JP4225588B2 - 皮膚タルミ改善作用の評価方法 - Google Patents
皮膚タルミ改善作用の評価方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4225588B2 JP4225588B2 JP24978096A JP24978096A JP4225588B2 JP 4225588 B2 JP4225588 B2 JP 4225588B2 JP 24978096 A JP24978096 A JP 24978096A JP 24978096 A JP24978096 A JP 24978096A JP 4225588 B2 JP4225588 B2 JP 4225588B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- collagen
- gel
- test
- strength
- skin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検体の皮膚タルミ改善作用の評価方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
老化における典型的な顔面の形態変化であるシワやタルミを予防・改善するのに有効な物質を発見あるいは製造することは、社会における重要な課題の一つである。このうち、シワ改善物質としてはレチノイン酸等数種の物質が知られているが、タルミ改善物質については全く知られていない。
【0003】
その原因の一つとしてタルミ改善物質の評価方法として唯一知られているin vivo評価法は、費用、時間、手間等がかかり、評価能率の点で非常に問題があることが挙げられる。このような事情から、簡便、安全かつ正確に皮膚タルミ改善物質を評価する方法の開発が望まれている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的はin vitroで簡便かつ正確に皮膚のタルミ改善作用を評価できる方法を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は真皮結合組織に多量に存在するコラーゲンに着目し、真皮結合組織のモデルとして知られているコラーゲン埋包培養におけるゲル強度と皮膚のタルミとの関係について検討してきたところ、当該ゲル強度を向上させる物質は皮膚のタルミを改善させる作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0006】
すなわち、本発明は、被検体及び哺乳類由来の線維芽細胞をコラーゲン溶液に添加し、形成するコラーゲンゲルの強度を応力緩和試験、クリープ試験及び動的粘弾性試験のいずれか1つ以上により測定し、次いで被検体無添加の場合のコラーゲンゲル強度と対比することを特徴とする当該被検体の老化による皮膚タルミ改善作用の評価方法を提供するものである。
【0007】
【発明の実施の形態】
皮膚は表皮、真皮、皮下組織の3層に主に分けられ、それらのうち真皮は皮膚の構造を維持する上で極めて重要であり、コラーゲンやエラスチンといった線維により強固かつ柔軟に造られ、真皮結合組織を形成している。これらコラーゲンやエラスチンといった結合組織の線維を構成するタンパク質は、線維芽細胞により合成/分解されている。線維芽細胞はこれらコラーゲン等の線維と相互作用することにより結合組織の状態をコントロールしている。
【0008】
通常の線維芽細胞培養条件下、線維芽細胞をコラーゲンゲル中に埋包して培養するとコラーゲンゲルは収縮し、ゲル強度を増す。線維芽細胞の存在しないコラーゲンのみのゲルや、リンパ球など浮遊性の細胞を埋包したゲルでは収縮は全く起こらず、ゲル強度にも変化はない。コラーゲンゲル埋包培養は一般に真皮結合組織のモデルとされている(Review: E. Bell et al. J. Invest. Dermatol.,81,2s(1983)等)。当該コラーゲンゲル埋包培養を利用したデータとしては、老齢者由来の線維芽細胞埋包コラーゲンゲルと若年者由来の線維芽細胞埋包コラーゲンゲルとを対比し、老齢者の場合は若年者の場合に比べてゲルの収縮が低下していることが知られている(M. Yamato, et al. Mech. Ageing Dev.,67,149(1993))。
【0009】
しかしながら、かかる細胞埋包コラーゲンゲルの強度と皮膚のタルミとの関係について検討した報告はなく、これらの間に相関性があることを見出したのは本発明者がはじめてである。
【0010】
