CN112641867B - 一种抗病毒的中药组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗病毒的中药组合物及其应用，属于医药领域。本发明中药组合物是由下列重量份的原料制成：紫锥菊5‑20重量份、金银花5‑20重量份、防风5‑20重量份、荆芥5‑20重量份、重楼5‑20重量份、甘草2‑10重量份。本发明中药组合物具有益气扶正、清热解毒及抗炎杀菌的功效，能够在较低使用浓度的情况下达到较好的细胞增殖促进作用，解决临床西药毒副作用大及耐药性问题，对病毒防治方面具有良好的应用前景。

Description

一种抗病毒的中药组合物及其应用
技术领域
本发明属于医药领域，特别涉及一种抗病毒的中药组合物及其应用。
背景技术
近年来，已报道越来越多的病毒感染引起的死亡病例，大多病毒具有传染性强、流行面广、变异率高等特点，并且近年来该病发病率不断升高。目前，抗病毒的药物主要以西药奥司他韦、利巴韦林及扎那米韦等为主，但其费用高，副作用大，耐药株逐渐增多，因此在临床应用上存在一定的局限性。接种疫苗是现阶段预防流感的主要手段，但其周期长，效果弱，对新型或变异病毒无作用，因此亟需开发高效低毒用于抗病毒的现代新药一直以来都是医药界迫切需要解决的问题，也是热点研究的目标。
中医药是中华民族几千年来防病治病的经验结晶，中药在中医整体理论的指导下，具有多靶点、低毒副作用、防治兼备等独特优势，在实验基础与临床应用中对比西药与疫苗有着不可低估的价值。面对日益严峻的流感疫情，开发具有中医药优势的复方药物对抗具有重大的现实意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有药物的不足，提供一种用于抗病毒的中药组合物。
中药复方是中医治病用药最主要的形式之一。本发明所涉及的组合物以国际抗病毒与免疫调节双重作用、主治上呼吸道感染疾病的紫锥菊为主要植物原料，同时借鉴古代治疗外感疾病经典方剂银翘散与荆防散，在中华医学会成员丁国梁主任中医师丰富的临床经验下，开发成紫锥菊抗病毒方药。该方是在中医“理法方药”指导下，由多味中药按君、臣、佐、使的分工合作原则配伍成的“有制之师”。
本发明所涉及的组合物由紫锥菊(君)、金银花(臣)、防风(佐)、荆芥(佐)、重楼(佐)与甘草(使)六味药组成，适宜于治疗多种等病毒性感染疾病。其中紫锥菊对流感病毒、腺病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、脑心肌炎病毒、滤泡性口炎病毒等具有直接的抑制效果。同时具有补气扶正功效，“祛邪”的同时可以“扶正”，增强机体免疫，从而达到抗病毒目的。配伍金银花可增强清热解毒之力，使主治尤为突出，疗效倍增。加减防风、荆芥以针对流感不同证型，既可疏散风寒，又可用于外感风热，进行相互协调补充，兼顾病证。重楼亦具有清热解毒，消肿止痛的功效。因感冒与流感始上焦，转中焦，终下焦。重楼可通上、中、下三效，加味重楼可作用于病毒感染不同阶段，缓解病情，缩短病程。甘草可抑制与减轻重楼毒性，调和诸药，进而达到安全有效的治疗效果。该方用药配伍严谨、精准，为病毒性感染疾病的治疗具有重要意义。
本发明的上述目的是应用响应面的分析方法，将复方中各组分的不同配比作为输入试验变量，以MDCK细胞活力检测指标作为输出响应变量，研究各植物药之间的相互配比，通过植物药之间的有效组合，评价紫锥菊复方用药安全性，明确其用药比例，从而科学的阐明中药复方的作用原理及配伍规律。通过体外抗病毒实验，评价紫锥菊复方的抗病毒效果，明确最佳病毒抑制浓度，为紫锥菊复方抗病毒体内研究及药物开发奠定基础。
以Design-Expert 8.0为数据分析软件，以不同浓度配比的复方用药毒性作用作为评价指标Y：一种具有抗病毒的中药组合物，该中药组合物由以下配比的中药提取物制成：紫锥菊5-20重量份、金银花0-20重量份、防风0-20重量份、荆芥0-20重量份、重楼5-20重量份、甘草2-10重量份。
优选由以下配比的中药提取物制成：紫锥菊5-20重量份、金银花5-20重量份、防风5-20重量份、荆芥5-20重量份、重楼5-20重量份、甘草2-10重量份。
所述紫锥菊的重量份数为5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、13份、15份、18份或者20份；所述金银花的重量份数为0份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、13份、15份、18份或者20份；所述防风的重量份数为0份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、13份、15份、18份或者20份；所述荆芥的重量份数为0份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、13份、15份、18份或者20份；所述重楼的重量份数为5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、13份、15份、18份或者20份；所述甘草的重量份数为2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或者10份。
所述紫锥菊的重量份数可优选为5份、10份、20份。所述金银花的重量份数可优选为5份、10份、20份。所述防风的重量份数可优选为5份、10份、20份。所述荆芥的重量份数可优选为5份、10份、20份。所述重楼的重量份数可优选为5份、10份、20份。所述甘草的重量份数可优选为2份、5份、10份。
本发明优选的抗病毒的中药组合物，该中药组合物由以下配比的中药提取物制成：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼10重量份、甘草5重量份。
本发明的另一个的目的是，提供该中药组合物的制备方法。具体包括如下步骤：
(1)按一定质量称取药材紫锥菊、金银花、防风、荆芥、重楼、甘草；
(2)加水煎煮、滤出药汁；重复再加水煎煮，滤出药汁，合并煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
