景的免疫治疗策略，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中尿石素A增强T细胞TCR通路的活化；

其中：A为基于Jurkat-NFATLuc细胞的TCR通路筛选体系原理模式图和验证图；B为筛选影响TCR通路的菌群代谢物图；C为尿石素A浓度梯度作用于筛选体系的结果图；D为Western blot检测PLCγ1,ZAP70和LCK蛋白的磷酸化水平图。

图2为本发明实施例中尿石素A促进CD8⁺T细胞的功能；

其中：A为通过流式检测尿石素A诱导后CD8⁺T细胞的细胞因子分泌情况；B为尿石素A及对照组诱导后的CTL杀伤靶细胞EL4-Fluc的体系和统计图，C为激光共聚焦高内涵成像分析系统对CTL杀伤EL4-Fluc的实时监测图。

图3为本发明实施例中尿石素A促进CAR-T细胞的功能；

其中：A为通过流式检测19BBz-CAR被成功构建到T细胞的结果图；B为尿石素A及对照诱导的19BBz-CAR-T细胞杀伤Nmalwa细胞后上清中TNF-α、IFN-γ和IL-2的检测情况；C为尿石素A及对照诱导的19BBz-CAR-T细胞杀伤Nmalwa细胞的百分比。

图4为本发明实施例中尿石素A促进CD8⁺T细胞过继回输治疗；

其中：A为EG7皮下瘤模型构建及过继回输策略图；B为回输对照及尿石素A诱导组CTL后，两组小鼠肿瘤生长曲线图；C为EG7肿瘤模型各组肿瘤大小图；D为B16F10-OVA尾静脉转移瘤模型构建及过继回输策略图；E为小动物活体成像仪检测到的肿瘤大小图；F为小动物活体成像结果统计图；G图为B16F10-OVA尾静脉转移瘤模型各组生存期结果；H图为B16F10-OVA尾静脉转移瘤小鼠肺部肿瘤大小图；I图为B16F10-OVA尾静脉转移瘤小鼠回输后第10天外周血中回输细胞的比例图；J图B16F10-OVA尾静脉转移瘤小鼠肺部肿瘤微环境中回输细胞的比例图。

图5为本发明实施例中口服灌胃尿石素A通过促进CD8⁺T细胞的功能介导抗肿瘤免疫；

其中：A为B16F10皮下瘤小鼠模型构建及口服灌胃对照及尿石素A策略图；B为两组小鼠肿瘤生长曲线图；C为两组小鼠肿瘤大小图；D为通过流式检测两组小鼠肿瘤和脾脏CD8⁺T细胞的比例图；E为流式检测后统计的肿瘤和脾脏中CD8⁺T细胞的比例结果图；F为流式检测两组小鼠肿瘤浸润CD8⁺T细胞的功能图；G为两组小鼠各个脏器的HE染色图。

图6为本发明实施例中口服灌胃尿石素A可促进PD1阻断抗体治疗效果；

其中：A为B16F10皮下瘤小鼠模型构建及联合治疗策略图；B为各组小鼠肿瘤生长曲线图；C为各组小鼠生存期统计图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例

实验方法

1、基于Jurkat-NFATLuc细胞的TCR通路筛选体系的构建

(1)构建NFATLuc表达质粒pultra-BSD-NFATLuc,将pultra-BSD-NFATLuc转入Jurkat T细胞(急性T细胞白血病细胞)中构建NFATLuc稳定表达的Jurkat-NAFTLuc细胞系，使用Blasticidin进行筛选；

