KR20120029346A

KR20120029346A - 사과 추출물 및 콜라겐 트리펩티드 함유 미용 음료

Info

Publication number: KR20120029346A
Application number: KR1020110092778A
Authority: KR
Inventors: 다쯔야 곤; 노부오 우오츠; 마사루 가와고시; 마사루 오치아이; 나오코 아사히
Original assignee: 가부시키가이샤환케루
Priority date: 2010-09-16
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2012-03-26
Also published as: TW201216869A; CN102415597A; JP2012062278A

Abstract

본 발명은 미용 음료를 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 미용 음료는, 콜라겐 및 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔을 수축시키는 콜라겐 겔 수축제로서, 사과 추출물 및 콜라겐 트리펩티드를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

Description

사과 추출물 및 콜라겐 트리펩티드 함유 미용 음료{Beauty drink containing apple extract and collagen tripeptide}

본 발명은 피부 개선 미용용 음료에 관한 것이다.

최근 들어, 진피 조직 모델로서, 콜라겐이 들어 있는 음료가 주목되고 있다.

본 출원인은, 특허문헌 1(일본국 특허 제4388289호 공보)로서, 젤라틴 분해물, 대두 유래의 사포닌, 대두 이소플라본, 세라미드, 글루코사민과 알코올을 함유하는 음료와 대두 배아 추출물을 함유하는 외용제로 되는 피부 노화 방지?개선 및/또는 피부 거칠어짐 방지?개선 키트를 제안하였다.

특허문헌 2(일본국 특허 제4506880호)에는, 콜라겐 펩티드, 효모 추출물, 식물 유래 카테킨, 탄닌 및 유자 폴리페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종류 이상, 또한 한천 분해물을 유산균으로 발효시켜서 얻어진 발효 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 미용 음료가 개시되어 있다.

특허문헌 3(일본국 특허 제4505322호 공보)에는, 생선냄새가 마스킹되어 양호한 풍미와 식감을 가지고 있고, 미용 건강 식품인 어류 유래 콜라겐 펩티드가 고농도로 함유되어 있는 젤리 음료가 개시되어 있다.

특허문헌 4(일본국 특허 제4057163호 공보)에는, 얼룩조릿대와 콜라겐 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 음료가 개시되어 있다.

특허문헌 5(일본국 특허공개 제2002-27957호 공보)에는, 차, 포도 또는 사과 유래의 식물 폴리페놀과 콜라겐을 포함하는 액체에 펙틴을 첨가함으로써, 식물 폴리페놀과 수용성 단백질에 의한 백탁 물질 및/또는 침전 물질의 생성이 억제된 액체 조성물이 개시되어 있다.

특허문헌 6(일본국 특허 제3802721호 공보)에 있어서, Gly-Pro-Hyp의 아미노산 서열을 갖는 트리펩티드를 함유하는 생체 콜라겐 합성 촉진제를 본 출원인은 제안하였다.

일본국 특허 제4388289호 공보 일본국 특허 제4506880호 일본국 특허 제4505322호 공보 일본국 특허 제4057163호 공보 일본국 특허공개 제2002-027957호 공보 일본국 특허 제3802721호 공보

본 발명은 콜라겐 수축능을 갖는 미용성을 높인 콜라겐 음료를 개발하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 사과 추출물에 콜라겐 수축능이 있는 것을 발견하고, 또한 콜라겐 트리펩티드와의 병용에 의해 콜라겐 수축능을 증강할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명에 이르렀다. 또한, 연구를 진행시킨 결과, 사과 추출물과 콜라겐 트리펩티드의 병용에 의해, 주름 형성 억제기능, DNA 손상 억제기능, 각질층 수분량 유지 기능, 표피 비후 억제기능이 있는 것을 발견하였다.

1. 콜라겐 및 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔을 수축시키는 콜라겐 겔 수축제로서, 사과 추출물 및 콜라겐 트리펩티드를 유효성분으로 하는 미용 음료.

2. 사과 추출물이 사과 유래의 폴리페놀이고, 콜라겐 트리펩티드의 평균 분자량이 400 이하인 것을 함유하는 콜라겐 트리펩티드인 것을 특징으로 하는 1. 기재의 미용 음료.

3. 주름 형성 억제용 미용 음료인 1. 또는 2. 기재의 미용 음료.

4. 자외선 피폭에 의한 주름 형성을 억제하는 3. 기재의 주름 형성 억제용 미용 음료.

5. DNA 손상 억제용 미용 음료인 1. 또는 2. 기재의 미용 음료.

6. 자외선 피폭에 의한 DNA 손상을 억제하는 5. 기재의 DNA 손상 억제용 미용 음료.

7. 각질층 수분량 유지용 미용 음료인 1. 또는 2. 기재의 미용 음료.

8. 자외선 피폭에 의한 각질층 수분량의 감소를 억제하는 7. 기재의 각질층 수분량 유지용 미용 음료.

9. 표피 비후 억제용 미용 음료인 1. 또는 2. 기재의 미용 음료.

10. 피부 탄력성 향상용 미용 음료인 1. 또는 2. 기재의 미용 음료.

본 발명의 미용 음료는, 사과 폴리페놀과 콜라겐 트리펩티드를 병용함으로써, 저농도영역에서 콜라겐 겔을 수축하는 기능이 현저히 향상되는 것이 확인되었다. 또한, 사과 추출물과 콜라겐 트리펩티드를 병용함으로써, 주름 형성 억제, DNA 손상 억제, 각질층 수분량 유지, 표피 비후 억제에 효과가 있는 것이 확인되었다. 이들 기능은, 특히, 햇빛 등에 포함되는 자외선 피폭을 원인으로 하는 장애에 대해 유효한 효과이다.

장기간의 지속 복용에 의해, 피부의 매끈매끈함이나 건조의 개선이 실감되고, 피부의 탄력성의 개선이 확인되며, 여드름의 악화나 발증 등의 증상도 억제할 수 있고, 화장료의 먹은 정도의 개선도 확인되어, 전체적으로 미용용 음료에 적합하다.

도 1은 사과 폴리페놀 첨가에 의한 평가 샘플의 콜라겐 겔 수축률의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 콜라겐 트리펩티드 첨가에 의한 평가 샘플의 콜라겐 겔 수축률의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 사과 폴리페놀과 콜라겐 트리펩티드 병용에 의한 평가 샘플의 콜라겐 겔 수축률의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 주름 체적률을 나타내는 그래프이다.
도 5는 경피 수분 증산량 TEWL을 나타내는 그래프이다.
도 6은 각질층 수분량 SC hydration을 나타내는 그래프이다.
도 7은 표피 두께를 나타내는 그래프이다.
도 8은 DNA 상해(8-OH dG)를 나타내는 그래프이다.
도 9는 PCNA(세포 증식 마커)를 나타내는 그래프이다.
도 10은 피부 히드록시 프롤린(Hyp)을 나타내는 그래프이다.
도 11은 복용에 의한 관능시험결과를 나타내는 그래프이다.
도 12a는 피부의 점탄성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12b는 피부의 탄력성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명자는 앞서 사과 추출물에 콜라겐 겔 수축작용이 있는 것을 발견하고, 사과 추출물을 유효성분으로 하는 콜라겐 겔 수축제에 관한 특허출원(일본국 특허출원 제2009-83818호)을 행하였다. 본 발명자는 또한 사과 추출물의 콜라겐 겔 수축작용에 대해서 탐구를 계속한 결과, 콜라겐 트리펩티드를 병용함으로써, 비약적으로 콜라겐 겔 수축작용이 증강되는 것을 발견하였다.