所述步骤(2)中第一次加水的量为药材总重量的6-10倍；优选8倍。第一次加水煎煮的时间为2-3h；优选2h。重复加水的量为药材总重量的6-8倍；优选6倍。重复加水煎煮的时间为1-3h；优选2h。
本发明优选的中药组合物安全性与抗病毒活性分析。
本发明的另一个目的是提供上述中药组合物在抗病毒中的应用。
本发明的上述应用目的，包括利用上述中药组合物提供一种抗病毒药物。
所述抗病毒药物包括中药组合物和载体。
所述载体包括但不限于：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠、一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或者水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、淀粉、蔗糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表明活性剂、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁。
所述抗病毒药物包括辅料，包括但不限于：包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
所述抗病毒药物的剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂、滴丸剂。优选的剂型是胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液或糖浆剂。可通过加入适量辅料用常规制剂方法制成临床所能接受的各种剂型。
本发明有益效果：
本发明的中药组合物由纯中药制成，其原料价格低，制备方法便捷，安全有效，通过合理配伍可使组合物抗病毒作用在低浓度下即可产生显著效果。所得抗病毒药物能够在较低浓度(1mg/mL)时使得较好的细胞增殖促进作用(细胞增殖活力可达209％)，显著的促进了细胞的增殖作用，中药组合物可抑制流感病毒的入侵，保护细胞并发挥抗病毒效果，具有显著的抗病毒效果、细胞存活率高达82％。中药组合物安全有效，可解决临床西药毒副作用大及耐药性问题，具有很好地应用前景和市场前景。
附图说明
图1为不同浓度中药组合物的对细胞活力的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼10重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例2：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼20重量份、甘草10重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例3：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼5重量份、甘草2重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例4：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊5重量份、金银花5重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼10重量份、甘草2重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例5：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风5重量份、荆芥5重量份、重楼5重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例6：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风5重量份、荆芥5重量份、重楼20重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例7：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊5重量份、金银花5重量份、防风5重量份、荆芥5重量份、重楼10重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例8：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊5重量份、金银花5重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼20重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例9：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊20重量份、金银花20重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼20重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例10：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风5重量份、荆芥5重量份、重楼10重量份、甘草2重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例11：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊20重量份、金银花20重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼10重量份、甘草10重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例12：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼5重量份、甘草10重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例13：