CN109316478A - 一种尿石素a在制备抗衰老的药物、化妆品中的应用及药物、化妆品 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种尿石素A在制备抗衰老的药物、化妆品中的应用及药物、化妆品，本发明通过尿石素A在抗衰老的药物、化妆品的应用，其能够增加细胞中胶原蛋白的含量，增加细胞中I型胶原蛋白的表达，减少细胞中基质金属蛋白酶‑1的表达，减少细胞内自由基的累积，具有启动并延缓细胞衰老的作用，效果显著，对于抗衰老方面均有显著促进作用，且无毒副作用，可安全地使用，且本发明具有广泛应用前景，重要社会意义和经济价值。

Description

一种尿石素A在制备抗衰老的药物、化妆品中的应用及药物、 化妆品

〖技术领域〗

本发明属于生物医药领域，且特别涉及一种尿石素A在制备抗衰老的药物、化妆品中的应用及药物、化妆品。

〖背景技术〗

尿石素A是鞣花单宁及鞣花酸在动物体内肠道微生物作用下的主要降解产物。石榴、草莓、覆盆子、黑莓、核桃、麝香葡萄等食物富含鞣花单宁，但是当食用此类食物后，鞣花单宁的吸收非常低，相反的在血液和尿液中能检测到大量的尿石素A的存在，这提示我们尿石素A可能是生物体内发挥作用的有效活性形式。使用特定细胞模型的体外研究可以有助于解开尿石素A在体内发挥作用的真正机制。体外诸多细胞系的研究表明尿石素A具有抗癌、抗炎、抗氧化的作用，但对于尿石素A抗衰老的研究却鲜有报道，因此我们使用复制性衰老的人皮肤成纤维细胞来探究尿石素A对衰老皮肤细胞的作用，揭示尿石素A 是具有抗衰老机制的。

〖发明内容〗

本发明提供了一种尿石素A在制备抗衰老的外用药物中、化妆品中的应用及药物、化妆品。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出了式(I)所示的尿石素A在制备延缓细胞衰老的组合物中的应用，

式(I)所示的尿石素A，其化学式：C13H8O4；分子量：228.2。

本发明中，所述化合物尿石素A可通过化学方法合成也可通过市场上购买获得。

本发明中，所述组合物包括药物组合物、食品、保健品或化妆品。所述组合物的剂型包括：洗剂、浴剂、搽剂、酊剂、油剂、霜剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴膏、贴片、涂膜剂、膜剂、凝胶剂、巴布剂、敷剂、喷雾剂、气雾剂、植入剂、乳剂、栓剂、片剂、胶囊、丸剂、注射剂、粉剂等。

本发明中，所述式(I)化合物尿石素A在组合物中的含量为0.0001wt％～99.9wt％。优选地，含量为0.001wt％～90wt％。优选地，含量为0.001wt％～10wt％。优选地，为0.001wt％～1wt％质量浓度。更优选地，含量为0.0001wt％～0.1wt％。

本发明中，所述组合物还含有其他细胞抗氧化和/或细胞抗癌的活性物质。

本发明中，所述化合物尿石素A还可以作为添加剂形式使用，再与相对应的辅料调配成酊剂、霜剂、软膏剂、乳剂、贴剂等等，用于抗衰老、抗氧化领域的问题，适用于局部涂抹和经皮给药。

本发明还提出了一种组合物，其含有：有效量的式(I)化合物尿石素A；以及，药学上可接受的载体，食品、保健品或化妆品可接受的载体。

本发明还提出了一种组合物，其含有：有效量的式(I)化合物尿石素A；药学上可接受的载体，食品、保健品或化妆品可接受的载体；以及，一种或多种其他抗衰老、抗氧化的活性物质。

进一步地，本发明组合物还可以添加表面活性剂、透皮吸收促进剂、防腐剂、抗氧剂、保湿剂、香精、香料等辅料。

本发明中，有效量是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物接受的量。药学上可接受的载体、化妆品可接受的载体是指包括各种赋形剂和稀释剂，为本领域技术人员所知悉。

本发明中，式(I)化合物尿石素A活性成分在组合物中的含量为0.0001wt％～99.9wt％。优选地，含量为0.001wt％～90wt％。优选地，含量为0.001wt％～10wt％。优选地，为0.001wt％～1wt％质量浓度。更优选地，含量为0.0001wt％～0.1wt％。余量即为药学上可接受的载体、化妆品可接受的载体或其他添加剂等。