본원 발명은 경구 섭취할 수 있는 미용 음료이다.

본 발명은 콜라겐 및 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔을 수축시키는, 콜라겐 겔 수축작용을 나타낸다. 또한, 사과 추출물과 콜라겐 트리펩티드의 병용성분을 유효성분으로 하는, 주름 형성 억제용 미용 음료, DNA 손상 억제용 미용 음료, 각질층 수분량 유지용 미용 음료, 표피 비후 억제용 미용 음료이다.

본 발명은 콜라겐 및 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔을 수축시킨다. 콜라겐 겔의 수축이란, 예를 들면, 겔의 크기가 작아지는 것을 말한다. 콜라겐 겔의 크기의 지표로서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 콜라겐 겔의 직경, 표면적, 체적 등을 들 수 있다.

또한, 사과 추출물과 콜라겐 트리펩티드의 병용성분은, 주름 형성 억제, DNA 손상 억제, 각질층 수분량 유지, 표피 비후 억제로서도 유효성분이 된다. 특히, 햇빛 등에 포함되는 자외선의 피폭을 원인으로 하는 주름 형성, DNA 손상, 각질층 수분량 감소, 표피 비후 등의 장애에 대해 억제작용으로서 유효하게 기능한다.

장기간의 복용에 의해, 피부의 건조가 방지되고, 매끈매끈함이 증진되며, 여드름 등의 피부 트러블이 억제되어, 피부 외용제인 화장료의 먹은 정도가 개선되는 미용용 음료이다.

<콜라겐 겔>

본 발명에 있어서 콜라겐 겔은 수축 가능한 형상이면 되고, 겔상 이외에, 예를 들면, 고형상이어도 된다.

콜라겐 겔에 포함되는 콜라겐의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, I형, II형, III형, IV형, V형 콜라겐 등을 들 수 있고, 바람직하게는 I형 콜라겐이다. 또한, 콜라겐은 예를 들면, 콜라겐을 가공처리한 것이어도 된다. 가공처리로서는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 열처리, 효소처리 등을 들 수 있다. 열처리한 콜라겐으로서는, 예를 들면, 젤라틴 등을 들 수 있고, 효소처리한 콜라겐으로서는, 예를 들면, 아텔로콜라겐, 콜라겐 펩티드 등을 들 수 있다. 콜라겐 겔 중의 상기 콜라겐 농도는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 형상 등에 따라 적절히 설정 가능하다.

콜라겐 겔에 있어서, 섬유아세포의 유래 조직은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 피부, 폐, 심장 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 피부이다. 섬유아세포의 유래종은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 인간, 돼지, 소, 토끼, 랫트, 마우스 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 인간이다. 콜라겐 겔 중의 섬유아세포의 세포밀도는 특별히 제한되지 않고, 적절히 설정 가능하다.

콜라겐 겔은 예를 들면, 콜라겐 및 섬유아세포 이외의 기타 성분을 포함해도 된다. 기타 성분으로서는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 배양액, 혈청 등을 들 수 있다.

<사과 추출물>

사과 추출물이 사과 과실의 추출물인 것이 바람직하다. 특히, 사과 유과(幼果) 추출물에 포함되는 폴리페놀을 주성분으로 하는 것이 바람직하다.

사과 추출물에는, 폴리페놀, 유기산, 아미노산 등을 포함하는 것이 알려져 있다.

사과 추출물은, 혈관기능 개선작용을 높이는 것이 가능한 BNP 조절제로서 추출물을 유효성분으로서 함유해서 되는 BNP 조절제, 혈행촉진제(일본국 특허공개 제2007-008837호 공보, 일본국 특허공개 제2006-265220호 공보)나 음료(일본국 특허공개 제2004-305087호 공보), 화장료(일본국 특허공개 제2001-187724호 공보), 소취제 성분(일본국 특허공개 평11-319051호 공보), 향료성분(일본국 특허공개 평08-023939호 공보) 등에 사용되는 것이 알려져 있다.

그러나, 사과 추출물 및 사과 유래의 폴리페놀에 대해서, 콜라겐 겔 수축효과는 아직 보고되어 있지 않다.

사과 추출물에 있어서, 사과(Malus pumila)의 품종은, 예를 들면, 후지, 국광, 왕림, 홍옥, 조나골드, 딜리셔스, 산사, 천추 등을 들 수 있고, 특별히 제한되지 않는다. 사과의 추출 부위는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 과실, 잎, 줄기, 꽃 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 과실이다. 상기 과실은, 예를 들면, 미숙과(유과)여도 되고, 완숙과여도 되며, 특별히 제한되지 않는다. 추출에 사용하는 상기 과실의 부위는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 전과(全果), 과육, 과피, 씨 등을 들 수 있다. 사과 추출물은, 이들 부위를 단독으로, 또는 2종 이상 조합해서 추출해도 된다.

사과 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 추출방법의 구체예로서는, 예를 들면, 이하와 같아도 된다. 먼저, 사과의 전과를, 수세 후, 그라인더 등에 의해 분쇄한다. 이 분쇄물을, 펙티나아제 처리에 제공하고, 원심분리 후, 추출 용매에 의해 분배 여과하여, 사과 추출물을 조제해도 된다. 상기 펙티나아제 처리로서는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 20~60℃의 온도 조건하에서, 펙티나아제를 10~50 ppm 첨가하여 행해도 된다. 추출 용매로서는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 헥산, 클로로포름 등의 유기용매를 들 수 있다.

사과 추출물은 예를 들면, 시판의 사과 추출물을 사용해도 되고, 사과 과실로부터 추출하여 조제해도 되며, 특별히 제한되지 않는다.

콜라겐 겔 수축제 중에 포함되는 사과 추출물 함량은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 0.001~99 중량%, 바람직하게는 0.001~5 중량%이다. 콜라겐이나 젤라틴과의 병용에 의해, 콜라겐 겔 수축능이 비약적으로 향상되기 때문에, 0.01 이하로 충분하다. 콜라겐 겔 수축제는, 사과 유래의 폴리페놀을 포함하는 사과 추출물이 바람직하다.

폴리페놀의 분획방법은 특별히 제한되지 않고, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 폴리페놀은, 예를 들면, 사과 추출물을 칼럼에 통액(通液) 후, 칼럼의 흡착물을 용출하고, 이 용출 분획을 감압 증류 제거 농축하여 분획해도 된다. 또한, 추가적으로, 이 농축액에 분말 보조제를 첨가하고, 동결건조 또는 분무건조하여 폴리페놀 분말을 조제해도 된다.

폴리페놀은 예를 들면, 시판의 사과 유래의 폴리페놀 함유물을 사용해도 되고, 사과 과실로부터 추출 및 분획하여 조제해도 되며, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 콜라겐 겔 수축제 중에 포함되는 상기 폴리페놀 함량은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.1~50 중량%이다.