(2)使用代谢产物预处理Jurkat-NAFTLuc细胞2h，2h后加入hCD3,hCD28和兔抗鼠IgG交联抗体刺激4h；

(3)加入10XFLuc-Lysis裂解液，室温裂解30min；

(4)加入FLuc Assay Working Solution,利用微孔板式发光仪(LB960)检测荧光强弱来表示TCR被激活的程度。

2、Western Blot检测TCR通路的磷酸化蛋白

(1)收集尿石素A及对照诱导的CD8⁺T细胞；

(2)将收集的细胞进行离心，用PBS冲洗3遍，每管中加入50ul蛋白裂解液，然后加入10ul的5×蛋白上样液，100℃条件下煮蛋白，变性10min；

(3)电泳。加入5ul蛋白marker，每孔加入10ul样品。上层胶电泳条件80V、30min；下层胶电泳条件120V、120min；

(4)转膜。电泳结束后，将PVDF膜在无水甲醇中浸泡5min，400mA转膜70min。电极板放置顺序：白色夹板(正极)-海绵-滤纸-PVDF膜-蛋白胶-滤纸-海绵-黑色夹板(负极)；

(5)封闭。转膜结束后，取膜于甲醇溶液中固定3min，然后用提前配置好的5％的BSA进行封闭，在摇床上摇动封闭2h；

(6)孵育一抗。封闭结束后，4℃过夜孵育一抗。一抗为Mouse p-Plcy1,p-Zap70和p-Lck，该抗体以1：1000浓度用TBST稀释；

(7)用配置好的1×TBST缓冲液冲洗过夜后的PVDF膜，冲洗3次，每次10min；

(8)孵育二抗，常温下孵育1h。二抗为兔抗体，该抗体以1：10000浓度用TBST稀释；

(9)用配置好的1×TBST缓冲液冲洗PVDF膜，冲洗3次，每次10min。加入显影液，进行显影，曝光时间3min左右。

3、流式细胞术检测CD8⁺T细胞的细胞因子分泌

(1)尿石素A诱导OT1细胞6天；

(2)使用Coating buffer使mCD3(2c11)终浓度为1ug/ml,mCD28(pv1)终浓度为3ug/ml，24孔板，每孔加250ul，4℃，过夜；

(3)24孔板，每孔5×10⁵个CD8⁺T细胞，mCD3(2c11)和mCD28(pv1)刺激2h；

(4)加入BFA(1:1000)，再刺激4h；

(5)收取细胞，1000rpm，5min离心，弃上清液；

(6)100ulPBS重悬细胞，加入相应的荧光标记的表面分子抗体，4℃避光45min；

(7)PBS洗细胞2次，以除去未结合的多余抗体成分，500μl PBS buffer重悬细胞，吹打混匀，置于流式管，上机分析；

(8)对于需要进行胞内染色的样品，4％多聚甲醛固定20min后，PBS洗2次，0.1％Triton X-100穿膜30min，PBS洗1次，然后进行胞内染色，步骤同表面染色；

(9)用流式细胞仪CytExpert检测样品，并分析。

4、利用微孔板式发光仪(LB960)检测CD8⁺T细胞对EL4-FLuc的杀伤实验

CD8⁺T细胞对EL4-FLuc的杀伤实验主要采用生物发光的方法进行体外杀伤检测，设四组效靶比，分别为10:1、5:1、2.5:1和1.25:1。具体如下：

(1)取1×10⁵靶细胞(提前孵育OVA257-264抗原肽)于96孔板中，加入相应数量的尿石素A诱导的(对照组)细胞，混匀，终体系为200ul，设靶细胞组和效应细胞组；