本发明中，所述组合物中的载体包括油脂性基质或水溶性基质。所述油脂性基质包括凡士林、植物油、石蜡、硅油、氢化植物油、甘油三酸酯、硬脂酸、十六醇、丙酮、石油醚、油酸乙酯等等。所述水溶性基质包括水、蒸馏水、甘油、明胶、黄原酸胶、壳聚糖、甲基纤维素、聚乙二醇等等。

本发明还提供了一种抗衰老制剂，其含有有效量的式(I)所示化合物尿石素 A。所述抗衰老制剂可进一步包括一种或多种药学上可接受的载体，食品、保健品或化妆品可接受的载体。还可进一步包括一种或多种其他抗衰老的活性物质。还可进一步添加一种或多种表面活性剂、透皮吸收促进剂、防腐剂、抗氧剂、保湿剂、香精、香料等辅料。所述抗衰老、抗氧化制剂中，式(I)化合物尿石素 A活性成在组合物中的含量为0.0001wt％～99.9wt％。优选地，含量为0.001wt％～ 90wt％。优选地，含量为0.001wt％～10wt％。优选地，为0.001wt％～1wt％质量浓度。更优选地，含量为0.0001wt％～0.1wt％。

本发明还提供了一种利用尿石素A或含有该化合物的组合物的延缓细胞衰老过程的方法。所述方法增加细胞中I型胶原蛋白的表达、减少细胞中基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达，减少细胞中自由基的累积，从而减少皮肤的氧化损伤，减少皱纹的产生，使皮肤处于健康有活力的状态。在一个具体实施方案中，将尿石素A或含有该化合物的组合物施用于细胞，实验结果表明细胞衰老期明显延迟。

本发明还提供了一种非治疗目的的美容方法，所述方法包括给予对象施用有效量的尿石素A以促进所述对象的皮肤细胞衰老过程。所述对象包括人类、及其他的动物包括不限于马、狗、猫等。

在一个具体实施方案中，每天一次或多次(例如1次、3次或5次)施用本发明尿石素A或本发明组合物。本发明还可以与其他中草药或西药或生物调节剂或其他施用方法等联合施用。

在一个具体实施方案中，本发明可施用于对象例如人类的皮肤例如手皮皮肤上。

在一个具体实施方案中，本发明可施用于生物对象。

本发明首次公开了尿石素A对于抗衰老的方法及应用，其能够增加胶原蛋白的含量,增加细胞中I型胶原蛋白的表达、减少细胞中基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)的表达的，减少细胞中自由基的累积，具有启动并延缓细胞衰老的作用，起效快且效果显著，对于抗衰老方面均有显著促进作用，且无毒副作用，可用于安全地使用。本发明为临床预防治疗、美容保健等提供了新的途径，可应用于制备皮肤抗皱的药物或化妆品等。本发明还适宜以添加剂形式使用，与相对应的辅料调配成酊剂、霜剂、软膏剂、乳剂、贴剂等等，用于治疗和/或预防皮肤衰老等，可适用于局部涂抹和经皮给药，能明显延缓细胞衰老。本发明具有广泛应用前景，重要社会意义和经济价值。

〖附图说明〗

图1为本发明实施例中人皮肤成纤维细胞(HSF)和基因的复制衰老用尿石素A处理HSF的表达衰老相关的β-半乳糖苷酶染色的年轻和衰老的原发性人皮肤成纤维细胞的实验示意图。

