CN113995748A - 鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂中的应用 - Google Patents

鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂中的应用，属于猪病毒病防治技术领域。本发明发现了鞣花酸能够抑制猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒的增殖，以及抑制其对细胞的感染；发现了鞣花酸能够有效防治猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒的感染，降低发病猪的死亡率。鞣花酸具有制备抗猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒的药物应用，具有制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂的应用。

Description

鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂中 的应用
技术领域
本发明属于猪病毒病防治技术领域，更具体涉及鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂中的应用。
背景技术
鞣花酸(Ellagic acid,EA)又名并没食子酸、胡颓子酸，是没食子酸的二聚衍生物，其分子式为C14H16O18。鞣花酸是广泛分布于石榴、草莓及覆盆子等水果或坚果中的天然多酚类抗氧化剂，可由鞣花单宁(Ellagitannin，ET)进入体内后水解生成。天然的鞣花酸多以缩合形式(如鞣花单宁、苷等)存在于自然界，鞣花酸通常与葡萄糖、西洛糖、阿拉伯糖等缩合成糖苷，但更容易参与鞣花单宁的形成，植物往往通过水解鞣花单宁来产生鞣花酸。此外，鞣花酸还以游离的形式存在于多种植物的果实中。鞣花酸是一种多酚二内酯，具有高度热稳定性。其4个环代表它的亲脂结构，亲水部分有4个酚基和2个内酯环，这些结构特性导致鞣花酸的亲水性以及亲脂性均较差。它是一种天然的植物多酚类物质，通常以黄色针状晶体形式存在，相对分子量为302.28，熔点大于360℃。鞣花酸微溶于水，鞣花酸的水溶液不稳定，溶解度随着温度的上升相对增大，不同温度处理后的鞣花酸水溶液的稳定性均有一定程度的下降；鞣花酸可溶于甲醇、乙醇、吡啶、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂；易溶于碱，溶液的pH值对鞣花酸的稳定具有较大影响，鞣花酸在碱性条件下的稳定性较差，这可能是因为鞣花酸含有酯基和酚羟基，容易与碱发生反应，同时其内酯结构也容易在碱的作用下发生分解；鞣花酸不溶于醚。鞣花酸对紫外线具有吸收作用，其水溶液经紫外线照射后会发生自身的氧化聚合，因此在紫外线照射下其稳定性有一定程度的下降。鞣花酸在乙醇溶液中最大吸收波长为255nm和366nm，遇三氯化铁呈蓝色，遇硫酸呈黄色。Greiss—meger反应呈阳性，还易与金属阳离子如Ca2+、Mg2+结合。据已有的研究表明鞣花酸具有以下几方面的功效：1、抗氧化：鞣花酸具有很强的清除自由基和抗氧化的能力，鞣花酸对于氧自由基和羟自由基都具有清除作用，EA对机体氧化应激的调节机制主要包括缓解脂质过氧化，提高抗氧化酶的活性；维持线粒体功能，促进线粒体生物合成；诱导线粒体自噬，清除功能受损的线粒体。2、抗癌：鞣花酸表现出对于化学物质诱导癌变以及其他多种癌变具有明显的抑制作用，特别是结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌以及皮肤癌等均有很好的抑制作用，EA靶向调节癌症发生的的可能机制包括调节细胞周期和凋亡相关基因，但该作用可能与剂量相关；调控细胞信号转导通路，如抑制AKT、ERK1/2、Wnt通路以及NF-КB磷酸化。3、抗炎：经鞣花酸处理后可以降低脂多糖引起的血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度，表明鞣花酸可以抑制细胞分泌炎症因子，从而抑制炎症的发生。4、解毒作用：鞣花酸对摄入亚硝酸盐导致的病变具有缓解功效，鞣花酸对马兜铃酸造成的急性肾损伤有缓解作用。5、抗病毒：鞣花酸抑制了HIV-1整合酶的表达，进而抑制了HIV-1的感染。