CN111939152A

CN111939152A - 鞣花酸代谢产物Urolithin A在制备抗肠道病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN111939152A
Application number: CN202010976153.5A
Authority: CN
Inventors: 王盛羽; 孙欣; 何灿粲; 乔俊华; 田浪飞; 陈雅萍
Original assignee: Zunyi Medical University
Current assignee: Zunyi Medical University
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN111939152B

Abstract

本申请公开了药物制剂技术领域中的鞣花酸代谢产物Urolithin A在制备抗肠道病毒药物中的应用，尤其是在制备防治肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)的药物中的应用。本发明通过UroA对EV71病毒滴度以及对EV71蛋白表达的影响，显示Urolithin A能在基因和蛋白水平抑制EV71的复制。证明所述的Urolithin A有明显的抗EV71的作用，可用于制备抗EV71的药物。

Description

鞣花酸代谢产物Urolithin A在制备抗肠道病毒药物中的应用

技术领域

本发明药物制剂技术领域，具体涉及鞣花酸代谢产物Urolithin A在制备抗肠道病毒药物中的应用。

背景技术

手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是由人肠道病毒(humanenterovirus，HEV)引起的一种全球性儿童常见传染病，高发于5岁以下儿童。HFMD多为自限性疾病，伴发热、手足部皮疹、口腔疱疹等症状。但部分患者病情进展迅速，可导致严重肺水肿、神经系统和全身并发症，甚至导致死亡。肠道病毒71型(human enterovirus 71，EV71)是HEV中的成员，为单股正链RNA病毒，属于微小病毒科(picornaviridae)，是导致HFMD重症及死亡病例的主要病原体。1997年以来，HFMD在亚太地区暴发流行，其中，2008年以来我国每年报告病例数约200万，而HFMD也是我省近年来报告病例数最多的丙型传染病之一。这无疑对公共卫生安全和经济发展造成了严重影响。目前，在临床实践中尚缺乏可用于HFMD预防和治疗有效药物。因此，开发抗HFMD药物势在必行。

鞣花酸是广泛分布于石榴、草莓、葡萄及核桃、板栗等多种水果或坚果中的天然多酚类抗氧化剂，其在自然界中主要以缩合形式——鞣花单宁存在。人体及动物实验表明，鞣花单宁和鞣花酸均具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及调节肠道微生物等多种生物活性，对癌症、糖尿病、心脑血管疾病和神经性病变等多种慢性疾病均具有潜在的预防或治疗功效。然而，鞣花单宁和鞣花酸的生物利用度极低，在血液和组织中的浓度很低，难以达到发挥其生物活性的浓度。而未被吸收的鞣花酸则在肠道微生物的作用下代谢为更容易吸收的尿石素类化合物(Urolithins)。因此，有报道认为Urolithins可能是鞣花单宁和鞣花酸在体内发挥生物活性的物质基础。

Urolithins是一类含有不同酚羟基的二苯并喃-6-酮衍生物，由鞣花酸失去一个内酯环，并逐步脱羟基而生成的。鞣花酸失掉内酯环后首先得到尿石素M-5(UroM-5)，UroM-5不同位置脱羟基后生成尿石素D(UroD)、尿石素M-6(UroM-6)等几种四羟基尿石素异构体，四羟基尿石素失掉一个羟基后得到尿石素C(UroC)、尿石素M-7(UroM-7)等三羟基尿石素，三羟基尿石素再失掉一个羟基得到Urolithin A(UroA)和尿石素A异构体(isoUroA)等二羟基尿石素，UroA的结构图见图1。UroA或isoUroA再失掉一个羟基得到单羟基的尿石素B(UroB)。生物活性研究表明，这些肠道微生物代谢具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及抑制蛋白质糖基化作用等多种生物活性，但在抗病毒作用方面尚无相关研究报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供鞣花酸代谢产物尤其是尿石素A在抗病毒药物中的应用。