(2)效应细胞和靶细胞共培养6h，离心，弃50ul上清；

(3)加入10XFLuc-Lysis裂解液16.6ul，室温裂解30min；

(4)加入FLuc Assay Working Solution,利用微孔板式发光仪(LB960)检测荧光值。

每组杀伤值按下式计算：

每组杀伤效率(％)＝(1-实验孔/靶细胞最大释放孔)*100％

5、慢病毒的包装以及CAR-T细胞的构建

首先进行慢病毒包装，待病毒包装成功后再感染T细胞构建CAR-T。

取6×10⁶个293T细胞接种于10cm²细胞培养皿中，过夜，待细胞密度达到80％时，更换6ml新鲜DMEM培养基。

(1)2h后进行包装病毒，向EP管中加入500μlOPMEM，混入下述质粒，混匀；

(2)另准备新的1.5ml EP管，加500μL OPMEM和60ul PEI；

(3)将2)加入1)，混匀，室温静置15min；

(3)将上述混合液加入293T细胞中，十字法混匀，培养箱培养6h；

(4)6h后更换6ml新鲜培养基，继续培养；

(5)48h后收集第一批病毒，并加入6ml新鲜培养基；

(6)72h后收集第二批病毒，此时可用荧光显微镜观察GFP荧光强度检测转染效率；

收集的病毒离心取上清，用0.22μm的滤膜过滤，然后进行浓缩。浓缩使用Backman超速离心机，32Ti转子，12000rpm×90min，弃上清后使用200μLX-VIVO(loza)培养基重悬，震荡30min后长期冻存于-80℃，并且对病毒进行滴度检测。

取MOI＝50的病毒量感染10×10⁴个T细胞，于24孔板中离心感染，600g×60min，感染后将T细胞转移至新鲜培养基中培养。

6、人T细胞的获取

首先获取健康志愿者的PBMCs：

⑴取10ml血液至50mlep管中，使用PBS按照1：1的比例进行稀释(10ml)；

⑵取Ficoll按照1:1(10ml)的比例准备于新的50ml离心管中；

⑶将PBS/血液混合液贴壁缓慢加入到Ficoll上层，尽量勿使红细胞沉降至管底；

⑷于水平式离心机，16℃，800g×30min，升速5降速0；

⑸吸取白色雾状层于新的15ml离心管中，加入PBS 1:1清洗，600g×10min，弃上清；

⑹沉淀即为PBMCs，将PBMCs适量放入24孔板中培养，每孔加入10μLCD3/CD28beads(美天旎)进行激活，激活48h后，增殖起来的即为T细胞。

7、小鼠体内实验

本研究使用维通利华公司提供的C57BL/6J雄性小鼠(CD45.2背景)，6～8周龄，体重18～22g，饲养条件按照SPF级动物标准执行。

EG7皮下瘤模型为每只小鼠皮下接种2×10⁶个细胞进行荷瘤造模，随后小鼠被随机分成2组，每组4只小鼠。然后每组回输尿石素A诱导组及对照组CD45.1⁺CD8⁺T细胞，每只小鼠回输4×10⁶个，体系200ul。随后观察小鼠的肿瘤生长情况。

B16F10-OVA尾静脉转移瘤小鼠模型为每只小鼠尾静脉回输3×10⁵个细胞进行荷瘤造模，随后小鼠被随机分成2组，每组8只小鼠。然后每组回输尿石素A诱导组及对照组CD45.1⁺CD8⁺T细胞，每只小鼠回输4×10⁶个，体系200ul。随后通过小动物活体成像仪检测小鼠的肿瘤生长情况，同时记录小鼠的生存期。另外取小鼠的外周血及肿瘤组织，利用流式细胞术检测回输细胞的比例。

B16F10皮下瘤模型为每只小鼠皮下接种1.25×10⁵个细胞进行荷瘤造模，随后小鼠被随机分成2组，每组4只小鼠。组1口服灌胃玉米油，组2口服灌胃尿石素A。随后观察小鼠的肿瘤生长情况。实验终点，取小鼠脾脏和肿瘤组织，使用流式细胞术检测CD8⁺T细胞的比例及功能。

B16F10皮下瘤模型为每只小鼠皮下接种1.25×10⁵个细胞进行荷瘤造模，随后小鼠被随机分成4组，每组5只小鼠。组1口服灌胃玉米油，组2进行PD1抗体阻断治疗，组3口服灌胃尿石素A，组4口服灌胃尿石素A联合PD1抗体阻断治疗。随后观察小鼠的肿瘤生长情况及小鼠的生存期。