<콜라겐 트리펩티드>

사과 추출물을 병용하는 콜라겐 트리펩티드는, 평균 분자량이 400 이하인 것을 함유하는 트리펩티드로, 통상 일반의 콜라겐이라 칭하는 것과는 구별되는 것이다. 더욱 상세하게는, 아미노산 서열이 Gly-X-Y(X, Y는 아미노산)인 펩타이드가 바람직하고, 특히 바람직하게는 아미노산 서열이 Gly-Pro-Hyp인 것이다.

본 발명의 콜라겐 트리펩티드는, 돼지 등의 동물 유래, 생선 유래 모두 사용 가능하다.

본 발명의 콜라겐 트리펩티드는, 주로 콜라겐을 가수분해하여 제조할 수 있다. 콜라겐 가수분해물은 이미 시판되고 있으나, 이들의 효소적으로 가수분해된 콜라겐의 대부분은, 분자량의 분포범위가 2천~8만이다. 이들의 가수분해물은 물에 대한 분산성의 향상을 목적으로 하는 것이다.

이에 대해 본 발명의 콜라겐 가수분해물은, 특정 유효성분으로서 분자량으로 약 400 이하의 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

첨가량은 0.01% 이상이 바람직하다. 본 시험계의 시험에서는 콜라겐 겔의 수축은 80% 정도가 상한으로 상정되기 때문에, 콜라겐 겔의 수축이 70% 정도 이상은, 첨가농도를 늘려도 증가효과는 작다. 따라서, 마이너스가 되는 경우는 없다고 하는 의미에서는 상한은 없으나, 실질적으로는 1.0% 정도가 상한이 된다.

[시험예 1]

<사과 추출물에 관한 콜라겐 겔 수축작용 시험>

이 시험에서는, 콜라겐 겔 수축제로서, 사과 추출물(상품명: 애플 페논 SH; 아사히 푸드 앤드 헬스케어사 제조)을 사용하여, 이하와 같이, 콜라겐 겔 수축작용을 측정하였다.

[재료]

(1) 아텔로콜라겐(상품명: AteloCell, 아텔로콜라겐(소 진피 유래) 5 ㎎/㎖

(2) DMEM(분말)(상품명: 둘베코 변법 이글배지(2), 닛스이)

(3) DMEM(액체)(상품명: Gibco)

[평가 검체]

(1) 사과 추출물(사과 폴리페놀)

상품명: 애플 페논 SH(아사히 푸드 앤드 헬스케어(주) 제조)

규격: 전체 폴리페놀량 98% 이상(UV법)

[시험방법]

사전에 계대배양한 피부 섬유아세포(신생아 유래)를 세포 현탁액(6×10⁵ cells/㎖ 용매 10% FBS 함유 DMEM)으로서 조제하였다. 빙랭 중에서 아텔로콜라겐(5 ㎎/㎖) 4 ㎖, 3배 농도 DMEM(D-Glc 1.2 M 함유 및 애플 페논 SH 0.03% 함유) 2 ㎖, FBS(소혈청) 0.67 ㎖, 10% FBS 함유 DMEM 3.34 ㎖ 및 세포 현탁액 2 ㎖를 혼합하고, 평평한 바닥 12 웰 플레이트에 1 ㎖씩 첨가하였다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하고, 5시간 후에 아텔로콜라겐이 재섬유화됨으로써 겔화되는 것을 확인하였다.

첨가로부터 6시간 후에 멸균한 스파튤라(spatula)의 자루를 사용하여 겔을 웰 플레이트로부터 벗겨낸 후, 10% FBS 함유 DMEM 용액 1 ㎖(0.5%, 0.2%, 0.1% HACP-01 함유)를 첨가하고, 재차 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 7일간 배양하였다.

배양액은 1일 간격으로 평가 약제를 임의의 농도로 용해시킨 10% FBS 함유 DMEM 용액 1 ㎖를 배지 교환하였다. 배양 종료 후, 배양액을 완전히 제거하고 PBS로 세정 후, 10% 중성 포르말린 용액(Wako)으로 24시간 침윤하여 겔을 고정하였다.

그 후, 1%(w/v) Triton-X 용액으로 치환하여, 겔 직경의 계측을 행하였다.

사과 추출물(사과 폴리페놀)은, 겔 형성 후에 첨가한 경우와, 겔 내포시에 첨가한 경우의 시험을 행하였다. 첨가량은 표 1에 기재한 바와 같다.

표 1에 기재된 첨가농도 A1, A2, A3, A4의 첨가농도는 겔 형성 후에 첨가하는 10% FBS 함유 DMEM 용액 1 ㎖ 중에 사과 추출물을 첨가시킨 수치를 나타내고 있다.

또한, 표 1에 기재된 첨가농도 B1, B2, B3는 겔 내포시에 사과 추출물을 첨가한 겔 용량 1 ㎖ 중의 첨가농도를 나타내고 있다. 즉, 겔 1 ㎖를 조성하는 각 시료의 용량은 (1) 아텔로콜라겐 333.3 ㎕, (2) 1.2 M D-글루코오스 함유 3배 농도 DMEM 166.7 ㎕, (3) FBS(소혈청) 55.8 ㎕, (4) 10% FBS 함유 DMEM 277.5 ㎕, (5) 세포 현탁액 166.7 ㎕로 구성되어 있고, 평가 검체의 사과 추출물은 (2) 3배 농도 DMEM의 용매에 대해, 0.3%의 농도로 조제한 사과 추출물 함유 1.2 M D-글루코오스 함유 3배 농도 DMEM 용액은 겔 첨가농도로서 0.3% ×(166.7 ㎕/겔 용량 1 ㎖)=0.05%의 B1에 나타낸 첨가농도가 된다. 마찬가지로, B2 및 B3의 첨가농도는 각각 0.1% 및 0.03%의 사과 추출물 함유 1.2 M D-글루코오스 함유 3배 농도 DMEM 용액을 각각 조제하여 겔 내포시에 첨가한 바, 각각 B2→0.0167%, B3→0.005%의 첨가농도로서 콜라겐 겔 수축률을 구하였다.

[겔 직경의 계측 및 겔 면적의 산출]

겔의 형상은 웰 플레이트와 동일하게 진원형상이 되는 것을 이용하여 겔 면적을 산출하였다.

상기 처리방법에 의해 조제한 겔을 2방향에 대해서 직경을 계측하고, 2직선의 평균값을 산출하였다. 그 겔 직경의 평균값으로부터 겔 반경이 산출되고, 겔 면적은 다음의 식으로 산출할 수 있다.

약제 미처리의 콜라겐 겔의 겔 면적에 대한 약제 처리시의 콜라겐 겔의 겔 면적의 면적비로부터 콜라겐 겔 수축률(%)을 산출하였다.

하나의 데이터에 대해서 n=3 웰 플레이트로 평가하고, 평균±표준편차(mean±S.D.)로 그래프 표기하였다.

[시험결과]

표 1 및 도 1에, 사과 추출물 단독 첨가의 시험예에 대한 콜라겐 겔 수축률(%)의 결과를 나타낸다.

사과 추출물을 겔 형성 후에 첨가한 경우도 겔 내포시에 첨가했을 때도 어느 경우도 콜라겐 겔 수축능이 농도 의존적으로 확인되었다. 그리고, 0.005%(w/v) 첨가시의 겔 수축능은 각각 15.2±6.9%, 16.3±6.5%로 매우 근사한 값을 나타내었다.

