CN108420815B

CN108420815B - 聚酮在抑制流感病毒中的应用

Info

Publication number: CN108420815B
Application number: CN201710077812.XA
Authority: CN
Inventors: 余利岩; 岑山; 赵建元; 庞旭; 张涛; 方晓梅; 张永欣
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2017-02-14
Filing date: 2017-02-14
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2037-02-14
Also published as: CN108420815A

Abstract

本发明公开了聚酮在抑制流感病毒中的应用。本发明提供了式A所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备流感病毒抑制剂中的应用。实验证明，式A所示的化合物G35，G36和G9对A型和B型流感病毒均有抑制作用，并且均高于阳性药利巴韦林(Ribavirin)。化合物G35，G36和G9的CC₅₀均大于100μM。说明式A所示的化合物对流感病毒具有较强的抑制活性，并且毒性较小。

Description

聚酮在抑制流感病毒中的应用

技术领域

本发明涉及聚酮在抑制流感病毒中的应用。

背景技术

流行性感冒病毒(influenza virus)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。其中，感染人类和畜禽的主要是A型流感病毒，甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感；乙型流感病毒对人类致病性也比较强，但是人们还没有发现乙型流感病毒引起过世界性大流行；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。

A型流感病毒的基因组为单股负链、分节段的RNA，共有8个独立的RNA片段组成，编码10种蛋白质。片段1-3编码RNA依赖的RNA聚合酶，片段1编码聚合酶亚基PB2，片段2编码聚合酶亚基PB1，片段3编码聚合酶亚基PA；片段4编码血凝素HA，是一种与病毒附着感染有关的表面糖蛋白；片段5编码核蛋白NP，是病毒RNA的主要结构部分；片段6编码神经氨酸酶NA，是一种包膜糖蛋白；片段7编码两种基质蛋白M1和M2，是非糖基化的结构蛋白；片段8编码两种非结构蛋白NS1和NS2。血凝素HA和神经氨酸酶NA经常发生抗原漂移和转换，是导致流感暴发的主要原因。

余利岩、庞旭等从曲霉(Aspergillus sp.)CPCC 400735发酵培养物的甲醇提取物中制备了CN 106085868A中图1-4所示的聚酮化合物，他们并通过实验确认图1-4所示的聚酮化合物具有抗HIV(Human Immunodeficiency Virus)活性(2016年11月09日公开的公布号为CN 106085868A、申请号为201610424586.3的中国发明专利申请)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何抑制流感病毒。

为了解决以上技术问题，本发明提供了式A所示的化合物或其药学上可接受的盐的用途，所述用途为P1至P4中的任一种；

所述R为

P1、式A所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备流感病毒抑制剂中的应用；

P2、式A所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或/和预防流行性感冒产品(如药物)中的应用；

P3、式A所示的化合物或其药学上可接受的盐在抑制流感病毒中的应用；

P4、式A所示的化合物或其药学上可接受的盐在治疗或/和预防流行性感冒中的应用。

本发明还提供了式A所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或/和预防流行性感冒药物中的应用。

本发明还提供了药用化合物，所述药用化合物为式A所示的化合物或其药学上可接受的盐。

上述药用化合物中，所述药用化合物或其药学上可接受的盐用于抑制流感病毒感染动物。

本发明还提供了抑制流感病毒感染动物的方法。

本发明所提供的抑制流感病毒感染动物的方法，包括给受体动物施用式A所示的化合物或其药学上可接受的盐以抑制流感病毒感染动物。

本发明还提供了治疗或/和预防流行性感冒的方法。

本发明所提供的治疗或/和预防流行性感冒的方法，包括给受体动物施用式A所示的化合物或其药学上可接受的盐进行治疗或/和预防流行性感冒。

本发明中，所述流感病毒可为A型流感病毒和/或B型流感病毒和/或C型流感病毒，所述流行性感冒可由A型流感病毒和/或B型流感病毒和/或C型流感病毒引起。

本发明中，所述动物可为哺乳动物，如人；所述动物还可为除哺乳动物以外的A、B和C型流感病毒感染的其他动物，如禽。

本发明式A所示的化合物可以以衍生自无机酸或有机酸的药学可接受的盐的形式使用。术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge,et al.,J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。所述盐可通过使本发明化合物的游离碱官能度与合适的有机酸反应来制备。

