CN111603526A

CN111603526A - 一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN111603526A
Application number: CN202010523463.1A
Authority: CN
Inventors: 王书源
Original assignee: Tianchang Yifan Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Tianchang Yifan Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2020-09-01

Abstract

本发明公开一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：其复方银花解毒药物的原料由青蒿17重量份、山银花14重量份、荆芥12重量份、薄荷5重量份、野菊花17重量份、大青叶17重量份、连翘12重量份、鸭跖草22重量份、淡豆豉12重量份、前胡12重量份。本发明复方银花解毒药物在MDCK细胞感染模型中对H1N1/FM1、H1N1/PR8、H1N1/WSN、H3N2甲型流感病毒，H5N1、H7N9和H9N2亚型禽流感病毒的复制是否存在抑制作用，提高了本发明复方银花解毒药物的药效性能检测准确性，充分证明本发明复方银花解毒药物对背景技术中提到的病毒具有良好的抑制作用。

Description

一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种中药药物制剂领域，具体涉及一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术

流感是一种传染性强，传播速度快的疾病。流感所引起的并发症和死亡非常严重。据世卫组织(WHO)发布的公告，全球每年流感病例为6亿～12亿例，死亡 50万～100万人，可见流感对人类的健康危害极大。其中H1N1型、H3N2型是主要的季节性流感病毒。

禽流感(avian influenza，AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus， AIV)引起的鸟类、禽类烈性传染病，由两种不同的糖蛋白构成，一种为血凝素 (hemagglutinin，H或Hp)，另一种为神经氨酸(neuraminidase，N或Np)，H 有1～15个亚型，N有1～9个亚型，H与N组合的不同形成了不同类型的病毒。其中H7N9型、H5N1型、H9N2型是主要的高致病流感病毒。

中医药临床防治流感具有独特效果，毒副作用小，药源丰富，可通过调节整体免疫功能抑制病毒复制，阻止病毒致细胞病变，在治疗流感和病毒性肺炎方面显示出了独特的优势。

本发明涉及的复方银花解毒药物原药材组成为：青蒿、山银花、荆芥、薄荷、野菊花、大青叶、连翘、鸭跖草、淡豆豉和前胡。功能主治为：疏风解表，清热解毒。用于普通感冒、流行性感冒属风热证，症见：发热，微恶风，头痛，鼻塞流涕，咳嗽，全身酸痛，苔薄白或微黄，脉浮数。涉及本复方银花解毒药物的组成、制备方法与剂型以及质量控制方法等内容在中国发明专利201810388255.8 中有较为详细的描述。该药物已获得国家食品药品监督管理局批准上市销售，药品的通用名称为复方银花解毒药物，药品批准文号为国药准字Z20040024。发明人在临床实践中意外地发现，本复方银花解毒药物具有非常好的抗流感病毒作用，发明人对该药进行了药效学研究，证明其疗效确切。

发明内容

本发明提供了一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用，以通过应用实施步骤，检测出本发明复方银花解毒药物对背景技术中提到的病毒具有良好的抑制效果。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：

一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：其中药物组合的原料由青蒿17重量份、山银花14重量份、荆芥12重量份、薄荷5重量份、野菊花17重量份、大青叶17重量份、连翘12重量份、鸭跖草22重量份、淡豆豉12重量份、前胡12重量份，其中所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、丸剂，病毒包括H1N1甲型流感病毒、冠状病毒、H7N9禽流感病毒、H5N1 亚型禽流感病毒、H3N2亚型人流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、病毒性肺炎。