[시험예 2]

<콜라겐 트리펩티드에 관한 콜라겐 겔 수축작용 시험>

이 시험에서는, 콜라겐 겔 수축제로서 콜라겐 트리펩티드를 사용하여, 이하와 같이, 콜라겐 겔 수축작용을 측정하였다.

[재료]

(2) DMEM(분말)(상품명: 둘베코 변법 이글배지(2), 닛스이)

(3) DMEM(액체)(상품명: Gibco)

[평가 검체]

(2) 콜라겐 트리펩티드

상품명: HACP-01(젤라이스 주식회사 제조)

규격: 트리펩티드(G-X-Y; X, Y는 임의의 아미노산)를 15% 이상 함유

[시험방법]

사전에 계대배양한 피부 섬유아세포(신생아 유래)를 세포 현탁액(6×10⁵ cells/㎖ 용매 10% FBS 함유 DMEM)으로서 조제하였다. 빙랭 중에서 아텔로콜라겐(5 ㎎/㎖) 4 ㎖, 3배 농도 DMEM(D-Glc 1.2 M 함유 및 애플 페논 SH 0.03% 함유) 2 ㎖, FBS(소혈청) 0.67 ㎖, 10% FBS 함유 DMEM 3.33 ㎖ 및 세포 현탁액 2 ㎖를 혼합하고, 평평한 바닥 12 웰 플레이트에 1 ㎖씩 첨가하였다. 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하고, 5시간 후에 아텔로콜라겐이 재섬유화됨으로써 겔화되는 것을 확인하였다.

첨가로부터 6시간 후에 멸균한 스파튤라의 자루를 사용하여 겔을 웰 플레이트로부터 벗겨낸 후, 10% FBS 함유 DMEM 용액 1 ㎖(0.5%, 0.2%, 0.1% HACP-01 함유)를 첨가하고, 재차 37℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 7일간 배양하였다.

콜라겐 트리펩티드는, 겔 형성 후에 첨가한 경우와, 겔 내포시에 첨가한 경우의 시험을 행하였다. 첨가량은 표 2에 기재한 바와 같다.

표 2에 기재된 첨가농도 A1, A2, A3의 첨가농도는 겔 형성 후에 첨가하는 10% FBS 함유 DMEM 용액 1 ㎖ 중에 콜라겐 트리펩티드를 첨가시킨 수치를 나타내고 있다.

또한, 표 2에 기재된 첨가농도 B1, B2, B3는 겔 내포시에 콜라겐 트리펩티드를 첨가한 겔 용량 1 ㎖ 중의 첨가농도를 나타내고 있다. 즉, 겔 1 ㎖를 조성하는 각 시료의 용량은 (1) 아텔로콜라겐 333.3 ㎕, (2) 1.2 M D-글루코오스 함유 3배 농도 DMEM 166.7 ㎕, (3) FBS(소혈청) 55.8 ㎕, (4) 10% FBS 함유 DMEM 277.5 ㎕, (5) 세포 현탁액 166.7 ㎕로 구성되어 있고, 평가 검체의 콜라겐 트리펩티드는 (2) 3배 농도 DMEM의 용매에 대해, 6.0%의 농도로 조제한 콜라겐 트리펩티드 함유 1.2 M D-글루코오스 함유 3배 농도 DMEM 용액은 겔 첨가농도로서 0.3% ×(166.7 ㎕/겔 용량 1 ㎖)=1.0%의 B1에 나타낸 첨가농도가 된다. 마찬가지로, B2 및 B3의 첨가농도는 각각 3.0% 및 0.6%의 콜라겐 트리펩티드 함유 1.2 M D-글루코오스 함유 3배 농도 DMEM 용액을 각각 조제하여 겔 내포시에 첨가한 바, 각각 B2→0.0167%, B3→0.005%의 첨가농도로서 콜라겐 겔 수축률을 구하였다.

[겔 직경의 계측 및 겔 면적의 산출]

겔의 형상은 웰 플레이트와 동일하게 진원형상이 되는 것을 이용하여 겔 면적을 산출하였다. 도 4에 나타내는 콜라겐 겔 수축제의 콜라겐 겔 수축상태를 나타낸 도면을 참조.

[시험결과]

표 2 및 도 2에, 콜라겐 트리펩티드 단독 첨가의 시험예에 대한 콜라겐 겔 수축률(%)의 결과를 나타낸다.

콜라겐 트리펩티드를 겔 형성 후에 첨가한 경우도 겔 내포시에 첨가했을 때도 어느 경우도 콜라겐 겔 수축능이 농도 의존적으로 확인되었다. 그리고, 0.1%(w/v) 첨가시의 겔 수축능은 각각 20.1±1.0%, 24.2±15.5%로 매우 근사한 값을 나타내었다.

[실시예 1]

[사과 폴리페놀, 콜라겐 트리펩티드 병용예]

사과 폴리페놀과 콜라겐 트리펩티드 병용 시험을 상기 시험방법과 동일하게 행하였다. 사과 폴리페놀을 겔 내포시에 첨가하고, 겔 형성 후에 콜라겐 트리펩티드를 첨가하였다. 그 결과를 표 3, 도 3에 나타낸다.

사과 폴리페놀로서 애플 페놀 SH를 사용하고, 콜라겐 트리펩티드로서 분자량 약 400의 돼지 유래 콜라겐 트리펩티드(제품명: HACP-01 젤라이스 주식회사 제조)를 사용하였다.

시험예 1은 사과 추출물인 애플 페논 SH를 0.005% 첨가한 예이다.

시험예 2는 콜라겐 트리펩티드인 HACP-01을 0.1% 첨가한 예이다.

실시예 1은 시험예 1과 시험예 2를 병용한 예이다.

실시예 1은 상정되는 상가(相加)효과인 참고와 비교해도 현저한 효과를 발휘하는 것을 알 수 있다.

그 결과, 실시예 1은 어느 것도 단독 사용보다도 현격히 콜라겐 겔을 수축시키는 작용을 하는 것이 확인되었다. 또한, 단순히 상정되는 상가 숫자인 참고와 비교해도 현저한 효과를 나타내고, 이것은 예상할 수 없는 효과이다.

[실시예 2]

[광노화 억제시험]

상기 시험에 있어서, 콜라겐 및 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔을 수축시키는 인 비트로(in vitro)의 시험계를 사용하여, 사과 추출물 및 콜라겐 트리펩티드를 병용함으로써 콜라겐 겔 수축을 상승(相乘)적으로 촉진시키는 것을 확인하였다.

장기간 태양(자외선)을 계속해서 쬐면, 얼굴, 목덜미의 깊은 주름을 증가시키고, 또한 피부의 건조 및 피부 거칠어짐이나 기미, 주근깨 등의 색소 침착을 일으키는 것이 알려져 있고, 이 광노화에 의한 피부의 트러블 대책으로서, 새롭게 발견된 사과 추출물 및 콜라겐 트리펩티드 병용이 갖는 콜라겐 수축능의 활용시험을 행하였다. 즉, 피부 노화나 피부의 광노화 현상을 완화, 예방, 억제, 개선하는 성분으로서, 폴리페놀을 주성분으로 하는 사과 추출물에 착안하여, 시험을 행하였다.

<시험방법>

UVA파 및 UVB파를 헤어리스 마우스에 조사시켜서 주름을 형성시키는 시험계에 있어서, 피험물질인 각각의 식품 원료를 경구 섭취시켜서 주름의 억제 및 피부 노화 억제효과에 대해서 검토를 행하였다.