图1A为本发明实施例中年轻的与复制性衰老的皮肤成纤维细胞的β-半乳 糖苷酶染色后细胞β-半乳糖苷酶不同浓度染色示意图。

图1B为本发明实施例中尿石素A处理5天后得到总RNA通过实时qPCR分 析的实验示意图。

图1C、D为本发明实施例中用β-肌动蛋白标准化的结果代表表示三次测定的±SD相对于对照的实验示意图。

图2A为本发明实施例中细胞内ROS用荧光分光光度计测量的实验示意图。

图2B为本发明实施例中荧光显微镜通过DCFH2-DA染色测量细胞内ROS的图像。

图2B为本发明实施例中实时qPCR分析显示中的ARE反应基因的mRNA水平尿石素A治疗5天后的人成纤维细胞的实验示意图。

图3A、3B、3C为本发明实施例中尿石素A对细胞毒性实验的示意图。

图4A、4B、4C为本发明实施例中尿石素A不诱导人皮肤成纤维细胞的凋亡的实验示意图。

图5为本发明实施例中尿石素A在不同含量浓度情况下对细胞毒性的影响示意图。

〖具体实施方式〗

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制的内容。

需注意的是，本发明中所提及的尿石素A包括纯化的尿石素A，以及尿石素 A的药学可接受组合物、化妆品组合物，本发明的尿石素A的药物、化妆品组合物可接受的组合物包括但不限于：组合物酸组合物、氢溴酸组合物、硼酸组合物、磷酸组合物、硫酸组合物、硫酸氢组合物和组合物酸氢组合物、苦味酸组合物、富马酸组合物、马来酸组合物、丙二酸组合物、琥珀酸组合物、酒石酸组合物、甲磺酸组合物和葡萄糖-1-磷酸组合物等。

本发明的药物、化妆品的设置，可以使尿石素A直接经皮肤进行吸收，因此，优选抗衰老的药物剂型、抗衰老的化妆品为外用剂型，便于局部使用，效果更佳。外用剂可以直接作用于患处，避免了通过内服等方式使用药物、化妆品时在人体内的代谢、释放等问题。

下面对本发明实施例的尿石素A在制备抗衰老的外用药物、化妆品中的应用进行具体说明。

尿石素A的分子式为C13H8O4,其结构如式(I)表示如下：

基于以上，本发明提供了一种基于尿石素A用于制备抗衰老的外用药物、化妆品，本发明的药物、化妆品包括尿石素A或其药用组合物、化妆品，并且是作为主要的具有生物活性的有效成分。

进一步地，根据制剂的要求，抗衰老的药物、化妆品还可以包括药学上可接受的载体以及化妆品上可接受的载体，通过发明人已知或公知的不同剂型的制作方式，制作为不同剂型的有效成分为尿石素A的抗衰老的外用药物、化妆品。

由于可以被制作为各种可接受的药剂类型及化妆品类型，而不同的药剂类型及化妆品类型的使用也可做出适应的调整，从而极大地方便用户选用。

其中，“可接受的载体”根据制剂需要而添加，且不会不利地抑制尿石素A 的生活活性的物质。通常地，载体可以是指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、佐剂或其它制剂辅料。例如，稀释剂、赋形剂，如水、生理组合物水或磷酸组合物缓冲液(PBS)等；填充剂，如淀粉等；粘合剂，如纤维素衍生物、藻酸组合物、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮；表面活性剂，如十六烷醇；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。或包括药学上符合使用规定的毒性制剂辅料。

正如前述，本发明的抗衰老的外用药物、化妆品可以被制作为各种需要的剂型。例如，药物的剂型包括洗剂、搽剂、水剂、乳剂、霜剂、膏剂、糊剂以及贴剂中的任一种。化妆品的剂型包括水剂、乳剂、膏剂、胶冻状、锭状、汽溶胶型及固体型中的任一种。特别地，当剂型为洗剂或搽剂时，尿石素A中采用的溶剂包括酒精，有效进行消毒。

或者，其剂型包括液体剂、固体剂、半固体剂或气体剂，液体剂包括溶液剂、注射剂，固体剂包括片剂、胶囊剂，半固体剂包括软膏剂、凝胶剂，气体剂包括气雾剂、喷雾剂。

以上剂型可使用在自然衰老的皮肤上，在自然衰老的皮肤细胞中的I型胶原蛋白合成减少，金属基质蛋白酶1的表达增加，自由基累积量高。

如图1所示，为本发明实施例中尿石素A对基因及蛋白表达的影响的示意图。如图1A所示，年轻的与复制性衰老的皮肤成纤维细胞的β-半乳糖苷酶染色，明显可以看出衰老细胞90％以上的细胞β-半乳糖苷酶不同浓度染色阳性的, 比例尺，200μm。如图1B所示，尿石素A对皮肤成纤维细胞胶原蛋白、弹性蛋白和金属基质蛋白酶1的mRNA表达的影响，尿石素A对弹性蛋白的表达没有明显的影响，当浓度达到20μM时，尿石素A可以显著增加胶原蛋白的mRNA水平，尿石素A可以显著降低金属基质蛋白酶1的mRNA表达量，并且有显著的量效关系。如图1C所示，尿石素A可以显著降低金属基质蛋白酶1的蛋白水平，并且这种降低随着尿石素A浓度的增加而更加显著，对GAPDH的影响不大。如图1D 所示，尿石素A可以显著增加胶原蛋白的表达量，并且有显著的量效关系，对 GAPDH的影响不大。