上文中，所述流感病毒抑制剂和所述治疗或/和预防流行性感冒药物，除含有式A所示的化合物或其药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药。

实验证明，式A所示的化合物G35，G36和G9对A型和B型流感病毒均有抑制作用，并且均高于阳性药利巴韦林(Ribavirin)：G35对A型流感病毒毒株A/WSN/33(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.02倍、对A型流感病毒毒株A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.03倍、对B型流感病毒毒株B/Massachusetts/02/2012的IC₅₀是利巴韦林的0.02倍、对B型流感病毒毒株北京海淀/1386/2013的IC₅₀是利巴韦林的0.02倍；G36对A型流感病毒毒株A/WSN/33(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.03倍、对A型流感病毒毒株A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.08倍、对B型流感病毒毒株B/Massachusetts/02/2012的IC₅₀是利巴韦林的0.13倍、对B型流感病毒毒株北京海淀/1386/2013的IC₅₀是利巴韦林的0.07倍；G9对A型流感病毒毒株A/WSN/33(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.03倍、对A型流感病毒毒株A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.03倍、对B型流感病毒毒株B/Massachusetts/02/2012的IC₅₀是利巴韦林的0.08倍、对B型流感病毒毒株北京海淀/1386/2013的IC₅₀是利巴韦林的0.05倍。化合物G35，G36和G9的CC₅₀均大于100μM。说明式Ⅱ所示的化合物对流感病毒具有较强的抑制活性，并且毒性较小。

附图说明

图1为化合物G35，G36和G9对Gluc活性本身的影响。其中，DMSO表示阴性对照组，Ribavirin表示阳性对照组，G35-10、G36-10和G9-10分别表示10μM的G35溶液组、G36溶液组和G9溶液组。

图2为化合物G9对流感病毒感染小鼠的保护作用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的聚酮为式A所示的通式化合物

其结构式具体如式1至式3所示(表1)。

表1、式A所示通式化合物

上述式1所示的G36、式2所示的G35和式3所示的G9均按照2016年11月09日公开的公布号为CN 106085868A、申请号为201610424586.3的中国发明专利申请中

实施例2的方法制备。

实施例1、聚酮的抗流感病毒活性

1实验方法

1.1细胞培养

人胚肾上皮细胞293T，293T衍生细胞系293T-Gluc，犬肾上皮细胞(Madin–Darbycanine kidney，MDCK)和人肺癌肿瘤细胞A549细胞均培养于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。

1.2重组甲型流感病毒制备

在10cm细胞培养皿中以3:1比例接种1.8×10⁶个293T细胞和0.6×10⁶个MDCK细胞。培养24h后，转染甲型流感病毒(IAV)A/WSN/33(H1N1)的8质粒(pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M，pHW188-NS)，转染量为1.2μg，转染试剂为Lipofectamine2000，根据使用说明书，每皿使用40μl。转染6h后，更换为新鲜DMEM培养基。转染24h后加入终浓度为1μg/mL的TPCK-trypsin。48h后收上清，1000rpm离心5min去掉细胞碎片，用0.45μm滤膜过滤，分装成小份，得到A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒，保存于-80℃冰箱。

其中，甲型流感病毒(IAV)8质粒反向遗传系统获赠于Dr.Robert G.Webster，分别为：pHW181-PB2，pHW182-PB1，pHW183-PA，pHW184-HA，pHW185-NP，pHW186-NA，pHW187-M，pHW188-NS(Hoffmann,E.,G.Neumann,et al.A DNA transfection system forgeneration of influenza A virus from eight plasmids[J].Proc Natl AcadSci U SA,2000,97:6108-6113)。