本発明に使用される動物細胞としては、コラーゲンゲルを収縮させる作用のある細胞であれば正常又はトランスフォームされたものでも、皮膚弛緩症等の患部由来のものでも、正常組織由来のものでも、いかなる組織のものでもいずれも利用できるが、正常の皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞、歯肉線維芽細胞、軟骨細胞、肝細胞、血管内皮細胞等がより好ましい。更には皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞がより好ましい。
【0011】
細胞由来の動物としては哺乳類が好ましく、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウシ、サル、ニワトリ、ウマ等が挙げられるが、この中でヒト、マウス、ラット、ウサギがより好ましい。これらの細胞は初代培養のものでも継代を繰り返したあとのin vitro老化させた細胞であってもよく、また、胎児由来のものであっても老齢者由来のものであってもよい。これらの細胞は組織より公知の方法により採取して用いてもよく、又は市販品を購入して用いてもよい。
【0012】
本発明に使用されるコラーゲンとしては、動物由来のコラーゲンであればいずれでもよいが、動物としては哺乳類が好ましく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシ等由来のコラーゲンがより好ましい。これらのコラーゲンは組織より公知の方法により採取して用いてもよく、又は市販品(例えば新田ゼラチン社製、typeI-A)を購入して用いてもよい。
【0013】
本発明に使用されるコラーゲンゲルは公知の方法に準じて作製できる。コラーゲンゲル作製時のコラーゲンの濃度は特に制限されないが、0.1〜5.0mg/mlが好ましく、0.5〜3.0mg/mlがより好ましい。この際埋包される動物細胞の密度は特に制限されないが、1,000〜5,000,000cells/mlが好ましく、5,000〜500,000cells/mlがより好ましい。作製されるコラーゲンの形状はいずれの形状でもよいが、円形の培養プレートで作製した円柱型が好ましい。
【0014】
被検体はコラーゲンゲル作製時のコラーゲン溶液中に添加すればよい。
【0015】
本発明のコラーゲンゲルの強度の測定法は応力緩和試験、切断試験、クリープ試験、引っ張り試験等いずれでもよいが、応力緩和試験、クリープ試験がより好ましい。また、動的粘弾性試験を行ってもよい。本発明において、コラーゲンゲルの作製時から強度の測定時までの培養期間は特に制限されないが、1日〜60日がより好ましい。
【0016】
被検体添加コラーゲンゲルの強度を被検体無添加の場合と対比することにより、当該被検体のタルミ改善作用が評価できる。すなわち、被検体無添加の場合に比べて被検体添加の場合のゲル強度が上昇していれば、その被検体には皮膚のタルミを改善する作用があると評価できる。
【0017】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【0018】
実施例1
コラーゲンゲルの応力緩和試験によるゲル形成強度の評価
コラーゲンゲルは文献「J. Cell Science,102,315(1992)」又は「J. Invest. Dermatol.93,792(1989)」に準じた方法で作製した。すなわち、氷冷下コラーゲン溶液(新田ゼラチン社製、typeI-A(3.0mg/ml,pH=3))にDMEM(Dulbecco's Modified Bagle Medium low glucose)濃縮溶液、中和液(250mM HEPES含有0.05M NaOH水溶液)、FCS(5%、Fatal Calf Serum)、精製水を加えて十分に攪拌し、中和した後、最後にヒト皮膚線維芽細胞(ヒト包皮、1歳、由来)の懸濁液を加えて、十分に攪拌し、気泡を取り除いた後、12穴プレートに各穴3mlずつ注入し、直ちに37℃でゲル化させた。この際の細胞密度を1万個/ml、5万個/ml、15万個/mlの3種の濃度として比較検討した。またコラーゲン濃度は1.5mg/mlに調製した。24時間後ゲルの周囲を剥離し、培地を加えて培養し、10日培養後に測定を行った。
【0019】
ゲルの形成強度試験は物性測定機器(Rheometer 2002DD、不動工業社製)を用いて応力緩和時間を測定した。アダプターは、収縮したゲルの直径(最小8mm程度)を考慮し直径5mmのものを使用した。応力は5g、応力緩和測定時間は90秒とした。
ゲルを短時間(数秒間)キムワイプ(ワイパーS200)に触れさせて余分な水分を除き、直ちに測定を開始した。測定は温度20〜22℃、湿度35〜45%の条件下で行った。結果を表1に示す。
【0020】
【表1】
【0021】