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊5重量份、金银花5重量份、防风20重量份、荆芥20重量份、重楼10重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例14：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊20重量份、金银花20重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼10重量份、甘草2重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例15：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊20重量份、金银花20重量份、防风5重量份、荆芥5重量份、重楼10重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例16：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼20重量份、甘草2重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例17：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风20重量份、荆芥20重量份、重楼10重量份、甘草2重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例18：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风20重量份、荆芥20重量份、重楼5重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例19：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风20重量份、荆芥20重量份、重楼20重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例20：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风20重量份、荆芥20重量份、重楼10重量份、甘草10重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例21：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊5重量份、金银花5重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼10重量份、甘草10重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例22：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊20重量份、金银花20重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼5重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例23：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊20重量份、金银花20重量份、防风20重量份、荆芥20重量份、重楼10重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例24：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊5重量份、金银花5重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼5重量份、甘草5重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例25：一种可用于抗病毒的中药组合物的制备
按重量份称取原料：紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风5重量份、荆芥5重量份、重楼10重量份、甘草10重量份。按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
实施例26：抗病毒中药组合物片剂/胶囊(抗病毒药物)的制备
实施例1-25中任一方式所得药物的片剂/胶囊的制备方法：取组合物中各药材，按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液3倍量酒精，搅拌，沉淀12h。取上清液，浓缩，加入辅料，干燥，压制成片剂或制粒填充胶囊。
实施例27：抗病毒中药组合物颗粒的制备
实施例1-25中任一方式所得药物颗粒的制备方法：取组合物中各药材，按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2.5量酒精，搅拌，沉淀12h。取上清液，浓缩，加入辅料，制粒，干燥，整粒得颗粒剂。
实施例28：抗病毒中药组合物口服液/糖浆剂的制备
实施例1-25中任一方式所得药物的口服液/糖浆剂的制备方法：取组合物中各药材，按照药材总重量加8倍水，煎煮2h，滤出药汁。再加6倍量水，煎煮2h，滤出药汁，合并两次煎煮液，滤过，取上清液，浓缩，放冷，加浓缩液2.5量酒精，搅拌，沉淀12h。取上清液，浓缩，加入辅料，制成口服液或糖浆剂。
实施例29：中药组合物体外毒性实验
1.材料与试剂：
(1)细胞：低代数的狗肾细胞株(MDCK细胞)由无锡市疾病预防控制中心提供。
(2)试剂：DMEM培养基，胎牛血清(FBS)，抗生素均购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)均购自美国Thermo公司；
(3)仪器与环境：超净工作台，CO2恒温培养箱，96孔微量细胞培养板，排枪，生物倒置显微镜，离心机，旋转蒸发仪，真空冷冻干燥机(ScientZ)，酶标仪。
2.实验方法：