1.3其他流感病毒毒株在鸡胚上的培养及扩增

1)在孵箱中孵育鸡胚至十日龄准备接种；

2)将流感病毒以1:10的比例稀释于生理盐水中；

3)在鸡胚接种前，用照卵灯检测鸡胚，挑选生长状况良好的活胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。在尿囊与气室交界边缘约1mm处避开血管做以标记，此即为注射点；

4)在注射点及周围用75％酒精消毒，并用小剪刀钻开一个小口。用注射器注入流感病毒0.1mL，然后用胶布封口，置35℃孵箱培养；

5)每日照检鸡胚一次，于接种后24h内死亡者为非特异性死亡应弃去；

6)于-80℃中保存较久的病毒首次在鸡胚上培养，统一在培养72h后收获并立即再次接种鸡胚进行传代；

7)再次传代，甲型流感病毒培养44-48h可进行收获；

8)收获前将鸡胚置于-20℃冰箱中预冷1-1.5h，预冷的目的是将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降；

9)收获时，以碘酒或75％酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走，然后用无菌吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液；

10)收获的尿囊液以1000rpm离心5min用以沉淀红细胞，吸取上清用0.22μM滤膜过滤；

11)将收获的病毒立刻进行红细胞凝集实验，若病毒血凝滴度过低，则提示需要多次连续鸡胚接种扩增，以提高滴度。若病毒滴度符合使用要求，则将病毒分装成小份，保存于-80℃冰箱。

1.4病毒感染力测定方法(TCID₅₀测定)

半数细胞培养物感染量TCID₅₀(50％tissue culture infective dose)可以准确地反映病毒感染力。

1)感染前一天，MDCK细胞用细胞维持液稀释接种96孔板1-11列，每孔接种10⁴个细胞，100μl体系；

2)细胞铺板24h左右，将病毒从-80℃冰箱取出并放于室温水中快速融化；

3)96孔板取11列，每孔加入180μl细胞维持液。前10列作为梯度稀释病毒使用，第11列为细胞；

4)第一列每孔接种20μl病毒原液，混匀后每孔取20μl加入到下一列对应孔中，以此类推，进行连续10倍稀释(从10^-1-10^-10)至第10列；

5)先将培养MDCK的96孔培养板中的培养基吸出，再将稀释好的病毒以孔对孔的方式接种到该板上，每孔接种100μl病毒液。第11列为正常细胞对照组；

6)35℃孵箱中培养，逐日观察并记录结果，一般需要观察3-5天；

7)结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法。

1.5基于293T-Gluc细胞的IC₅₀测定

293T-Gluc细胞(Gao Q,Wang Z,Liu Z,et al.A cell-based high-throughputapproach to identify inhibitors of influenza A virus[J].Acta PharmaceuticaSinica B,2014,4(4):301-306)铺96孔板，每孔接种2.5×10⁴个细胞，于100μl含10％FBS的DMEM培养液中培养。细胞铺板24h后每孔加入1μl梯度稀释的待测化合物G35、G36或G9(待测化合物溶解在DMSO中，并用DMSO进行稀释)。待测化合物加入1h后按照MOI 0.25进行病毒感染。24h后各取10μl上清液检测Gluc蛋白含量，用以计算IC₅₀(将病毒抑制50％所需的浓度)。实验重复三次。