实验结果

以体外结果和体内结果的顺序进行展示，进一步阐述尿石素A在肿瘤免疫治疗中应用：

1、尿石素A对于T细胞TCR通路的调控

本发明首先构建了基于激活TCR(T细胞受体)通路的筛选体系用来检测T细胞的活化变化。该体系主体是Jurkat-NFATLuc细胞(图1A)，原理为当加入hCD3,hCD28和兔抗鼠IgG交联抗体后，TCR通路会被激活进一步启动NFAT转录因子，从而启动下游的荧光素酶基因的表达。一旦启动后，裂解Jurkat-NFATLuc细胞，加入荧光素酶底物，即可检测到生物发光。根据荧光的强弱，可以衡量TCR通路激活的程度。

本发明使用了一系列菌群代谢产物来处理Jurkat-NFATLuc细胞，同时使用hCD3,hCD28和兔抗鼠IgG交联抗体刺激。刺激结束后，加入裂解液裂解细胞，之后加入荧光素酶底物，利用微孔板式发光仪(LB960)检测荧光强弱来表示TCR被激活的程度。结果表明尿石素A能够显著促进TCR通路的活化(图1B)。本发明使用不同浓度的尿石素A处理Jurkat-NFATLuc细胞，发现尿石素A可浓度梯度激活TCR通路(图1C)。TCR通路中PLCγ1,ZAP70和LCK蛋白的磷酸化也可以证实TCR通路的激活，本发明将尿石素A预处理Jurkat T细胞，使用hCD3,hCD28和兔抗鼠IgG交联抗体分别刺激0、5、10和15分钟，利用Westernblot检测发现尿石素A可以显著升高PLCγ1,ZAP70和LCK蛋白的磷酸化水平，从而进一步明确了尿石素A对TCR通路的活化(图1D)。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

筛选到代谢产物尿石素A可以促进T细胞的TCR通路激活，为探究尿石素A对CD8⁺T细胞功能的调控实验的顺利进行奠定了基础。

2、尿石素A对于CD8⁺T细胞的抗肿瘤功能调控

为了探究尿石素A对CD8⁺T细胞功能的调控，本发明使用OTI TCR转基因小鼠的CD8⁺T细胞诱导成熟的CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，并加入尿石素A进行处理。诱导6天后，加入小鼠的CD3(2c11)和CD28(pv1)抗体包板刺激6h，利用流式细胞术检测CD8⁺T细胞分泌细胞因子IFN-γ，Granzyme B，CD107A和IL-2的能力，结果显示尿石素A处理显著促进了CD8⁺T细胞的细胞因子分泌(图2A)。此外，将诱导的CD8⁺T细胞与表达荧光素酶的肿瘤细胞EL4-FLuc(靶细胞)共培养，通过检测共培养体系中荧光素酶含量可以计算存活靶细胞的比例，明确CD8⁺T细胞的杀伤能力。本杀伤实验中设立多个效靶比，分别为1.25:1、2.5:1、5:1和10:1，杀伤时长为6小时。结果显示，与对照组相比，尿石素A处理显著增强了CD8⁺T细胞的杀伤肿瘤细胞功能(图2B)。同时，本发明使用了激光共聚焦高内涵成像分析系统进行了实时监测杀伤肿瘤过程，得到同样的结论(图2C)。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

尿石素A处理能够促进CD8⁺T细胞的分泌细胞因子以及杀伤肿瘤细胞的功能。

3、尿石素A对CAR-T细胞抗肿瘤功能的调控

针对CD19抗原的CAR-T技术在慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗中的取得了很大的成功。患者本身的T细胞功能活性对于其体外扩增以及CAR-T构建改造非常关键。但是由于很多患者本身的T细胞功能严重底下，严重限制了CAR-T的治疗效果。因此本发明进一步探究是否可以利用尿石素A增强体外扩增的CAR-T细胞的效应功能。