而且不论HIV-1感染前后，鞣花酸都表现出抑制作用，可能意味着鞣花酸可以抑制HIV-1早期和晚期复制；EA可以降低乙型肝炎病毒(HBV)感染细胞中HBeAg(一种乙型肝炎病毒蛋白)的分泌，减少HBeAg在血清中的积累，进而阻断了HBeAg引起的免疫耐受。而在丙型肝炎病毒(HCV)中，非结构蛋白NS3具有解旋酶和NTPase活性，再与辅因子NS4A合组成主要的病毒蛋白酶NS3/4A，而NS5B是RNA依赖的RNA聚合酶，参与病毒RNA的复制。EA在体外能抑制NS3/4A蛋白酶活性，最终通过减少NS5B活性和HCV中RNA水平，表现出EA对HCV的抗病毒作用。尽管有报道鞣花酸可能通过上调断奶仔猪肠道黏膜中紧密蛋白相关基因，并下调炎症相关因子的表达，提高肠道内有益菌的丰度，使断奶仔猪肠道保持健康的稳态，维持小肠屏障功能，减少仔猪腹泻的发生，进而促进动物体的生长发育。但关于鞣花酸对猪腹泻性病毒的作用仍未见报道。
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染引起的猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种高度接触性肠道传染病。其特征性临床症状为感染仔猪的呕吐、腹泻和脱水。该病的主要危害为对仔猪的高致死率，低于七日龄的仔猪感染后死亡率可达100％。1971年，该病首次在英国被报道，随后在欧洲其他地区流行，我国、泰国、日本和韩国等亚洲国家也相继报道。近十年来，PEDV变异毒株引起的PED在世界范围内暴发，给全球的养猪业造成了巨大的损失。2013年美国暴发的PED疫情造成了至少700万头猪只死亡和9-18亿美元的经济损失，欧洲、亚洲等一些国家也受到了严重影响。2010年以来PEDV变异毒株在我国规模性性猪场广泛流行，造成大量仔猪的死亡，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。2010年后的流行病学调查发现PEDV已经成为我国猪病毒性腹泻中最重要的病原，而其中变异毒株是PEDV感染中的主要病原。
猪轮状病毒腹泻是由猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)引起的猪急性肠道传染病，仔猪轮状病毒性腹泻主要以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征,一旦暴发就可能连年发生,患病猪和隐性带毒猪是该病的主要传染源。Woode等在1974年首次从猪分离出轮状病毒。中国于1982年从腹泻猪粪便中分离到轮状病毒。澳大利亚、美国、英国等先后都有关于该病毒的报道,目前该病在全世界普遍存在。我国轮状病毒流行的特点是混合感染,由于饲养环境较差,人们往往认为这一时期仔猪腹泻是大肠埃希菌引发,其实轮状病毒是其发病的一个重要诱因。轮状病毒性腹泻对人类健康和畜牧业发展都有较大危害,在全球已成为一个重要的公共卫生问题。
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis of swine，TGE)又称幼猪的胃肠炎，是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染引起的，一种高度接触传染性，以呕吐、严重腹泻、脱水，致两周龄内仔猪高死亡率为特征的病毒性传染病。从1933年起，在美国的伊利诺斯州就有本病的记载，随后，日本在1956年，英国在1957年相继发生本病。以后许多欧洲国家，中南美洲、加拿大、朝鲜和菲律宾相继报道了本病。我国的四川、湖北等多省市也有本病的发生。TGE对首次感染的猪群造成的危害尤为明显。在短期内能引起各种年龄的猪100％发病，病势依日龄而异，日龄越小，病情愈重，死亡率也愈高，2周龄内的仔猪死亡率达90％-100％。康复仔猪发育不良，生长迟缓，在疫区的猪群中，患病仔猪较少，但断奶仔猪有时死亡率达50％。在1977年，法国仅由于应付TGE的暴发就耗用了1000万美元的防治费用。TGE的发生和流行有明显季节性，一般多发生于冬季和春季，发病高峰为1～2月份。病毒传播可通过猪的直接接触。母猪乳汁可以排毒，并通过乳汁传播给哺乳仔猪，也可以通过呼吸道传播。粪便带有病毒可经口、鼻感染传播。病后康复猪带毒时间可长达8周，是发病猪场主要传染源。TGEV常与大肠杆菌、轮状病毒混合感染，而导致哺乳仔猪和断奶仔猪死亡率增多。TGEV是我国仔猪腹泻发生的主要病原，严重的阻碍了生猪养殖业的发展。