如图2所示，为本发明实施例中尿石素A对细胞内ROS的影响的实验示意 图。如图2A、2B所示，尿石素A可以明显降低细胞内的ROS含量,B为数据统计 结果，比例尺，200μm；如图2所示，尿石素A可以增加细胞内抗氧化基因的 mRNA水平，并且具有明显的量效关系。血红素加氧酶1(HMOX1)、NADPH脱氢酶， 醌1(NQO1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶，催化亚基 (GCLC)。

更具体地，皮肤成纤维细胞内ROS降低的原因为：抗氧化基因的mRNA表达表达水平随着尿石素A的浓度增加而增加，表明皮肤成纤维细胞内ROS水平的降低是由于抗氧化基因的mRNA的表达增加所致。

根据衰老的自由基理论，随着年龄的增加，自由基的累积损伤是皮肤衰老的重要原因。因此，延缓皮肤老化的有效方法提供外部的抗氧化剂来抑制ROS 的产生和清除过量的ROS。

在本发明实施例的实验中采用的原料之一为：成年男性包皮的皮肤成纤维细胞，该种类细胞的正常传代到50-60代次，用β-半乳糖苷酶染色的方法检测该种类细胞的衰老程度，阳性细胞能够达90％以上。

关于复制性衰老的皮肤成纤维细胞，该种类细胞的倍增时间为96小时左右，在复制性衰老的皮肤成纤维细胞的倍增时间内，该种类细胞的β-半乳糖苷酶表达量增加，且离体培养的复制性衰老的皮肤成纤维细胞增殖的平台期在55代次 (PDL,populationdoublings)左右，本发明实施例的实验中选取倍增时间的 120小时作为数据收集时间点，在此时间点能够更好的观察尿石素A对细胞的影响，使用该种类细胞的β-半乳糖苷酶染色作为提供细胞复制性衰老的直接证据。

皮肤成纤维细胞培养：皮肤成纤维细胞购自中科院昆明细胞库，皮肤成纤维细胞培养基为DMEM加10％的小牛血清(NBCS)、青霉素、链霉素，置于37℃， 5％的二氧化碳培养箱中培养。

β-半乳糖苷酶染色：使用试剂盒染色，试剂盒购于Cell Signaling，将皮肤成纤维细胞铺于六孔板中，培养箱中培养24小时。吸掉培养基，PBS清洗一次，2％甲醛固定液固定10分钟，然后pH6.0的染色液染色过夜。最后用徕卡倒置显微镜进行观察并成像。

RNA提取以及实时定量PCR：实时定量PCR的试剂盒购于上海海方生物，使用细胞裂解液获取皮肤成纤维细胞的总RNA，并将其反转录成cDNA。引物的序列如下表：

实时定量PCR体系为20μl，含有4μlcDNA、0.4ul ROX reference dye2、4.6ulddH2O、0.5μl引物(10μM)和10μlSYBR green mix。均匀的加到96孔板中，每个样品三个复孔，将96孔板放到7500Fast Real-Time PCR System(ABI) 仪器中，运行以下程序95℃、5分钟,95℃、15秒,60℃、1分钟，后面两步 40个循环。数据通过肌动蛋白进行归一化，每个实验至少重复三次。

蛋白免疫印迹：用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液将尿石素A处理过的细胞裂解，收集蛋白，制样后用12％的SDS-PAGE跑胶，然后将蛋白转移到NC膜上，封闭1小时，一抗过夜[MMP-1(Santa Cruz),GAPDH(willget),COL1A(Santa Cruz)]，洗涤三次，对应二抗孵育1小时，化学发光法显色。数据处理使用软件ImageJ,用GAPDH的数值进行归一化处理。