本发明的目的之一是提供鞣花酸代谢产物尿石素类化合物在制备抗肠道病毒药物中的应用。

本发明的目的之二是提供Urolithin A在制备抗病毒药物中的应用。

本发明的目的之三是提供Urolithin A在制备抗肠道病毒药物中的应用。

其中，所述肠道病毒为肠道病毒71型。

更具体的，所述肠道病毒71型感染所致的疾病包括手足口病、病毒性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰质炎和中枢神经系统感染。

本发明的目的之四是提供Urolithin A作为活性成分制备的抗肠道病毒感染的药物。

本发明的目的之五是提供Urolithin A作为活性成分制备的抗肠道病毒71型感染的药物。

本发明的工作原理：Urolithin A作为鞣花酸在体内发挥生物活性的主要物质之一，具有很低的毒性和很强的抗病毒活性。通过细胞毒性实验，Urolithin A适合作为临床候选药物，特别是针对婴幼儿的抗病毒药物。经过Urolithin A对EV71增殖实验验证，验证Urolithin A能够明显降低EV71导致的细胞病变，Urolithin A可以作为活性成分制备的抗肠道病毒71型的药物。

附图说明

图1为UroA的化学结构示意图；

图2为利巴韦林(Ribavirin)与UroA对细胞毒性的比较示意图；

图3为UroA对EV71致细胞病变显微镜下观察图；

图4为UroA对EV71基因组RNA复制的影响示意图；

图5为UroA对EV71蛋白VP1表达的影响示意图；

图6为UroA对EV71病毒滴度的影响示意图；

图7为UroA和Ribavirin在相同药物浓度下抗病毒能力比较示意图；

图8为相同的浓度梯度下Ribavirin和UroA的抗病毒活性比较示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

以下叙述中，Urolithin A均简写成UroA，其结构式如图1所示。

1检测Ribavirin和UroA对细胞的毒性

采用CCK8法检测Ribavirin和UroA对细胞的毒性。将细胞接种在96孔细胞培养板中，细胞密度达到70％时，PBS洗细胞1次，细胞培养孔中加入药物浓度依次为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM和0μM的细胞维持培养基(含1％血清和1％青链霉素)100μL。每个药物浓度做4个重复。维持培养(5％CO₂和37℃培养条件)48小时后每孔加入10μL的CCK8，在450nm波长测定OD值。0μM药物浓度的OD值细胞活力为100％，比较不同药物浓度对细胞的毒性。

2检测UroA对EV71增殖的影响

在6孔板中接种细胞，待细胞融合度达70％时感染EV71，病毒感染量为10³TCID₅₀/mL病毒液1mL，5％CO₂和37℃条件下孵育1h，之后弃去上清病毒液，分别用不含和含有UroA的细胞维持液维持细胞。

(1)分别在之后的12h和24h显微镜观察细胞病变差异，并拍照记录。

(2)分别在之后的12h和24h收取细胞，Trizol裂解细胞提取RNA，用针对EV71基因组RNA的特异性荧光定量引物进行荧光定量PCR实验，检测病毒核酸复制差异。

(3)分别在之后的12h和24h收取细胞，RIPA蛋白裂解液裂解细胞，Western-blot实验检测病毒VP1蛋白的表达变化。

(4)分别在之后的12h和24h收取细胞维持液，TCID₅₀实验检测病毒滴度。

3评价分析UroA抗EV71的效果

(1)在6孔板中接种细胞，待细胞融合度达70％时感染EV71，病毒感染量为10³TCID₅₀/mL病毒液1mL，5％CO₂和37℃条件下孵育1h，之后弃去上清病毒液，分别用含有相同浓度(本实验浓度为12.5μM)的Ribavirin或UroA的细胞维持液维持细胞。24h后提取细胞总蛋白，Western-blot实验检测不同组别中病毒VP1蛋白表达差异。