所述应用的实施步骤如下：

a、制备原药：精确称取复方银花解毒药物干粉，采用灭菌超纯水配置成 100mg/ml的药液作为受试药母液，冻存于-20℃冰箱备用，用时用DMEM细胞维持液，稀释成2mg/ml的起始浓度，过滤除菌后，按2倍稀释成6-8个系列的终浓度备用,所述DMEM细胞维持液的成分为1％胎牛血清、2μg/ml TPCK-treated胰酶、100U/ml的青霉素和链霉素组合而成；

b、病毒毒力的测定：将不同亚型流感病毒种毒尿囊液连续作10倍梯度浓度稀释，将不同稀释度的病毒接种于MDCK细胞中，于35℃吸附1h后，后换用维持液继续培养，设正常细胞对照，每稀释度4个复孔，每天在倒置显微镜下观察细胞病变，记录病变程度和孔数，将细胞病变率达50％及以上的培养孔计为病变孔，然后通过血凝试验测试细胞上清中各稀释度子代病毒的释放情况，72小时后取上清，采用甲醛固定细胞板，采用结晶紫染色再次确定各孔的细胞病变情况，最后根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50；

c、药物对细胞毒性的测定：采用含2％血清的DMEM维持液稀释成终浓度再给药，将生长良好的MDCK细胞经胰酶消化成单个细胞后，用生长液调整至 2×105/mL，按0.1mL/孔加入96孔微量细胞培养板中，过夜后，加入不同稀释度的各种药物，每稀释度4个复孔，每孔0.2mL，同时设置正常细胞对照孔， 37℃5％CO2温箱培养，每日观察细胞病变，72小时后采用甲醛固定细胞，利用结晶紫染色法测定细胞病变，以不出现细胞病变CPE的药物最小稀释度为药物的最大无毒浓度TC0，按Reed-Muench法计算50％细胞毒性浓度；

d、体外抗流感病毒药效测定：将孵育培养12h的MDCK细胞弃去上清液后，每孔吸附感染含不同TCID50的流感病毒稀释液50μl，置35℃5％CO2培养箱中吸附感染1小时后，加入含药的细胞维持液，每个浓度4个重复，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱中培养72h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，同时采用血凝试验检测每孔的病毒滴度，最后采用结晶紫染色法判定各孔的细胞病变程度,最后按Reed-Muench计算50％抑制病毒复制的浓度 IC50和治疗指数SI，SI＝TC50/IC50；

e、复方银花解毒药物对H1N1所致病毒性肺炎的保护作用测定：将动物随机分组编号，分别分为正常动物组、病毒感染组、利巴韦林组、复方银花解毒药物高、低剂量组，各药物处理组于感染后开始给药，病毒对照组给药同体积灭菌水，阳性药物组采用腹腔注射给药，每日1次，连续给药6天，攻毒时除正常对照组用生理盐水滴鼻外，其余各组经滴鼻感染10LD50的H1N1流感病毒，试验期间每天观察动物发病情况，记录死亡数，共观察15d，计算死亡保护率和生命延长率。

本发明通过以上应用实施步骤，能够准确测定出：本发明复方银花解毒药物在MDCK细胞感染模型中对H1N1/FM1、H1N1/PR8、H1N1/WSN、H3N2甲型流感病毒， H5N1、H7N9和H9N2亚型禽流感病毒的复制是否存在抑制作用，提高了本发明复方银花解毒药物的药效性能检测准确性，充分证明本发明复方银花解毒药物对背景技术中提到的病毒具有良好的抑制作用。

具体实施方式

一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：其中药物组合的原料由青蒿17重量份、山银花14重量份、荆芥12重量份、薄荷5重量份、野菊花17重量份、大青叶17重量份、连翘12重量份、鸭跖草22重量份、淡豆豉12重量份、前胡12重量份。

其中所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、丸剂。

病毒包括H1N1甲型流感病毒、冠状病毒、H7N9禽流感病毒、H5N1亚型禽流感病毒、H3N2亚型人流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、病毒性肺炎

应用实施步骤如下：

实施例1：

1.实验材料

1.1供试品与阳性药：

(1)复方银花解毒药物干膏粉，

配制方法：精确称取复方银花解毒药物提取物干粉，采用灭菌超纯水配置成100mg/ml的药液作为受试药母液，冻存于-20℃冰箱备用，用时用DMEM细胞维持液(1％胎牛血清、2μg/ml TPCK-treated胰酶、100U/ml的青霉素和链霉素) 稀释成2mg/ml的起始浓度，过滤除菌后，按2倍稀释成6-8个系列的终浓度开展药效与毒性评价试验。