细胞活力测定根据制造商的说明书，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8， DojindoLaboratories，Tokyo，Japan)测定尿石素A对细胞活力的影响。将4 ×103个细胞/孔接种在96孔平底板中，在温育一天后，用指定浓度的尿石素 A处理细胞，然后在10％NBCS存在下在DMEM中培养另外1,3和5天。然后，向各孔中加入10μlCCK-8染料，将细胞在37℃下培养2小时，最后使用uQuant Microplate Spectrophotometer(BioTek，USA)在450nm下测定吸光度。与对照细胞相比，尿石素A处理的细胞的存活率降低表示为百分比，对照细胞被认为是100％存活的。为了确保连续暴露于化合物，将细胞隔天转移到含有新尿石素A的培养基中，将本研究中使用的所有化合物溶解在DMSO储备溶液中。

用相应浓度处理对照群体，最终浓度为0.1％DMSO；每个实验一式三份进行。细胞内ROS产生的评估使用2'，7'-二氯二氢-荧光素二乙酸酯(DCFH2-DA， Sigma-Aldrich Co.，LLC。，USA)测定细胞内ROS。与5mg/ml DCFH2-DA温育 20分钟后，将细胞在PBS中洗涤两次，然后用胰蛋白酶消化并接种在96孔平底板(Perkin Elmer)中。使用Perkin ElmerVictor3V 1420-040平板读数器 (Perkin Elmer，USA)在485nm的激发波长和530nm的发射波长下检测DCF (DCFH2-DA的氧化产物)的信号。用PBS观察到的荧光用于从每个相应的孔中减去样品值。使用倒置荧光显微镜(Leica DMIL-LED)进行DCF荧光成像。

然后评估线粒体膜电位，将细胞与线粒体特异性阳离子四甲基罗丹明甲酯(TMRM，100nM，35分钟，37℃，Invitrogen)一起温育，通过具有535nm激发波长的Leica倒置微型上模获得图像，使用Image J软件定量荧光强度，每个培养皿分析10个细胞区域，每个实验一式三份进行。

DAPI染色用不同浓度的尿石素A处理HSF细胞5天。弃去细胞培养基，用 PBS洗涤细胞两次。将细胞用4％多聚甲醛(pH7.4)固定15分钟，然后用PBS 洗涤两次。将细胞核用10μg/ml的4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Molecular Probes，USA)染色30分钟，然后使用倒置显微镜(具有DFC450C照相机的Leica DMIL-LED显微镜)拍照，激发波长为470nm。

结果复制衰老HSF的群体倍增时间约为4天。本发明在第5天收集数据以更好地观察尿石素A对细胞的影响。

在衰老的人成纤维细胞中HSFsβ-半乳糖苷酶表达的复制衰老增加，因此，β-半乳糖苷酶染色提供细胞复制衰老的直接证据。体外培养的成纤维细胞在约 55次PDL(群体倍增)后达到平台期。本发明将从成人包皮中分离的成纤维细胞传代培养至50-60PDL，然后进行β-半乳糖苷酶染色以确定细胞衰老。在培养物中发现超过90％的β-半乳糖苷酶阳性染色细胞(如图1A所示)。因此，本发明使用这种复制衰老的细胞模型进行以下实验。

尿石素A刺激I型胶原蛋白表达的合成并抑制MMP-1的表达。胶原蛋白是真皮成纤维细胞中最丰富的细胞外基质蛋白。人体内超过90％的胶原蛋白是I 型。弹性蛋白是结缔组织中的弹性蛋白，有助于组织恢复，并有助于维持拉伸和收缩后的形态。MMP-1是一种特异性降解I、II和III型胶原蛋白的胶原酶。在自然老化的皮肤中，I型胶原蛋白合成减少，MMP-1表达增加。

首先尿石素A处理细胞中I型胶原蛋白，弹性蛋白和MMP-1表达的表达。尿石素A处理5天后，未发现弹性蛋白mRNA表达的显着变化。在用20μM和50 μM尿石素A处理的细胞中胶原mRNA表达显着增加，并且以尿石素A剂量依赖性方式显着降低MMP-1的mRNA表达(如图1B所示)。然后对蛋白质印迹分析，以比较从尿石素A处理和未处理细胞以及未处理的对照细胞中提取的蛋白质。发现尿石素A处理的细胞中的I型胶原蛋白表达上调(如图1D所示)，而MMP-1 表达显着下调(如图1C所示)。结论为：响应于不同的尿石素A浓度，I型胶原蛋白水平的剂量依赖性增加是由于MMP-1的下调，这降低了I型胶原蛋白降解。