1.6化合物抗流感假阳性的排除

考查了化合物对对Gluc的活性,具体方法如下：在293T细胞中转染pHH-Gluc质粒(de Vries,E.,D.M.Tscherne,et al.Dissection of the influenza A virus endocyticroutes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway[J].PLoSPathog,2011,7:e1001329)(获赠于Dr.Erik de Vries)，六孔板每孔转染800ng，转染后6h分别加入终浓度为10μM的3个化合物溶液(溶剂为DMSO)，48h后检测Gluc信号。设空白对照组(转染pcDNA3.1质粒(美国Invitrogen公司))，阴性对照组加入相同体积的DMSO，阳性对照组加入终浓度为10μM的利巴韦林(Ribavirin)溶液(溶剂为DMSO)。实验重复三次。

1.7细胞活力测定

CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒，是一种基于WST-8(水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲基氧-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。通过酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

293T-Gluc细胞接种于96孔板，每孔2.5×10⁴个细胞，于100μl含10％FBS的DMEM培养液中培养。细胞铺板24h后每孔加入1μl梯度稀释的待测化合物G35、G36或G9(待测化合物溶解在DMSO中，并用DMSO进行稀释)，同时设置空白对照(只加100μl DMEM培养基)、阳性对照(加入1μl Ribavirin)和阴性对照(加入1μl DMSO)，37℃孵育48h。取出96孔板，每孔加入10μl CCK-8，37℃继续孵育1-2个小时后，使用Enspire2300多功能酶标仪检测各孔在450nm波长处的光吸收值，用以计算半数细胞毒性浓度CC₅₀(指致使50％细胞死亡的药物浓度)。实验重复三次。

1.8化合物对不同株流感病毒的抗病毒效果

按照下述方法测定了化合物G35，G36或G9和阳性药利巴韦林(Ribavirin)(上海贝达医药开发有限公司)对甲型流感病毒(IAV)A/WSN/33(H1N1)(Hoffmann,E.,G.Neumann,etal.A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eightplasmids[J].Proc Natl AcadSci U S A,2000,97:6108-6113)、A/PR/8/34(H1N1)(唐静,辛丽,郭俊峰,等.流感病毒A/PR/8/34重配母本株高免疫原性HA蛋白制备及鉴定[J].病毒学报,2016,32(2):141-144)(下文简称PR8,获赠于国家流感中心舒跃龙教授，使用鸡胚培养增殖)、B型流感病毒B/Beijing-Haidian/1386/2013(成艳辉等.2013-2014年中国B型流感病毒抗原性及基因特性分析.中华实验和临床病毒学杂志.2015年10月第29卷第5期)(下文简称BV)、B型流感病毒B/Massachusetts/2/2012(成艳辉等.2013-2014年中国B型流感病毒抗原性及基因特性分析.中华实验和临床病毒学杂志.2015年10月第29卷第5期)(下文简称BY-3)这四个病毒毒株的抗病毒效果，具体实验方法如下：

A549铺24孔板，每孔接种1×10⁵个细胞。细胞培养24h后，每孔加入梯度稀释的待测化合物G35、G36、G9、或利巴韦林(待测化合物溶解在DMSO中，并用DMSO进行稀释)。待测化合物加入1h后用不同株的流感病毒进行感染。病毒感染48h后收病毒上清，通过TCID₅₀实验检测病毒产量，计算化合物的IC₅₀值(将病毒抑制50％所需的浓度)。实验重复三次。

1.9化合物治疗流感体内药效学研究

按照下述方法测定了化合物G9和阳性药利巴韦林(Ribavirin)(上海贝达医药开发有限公司)对甲型流感病毒所致疾病的治疗效果。

1.9.1流感病毒半数致死量(LD₅₀)的测定：30只BALB/c小鼠(4-6周龄，SFP级，雄性，体重(23±2)g，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK-(军)2012－0004。饲养环境：室温(23±1)℃，相对湿度：(45±10)％)，随机分成3组，每组10只，乌拉坦溶液小鼠腹腔注射麻醉，用4℃预冷PBS将A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒10倍梯度稀释，共设3个浓度，分别为10^-2、10^-3和10^-4，将稀释好的3个浓度梯度流感病毒分别以40μl/只滴鼻造模，观察14d，分别观察小鼠发病状态，记录流感病毒各梯度稀释组的死亡数，计算死亡率，按Reed&Meunch法计算病毒的半数致死量(LD₅₀)。