(2)磷酸奥司他韦(Oseltamivir Phosphate)，

配制方法：精确称取原药，采用DMSO作为稀释液，将其稀释成40mg/ml的母液，储藏存于-20℃冰箱，用时用DMEM细胞维持液(1％胎牛血清、2μg/ml TPCK-treated胰酶、100U/ml的青霉素和链霉素)稀释成40μg/ml的起始浓度，然后依次按2倍稀释成8个终浓度开展药效与毒性评价试验。

(3)利巴韦林注射液，

1.2试剂

(1)DMEM培养基，Hyclone；

(2)肽牛血清，BI Biological Industries；

(3)胰酶，Hyclone；

1.3仪器

(1)4B2型生物安全柜，MSC-Advantage，

(2)万分之一分析天平，SQP；

(3)CO2培养箱，HERAcell 150i；

(4)倒置显微镜，CKX 53

(5)全自动高压灭菌器，CLG-32L型；

(6)小型冷冻离心机5415R；

(7)移液枪，Corning；

(8)烘箱，XMTD-8222。

1.4细胞株和病毒株

流感病毒易感的犬肾传代细胞株(MDCK细胞)购自中科院上海细胞生化研究所。季节性甲流感H1N1(A/WSN/1/33、A/PR/8/33、A/FM1/1/33)、H3N2 (A/YZ/201/2010)病毒株、禽流感病毒H5N1(A/Duck/Jiangsu/Sheyang/2004)、 H7N9(A/Chicken/Jiangsu/CZJTC4/2013)、H9N2 (A/Chicken/Shangdong/SKD1/2011)病毒株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离鉴定并保存，上述试验均在扬州大学动物生物安全二级或三级实验室完成。

1.5实验动物

ICR小鼠，清洁级，雌性，体重13-14g，许可证号：SCXK(苏)2017-0007；许可证号：SYXK(苏)2017-0044。

实验动物饲养条件：动物称重后随机分组编号，分笼饲养于IVC中。实验室温度20-25℃，相对湿度40％-60％，每小时空气交换10-15次，保证12(日)/12 (夜)h的光照周期。上述实验均在畜禽传染病学重点开放实验室完成。小鼠购买回来后适应性饲养5天后才开始实验。

2.实验方法

2.1病毒毒力的测定(TCID50)：

将不同亚型流感病毒种毒尿囊液连续作10倍梯度浓度稀释，将不同稀释度的病毒接种于MDCK细胞中，于35℃吸附1h后，后换用维持液继续培养，设正常细胞对照，每稀释度4个复孔。每天在倒置显微镜下观察细胞病变，记录病变程度和孔数，将细胞病变率达50％及以上的培养孔计为病变孔，然后通过血凝试验测试细胞上清中各稀释度子代病毒的释放情况，72小时后取上清，采用甲醛固定细胞板，采用结晶紫染色再次确定各孔的细胞病变情况，最后根据 Reed-Muench法计算病毒的TCID50(median tissue culture infectivedosage)。

2.2药物对细胞毒性的测定：

上述药物临用时采用含2％血清的DMEM维持液稀释成终浓度再给药。将生长良好的MDCK细胞经胰酶消化成单个细胞后，用生长液调整至2×105/mL，按0.1 mL/孔加入96孔微量细胞培养板中，过夜后，加入不同稀释度的各种药物，每稀释度4个复孔，每孔0.2mL，同时设置正常细胞对照孔。37℃5％CO2温箱培养，每日观察细胞病变，72小时后采用甲醛固定细胞，利用结晶紫染色法测定细胞病变，以不出现细胞病变(CPE)的药物最小稀释度为药物的最大无毒浓度(TC0)，按Reed-Muench法计算50％细胞毒性浓度(TC50)。