疫苗预防是防控病毒性感染的有效途径，但是有些病毒变异性强，疫苗的研发速率难以赶上病毒的变异，所以往往会出现免疫失败的现象。另外，由于疫苗免疫仅仅具有预防病毒性疾病发生的作用，所以不能为已经感染发病的猪只提供保护。鉴于猪病毒性腹泻的防控现状，开发抗病毒性腹泻的药物已经迫在眉睫。研究发现鞣花酸具有抗氧化、抗炎和抗病毒等作用，目前可被用作为天然植物活性成分类饲料添加剂，以保障畜禽的健康生长。截止目前，尚未见到有关鞣花酸在抗猪病毒性腹泻方面的应用。本发明公布了鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂中的应用，并探究了其在抗猪病毒型腹泻方面的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂中的应用，将鞣花酸用于治疗或预防猪病毒性腹泻具有安全性高、无毒副作用，对猪病毒感染保护率高的效果。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明通过体外实验发现鞣花酸能够抑制猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒的增殖，以及抑制其对细胞的感染，即鞣花酸具有抗猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒作用。
本发明第一方面提供：
鞣花酸在制备抗猪传染性胃肠炎病毒的药物中的应用；鞣花酸在制备抗以下病毒组合的药物中的应用：猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒。
猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒是引起猪病毒性腹泻的主要病原，本发明通过动物试验发现鞣花酸能够有效防治猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒的感染，降低发病猪的死亡率。
本发明第二方面提供：
鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂中的应用，所述的猪病毒性腹泻由以下病毒中的一种或多种引起：猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒，鞣花酸可单独给药，也可与辅料一起制成制剂给药。
所述的治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂可以为口服液、颗粒剂、片剂、粉剂等剂型，采用药学上常规的制剂方法制备而成，比如采用下述方法中的一种或多种制成相应剂型：
A、将鞣花酸5g或10g与无水乙醇20mL、吐温-80 30mL、注射用水50mL，按此比例溶解混匀后制成50mg/mL或100mg/mL的口服液；
B、将鞣花酸50g与乳糖15g、可溶性淀粉35g，按此比例用常规技术制成鞣花酸含量为50％的颗粒剂或者片剂；
C、将鞣花酸50g与可溶性淀粉50g或者麸皮50g，按此比例用常规技术制成鞣花酸含量为50％的粉剂。
所述的治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂的使用方法为下述方法中的一种或多种：
(1)将含鞣花酸颗粒剂、口服液、粉剂或者片剂加入到饲料或饮水中，按照鞣花酸10-100mg/kg体重的剂量使用。
(2)鞣花酸为单独给药，按照10-100mg/kg体重的剂量使用。
(3)作为平时预防猪病时添加，可以按照10mg/kg体重的添加剂量添加于饲料中，在整个饲养周期使用。
(4)当用于临床治疗猪病时，可以按照100mg/kg体重的剂量将口服液经口腔灌服；或者将粉剂、颗粒剂或片剂按照100mg/kg体重剂量直接饲喂；或将粉剂、颗粒剂或片剂按照100mg/kg体重剂量与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、鞣花酸，安全性高，可以作为饲料添加剂长期使用，以达到预防疫病的目的，长期使用也不会导致耐药菌株产生，也不会有其他的毒副作用，这是其他抗病药物所不具备的优点。
2、鞣花酸通过增强机体抗氧化防御机能，提高猪的天然免疫功能和抗病毒活性，能有效防治猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒的感染，从而降低猪腹泻病的发生及发病猪的死亡。鞣花酸作为治疗和预防猪病毒性腹泻具有显著的功效。