1.9.2化合物G9对流感病毒感染小鼠的保护作用：36只BALB/c小鼠，随机分为6组，每组6只，分别为(1)正常对照组(等量0.5％羧甲基纤维素钠溶液)；(2)模型组(等量0.5％羧甲基纤维素钠溶液)；(3)阳性对照组-利巴韦林组(利巴韦林给药剂量为100mg/kg体重，溶剂为0.5％羧甲基纤维素钠溶液)；(4)三个实验组(化合物G9给药剂量分别为100mg/kg体重，20mg/kg体重和4mg/kg体重三个剂量)，适应性喂养48h。取-80℃冻存的A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒，冰上解冻，用4℃PBS(pH＝7.4)将其稀释为每50μl含5倍LD₅₀的病毒稀释液。乌拉坦腹腔注射麻醉，正常对照组以50μl PBS滴鼻造模，其余组以50μl A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒稀释液滴鼻造模。

造模1天后开始给药，利巴韦林组给药为利巴韦林溶液(溶剂为0.5％羧甲基纤维素钠溶液)，利巴韦林给药剂量为100mg/kg体重；三个实验组G9高剂量组(G9-100mg/kg)、G9中剂量组(G9-20mg/kg)、G9低剂量组(G9-4mg/kg)给药为G9溶液(溶剂为0.5％羧甲基纤维素钠溶液)，G9给药剂量分别为100mg/kg体重，20mg/kg体重和4mg/kg体重；正常对照组和模型组每天以等体积0.5％羧甲基纤维素钠溶液给药。小鼠灌胃给药容量0.2ml/10g体重，每天早晚同时间点各灌胃1次，连续灌胃给药8天。观察动物感染后的发病情况，记录14天内动物死亡情况和体重变化。

统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析，所有实验数据以均值±标准差(x±s)表示。

2实验结果

2.1G9等3个化合物在流感病毒高通量筛选模型中的抗病毒效果(针对甲型流感)

化合物G35，G36和G9在含有gluc报告基因的抗流感化合物高通量筛选模型中对A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒表现出较强的抗IAV活性，且细胞毒性较小(表2):20μM的G35溶液，G36溶液和G9溶液对甲型流感病毒-A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒的抑制率分别为98.53±0.11％、98.17±0.29％、98.53±0.11％；在293T-Gluc mono6细胞中测定的化合物G35，G36和G9对甲型流感病毒-A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒的IC₅₀分别为0.36μM、0.86μM和0.28μM，化合物G35，G36和G9的CC₅₀均大于100μM。

表2.聚酮化合物抗IAV活性结果

化合物编号	20μM待测化合物溶液对IAV抑制率(％)	IC<sub>50</sub>(μM)	CC<sub>50</sub>(μM)
				G35	98.53±0.11	0.36	>100
G36	98.17±0.29	0.86	>100
				G9	98.53±0.11	0.28	>100

同时，验证了化合物G35，G36和G9对Gluc活性本身的影响结果表明化合物G35，G36和G9在相对较高浓度(10μM)的条件下，对Gluc活性几乎没有影响(图1)。说明是化合物G35，G36和G9对流感病毒产生了抑制作用。