本发明中涉及的CAR为包含4-1BB和CD3ζ的二代CAR(19BBz-CAR)。

本发明使用Ficoll密度梯度离心法提取健康人的外周血单个核细胞(PBMCs)，PBS清洗后置于24孔板中培养，每孔加入10μl CD3/CD28磁珠(美天旎)，48h后增殖的细胞即为T细胞。使用浓缩的CAR慢病毒对T细胞进行感染，MOI＝50，感染12h，换液，72h以后在荧光显微镜下观察CAR-T细胞GFP的表达。另外，通过流式细胞术检测发现，40％-60％的CAR-T细胞表达GFP(图3A)，表明CAR被成功地构建于T细胞。

为了探究尿石素A对CAR-T细胞效应功能的影响，本发明使用尿石素A处理构建的CAR-T细胞7天。之后将CAR-T细胞与靶细胞Namalwa在按照4:1、2:1和1:1的不同效靶比进行共培养18h，通过ELISA方法检测了共培养上清中的效应分子TNF-α、IFN-γ和IL-2的含量，其含量的高低与CAR-T细胞杀伤能力的强弱成正比。结果显示：与靶细胞Namalwa共孵育后，CAR-T细胞释放的TNF-α、IFN-γ和IL-2要远高于对照细胞组(图3B)。同时，使用红色荧光染料标记Namalwa细胞，共培养结束后，使用anti-human CD3(FITC)抗体标记CAR-T细胞染。通过流式细胞术检测对照组及实验组CAR-T细胞杀伤的百分比，进一步明确尿石素A对CAR-T细胞功能的调控。结果表明：尿石素A处理后，CAR-T细胞的杀伤能力显著上调(图3C)。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

尿石素A可显著上调CAR-T细胞对于肿瘤细胞的效应功能。

4、尿石素A增强了过继回输T细胞治疗肿瘤效果

实验用小鼠为C57BL/6J(CD45.2)雄性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，由维通利华公司提供，饲养条件按照SPF级动物标准执行。所有涉及到小鼠的实验完全按照山东大学动物保护和利用委员会的要求执行。

C57BL/6J小鼠皮下接种EG7细胞进行荷瘤造模，然后随机分成2组，每组4只，之后尾静脉回输效应CD8⁺T细胞：组1回输对照组CD8⁺T(CD45.1)细胞，组2回输尿石素A处理组CD8⁺T(CD45.1)细胞，记录小鼠肿瘤生长曲线。结果显示：回输尿石素A处理的CD8⁺T细胞显著抑制了小鼠的肿瘤生长(图4A和B)，并缩小了肿瘤体积(图4C)，说明尿石素A诱导后的CD8⁺T细胞在体内具有较强的清除皮下肿瘤的能力。

C57BL/6J小鼠尾静脉接种B16F10-OVA细胞进行荷瘤造模，然后随机分成2组，每组4只，之后尾静脉回输效应CD8⁺T细胞：组1回输对照组CD8⁺T细胞，组2回输尿石素A诱导组细胞。利用小动物活体成像仪动态检测肿瘤生长情况，并观察小鼠生存情况。第10天，检测两组小鼠外周血中回输细胞的含量。实验终点，处死小鼠检测肿瘤微环境中回输细胞的含量。小鼠活体成像统计结果显示，回输尿石素A处理组CD8⁺T细胞的小鼠肿瘤生长较慢，说明CD8⁺T细胞成功地抑制了肺转移瘤的生长和增殖(图4D、E和F)。统计小鼠生存情况，发现回输尿石素A组小鼠生存周期更长(图4G)。同时，肺部的肿瘤大小显著减小(图4H)。流式细胞术检测回输后外周血中回输细胞的比例，表明尿石素A诱导的细胞存活能力更强(图4I)。对肿瘤微环境中回输细胞的检测进一步表明尿石素A诱导的CD8⁺T细胞浸润到肿瘤部位的能力和存活能力都优于对照组(图4J)。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