组合物：将实施例1-25所得浓缩产物经过旋转蒸发仪蒸发浓缩后，-50℃真空冷冻干燥至粉末状冻干粉。
细胞传代与铺板操作，待培养于96孔板的MDCK细胞至80％的致密单层且状态良好时，停止培养。使用细胞维持液分别对实施例1-25所得组合物相应的冻干粉样品进行梯度稀释，获得浓度为0、0.5、1、1.5、2、3、4、6mg/mL的实施例1-25药物组合物。将各浓度的药物组合物样品以及各实施例药物组合物加入培养好的细胞中，每个浓度设4个复孔，每孔100μL，置37℃、5％CO2培养箱培养24h，倒置显微镜观察细胞病变程度(CPE)，采用CCK-8试剂盒检测细胞活力(又称细胞增殖活力或细胞毒性活力)。
细胞增殖活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]*100％；
注：A(加药)：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度；
A(空白)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；
A(0加药)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
以MDCK细胞活力水平为响应值，根据金银花与紫锥菊的药性相同，防风与荆芥的药性相同，分别将其归为一类，作为因素A与因素B，同因素C重楼与因素D甘草组合：
表1不同配比药物组合物对细胞活力的影响(浓度在1mg/mL)
Figure BDA0002883235690000081
Figure BDA0002883235690000091
根据表1可知，最佳复方配比为实施例1中紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼10重量份、甘草5重量份。
稀释实施例1所得中药组合物，获得浓度为0、0.5、1、1.5、2、3、4、6mg/mL的组合物，探究其细胞增殖活力，结果见图1和表2。
表2中药组合物对MDCK细胞增殖活力的影响
Figure BDA0002883235690000092
结果发现：中药组合物不同药物浓度下细胞状态存在差异，较高浓度时，细胞出现皱缩与脱落现象。细胞活力结果显示，药组合物浓度在1mg/mL时细胞增殖活力较高为209％(实施例1组合物)，显著的促进了细胞的增殖作用，之后随着细胞密度过大或者毒性作用致使细胞活力降低。
实施例30甲型H1N1流感病毒TCID50的测定
1、实验材料
1.1实验细胞与病毒
低代数的狗肾细胞株(MDCK细胞)由无锡市疾病预防控制中心提供。甲型H1N1流感病毒株由无锡市疾病预防控制中心提供，保存于-80℃备用。
1.2实验试剂
DMEM培养基，胎牛血清(FBS)，抗生素均购自美国Gibco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)均购自美国Thermo公司；病毒培养液，含青、琏霉素母液由无锡市疾病预防控制中心提供；新鲜O型血血液；生理盐水。
1.3实验仪器
超净工作台，CO2恒温培养箱，96孔微量细胞培养板，排枪，生物倒置显微镜，离心机，BSL-2级实验室，生物安全柜。
2、实验方法
2.1细胞准备
(1)细胞培养待细胞传代后，取生长良好的细胞进行铺板，培养箱孵育24h。
2.2病毒接种
(1)病毒稀释采取半对数稀释的方法，用病毒培养液进行稀释病毒，使之成为10-2，10-2.5，10-3......10-7，将梯度稀释病毒液接种于细胞板，置于培养箱孵育1h，每隔半小时晃动细胞板一次。每孔加入100μLPBS清洗细胞一次，加入病毒培养液，置于培养箱中孵育，每日观察细胞病变。
2.3红细胞凝集滴度测定
待细胞病变停止发展时，后检测病毒的红细胞凝集滴度(HA)。具体步骤如下：(1)采取新鲜O型血血液，1000rpm/min，离心5min去除上清，用生理盐水洗涤，4-5次获得红细胞，生理盐水稀释。(2)准备新的96孔板，分别吸取50μL平行的两板病变的细胞，加入50μL稀释的红细胞，轻轻震荡，反应30min，观察凝集程度，根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行计算。
3、实验结果
3.1细胞形态观察
于倒置显微镜观察细胞病变情况，以最高稀释度不再出现新病变为终点，当病毒感染到72h时，细胞病变停止发展，可以明显观察到细胞变圆、皱缩与脱落的现象。
3.2病毒滴定结果
该结果出现31个阳性结果，即完全凝集。出现17个阴性结果，即不完全凝集或者不与病毒结合出现血沉现象。
根据Reed和Muench方法，获得甲型H1N1流感病毒对MDCK的半数感染量TCID50为10-5.3。
实施例31：中药组合物抗甲型H1N1流感病毒效果
1、实验材料
同实施例30。
2、实验方法
细胞铺板:同实施例30。
中药组合物稀释：实施例1所得中药组合物由最大无毒浓度依次稀释不同浓度，获得0、0.375、0.5、0.75、1、1.5、2mg/mL组合物浓度。
病毒接种：培养好的细胞，用PBS清洗细胞面3次，洗净细胞后，取细胞维持液稀释的100TCID50的病毒加入孔内，50μL/孔培养箱吸附1-2h，每隔30min轻轻晃动一下，吸附结束后，吸出上层病毒液，PBS清洗2次。加入不同浓度中药组合物，培养箱中培养，每隔8h观察细胞病变，病毒对照组CPE达到75％时，CCK8检测各组细胞存活率。
3、实验结果
3.1细胞形态观察
观察接种病毒后细胞病变情况，可以明显观察到细胞皱缩，脱落死亡。药物干预后，随着药物浓度的升高，细胞病变特征减弱。
3.2组合物抗病毒结果
药物组合物浓度为0mg/mL即为病毒对照组，细胞存活率较低；而经不同浓度的中药组合物干预后，细胞存活率升高，且随着试药浓度的升高，抗病毒效果越明显。表明药物组合物在最大无毒浓度范围内中，能有效提高病毒感染细胞的存活率，具有优异的抗病毒功效；且中药组合物浓度越高，细胞存活率越大。结果见表3。
表3中药组合物对甲型H1N1流感病毒的影响
Figure BDA0002883235690000111
实施例32：中药组合物配比验证试验
为分析组合物中各植物药的重要性，通过去掉某一植物药或通过加大其用量，用以比较与验证复方配比的优化结果，同时比较组合物H1N1流感病毒的抑制效果。