2.2G9等3个化合物对不同株流感病毒的抗病毒效果

表3.3个化合物和利巴韦林对不同株流感病毒抑制作用

结果表明化合物G35，G36和G9对A型和B型的四株流感病毒均有抑制作用，并且均高于阳性药利巴韦林(Ribavirin)：G35对A型流感病毒毒株A/WSN/33(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.02倍、对A型流感病毒毒株A/PR/8/34(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.03倍、对B型流感病毒毒株B/Massachusetts/2/2012的IC₅₀是利巴韦林的0.02倍、对B型流感病毒毒株B/Beijing-Haidian/1386/2013的IC₅₀是利巴韦林的0.02倍；G36对A型流感病毒毒株A/WSN/33(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.03倍、对A型流感病毒毒株A/PR/8/34(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.08倍、对B型流感病毒毒株B/Massachusetts/2/2012的IC₅₀是利巴韦林的0.13倍、对B型流感病毒毒株B/Beijing-Haidian/1386/2013的IC₅₀是利巴韦林的0.07倍；G9对A型流感病毒毒株A/WSN/33(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.03倍、对A型流感病毒毒株A/PR/8/34(H1N1)的IC₅₀是利巴韦林的0.03倍、对B型流感病毒毒株B/Massachusetts/2/2012的IC₅₀是利巴韦林的0.08倍、对B型流感病毒毒株B/Beijing-Haidian/1386/2013的IC₅₀是利巴韦林的0.05倍。说明式Ⅱ所示的化合物对流感病毒具有较强的抑制活性，并且毒性较小。

2.3化合物治疗流感体内药效学研究结果

2.3.1小鼠半数致死量(LD₅₀)测定

小鼠感染A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒后第3天，病毒感染小鼠均出现体重降低、耸毛卷缩、食欲减退，聚集成堆、反应迟钝、活动减少等症状；病毒感染后第4天，病毒感染小鼠开始出现死亡情况，共观察14天。统计各组小鼠死亡数目(见表1)，经计算得出A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒的LD₅₀为10^-3。

表4.A/WSN/33(H1N1)重组流感病毒小鼠半数致死量(LD₅₀)

病毒稀释度	死亡数(n)	存活数累计	死亡比例	死亡累计(％)
					10<sup>-2</sup>	7	3	15/18	83.3
10<sup>-3</sup>	5	8	8/16	50
					10<sup>-4</sup>	3	15	3/18	16.7

2.3.2化合物G9对流感病毒感染小鼠的死亡保护作用

A/WSN/33(H1N1)流感病毒可导致小鼠致死性疾病。为了验证化合物G9是否能够保护小鼠免受H1N1流感病毒致死性攻击。实验时化合物G9分别选用高、中、低三个剂量治疗8天。到第3天，在0.5％羧甲基纤维素钠溶液灌胃的模型组中的小鼠大多数表现出严重的呼吸道疾病的临床症状，包括呼吸困难，所有6只小鼠在感染后的6-9天全部死亡(图2中A)。然而，在低剂量的化合物G9治疗后，感染小鼠的死亡率降低至33.3％(至第14天存活4只，死亡2只)，存活率为67.7％(图2中A)，小鼠仍然表现出明显的临床症状，包括食欲减退、活动减少、聚集成堆、耸毛卷缩、弓背等。G9中剂量治疗后，几乎保护了该组中所有小鼠，至第14天存活5只，死亡1只，存活率为83.3％(图2中A)，没有表现出明显的临床体征，只有轻微的体重下降(图2中B)。G9高剂量组保护了所有6只小鼠免于死亡(图2中A)，该组中的小鼠没有显示典型的临床体征，体重变化呈缓慢的上升趋势，且与阳性药利巴韦林组基本一致(图2中B)。正常对照组在实验过程中没有显示任何临床体征(图2)。综合以上数据表明化合物G9可有效抑制A/WSN/33(H1N1)流感病毒复制，并保护小鼠免受H1N1流感病毒感染。

Claims

1.式A所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备流感病毒抑制剂中的应用：

所述R为

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为A型流感病毒和/或B型流感病毒和/或C型流感病毒。

3.权利要求1中式A所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或/和预防流行性感冒产品中的应用；所述流行性感冒由A型流感病毒和/或B型流感病毒和/或C型流感病毒引起。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述治疗或/和预防流行性感冒产品为治疗或/和预防流行性感冒药物。