尿石素A处理CD8⁺T细胞后，能够显著促进CD8⁺T细胞在体内的抗肿瘤能力，提高过继回输T细胞治疗肿瘤的效果。

5、口服尿石素A可直接促进抗肿瘤免疫

实验用小鼠为C57BL/6J(CD45.2背景)雄性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，由维通利华公司提供，饲养条件按照SPF级动物标准执行。所有涉及到小鼠的实验完全按照山东大学动物保护和利用委员会的要求执行。

C57BL/6J小鼠皮下接种B16F10细胞进行荷瘤造模，然后小鼠被随机分成2组，每组4只，之后口服灌胃：组1口服灌胃玉米油，组2口服灌胃尿石素A(50mg/kg)，记录小鼠肿瘤生长曲线。结果显示：口服灌胃尿石素A组小鼠肿瘤生长较慢(图4A和B)，肿瘤体积较小(图4C)，说明口服灌胃尿石素A具有抗肿瘤效应。实验终点，取两组小鼠脾脏和肿瘤浸润单个核细胞，通过流式细胞术检测CD8⁺T细胞的比例和功能。结果显示：口服灌胃尿石素A组小鼠各个器官中CD8⁺T细胞的比例上调(图4D和E)，同时，肿瘤浸润TIL细胞因子分泌能力显著上调(图4F)。

最后，本发明通过HE染色表征口服灌胃尿石素A对小鼠各个脏器的病理损伤情况，结果表明：口服灌胃尿石素A不会对小鼠脏器造成病理性损伤(图4G)。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

小鼠口服灌胃尿石素A是安全的。口服灌胃尿石素A可以通过上调CD8+T细胞的功能增强小鼠抗肿瘤能力。

6、口服上述尿石素A促进了PD1阻断的治疗效果

实验用小鼠为C57BL/6J(CD45.2背景)雄性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，由维通利华公司提供，饲养条件按照SPF级动物标准执行。所有涉及到小鼠的实验完全按照山东大学动物保护和利用委员会的要求执行。

C57BL/6J小鼠皮下接种B16F10细胞进行荷瘤造模，然后小鼠被随机分成4组，每组5只，之后口服灌胃尿石素A和进行PD1阻断抗体治疗：组1口服灌胃玉米油，组2PD1阻断抗体治疗(100ug/次，每2-3天打一次)，组3口服灌胃尿石素A，组4口服灌胃尿石素A联合PD1阻断抗体治疗，记录小鼠肿瘤生长曲线和小鼠生存期。结果显示：与对照组相比，PD1阻断抗体治疗和口服灌胃尿石素A可以减缓肿瘤生长，其中口服灌胃尿石素A组效果要优于PD1抗体治疗组。口服灌胃尿石素A联合PD1阻断抗体治疗，可进一步提高抗肿瘤治疗效果，同时小鼠的生存期也更长(图6A、B和C)。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

口服灌胃尿石素可以提高免疫检查点阻断癌症疗法的治疗效果。

综上，本发明筛选到的肠道菌群代谢产物尿石素A，有望成为一种新型的抗肿瘤代谢产物。通过多种小鼠体内实验，研究者从多方面验证了尿石素A的抗肿瘤免疫功能。尿石素A对于CD8⁺T细胞功能的调控也进一步揭示了菌群代谢产物与免疫系统的互作，为深入挖掘更多的调控免疫的代谢产物提供了理论基础。

本发明未尽事宜为公知技术。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.尿石素A在如下a1)-a2)至少一种中的应用：

a1)促进Jurkat-NFATLuc细胞中TCR通路活化；

a2)促进CAR-T细胞对于肿瘤细胞分泌效应因子，所述效应因子为TNF-α、IFN-γ和IL-2；

上述应用均在体外环境中进行，且所述应用不包含疾病诊断和治疗用途。