2.3体外抗流感病毒药效评价判定方法：

将孵育培养12h的MDCK细胞弃去上清液后，每孔吸附感染含不同TCID50的流感病毒稀释液50μl，置35℃5％CO2培养箱中吸附感染1小时后，加入含药的细胞维持液，每个浓度4个重复，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％ CO2培养箱中培养72h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，同时采用血凝试验检测每孔的病毒滴度，最后采用结晶紫染色法判定各孔的细胞病变程度。最后按Reed-Muench计算50％抑制病毒复制的浓度(IC50)和治疗指数(SI)， SI＝TC50/IC50。血凝试验方法与判定标准参照WHO流感病毒诊断标准进行。

2.4复方银花解毒药物对H1N1所致病毒性肺炎的保护作用

将动物随机分组编号，分别分为正常动物组、病毒感染组、利巴韦林组、复方银花解毒药物高、低剂量组。各药物处理组于感染后开始给药，病毒对照组给药同体积灭菌水，阳性药物组采用腹腔注射给药，每日1次，连续给药6天。攻毒时除正常对照组用生理盐水滴鼻外，其余各组经滴鼻感染10LD50的H1N1流感病毒。试验期间每天观察动物发病情况，记录死亡数，共观察15d。计算死亡保护率和生命延长率，死亡保护率＝(病毒对照组死亡数-给药组死亡数)/病毒对照组死亡数×100，生命延长率＝(给药组平均存活天数-病毒对照组平均存活天数)/(正常对照组平均存活天数-病毒对照组平均存活天数)×100。

3.实验结果

3.1流感病毒TCID₅₀测定结果

各病毒TCID₅₀测定结果如下表1。

表1流感病毒TCID₅₀测定结果

3.2复方银花解毒药物抑制流感毒株复制及对细胞病变的保护效应

复方银花解毒药物在MDCK细胞感染模型中对甲型流感病毒H1N1/FM1、 H1N1/PR8、H1N1/WSN、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亚型流感病毒的复制都有一定的抑制作用，其抑制上述病毒100TCID₅₀感染的浓度分别为354.8μg/mL， 707.9μg/mL，707.9μg/mL，707.9μg/mL，707.9μg/mL，707.9μg/mL和 398.2μg/mL；其抑制上述病毒10TCID₅₀感染的浓度分别为177.8μg/mL， 354.8μg/mL，354.8μg/mL，354.8μg/mL，354.8μg/mL，354.8μg/mL和 199.6μg/mL，SI指数分别为5.62，2.82，2.82，2.82，2.82，2.82和5.0。在上述浓度条件下，复方银花解毒药物对上述甲型流感病毒引起的细胞病变有一定的保护作用。对照药利巴韦林在50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL三个浓度条件下均能完全抑制上述流感病毒的复制，保护细胞病变。阳性对照药奥司他韦在 8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL三个浓度条件下均能完全抑制上述流感病毒的复制，保护细胞病变。结果见表 2.

表2复方银花解毒药物体外抗病毒作用

3.3复方银花解毒药物对病毒性肺炎的保护作用

由表3数据可见，复方银花解毒药物可显著降低H1N1所致病毒性肺炎小鼠的死亡率，显著延长病毒性肺炎小鼠存活天数，其保护效力与阳性药利巴韦林相当。

表3复方银花解毒药物对病毒性肺炎致死率的保护作用

4.结论

复方银花解毒药物在MDCK细胞感染模型中对H1N1/FM1、H1N1/PR8、H1N1/WSN、H3N2甲型流感病毒，H5N1、H7N9和H9N2亚型禽流感病毒的复制都有一定的抑制作用，可显著降低病毒性肺炎小鼠的致死率，延长病毒性肺炎小鼠的存活天数，提示复方银花解毒药物具有广谱的抗病毒作用，对病毒性肺炎具保护作用。