尿石素A减少细胞内ROS的产生并上调HSFs的Nrf2下游ARE反应基因的表达。根据衰老的ROS理论，ROS的积累是一个主要因素。因此，延缓皮肤衰老过程的有效方法是提供外部抗氧化剂，以抑制ROS的产生或消除过量的ROS。衰老细胞中ROS明显增加。使用DCFH2-DA来检测细胞内ROS，复制的衰老HSF显示出明显的荧光染色(图2B)，用尿石素A治疗5天后，细胞内ROS水平显着降低(图2A和2B)，表明尿石素A在衰老细胞中减弱ROS。

尿石素A可以激活Nrf2/ARE途径以刺激皮肤成纤维细胞中细胞内ROS产 生的淬灭。对于含有ARE的基因下游Nrf2的mRNA水平，如超氧化物歧化酶1 (SOD1)，NAD(P)H脱氢酶，醌1(NQO1)，谷氨酸-尿石素A处理后，半胱氨 酸连接酶催化亚基(GCLC)和血红素加氧酶1(HMOX1)，在HSF细胞中。定量 RT-PCR分析显示这些基因的mRNA表达以剂量依赖性方式显着增加(图2)。总 体而言，分析结果支持尿石素A调节细胞ROS水平的观点，至少部分地通过激 活Nrf2介导的抗氧化反应来调节皮肤成纤维细胞中细胞内ROS的产生。

尿石素A没有改变细胞衰老的命运由于尿石素A增加I型胶原蛋白表达并降低细胞内ROS水平，表明非常强的抗衰老潜力。

使用CCK-8测定来确定细胞活力并评估尿石素A在不同持续时间(天)和暴露浓度下的作用，结果显示低剂量(10μM和20μM)的尿石素A对细胞活力没有显着影响，但是50μM的尿石素A显着降低了细胞活力，并且效果是暴露时间依赖性的(图3A)。衰老皮肤成纤维细胞的复发减慢主要是由于细胞周期阻滞在G1期，细胞周期试验表明，大约90％的复制衰老细胞处于G1期。然而，虽然5天低剂量(10μM)尿石素A治疗对细胞周期没有显着影响，但50μM的尿石素A减少了G1期和S期的细胞数量，并显着增加了细胞数量G2/M期(图 3B和3C)，表明显着的G2/M细胞周期阻滞。这些结果表明抑制细胞增殖是由于 G2/M细胞周期阻滞。

尿石素A不会诱导HSF细胞凋亡。证据表明诱导的G2/M细胞周期停滞可能反过来导致凋亡反应。之前的研究还表明，高剂量(50-100μM)的尿石素A可诱导癌细胞凋亡。检查了一些生物学指标为了验证尿石素A治疗后细胞是否经历细胞凋亡。细胞凋亡可以通过其特有的核变化与坏死区分开来。DAPI是核染色，当在荧光显微镜下激发时，其被观察为蓝色荧光。如图4A所示，在50μM 尿石素A处理5天后，细胞核没有显着变化。Bcl-2被特别认为是一种重要的抗凋亡蛋白，位于线粒体的外膜上，它在促进细胞存活中发挥重要作用。定量 RT-PCR分析显示Bcl-2的mRNA表达以剂量依赖性方式显着增加(图4B)。线粒体膜电位降低被认为是细胞凋亡的最初和不可逆转的步骤。为了评估线粒体膜电位，我们量化了阳离子TMRM的平均线粒体荧光强度。结果显示，在尿石素A 处理后，HSF的线粒体膜电位没有显示出任何明显的变化(图4C)。

综合以上，实验结果证明用尿石素A处理的细胞不会引起细胞凋亡。那么对于上述细胞的周期阻滞引起的细胞内部反应最有可能的是自噬，的研究表明，短期尿石素A给药会激活秀丽线虫和哺乳动物细胞的自噬，这导致细胞内线粒体含量的下降，而长期的尿石素A的处理则会导致线粒体含量的增加，这表明尿石素A处理能激活线粒体的生物发生，从而提高细胞的活力状态，呈现出年轻态。这与我们的结果是一致的。