시험개시시 6주령의 헤어리스 마우스(Hos:HR-1 암컷)를 사용하여 이하의 1)~11)의 조건?방법으로 시험을 행하였다.

1) 시험 대상물의 조제 및 투여

헤어리스 마우스의 군나누기는 투여개시일에, 일반상태가 양호한 동물을 체중에 따라, 군간에서의 차가 없도록 1군 6마리로 분배하였다. 또한, 시험군 5의 「2자 병용 혼이(混餌)」의 군에 대해서는 n=5로 평가하고, 각 군의 개체는 1 게이지/군으로 사육하는 것으로 하였다.

마우스용 사료 MF(오리엔탈 바이오 서비스 제조)에, 표 4에 나타내는 각각 피험물질이 균일하게 섞이도록 혼합처리를 행하고, 혼이로 자유 섭취시켰다. 투여군의 일람을 나타낸다. 혼이는 동물 반입 직후부터 해부 18시간 전까지 실시하였다.

(1) 사과 추출물로서 포마쿠티브 HFV(프랑스의 봐르?데?뵈르?바이오 액티브즈사(VVB사) 제조(일본대리점 유니테크 푸즈))를 사용하였다. 포마쿠티브 HFV는, 프랑스산 시드르용 사과를 원료로 한 사과 폴리페놀 제품. 규격성분은 전체 폴리페놀 90% 이상(UV법으로 산출)이다. 프로시아니딘, 퀘세틴(quercetin)(배당체), 프롤리딘, 카테킨류를 주성분으로 한다.

(2) 콜라겐 트리펩티드 원료로서 HACP-01을 사용하였다.

HACP-01(콜라겐 트리펩티드 원료)은, 돼지 유래의 콜라겐을 원료로 하고, 젤라이스사가 제조 판매하고 있는 콜라겐 트리펩티드이다.

이 콜라겐 트리펩티드는, 평균 분자량이 400 이하인 것을 함유하는 트리펩티드로, 통상 일반의 콜라겐으로 칭하는 것과는 구별되는 것이다. 더욱 상세하게는, 아미노산 서열이 Gly-X-Y(X, Y는 아미노산)인 펩타이드가 바람직하고, 특히 바람직하게는 아미노산 서열이 Gly-Pro-Hyp인 것이다.

콜라겐 펩티드는, 돼지 등의 동물 유래, 생선 유래 모두 사용 가능하다. 콜라겐 트리펩티드는, 주로 콜라겐을 가수분해하여 제조할 수 있다. 콜라겐 가수분해물은 이미 시판되고 있으나, 이들의 효소적으로 가수분해된 콜라겐의 대부분은, 분자량의 분포범위가 2천~8만이다. 이들의 가수분해물은 물에 대한 분산성의 향상을 목적으로 하는 것이다.

이에 대해 젤라이스 제조의 콜라겐 가수분해물 HACP-01은, 특정 유효성분으로서 분자량으로 약 400 이하의 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

2) UV 조사(표 4; 시험개요)

UV 조사시는, 동물을 전용 게이지로 옮기고, 1군씩 UVB 20 mJ/㎠ 및 UVA 10 J/㎠를 조사하였다. 조사는 주 3회 월요일, 수요일, 금요일 10주간 실시하였다.

3) 경피 수분 증산량(TEWL)의 측정

경피 수분 증산량의 측정은, vapometer(키스톤 사이언티픽 제조)를 사용하여, 배부(背部)의 꼬리가 붙어 있는 밑동부분으로부터 목을 향해 2 ㎝, 요추에서 우측으로 0.5 ㎝ 부위에 단말(端末)을 대고 측정하였다. 측정일은 시험개시일에 실시하여 각 군의 TEWL값에 편차가 없는 것을 확인하고, 그 후, 해부 직전에 측정하였다.

4) 각질층 수분량의 측정

각질층 수분량의 측정은, MoistureCheckerMY-808S(SCALAR제)를 사용하여, 배부의 꼬리가 붙어 있는 밑동부분으로부터 목을 향해 2 ㎝, 요추에서 우측으로 0.5 ㎝ 부위에 단말을 대고 측정하였다.

5) 해부

각 군, 본 사육기간 종료 익일부터 18시간 절식 후, 빙랭한 Avertin(2,2,2-트리브로모에탄올)을 0.5 ㎎/㎏ 체중 복강 내 투여에 의해 마취를 도입하였다. 그 후, 피부 배부의 꼬리가 붙어 있는 밑동부분으로부터 목을 향해 2 ㎝, 요추에서 우측으로 0.5 ㎝ 부위 범위에서 반사형 레플리카((유) 아사히 바이오메드 제조)를 채취하였다. 그 후, 개복하여 해부를 행하였다. 피부 조직은 10% 중성 포르말린 침윤, 파라핀 포매 후에 헤마톡실린-에오신 염색하였다.

6) 피부 형태 관찰 및 주름 체적률 계측

피부 표면부의 사진촬영과 채취한 레플리카의 판정을 행하였다. 주름 형성 정도를 지표로 하여 ASA-03RXD((유) 아사히 바이오메드 제조)를 사용하여 주름 체적률%(㎛³/㎟/100)를 산출하였다.

7) 표피 비후

「5) 해부」항목에서 실시한 피부 조직의 헤마톡실린-에오신 염색에 의해, 표피의 두께를 계측하였다. 동일 염색 화상 500 ㎛ 중에서 임의로 6개소를 선택하고, 각각의 장소에 있어서의 표피의 두께를 계측하여, 그 6점의 평균값을 그 개체의 표피의 두께로 하였다.

8) 8-히드록시-2'-데옥시구아노신(8-OH dG) 측정

면역 조직 염색에 의해 DNA 손상의 바이오 마커인 8-OH dG의 측정을 표피세포에 착안하여 실시하였다.

「5) 해부」항목에서 준비한 파라핀 포매를 마친 피부 조직을 5 ㎛ 두께로 절편을 적절히 제작하여, 탈파라핀, 친수화는 공지의 방법을 토대로 실시하였다. 항원 부활화는 0.01 M 구연산 완충액(pH 6.0) 비등 중에서 마이크로웨이브 처리 5분을 실시하였다. 실온까지 냉각 후, 상온하 0.3% 과산화수소 함유 메탄올로 30분 반응시켜서 내인성 퍼옥시다아제를 저해하였다. 수세, 10 mM PBS(-) 세정 후, 토끼 혈청 75배(희석용액은 PBS(-))로 30분간 실온 방치하여 블로킹 반응을 행하였다. 혈청을 슬라이드 글래스로부터 떨어뜨려 1차 항체(N 45.1:닛켄 자일(주) 제조)를 5 ㎍/㎖로 4℃에서 하룻밤 방치하여 1차 항체를 반응시켰다. PBS(-)로 2회 세정하고, 비오틴화 2차 항체(비오틴화 토끼 면역 글로불린 M; DAKO 제조)를 300배 희석한 것을 30분간 실온에서 2차 항체를 반응시켰다. PBS(-)로 2회 세정하고, ABC 시약(ABC-HRP; Vectastain 제조)을 30분간 실온에서 반응시켰다. 발색 시약으로서 DAB(3,3-디아미노벤지딘테트라히드로클로라이드: DAKO 제조)를 사용하여 3분 30초 상온하에서 반응시켰다. 수세 후, 공지의 방법을 토대로 탈수, 봉입처리를 행하였다. 현미경하에서 피부 조직의 염색상황을 관찰하고, 이하의 기준을 토대로 스코어화하였다. 스코어화의 판별이 곤란한 것은 그의 중간값 0.5를 더해, 각 군의 스코어를 산출하였다.