实施例2：复方银花解毒药物对冠状病毒的抑制作用检测实施应用

1实验材料

1.1供试品与阳性药

复方银花解毒药物干膏粉，

1.2阳性对照药

利巴韦林注射液(RBV)，规格为100mg/ml，用时稀释至所需浓度，4℃冰箱保存。

1.3细胞

传代人肝癌细胞Huh7、Huh7.5细胞和人肺癌细胞H460细胞均为本室传代保存，在含10％胎牛血清(inactivated fetal bovine serum)和1％双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。2-3天传代一次。

1.4毒株

HCoV-229E于Huh7.5细胞中传代，保存于-80℃冰箱；HCoV-OC43于HCT-8 细胞中传代，保存于-80℃冰箱。

1.5试剂

DMEM液体培养基、胎牛血清(fetal bovine serum)、青霉素和链霉素溶液(penicillin-streptomycin)。

1.6实验用品及仪器

细胞培养瓶、96孔培养板和移液管为；二氧化碳孵箱(Model 3111)；生物安全柜；倒置显微镜；真空泵；12道移液器和单道移液器。

2.实验方法

2.1细胞培养

以H460细胞为例：在长满H460细胞的培养瓶内加0.25％Trypsin-EDTA 3 ml，37℃消化1～2分钟，弃消化液，加培养液吹打，1:3传代，2-3天传代一次，种板时配制成每毫升15万个细胞，接种96孔细胞培养板，每孔0.1ml，37℃， 5％CO₂培养过夜，细胞长成单层后进行实验。

2.2抗HCoV-229E的活性测定(CPE法)

实验在传代Huh7和Huh7.5细胞中进行，Huh7细胞(1.5×10⁴个/孔)和Huh7.5 细胞(1.5×10⁴个/孔)接种于96孔板中，过夜培养后将100TCID₅₀ HCoV-229E 病毒液感染96孔板内细胞，待测药物用维持液稀释，于感染同时给药进行测定，待测药物以三倍稀释8个剂量的样品进行实验，每个剂量设2个平行孔，待病毒对照组病变达4+号时观察结果，记录并用Reed-Muench法计算药物对病毒的半数抑制浓度(公式如下)及选择指数(SI＝IC₅₀/TC₅₀)。

其中：A＝累积抑制率<50％的药物浓度，B＝累积抑制率>50％的抑制率，C＝累积抑制率<50％的抑制率，D＝log稀释倍数

2.3抗HCoV-OC43的活性测定(CPE法)

实验在传代H460细胞中进行，细胞以1.5×10⁴个/孔接种于96孔板中，过夜培养后将100TCID₅₀ HCoV-OC43病毒液感染96孔板内细胞，待测药物用培养液液稀释，于感染同时给药进行测定，待测药物以三倍稀释8个剂量的样品进行实验，每个剂量设2个平行孔，待病毒对照组病变达4+号时观察结果，记录并用 Reed-Muench法计算药物对病毒的半数抑制浓度(公式如下)及选择指数(SI＝ IC₅₀/TC₅₀)。

3.实验结果

3.1在Huh7细胞内对HCoV-229E毒株的抑制作用

如表1所示，在Huh7细胞中，CPE法测定复方银花解毒药物的TC₅₀为2035.21 ±521.19μg/ml，其对HCoV-229E的IC₅₀为438.16±166.04μg/ml，选择指数 SI为4.64；RBV的TC₅₀为>100μg/ml，其对HCoV-229E的IC₅₀为2.98±2.47 μg/ml，选择指数SI为>33.56。

表1：药物在Huh7细胞内HCoV-229E的抑制作用(IC₅₀)(CPE法)

3.2在Huh7.5细胞内对HCoV-229E毒株的抑制作用

如表2所示，在Huh7.5细胞中，CPE法测定复方银花解毒药物的TC₅₀为2403.75μg/ml，其对HCoV-229E的IC₅₀为431.14μg/ml，选择指数SI为5.58； RBV的TC₅₀为>100μg/ml，其对HCoV-229E的IC₅₀为4.73μg/ml，选择指数SI 为>21.15。

表2：药物在Huh7.5细胞内HCoV-229E的抑制作用(IC₅₀)(CPE法)