(2)细胞病变抑制实验检测UroA和Ribavirin在不同浓度下抑制细胞病变的能力。RD细胞接种于96孔板，长至70％丰度后，感染病毒，每孔感染病毒量为10³TCID₅₀/mL病毒液100mL，孵育1h后弃去，PBS洗细胞1次，细胞培养孔中分别加入Ribavirin和UroA两种药物浓度均依次为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM和0μM的细胞维持培养基(含1％血清和1％青链霉素)100μL。每个药物浓度做8个重复。维持培养(5％CO₂和37℃培养条件)48小时后用PBS洗细胞1次，用0.1％结晶紫在室温下染色20min，用PBS洗细胞并将细胞板晾干。测定在570nm下每孔细胞的OD值，并利用Graphpad Prim 5.0软件计算IC₅₀。

研究结果

1 UroA对细胞的毒性

本研究通过CCK8实验检测了利巴韦林(Ribavilin)与UroA对细胞的毒性。实验结果显示，UroA具有更低的细胞毒性。结果如下图2所示。

2 UroA对EV71增殖的影响

2.1 UroA对EV71致细胞病变的影响

显微镜下观察UroA(25μM)对EV71致细胞病变的影响。结果显示，UroA能够明显降低EV71导致的细胞病变。结果如图3所示。

2.2 UroA对EV71基因组RNA复制的影响

荧光定量检测了UroA(25μM)对EV71基因组RNA复制的影响。结果显示，UroA能够明显降低EV71基因组RNA的复制。

所用引物序列如下表1所述，结果如图4所示。

qEV71-F	GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC
		qEV71-R	ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC

2.3 UroA对EV71蛋白表达的影响

Western-blot实验检测了UroA(25μM)对EV71蛋白表达的影响。结果显示，UroA能够非常显著的抑制EV71的VP1蛋白的表达。所得结果如图5所示。

2.4 UroA对EV71病毒滴度的影响

TCID₅₀实验检测了UroA(25μM)对细胞维持上清中EV71病毒滴度的影响。结果显示，UroA能够显著的抑制EV71感染细胞的细胞维持上清中的病毒滴度。所得结果如图6所示。

3 UroA和Ribavirin抗病毒活性的比较分析

3.1相同药物浓度下抗病毒能力比较

Western-blot实验检测了相同给药浓度下UroA(12.5μM)和Ribavirin(12.5mM)对EV71蛋白表达的影响。结果显示，在EV71感染后的24h，UroA(12.5μM)抑制EV71的VP1蛋白的表达更强。结果如图7所示。

3.2相同浓度梯度下抗病毒活性比较

通过细胞病变抑制实验检测了UroA和Ribavirin在不同浓度下抑制细胞病变的能力。结果显示，UroA具有更强的抑制病毒增殖的活性。结果如图8所示。

3.3药效评价指数比较

利用Graphpad Prim 5.0软件计算获得两种药物的药效评价指数CC₅₀、IC₅₀和SI。结果显示，UroA的CC₅₀为133.425μM左右，远大于Ribavirin的CC₅₀(88.41μM左右)；UroA的IC₅₀为6.1015μM左右，小于Ribavirin的IC₅₀(8.9215μM左右)；且UroA的SI指数为20.84。结果如表2所示。因此，与Ribavirin相比，UroA具有很低的细胞毒性，且具有更强的抗病毒活性，可作为很好的潜在抗病毒候选药物。

表2

结论

相关研究表明，鞣花酸具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及调节肠道微生物等多种生物活性。然而，鞣花酸不能够被人体吸收利用，必须分解成尿石酸等物质后才能被人体吸收。因此，本课题组研究了能够被人体吸收利用的鞣花酸经肠道代谢后的单体物质UroA的生物学功能。通过研究发现，与Ribavirin相比，UroA具有很低的细胞毒性，且具有更强的抗病毒活性，适合作为潜在的抗病毒候选药物加以利用。

Claims

1.鞣花酸代谢产物尿石素类化合物在制备抗肠道病毒药物中的应用。

2.Urolithin A在制备抗病毒药物中的应用。

3.Urolithin A在制备抗肠道病毒药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肠道病毒为肠道病毒71型。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述肠道病毒71型感染所致的疾病包括手足口病、病毒性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、脊髓灰质炎和中枢神经系统感染。

6.Urolithin A作为活性成分制备的抗肠道病毒感染的药物。

7.Urolithin A作为活性成分制备的抗肠道病毒71型感染的药物。