스코어

× : 스코어 3 : 표피세포보다도 상층의 세포핵이 몇 층이나 염색

△ : 스코어 2 : 표피세포보다도 상층의 세포핵이 염색

○ : 스코어 1 : 표피세포의 세포핵이 염색

◎ : 스코어 0 : 표피세포의 세포핵이 점재하는 정도의 염색

9) Proliferation Cell Nuclear Antigen(PCNA; 증식 세포핵 항원) 측정

PCNA는 세포 주기의 세포 성장기 후기부터 DNA 합성기 초기에서 발현이 확인되는 핵단백질로, DNA 손상시에 DNA 폴리메라아제나 RFC(복제인자 C; 클램프 장착 인자)와 복합체를 형성하고, 새롭게 DNA를 합성?수복한다. 그러나, 미약한 자외선의 연속 조사 등의 상시 PCNA가 발현하고 있는 환경에 있어서는 세포 주기가 이상해져, 계속해서 세포 증식이 과잉이 되어 표피세포의 턴오버가 항진하고, 각화부전(角化不全)이나 표피 비후를 초래하여, 최종적으로는 광노화현상을 일으키는 것으로 생각된다.

면역 조직 염색에 의해 세포 증식의 바이오 마커인 PCNA의 측정을 표피세포에 착안하여 실시하였다.

「5) 해부」항목에서 준비한 파라핀 포매를 마친 피부 조직을 5 ㎛ 두께로 절편을 적절히 제작하여, 탈파라핀, 친수화는 공지의 방법을 토대로 실시하였다. 항원 부활화는 0.01 M 구연산 완충액(pH 6.0) 비등 중에서 마이크로웨이브 처리 5분을 실시하였다. 실온까지 냉각 후, 상온하 0.3% 과산화수소 함유 메탄올로 30분 반응시켜서 내인성 퍼옥시다아제를 저해하였다. 수세, PBS(-) 세정 후, 토끼 혈청 75배(희석용액은 PBS(-))로 30분간 실온 방치하여 블로킹 반응을 행하였다. 혈청을 슬라이드 글래스로부터 떨어뜨려 1차 항체(PC-10: Santa Cruz 제조)를 1 ㎍/㎖로 4℃에서 하룻밤 방치하여 1차 항체를 반응시켰다. PBS(-)로 2회 세정하고, 비오틴화 2차 항체(비오틴화 토끼 면역 글로불린 M; DAKO 제조)를 300배 희석한 것을 30분간 실온에서 2차 항체를 반응시켰다. PBS(-)로 2회 세정하고, ABC 시약(ABC-HRP; Vectastain 제조)을 30분간 실온에서 반응시켰다. 발색 시약으로서 DAB(3,3-디아미노벤지딘테트라히드로클로라이드: DAKO 제조)를 사용하여 3분 30초 상온하에서 반응시켰다. 수세 후, 공지의 방법을 토대로 탈수, 봉입처리를 행하였다. 현미경하에서 피부 조직의 염색상황을 관찰하고, 이하의 기준을 토대로 스코어화하였다. 스코어화의 판별이 곤란한 것은 그의 중간값 0.5를 더해, 각 군의 스코어를 산출하였다.

스코어

△ : 스코어 2 : 표피세포보다도 상층의 세포핵이 염색

○ : 스코어 1 : 표피세포의 세포핵이 염색

◎ : 스코어 0 : 표피세포의 세포핵이 점재하는 정도의 염색

10) 피부 히드록시 프롤린(Hyp)

피부 단백질을 염산 가수분해하고, LC/MS/MS에 의해 히드록시 프롤린량을 측정하였다.

「5) 해부」항목에서 동결 보존해 두었던 마우스 피부로부터 콜라겐 측정용으로 10 ㎎을 잘라내었다. 그 피부편을 가위로 잘게 잘라 스크류 캡 부착 시험관에 넣은 후, 6 N 염산 1 ㎖를 첨가하고, 110℃에서 24시간 가수분해하였다. 반응용액을 MilliQ 워터로 50배로 희석한 후에, 필터 여과(ø=0.45 ㎜)하고, 추가로, MilliQ 워터로 100배 희석한 것을 히드록시 프롤린 측정용 샘플로 하였다.

히드록시 프롤린은 LC/MS/MS 시스템의 ACQUITY^(R) TQD(Waters)를 사용해서 측정하였다.

LC 조건

?칼럼 HSS T3 2.1×100 ㎜(Waters 제조)

?유속 0.4 mL/min

?칼럼 온도 50℃

?이동상 A: 0.1% 포름산

B: 0.1 포름산, 80% 아세토니트릴

?그라디언트

MS/MS 조건

?이온화 ESI+(Positive)

?캐필러리 전압 0.5 kV

?탈용매 가스 1,000 L/Hr

? 콘가스 50 L/Hr

?이온원 히터 150℃

?모니터 MRM

?프리커서 이온(m/z) 132.16

?프로덕트 이온(m/z) 86.1

?Dwell 시간(초) 0.05

?콘전압(V) 28

?충돌에너지(Collision Energy)(eV) 12

표준품의 히드록시 프롤린(Wako 제조)과의 피크 에어리어를 비교함으로써 피부 콜라겐 중의 히드록시 프롤린량(Hyp)을 산출하였다.

11) 통계처리

시험결과는 평균값±표준편차(mean±S.D.)로 나타내고, 다중비교(Steel's test)를 엑셀 통계 2008의 해석 소프트웨어로 유의차 검정을 행하였다. **⇒p<0.01, *⇒p<0.05로 하고, p<0.1에 대해서는 유의 경향으로서 주의 표기하였다.

<시험결과>

이하에, 본 실시예 2의 각 시험예의 결과를 순차적으로 나타낸다.

1. 일반상태 관찰 및 주름 체적률 계측

자외선 조사 제4주째경부터 UV 조사 동물에 있어서, 두부(頭部) 피부의 경도 갈색화나 경부(頸部)의 주름 깊이 및 후지배부(後肢背部)의 주름이 UV 비조사 동물과 비교하여 눈에 띄게 되었다.

해부시의 외관관찰에서는, UV 조사 동물에서 얼굴, 경부 및 후지배부의 주름이 명료하게 확인되었으나, UV 조사에 있어서도 2자 병용 혼이(포마쿠티브 HFV 0.006% 및 HACP-01 0.5% 혼이)한 마우스에 있어서 그 증상은 경도이고, 2자 병용 혼이군에서는 주름의 심도가 얕아, 육안적으로는 주름의 정도가 전혀 없었다. 또한, 고농도 섭취 동물은, 대조군과 비교하여 피부에 촉촉한 느낌이 있었다.