3、体外实验结果表明：鞣花酸具有显著抑制PEDV、TGEV和PoRV的体外增殖的效果，按100μg/mL的添加量在细胞培养基中添加鞣花酸，能够使猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒在相应细胞上的TCID50分别降低约6-8个滴度。
4、体内实验结果表明：鞣花酸具有增强天然免疫功能、抗病毒活性，能有效防治猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒的感染，从而降低发病猪的死亡率，有效提高猪的成活率和生产性能。按100mg/kg体重经口服或在仔猪饲料中添加鞣花酸对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒的感染保护率可达到80％左右。
附图说明
图1是荧光显微镜观察鞣花酸对PEDV DR13毒株在Vero细胞增殖的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物和饲料添加剂中的应用
A、称取鞣花酸10g、无水乙醇20mL、吐温-80 30mL、注射用水适量。
B、制备方法：先将鞣花酸溶于无水乙醇中，接着加入吐温-80，最后缓慢加入注射用水，补足至100mL。
C、获得一种鞣花酸口服液(100mg/mL)。
D、作为平时预防猪病时使用，可以按照10mg/kg体重的添加剂量添加于饲料中，在整个饲养周期使用。
E、用于临床治疗猪病时，可以按照100mg/kg体重的剂量将口服液经口腔灌服；或者将口服液按照100mg/kg体重剂量直接饲喂；或将口服液按照100mg/kg体重剂量与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。
实施例2：鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物和饲料添加剂中的应用
A、称取鞣花酸5g、无水乙醇20mL、吐温-80 30mL、注射用水适量。
B、制备方法：先将鞣花酸溶于无水乙醇中，接着加入吐温-80，最后缓慢加入注射用水，补足至100mL。
C、获得一种鞣花酸口服液(50mg/mL)。
D、作为平时预防猪病时使用，可以按照10mg/kg体重的添加剂量添加于饲料中，在整个饲养周期使用。
E、用于临床治疗猪病时，可以按照100mg/kg体重的剂量将口服液经口腔灌服；或者将口服液按照100mg/kg体重剂量直接饲喂；或将口服液按照100mg/kg体重剂量与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。
实施例3：鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物和饲料添加剂中的应用
A、称取鞣花酸50g、乳糖15g、可溶性淀粉35g。
B、制备方法：将鞣花酸、乳糖、可溶性淀粉混合制粒，烘干制粒，分装即得。
C、获得一种鞣花酸颗粒剂(鞣花酸含量为50％)。
D、作为平时预防猪病时使用，可以按照10mg/kg体重的添加剂量添加于饲料中，在整个饲养周期使用；
E、用于临床治疗猪病时，可以按照100mg/kg体重的剂量将颗粒剂直接饲喂；或将颗粒剂按照100mg/kg体重剂量与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。
实施例4：鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物和饲料添加剂中的应用
A、称取鞣花酸50g、可溶性淀粉50g或麸皮50g。
B、制备方法：将鞣花酸与可溶性淀粉或麸皮混合均匀，过60目筛，分装即得。
C、获得一种鞣花酸粉剂(鞣花酸含量为50％)。
D、作为平时预防猪病时使用，可以按照10mg/kg体重的添加剂量添加于饲料中，在整个饲养周期使用。
E、用于临床治疗猪病时，可以按照100mg/kg体重的剂量将粉剂直接饲喂；或将粉剂按照100mg/kg体重剂量与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。
实施例5：鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物和饲料添加剂中的应用
A、称取鞣花酸50g、乳糖15g、可溶性淀粉35g。
B、制备方法：将鞣花酸、乳糖、可溶性淀粉混合后，用压片机压片烘干即可。
C、获得一种鞣花酸片剂(鞣花酸含量为50％)。
D、作为平时预防猪病时使用，可以按照10mg/kg体重的添加剂量将片剂添加于饲料中，在整个饲养周期使用。