其中尿石素A的毒理实验，包括：1.急性毒性试验：包括口服、静脉注射和最大限量给药实验；2.Ames实验；3.小鼠骨髓细胞微核实验；4.鼠精子畸形实验；5.小鼠睾丸染色体畸变实验；6.慢性致死实验；7.亚慢性毒性(90天喂养) 实验；8.传统致畸实验；实验结果表明尿石素A属无毒物质。

在此之外，如图4所示，从细胞毒性的结果可以看出，使用时，20uM以下尿石素A是相对日常安全使用的浓度，高于20uM浓度尿石素A会导致细胞表皮或者真皮细胞的细胞周期阻滞，可以在医生指导下使用为去除结疤等作用。但是由于浓度越高，对胶原蛋白的增加以及抗氧化基因的表达约显著，因此，而可以考虑短时间内的高浓度暴露，以达到最佳的使用效果。所以为了更好的陈述尿石素A的有效浓度范围，使用表皮细胞(HaCaT)进行了尿石素A抗氧化的有效浓度检测，如图5所示，使用200uM H2O2处理细胞1小时，而后用不同浓度的尿石素A处理细胞，24小时后看细胞的活力，实验结果显示，即使尿石素A 低至0.0001uM，尿石素A依然具有保护细胞的作用。所以尿石素A的有效浓度范围可以界定到0.0001uM，但考虑到综合的功效推荐使用的最佳浓度为0.01uM。

临床试验

本发明实施例1提供一种含有尿石素A的抗衰老组合物，包括有按重量百分比计算的如下组分：尿石素A 0.0001％～0.1％、聚氧乙烯(21)硬脂酸醚 (Brij721)2％～3％、硬脂酸甘油酯(tegrin)1.0％～1.2％、硬脂醇4％～6％、三癸酸丙三醇酯/辛酸丙三醇酯12％～13％、丁二醇2％～4％、甘油1％～3％、防腐剂 0.4～0.6％、香精0.4％～0.6％、甲氧基肉桂酸辛酯(紫外线屏蔽剂)7％～8％、水 60％～71％。

本发明另一实施例2提供一种含有尿石素A的抗衰老组合物，包括有按重量百分比计算的如下组分：尿石素A0.0001％～0.1％、EDTA0.1％～0.2％、增溶剂 0.5％～1.5％、香精0.2％～0.4％、乙醇4％～6％、苯甲酮-4(紫外线屏蔽剂)0.12％～ 0.14％、水75％～80％。

制得足够多的抗衰老的外用组合物，包括实施例1所述含有尿石素A的抗衰老组合物和实施例2所述含有尿石素A的抗衰老组合物，选择试验者100名(男女比1：1)，使用本发明实施例1-2制得的用于抗衰老组合物，每日使用三次。经验证，93％的试验者在使用本发明提供的用于抗衰老组合物后5d后，皮肤情况明显改善。

综上，本发明实施例的尿石素A在制备用于抗衰老的外用药物、化妆品中的应用及药物、化妆品，能有效延缓皮肤衰老症状，效果佳，同时无任何毒副作用。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.式(Ⅰ)所示的尿石素A在制备抗衰老的组合物中的应用，

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物以尿石素A为活性成分。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物还包括药物组合物或化妆品。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物还含有药学上或化妆品可接受的载体。

5.式(Ⅰ)所示的尿石素A在制备增加细胞中胶原蛋白的表达的抗衰老的组合物中、减少细胞中基质金属蛋白酶-1的表达的抗衰老的组合物中、减少细胞中自由基的累积的抗衰老的组合物中的应用，

6.式(Ⅰ)所示的尿石素A在制备抗衰老的制剂中的应用，

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为减少细胞中自由基的累积、减少细胞中基质金属蛋白酶-1的表达、增加细胞中胶原蛋白的表达。

8.一种非治疗目的的美容方法，其特征在于，所述方法包括给予对象施用权利要求1中式(I)所示的化合物尿石素A以延缓所述对象的皮肤衰老过程。

9.一种用于抗衰老的外用药物，其特征在于，包括0.0001wt％～0.1wt％的权利要求1中式(I)所示的化合物尿石素A或其可药用组合物。

10.一种用于抗衰老的化妆品，其特征在于，包括0.0001wt％～0.1wt％的权利要求1中式(I)所示的化合物尿石素A的组合物或其盐。