표 6, 도 4의 주름 체적률의 그래프가 나타내는 바와 같이, 자외선 조사에 의해 명확한 주름의 형성이 확인되고, 동일 자외선 조사 조건하에서, 혼이군에서는 농도 의존적으로 주름 억제효과가 유의하게 확인되었다. 한편, 사과 혼이군 및 콜라겐 트리펩티드 혼이군에서는 주름의 억제효과는 매우 근소한 것으로, 유의차 검정에 의해, UV+군과의 유의한 주름 체적률의 억제는 확인되지 않았다. 한편, 2자 병용 혼이군에서만 유의하게 주름 체적률을 억제하였다.

2. 체중 추이

표 6에 나타내는 바와 같이 체중 추이는, 각 군 커다란 차이는 확인되지 않았다.

3. 섭이량

표 6에 나타내는 바와 같이, 섭이량에 대해서도 체중 추이와 동일하게 커다란 차이는 확인되지 않았다. 섭식량은 체중 증가가 완만해진 자외선 조사 6주간부터 10주간에 있어서의 평균값으로부터 산출하였다. 이 섭취량은 사람이 무리 없이 섭취할 수 있는 양으로 광노화현상에 수반되는 주름을 억제할 수 있을 것으로 생각된다.

4. 간장 중량

간장 중량에 대해서도 커다란 차이는 확인되지 않고 이상한 증상은 관찰되지 않았다. 또한, 다른 장기에 대해서도 이상은 확인되지 않았다.

5. 경피 수분 증산량(TEWL)

결과를 표 6에 나타낸다.

경피 수분 증산량은 그 수치가 높을수록, 각질층으로부터 수분이 증발되어 피부의 건조상태를 일으키고 있는 것으로 생각된다. UV 조사에 의해 경피 수분 증산량의 상승이 일반적으로 알려져 있고, 본 시험에서도 해부일의 경피 수분 증산량은 UV-군과 비교하여 UV+군에서는 높아져 건조상태를 뒷받침하고 있었다. 이때, UV+ 조사 및 포마쿠티브 HFV 혼이군은 낮은 TEWL값을 나타내었다. UV+ 조사군과 비교하여 UV-군, 사과 혼이군 및 2자 병용군에서 유의하게 낮은 TEWL값을 나타내었다. 콜라겐 트리펩티드 혼이군에서는 유의 경향(p=0.0987)으로서 낮은 TEWL값을 나타내었다.

6. 각질층 수분량

결과를 표 7에 나타낸다.

각질층 수분량은 그 수치가 낮을수록, 각질층의 수분 또는 수분 유지에 관여하는 천연 보습 인자(Natural Moisturizing Factor; NMF)가 감소하여, 피부의 건조상태를 일으키고 있는 것으로 생각된다. UV 조사에 의해 각질층 수분량이 감소한다고 일반적으로 알려져 있고, 본 시험에서도 해부일의 각질층 수분량은 [UV-/조절식]군과 비교하여 [UV+/조절식]군에서는 낮아져 건조상태를 뒷받침하고 있었다. 이때, 사과 혼이군은 각질층 수분량의 회복을 나타내었다. UV+ 조사군과 비교하여 사과 혼이군 및 2자 병용군에서 유의하게 높은 각질 수분량을 나타내었다.

7. 표피 비후

결과를 표 7에 나타낸다.

[UV+/조절식]군에 대해, [UV-/조절식]군, 콜라겐 트리펩티드 혼이군 및 2자 병용군에서 유의한 표피 비후(아칸토시스(acanthosis))의 억제가 증명되었다. 또한, 0.006% 혼이군에서는 유의 경향(p=0.0831)으로서 표피 비후가 억제되어 있었다.

8. 8-OH dG

결과를 표 7에 나타낸다.

[UV+/조절식]군에 대해, [UV-/조절식]군, 2자 병용군에서 유의하게 8-OH dG를 억제하였다. 한편, 사과 혼이군에서는 8-OH dG를 억제하지 않았다. 또한, 콜라겐 트리펩티드 혼이군에서는 유의 경향(p=0.0596)으로서 8-OH dG를 억제하였다.

8-OH dG는 세포의 DNA 손상 지표의 하나로, 자외선이나 방사선, 화학오염물질, 담배연기 등 산화스트레스의 폭로에 의해 DNA의 구아닌이 산화되어 형성된다. 본 시험에서의 자외선 조사에 의해 마우스 피부의 기저세포층에 8-OH dG가 증가하고 있었기 때문에 DNA 손상이 일어난 것 및 사과와 콜라겐 트리펩티드의 2자 병용 혼이군에서는 그 DNA 손상이 억제되어 있던 것을 시사하고 있다.

9. PCNA

결과를 표 7에 나타낸다.

[UV+/조절식]군에 대해, [UV-/조절식]군, 사과 혼이군 및 2자 병용군에서 유의하게 PCNA를 억제하였다. 콜라겐 트리펩티드 혼이군에서는 유의 경향(p=0.0645)으로서 PCNA의 발현이 억제되었다.

PCNA는 세포 증식이나 세포 주기의 지표의 하나로, 세포 성장기 후기~DNA 합성기 초기에서 발현 증강하고, DNA 폴리메라아제나 복제인자 C(RFC) 등과 복합체를 형성하여 DNA 손상 부위의 잘라냄과 새로운 DNA의 합성이나 수복을 행하는 핵단백질이다. 본 시험에 있어서, 자외선 조사로 과잉으로 증가한 DNA 상해를 정상상태로 수복하기 위해 PCNA가 과잉 발현하여 DNA가 과잉으로 합성되어 표피 기저세포의 세포 주기 이상을 초래하고, 계속해서 기저세포의 증식 과잉이 표피의 턴오버 이상으로 이어져, 최종적으로는 표피의 비후나 피부 외관의 주름을 일으킨 것으로 생각된다. 이 PCNA의 과잉 발현을 사과와 콜라겐 트리펩티드 2자 병용 혼이군에서 유의하게 억제한 것은, 사과와 콜라겐 트리펩티드 2자 병용에 의해 미연에 자외선 손상을 완화하여 주름 형성 억제나 표피 비후 억제로 도출한 것으로 시사된다.

10. 피부 히드록시 프롤린(Hyp)

결과를 표 7에 나타낸다.

[UV+/조절식]군에 대해, 2자 병용군에서 유의 경향(p=0.0938)의 Hyp의 상승이 확인되었다. Hyp 상승은 피부 조직에 있어서의 콜라겐량의 증가를 시사하고 있다.

상기 각 동물실험을 총괄하면, 각 시험에 있어서, 사과 추출물과 콜라겐 트리펩티드의 2자 병용이 효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다.

특히, 주름 체적률, 8-OH dG의 2항목이 자외선 조사 조건에 있어서도 2자 병용군에서만 유의하게 억제하는 것이 확인되어, 사과 추출물과 콜라겐 트리펩티드의 2자 병용효과를 발휘하였다.

그 밖에, TEWL, 각질층 수분량, 표피 두께에 있어서도 2자 병용군에서 유의하게 자외선 손상의 영향을 완화?억제하고 있고, 피부조직 중의 Hyp도 2자 병용군에서만 유의 경향으로서 상승을 나타낸 것도 2자 병용의 유용성을 시사하고 있다.