E、用于临床治疗猪病的时候，可以按照100mg/kg体重的剂量将片剂直接饲喂；或将片剂按照100mg/kg体重剂量与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。
实施例6：鞣花酸对致猪腹泻性病毒(PEDV、TGEV和PoRV)体外增殖的抑制作用
1、材料与方法：
1.1病毒：猪流行性腹泻病毒(PEDV)DR13株(带荧光标签的重组毒株DR13-EGFP)和YN株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)WH1株，猪轮状病毒(PoRV)TM-a株由华中农业大学国家农业微生物重点实验室分离、保存并馈赠。
1.2细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，用于PEDV DR13株和YN株的增殖；猪肾细胞(PK-15)用于TGEV WH1株的增殖；恒河猴胚肾传代细胞系(MA-104细胞)用于PoRV TM-a株的增殖，所有的细胞由华中农业大学惠赠。
1.3试验药物：鞣花酸(麦克林公司，纯度90％)。
1.4试剂：DMEM培养基、EDTA、胰酶、胎牛血清和双抗(青链霉素)均购自GIBCO公司。
1.5体外增殖抑制作用：
PEDV体外增殖抑制试验：所有的体外试验均设置三个试验组和一个空白组，试验组分别在培养基中加入不同剂量的鞣花酸，其中鞣花酸低剂量组(按照10μg/mL培养基添加)、鞣花酸中剂量组(按照20μg/mL培养基添加)、鞣花酸高剂量组(按照40μg/mL培养基添加)和空白对照组(培养基中不添加鞣花酸)。使用PEDV DR13毒株感染Vero细胞(MOI＝0.001)，感染同时添加不同浓度的鞣花酸。感染后36h后，利用荧光显微镜观察鞣花酸对PEDV DR13毒株体外增殖的影响。
同时将PEDV YN株病毒液用DMEM维持液做10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度，分别接种于已培养好的Vero细胞单层的96孔板，100μL/孔，每个组分别加入含有不同浓度鞣花酸的DMEM维持液，置37℃含5％CO2培养箱中继续培养36h，观察细胞病变。统计每个稀释度的细胞孔中病变阳性孔数，利用Reed-Muench法计算出每个鞣花酸组的TCID50，比较不同组TCID50的值判断鞣花酸对PEDV体外增殖的抑制作用，每个组做三个重复。
TGEV体外增殖抑制试验：经TGEV WH1株病毒液用DMEM维持液做10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度，分别接种于已培养好的PK15细胞单层的96孔板，100μL/孔，每个组分别加入含有不同浓度鞣花酸的DMEM维持液，置37℃含5％CO2培养箱中继续培养48h，观察细胞病变。统计每个稀释度的细胞孔中病变阳性孔数，利用Reed-Muench法计算出每个鞣花酸组的TCID50，比较不同组TCID50的值判断鞣花酸对TGEV体外增殖的抑制作用，每个组做三个重复。
PoRV体外增殖抑制试验：将PoRV TM-a株病毒液用DMEM维持液做10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度，分别接种于已培养好的MA-104细胞单层的96孔板，100μL/孔，每个组分别加入含有不同浓度鞣花酸的DMEM维持液，置37℃含5％CO2培养箱中继续培养48h，观察细胞病变。统计每个稀释度的细胞孔中病变阳性孔数，利用Reed-Muench法计算出每个鞣花酸组的TCID50，比较不同组TCID50的值判断鞣花酸对PoRV体外增殖的抑制作用，每个组做三个重复。
1.6数据分析：试验数据采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析(One-wayANOVA)和Duncan氏法多重比较，以P<0.05为差异显著性标准，以P<0.01为差异极显著标准。结果用平均值表示。
2、实验结果：
2.1鞣花酸对PEDV DR13毒株在Vero细胞增殖的荧光观察
通过荧光显微镜观察，在PEDV重组毒株DR13-EGFP感染过程中加入不同浓度的鞣花酸，感染后36h后通过荧光显微镜观察病毒的感染情况(通过EGFP反应病毒感染细胞的情况)。结果(图1)发现鞣花酸可以有效降低PEDV感染Vero细胞的数量，呈现明显的剂量依赖性，表明鞣花酸在体外具有良好的抗PEDV效果。