1、实验材料
中药组合物中单味药含量差异对细胞毒性的影响试验同实施例29，中药组合物中单味药含量差异对H1N1流感病毒的抑制效果试验同实施例30。
2、实验方法
细胞铺板：实施例30。
药物：在最大无毒浓度范围内，取具有最大抗病毒效果的中药组合物浓度2mg/mL作为适宜浓度。分别探中药配伍中紫锥菊、金银花、防风、荆芥、重楼、甘草组分的配合协同作用：
探究过程(1)：
参照实施例1，组合物中重楼的重量份数分别替换为0份、2份、30份，其他不变，制得相应的药物组合物。检测各组合物对细胞的毒性以及抗病毒效果，结果如下表4。
表4不同重楼份数所得组合物的毒性以及抗病毒效果
重楼的重量份数 毒性-细胞活力均值(％) 抗病毒-细胞存活率均值(％)
0 85.3 44.2
2 92.2 63.3
30 48.1 20.5
探究过程(2)：
参照实施例1，将组合物中紫锥菊的重量份数分别替换为0份、2份、30份，其他不变，制得相应的药物组合物。检测各组合物对细胞的毒性以及抗病毒效果，结果如下表5。
表5不同紫锥菊份数所得组合物的毒性以及抗病毒效果
紫锥菊的重量份数 毒性-细胞活力均值(％) 抗病毒-细胞存活率均值(％)
0 79.9 40.4
2 106.1 72.3
30 56.0 32.7
探究过程(3)：
参照实施例1，将组合物中甘草的重量份数分别替换为0份、20份，其他不变，制得相应的药物组合物。检测各组合物对细胞的毒性以及抗病毒效果，结果如下表6。
表6不同甘草份数所得组合物的毒性以及抗病毒效果
甘草的重量份数 毒性-细胞活力均值(％) 抗病毒-细胞存活率均值(％)
0 92.1 48.6
2 108.2 78.9
30 76.5 34.8
探究过程(4)：
参照实施例1，将组合物中防风的重量份数分别替换为2份、30份，其他不变，制得相应的药物组合物。检测各组合物对细胞的毒性以及抗病毒效果，结果如下表7。
表7不同防风份数所得组合物的毒性以及抗病毒效果
防风的重量份数 毒性-细胞活力均值(％) 抗病毒-细胞存活率均值(％)
2 98.4 61.5
30 65.2 19.9
探究过程(5)：
参照实施例1，将组合物中金银花的重量份数分别替换为2份、30份，其他不变，制得相应的药物组合物。检测各组合物对细胞的毒性以及抗病毒效果，结果如下表8。
表8不同金银花份数所得组合物的毒性以及抗病毒效果
金银花的重量份数 毒性-细胞活力均值(％) 抗病毒-细胞存活率均值(％)
2 97.3 70.3
30 82.0 40.1
探究过程(6)：
参照实施例1，将组合物中荆芥的重量份数分别替换为2份、30份，其他不变，制得相应的药物组合物。检测各组合物对细胞的毒性以及抗病毒效果，结果如下表9。
表9不同荆芥份数所得组合物的毒性以及抗病毒效果
荆芥的重量份数 毒性-细胞活力均值(％) 抗病毒-细胞存活率均值(％)
2 98.8 69.7
30 79.6 42.0
3、实验结果
结果表明，组合物中紫锥菊、金银花、防风、荆芥、重楼、甘草的重量份中某一或者某些味药过高、过低、甚至不加，均会显著影响细胞活力大小和抗病毒水平。具有较好细胞活力促进作用和抗病毒作用的组合范围为：紫锥菊5-20重量份、金银花0-20重量份、防风0-20重量份、荆芥0-20重量份、重楼5-20重量份、甘草2-10重量份；其中，紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼10重量份、甘草5重量份组成的中药组合物为最优选的抗病毒配方。
综上，本发明中药组合物在较低浓度时对细胞无毒且有显著的促进增殖作用，可作为抗病毒最佳药物浓度。经响应面试验优化组合后，可作为抗病毒最佳药物配比。体外研究显示中药组合物对病毒感染的细胞有保护作用，发挥显著的抗病毒效果，且证实该中药组合物为各植物药最优配比，具有良好的抗病毒作用，为中药抗病毒复方体内与临床研究奠定了理论基础，为新药研发开辟了一条新的途径。
以上对本发明的实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文应用了具体个例对本发明实施例的实施方式进行了阐述，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，利用本发明所揭示技术内容所做出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。

Claims (7)

1.一种用于抗病毒的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由以下重量份数配比的中药药材制成：
紫锥菊的重量份数为5-20份；金银花的重量份数为5-20份；防风的重量份数为5-20份；荆芥的重量份数为5-20份；重楼的重量份数为5-20份；甘草的重量份数为2-10份。
2.根据权利要求1所述的一种用于抗病毒的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由以下重量份数配比的中药药材制成：
紫锥菊10重量份、金银花10重量份、防风10重量份、荆芥10重量份、重楼10重量份、甘草5重量份。
3.权利要求1-2任一所述的一种用于抗病毒的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）按照重量份数配比称取中药药材；
（2）加水煎煮、滤出药汁；重复再加水煎煮，滤出药汁，合并煎煮液，滤过，取上清液，浓缩。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中第一次加水的量为药材总重量的6-10倍；第一次加水煎煮的时间为2-3h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中重复加水的量为药材总重量的6-8倍；重复加水煎煮的时间为1-3h。
6.权利要求1-2任一所述的一种用于抗病毒的中药组合物在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用。
7.一种抗病毒药物，其特征在于，所述抗病毒药物包括权利要求1-2任一所述的一种用于抗病毒的中药组合物和载体。
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