본 출원인은, 첨가량을 변경하여 포마쿠티브 HFV만을 혼이한 시험을 본 시험과 동일한 내용에 대해서 별도로 행하였다. 첨가량은 0.006 중량%, 0.012 중량%, 0.060 중량%의 3종류로 하였다. 이 시험결과, 농도 의존적으로 작용효과를 발휘하는 것이 확인되어 있다. 예를 들면, 주름 체적률을 참고로 나타내면, 각각의 첨가량에 따라, 31.1%, 13.4%, 9.0%이다. 조절식의 UV 유무의 결과는, 본 시험예와 동일하다. 본 시험예에서는, 사과 추출물 0.006 중량%와 콜라겐 트리펩티드 0.5 중량%의 2자 병용은, 12.0%의 주름 체적률을 나타내고 있는 것은, 저농도 첨가에 있어서, 현저한 주름 형성 억제능을 발휘하는 것을 확인할 수 있다. 이와 같이, 사과 추출물과 콜라겐 트리펩티드의 2자 병용은, 저농도에서도 현저한 상승효과를 발휘한다.

[실시예 3]

사과 추출물(실시예 2와 동일)과 콜라겐 트리펩티드(실시예 2와 동일)를 혼합한 음료의 연일 경구 섭취에 따른 건강한 정상인의 피부상태에 미치는 유효성의 확인시험을 행하였다.

1. 시험방법

시험 디자인 : 병행군간 이중맹검법

피험자 수 : 20명(각 군 10명), 30대 이상의 건강한 정상인 여성

섭취기간 : 30일간

섭취량 : 드링크 1일 1병 50 ㎖ 취침 전의 섭취 권장

조사시기 : 섭취 전, 10일 후, 30일 후,

조사방법 : 직전, 시험개시 후 10일, 30일

2. 시험품

(a) 콜라겐 트리펩티드 배합 음료 50 ㎖/1병

트리펩티드 함유 콜라겐 펩티드 : 2600 ㎎

세라미드 : 600 ㎍

비타민 C : 250 ㎎

댕댕이나무(하스컵) 추출물 : 15 ㎎

코엔자임 Q10 : 1 ㎎

비타민 E(α-토코페롤로서) : 2 ㎎

히알루론산 : 1 ㎎

(b) 콜라겐 트리펩티드와 사과 폴리페놀 배합 음료 50 ㎖/1병

항노화 소재로서 알려져 있는 댕댕이(하스컵) 추출물 대신에, 사과 폴리페놀을 배합하였다.

트리펩티드 고함유 콜라겐 펩티드 : 2600 ㎎

사과 폴리페놀 : 83 ㎎

※ 사과 폴리페놀 원료는 열수 추출 건조물

세라미드 : 600 ㎍

비타민 C : 250 ㎎

코엔자임 Q10 : 1 ㎎

비타민 E(α-토코페롤로서) : 2 ㎎

히알루론산 : 1 ㎎

3. 시험기간의 유의사항

1) 시험기간 중에는 폭음 폭식을 피한다.

2) 시험기간 중에는 생활습관을 바꾸지 않도록 한다.

3) 콜라겐 펩티드, 대두 이소플라본, 비타민 C 등 특히 미용을 목적으로 한 건강식품의 섭취, 에스테틱 등의 시술, 새로운 화장품의 사용은 삼가한다.

4. 조사항목

1) 문진표 : 건조, 화장의 먹은 정도, 탱탱함, 밝음, 부드러움, 기타

2) 기기측정 : 탄력성

탄력성 : 피부 탄력 큐트미터 MPA580 2회

측정부위 : 안면 우협부(右頰部)

5. 시험결과

(1) 문진표에 의한 시험결과를 도 11에 나타낸다. 도 11에 나타내는 데이터는, 시험 전의 상태와 시험기간인 30일 경과 후의 상태에 대해서 행한 앙케이트의 회답을 정리한 것이다. 회답 종류는, 각각의 항목에 대해서, 「1. 개선되었다 2. 변함 없다 3. 나빠졌다 4. 원래 신경쓰이지 않는다」 등의 4항목으로부터의 선택으로 하였다.

자각증상 앙케이트는 개선되었다를 +1, 변함 없다를 0, 나빠졌다를 -1로 하였다.

그 결과, 콜라겐 트리펩티드와 사과 폴리페놀을 병용한 (b)는, 콜라겐 트리펩티드를 배합한 (a)와 비교하여, 피부의 매끈매끈함, 건조, 화장의 먹은 정도 등에 있어서, 우수한 개선효과가 자각되어 있다. 또한, 여드름에 관하여, 생기기 쉬움, 낫기 어려움, 악화되기 쉬움에 대해서는, 억제효과가 있는 것이 자각되어 있다.

따라서, 계속적인 복용에 의해, 피부가 윤이 나고, 화장의 먹은 정도가 좋아지는 동시에, 여드름의 발생, 증상이 억제되는 것을 기대할 수 있다.

(2) 피부 탄력성의 평가

큐트미터 MPA580(Courage+Khazaka Electronic Gmbh사 제조)을 사용하여 계측한 피부의 점탄성과 탄력성을 계측한 결과를 도 12(a)(b)에 나타내었다. 피부 점탄성에 대해서는, 큐트미터 MPA580의 계측 파라미터 R0, 피부 탄력성에 대해서는 파라미터 R2를 사용해서 평가하였다. 계측은, 시험개시 전, 시험개시 후 10일째, 시험개시 30일 후(시험기간 종료 후)의 3회 측정하였다. 표 중 a는 콜라겐 트리펩티드를 배합한 시음료를 나타내고, b는 사과 폴리페놀과 콜라겐 트리펩티드를 배합한 시음료를 나타낸다.

도 12(a)에 나타내는, 점탄성에 대해서는 중간의 10일 섭취에서는, 사과 폴리페놀의 유무에 따른 차는 확인되지 않으나, 30일간 섭취에서는, 사과 폴리페놀과 콜라겐 트리펩티드를 병용한 샘플(b)의 개선효과과 커져 있다.

도 12(b)에 나타내는 탄력성에 대해서는, 중간의 10일 섭취, 30일 섭취 모두 사과 폴리페놀과 콜라겐 트리펩티드를 병용한 샘플(b)의 개선효과가 커져 있다.

따라서, 장기 계속 섭취에 의해, 샘플(b) 쪽이 피부의 점탄성, 탱탱함이 개선되는 것이 기기계측에 의해서도 확인할 수 있었다.

Claims

콜라겐 및 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔을 수축시키는 콜라겐 겔 수축제로서, 사과 추출물 및 콜라겐 트리펩티드를 유효성분으로 하는 미용 음료.
제1항에 있어서,
사과 추출물이 사과 유래의 폴리페놀이고, 콜라겐 트리펩티드의 평균 분자량이 400 이하인 것을 함유하는 콜라겐 트리펩티드인 것을 특징으로 하는 미용 음료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
주름 형성 억제용 미용 음료인 미용 음료.
자외선 피폭에 의한 주름 형성을 억제하는 제3항에 기재된 주름 형성 억제용 미용 음료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
DNA 손상 억제용 미용 음료인 미용 음료.
자외선 피폭에 의한 DNA 손상을 억제하는 제5항에 기재된 DNA 손상 억제용 미용 음료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
각질층 수분량 유지용 미용 음료인 미용 음료.
자외선 피폭에 의한 각질층 수분량의 감소를 억제하는 제7항에 기재된 각질층 수분량 유지용 미용 음료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
표피 비후 억제용 미용 음료인 미용 음료.
제1항 또는 제2항에 있어서,
피부 탄력성 향상용 미용 음료인 미용 음료.