2.2鞣花酸对不同病毒TCID50的影响
表1鞣花酸对不同病毒的TCID50影响
Figure BDA0003359155360000081
表1结果显示：在细胞培养液中添加不同浓度的鞣花酸显著影响PEDV在Vero细胞上的TCID50值，随着鞣花酸添加量的增加，PEDV在Vero细胞上的TCID50显著下降，说明鞣花酸对PEDV在体外培养的Vero细胞中的增殖具有一定的抑制作用。在细胞培养液中添加不同浓度的鞣花酸显著影响TGEV在PK15细胞上的TCID50值，随着鞣花酸添加量的增加，TGEV在PK15细胞上的TCID50显著下降，说明鞣花酸对TGEV在体外培养的PK15细胞中的增殖具有明显的抑制作用。在细胞培养液中添加不同浓度的鞣花酸显著影响猪轮状病毒在细胞上的TCID50值，随着鞣花酸添加量的增加，PoRV在MA-104细胞上的TCID50显著下降，说明鞣花酸对PoRV在体外培养的MA-104细胞中的增殖具有明显的抑制作用。
实施例7：鞣花酸对猪流行性腹泻病毒感染仔猪的保护作用
材料与方法：
1.试验病毒：PEDV YN株由华中农业大学国家农业微生物学重点实验室馈赠。
2.鞣花酸：鞣花酸(麦克林公司，纯度90％)。
3.试验动物：挑选品种、来源相同，体重相近，没有母源抗体的7日龄健康仔猪，进行攻毒试验，试验仔猪分为三个试验组(鞣花酸低、中、高剂量组)和一个空白对照组，鞣花酸溶于牛奶中，定容至3mL灌服，其中鞣花酸低剂量组(按照10mg/kg体重剂量添加)、鞣花酸中剂量组(按照50mg/kg体重剂量添加)和鞣花酸高剂量组(按照100mg/kg体重剂量添加)和空白对照组(灌喂等剂量的牛奶，不添加鞣花酸)，每个组10头仔猪。
4.攻毒试验：各个组仔猪在饲喂一周后，以107TCID50/mL的PEDV(NY株)攻毒，每头口服灌注5.0mL，对照组灌服同等剂量的细胞培养基(DMEM)，然后隔离饲养，连续观察7天至试验结束。
5.观察指标：每天观察试验仔猪的腹泻情况，试验期满屠宰试验仔猪观察肠道病变，同时统计死亡猪数，计算腹泻率、死亡率及保护率。鞣花酸对PEDV病毒的抑制作用，通过实时定量PCR检测仔猪肠道黏膜中PEDV结构基因N或M的表达量来确定。
6.数据分析：
试验数据采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较，以P<0.05为差异显著性标准，以P<0.01为差异极显著标准。结果用平均值表示。
实验结果：
饲料中添加不同剂量的鞣花酸后，各组仔猪发病率与死亡率见表2。
表2鞣花酸对PEDV感染仔猪的免疫保护
Figure BDA0003359155360000091
Figure BDA0003359155360000101
表2结果显示：在仔猪饲料中添加不同浓度鞣花酸能够显著降低PEDV感染仔猪的腹泻率与死亡率，与空白组相比，感染PEDV仔猪的腹泻率下降30％～90％；而发病猪的死亡率下降50％～100％；试验结果充分表明：鞣花酸添加后能显著提高仔猪对PEDV感染的保护率。
表3鞣花酸在猪体内对PEDV的抑制效果
Figure BDA0003359155360000102
表3结果显示：添加鞣花酸可以显著降低PEDV的N和M基因表达量，鞣花酸添加后能显著降低PEDV毒力，抑制PEDV复制。
实施例8：鞣花酸对猪传染性胃肠炎病毒感染仔猪的保护作用
材料与方法：
1.试验病毒：TGEV WH1株由华中农业大学国家农业微生物学重点实验室馈赠。
2.鞣花酸：鞣花酸(麦克林公司，纯度90％)。
3.试验动物：挑选品种、来源相同，体重相近，没有母源抗体的7日龄健康仔猪，进行攻毒试验，试验仔猪分为三个试验组(鞣花酸低、中、高剂量组)和一个空白对照组，鞣花酸溶于牛奶中，定容至3mL灌服，其中鞣花酸低剂量组(按照10mg/kg体重剂量添加)、鞣花酸中剂量组(按照50mg/kg体重剂量添加)和鞣花酸高剂量组(按照100mg/kg体重剂量添加)和空白对照组(灌喂等剂量的牛奶，不添加鞣花酸)，每个组10头仔猪。
4.攻毒试验：各个组仔猪在饲喂1周后，以106TCID50/mL的TGEV WH1株攻毒，每头口服灌注5.0mL，对照组灌服同等剂量的生理盐水，然后隔离饲养，然后隔离饲养，连续观察7天至试验结束。
5.观察指标：每天观察试验仔猪的腹泻情况，试验期满屠宰试验仔猪观察肠道病变，同时统计死亡猪数，计算腹泻率、死亡率。