3.3在H460细胞对HCoV-OC43毒株的抑制作用

如表3所示，在H460细胞中，CPE法测定复方银花解毒药物的TC₅₀为2935.28 ±751.70μg/ml，其对HCoV-229E的IC₅₀为165.13±28.37μg/ml，选择指数SI 为17.78；RBV的TC₅₀为>100μg/ml，其对HCoV-229E的IC₅₀为6.82±1.25μg/ml，选择指数SI为>14.67。

表3：药物在H460细胞内对HCoV-OC43的抑制作用(IC₅₀)(CPE法)

4.结论

本实验条件下，复方银花解毒药物对HCoV-OC43和HCoV-229E感染所致的细胞病变CPE均有抑制作用；阳性对照药RBV对HCoV-OC43和HCoV-229E感染所致的细胞病变CPE均有抑制作用。RBV的抗冠状病毒HCoV-229E和HCoV-OC43活性与文献和本实验之前的结果相当，说明实验系统成立。本实验结果说明复方银花解毒药物具有抗冠状病毒HCoV-229E和HCoV-OC43活性。

通过以上实验可以证明，复方银花解毒药物具有广谱的抗病毒作用，包括 H1N1、H3N2甲型流感病毒，H5N1、H7N9和H9N2亚型禽流感病毒，和冠状病毒 HCoV-229E和HCoV-OC43。体内实验显示复方银花解毒药物可显著降低病毒性肺炎小鼠的死亡率，延长病毒性肺炎小鼠的存活时间，表明其对H1N1引起的病毒性肺炎具有较好的保护作用。

Claims

1.一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：其中药物组合的原料由青蒿17重量份、山银花14重量份、荆芥12重量份、薄荷5重量份、野菊花17重量份、大青叶17重量份、连翘12重量份、鸭跖草22重量份、淡豆豉12重量份、前胡12重量份，所述药物的剂型为颗粒剂、片剂、硬胶囊剂、丸剂，所述病毒包括H1N1甲型流感病毒、冠状病毒、H7N9禽流感病毒、H5N1亚型禽流感病毒、H3N2亚型人流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、病毒性肺炎，所用冠状病毒毒株类型为HCoV-229E和HCoV-0C43。

2.根据权利要求1所述的一种复方银花解毒药物在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述应用的实施步骤如下：

a、制备原药：精确称取复方银花解毒药物干粉，采用灭菌超纯水配置成100mg/ml的药液作为受试药母液，冻存于-20℃冰箱备用，用时用DMEM细胞维持液，稀释成2mg/ml的起始浓度，过滤除菌后，按2倍稀释成6-8个系列的终浓度备用,所述DMEM细胞维持液的成分为1％胎牛血清、2μg/ml TPCK-treated胰酶、100U/ml的青霉素和链霉素组合而成；

c、药物对细胞毒性的测定：采用含2％血清的DMEM维持液稀释成终浓度再给药，将生长良好的MDCK细胞经胰酶消化成单个细胞后，用生长液调整至2×105/mL，按0.1mL/孔加入96孔微量细胞培养板中，过夜后，加入不同稀释度的各种药物，每稀释度4个复孔，每孔0.2mL，同时设置正常细胞对照孔，37℃5％CO2温箱培养，每日观察细胞病变，72小时后采用甲醛固定细胞，利用结晶紫染色法测定细胞病变，以不出现细胞病变CPE的药物最小稀释度为药物的最大无毒浓度TC0，按Reed-Muench法计算50％细胞毒性浓度；

d、体外抗流感病毒药效测定：将孵育培养12h的MDCK细胞弃去上清液后，每孔吸附感染含不同TCID50的流感病毒稀释液50μl，置35℃5％CO2培养箱中吸附感染1小时后，加入含药的细胞维持液，每个浓度4个重复，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱中培养72h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，同时采用血凝试验检测每孔的病毒滴度，最后采用结晶紫染色法判定各孔的细胞病变程度,最后按Reed-Muench计算50％抑制病毒复制的浓度IC50和治疗指数SI，SI＝TC50/IC50；