6.数据分析：试验数据采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析(One-wayANOVA)和Duncan氏法多重比较，以P<0.05为差异显著性标准，以P<0.01为差异极显著标准。结果用平均值表示。
实验结果：
饲料中添加不同剂量的鞣花酸后，各组仔猪发病率与死亡率见表4。
表4鞣花酸对TGEV感染仔猪的保护
Figure BDA0003359155360000111
表4结果显示：仔猪口服不同剂量的鞣花酸能够显著降低TGEV感染仔猪的发病率与死亡率，与空白组相比，随着剂量的增加，感染TGEV仔猪的腹泻率下降30％～90％；而发病猪的死亡率下降30％～70％；试验结果充分表明：鞣花酸添加后能显著提高仔猪对TGEV感染的保护率。
实施例9：鞣花酸对猪轮状病毒感染仔猪的保护作用
材料与方法：
1.试验病毒：猪轮状病毒(PoRV)TM-a株由华中农业大学国家农业微生物重点实验室馈赠。
2.鞣花酸：鞣花酸(麦克林公司，纯度90％)。
3.试验动物：挑选品种、来源相同，体重相近，没有母源抗体的3日龄健康仔猪，进行攻毒试验，试验仔猪分为三个试验组(鞣花酸低、中、高剂量组)和一个空白对照组，鞣花酸溶于牛奶中，定容至3mL灌服，其中鞣花酸低剂量组(按照10mg/kg体重剂量添加)、鞣花酸中剂量组(按照50mg/kg体重剂量添加)和鞣花酸高剂量组(按照100mg/kg体重剂量添加)和空白对照组(灌喂等剂量的牛奶，不添加鞣花酸)，每个组10头仔猪。
4.攻毒试验：各个组仔猪在饲喂1周后，以107TCID50/mL的PoRV TM-a株攻毒，每头口服灌注5.0mL，对照组灌服同等剂量的生理盐水，然后隔离饲养，然后隔离饲养，连续观察7天至试验结束。
5.观察指标：每天观察试验仔猪的腹泻情况，试验期满屠宰试验仔猪观察肠道病变，同时统计死亡猪数，计算腹泻率、死亡率。
6.数据分析：试验数据采用SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析(One-wayANOVA)和Duncan氏法多重比较，以P<0.05为差异显著性标准，以P<0.01为差异极显著标准。结果用平均值表示。
实验结果：
饲料中添加不同剂量的鞣花酸后，各组仔猪发病率与死亡率见表5。
表5鞣花酸对PoRV感染仔猪的保护
Figure BDA0003359155360000121
表5结果显示：仔猪口服不同剂量的鞣花酸能够显著降低PoRV感染仔猪的发病率与死亡率，与空白组相比，随着剂量的增加，感染PoRV仔猪的腹泻率下降30％～90％；而发病猪的死亡率下降20％～50％；试验结果充分表明：鞣花酸添加后能显著提高仔猪对PoRV感染的保护率。

Claims (7)

1.鞣花酸在制备抗猪传染性胃肠炎病毒的药物中的应用。
2.鞣花酸在制备抗病毒组合的药物中的应用，其特征在于：所述的病毒组合选自：猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒。
3.鞣花酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻药物或饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述的猪病毒性腹泻由以下病毒中的一种或多种引起：猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物或饲料添加剂为鞣花酸；或所述的药物或饲料添加剂为以鞣花酸作为有效成分添加辅料制成的制剂，所述的制剂包括口服液、颗粒剂、片剂、粉剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：鞣花酸的剂量为10-100mg/kg体重。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：预防猪病毒性腹泻时，鞣花酸的剂量为10mg/kg体重，在猪的整个饲养周期使用所述的药物或饲料添加剂。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：治疗猪病毒性腹泻时，鞣花酸的剂量为100mg/kg体重，每天早中晚添加三次所述的药物或饲料添加剂，连续使用一周。
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刘伟等: "桃金娘4种酚类成分体外抗猪流行性腹泻病毒活性研究", 《现代畜牧兽医》 *

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