表1より、細胞密度が高くなるにつれコラーゲンゲルの緩和時間は増大し、ゲル強度が増加していることがわかる。また、緩和率は細胞密度が高くなるにつれ低下することからもゲル強度が増加していることが明らかである。
【0022】
実施例2
コラーゲンゲル形成強度試験とタルミの相関性
老齢者由来と若齢者由来の皮膚線維芽細胞についてコラーゲンゲル形成強度について評価した。
実施例1と同様氷冷下コラーゲン溶液に中和液、DMEM濃縮溶液、FCS、精製水を加えて、十分に攪拌中和した後、最後にヒト皮膚線維芽細胞(老齢者由来:64歳から75歳、n=5、若齢者由来0歳から20歳、n=5)の懸濁液を加えて十分に攪拌し、気泡を取り除いた後、12穴プレートに各穴3mlずつ注入し、直ちに37℃でゲル化させた。この際の細胞密度は5万個/mlとし、また、コラーゲン濃度は1.5mg/mlに調製した。24時間後ゲルの周囲を剥離し、培地を加えて培養し、10日培養後に測定を行った。
ゲルの形成強度試験は実施例1と同様に測定した。結果を表2に示す。
【0023】
【表2】
【0024】
表2より、若齢者由来のものより老齢者由来の細胞の方がコラーゲンゲルの緩和時間は減少し、ゲル強度が低下していることがわかる。また、緩和率は若齢者由来のものより老齢者由来の方が増加することからもゲル強度が低下していることが明らかである。
【0025】
更に、10歳代から70歳以上までのヒト(n=200)の顔面部のタルミスコアをパネラー5人により評価した。タルミスコアは以下の基準でつけた。結果を表3に示す。
【0026】
スコア0:全く弛んでいない
スコア1:微かに弛んでいる感じがする
スコア2:やや弛んでいる
スコア3:弛んでいる
スコア4:非常に弛んでいる
【0027】
【表3】
【0028】
表3より明らかなように、若齢者よりも老齢者の方がタルミの程度が高いことがわかる。
表2及び表3よりコラーゲンゲルの強度と皮膚のタルミには負の相関性、すなわちゲル強度の低下とタルミの程度に相関が得られていることは明らかである。
【0029】
実施例3
コラーゲンゲルの形成強度試験による被験物質の評価
実施例1と同様氷冷下コラーゲン溶液に中和液、DMEM濃縮溶液、FCS、精製水を加えて十分に攪拌中和した後、最終濃度0.01%(乾燥固形換算重量%)の被験物質(各種植物エキス及びコントロールとしてその抽出溶媒であるエタノール、ブチレングリコール)を加え、最後にヒト皮膚線維芽細胞の懸濁液を加えて、十分に攪拌し、気泡を取り除いた後、12穴プレートに各穴3mlずつ注入し、直ちに37℃でゲル化させた。この際の細胞密度は5万個/mlとし、また、コラーゲン濃度は1.5mg/mlに調製した。24時間後ゲルの周囲を剥離し、培地を加えて培養し、10日培養後に測定を行った。
ゲルの形成強度試験は実施例1と同様に測定した。結果を表4に示す。
【0030】
【表4】
【0031】
表4より明らかなように、種々の植物エキスによりコラーゲンゲルの緩和時間は増大し、ゲル強度が増加していることがわかる。また、緩和率が種々のエキスを加えることにより低下することからもゲル強度が増加していることが明らかである。
【0032】
一方、上記被検物質について皮膚に長期間の塗布を行い、皮膚のタルミ改善作用を市販の皮膚粘弾性測定機(Custometer SEM474(Courage & Khazaka))により評価したところ、表4のデータと正の相関性が確認された。
【0033】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便、安全かつ正確に皮膚タルミ改善物質を評価することができる。
Claims (1)
- 被検物質及びヒト皮膚線維芽細胞をコラーゲン溶液に添加し、形成するコラーゲンゲルの強度を応力緩和試験、クリープ試験及び動的粘弾性試験のいずれか1つ以上により測定し、次いで被検物質無添加の場合のコラーゲンゲル強度と対比することを特徴とする当該被検物質の老化による皮膚タルミ改善作用の評価方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24978096A JP4225588B2 (ja) | 1996-09-20 | 1996-09-20 | 皮膚タルミ改善作用の評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24978096A JP4225588B2 (ja) | 1996-09-20 | 1996-09-20 | 皮膚タルミ改善作用の評価方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1095713A JPH1095713A (ja) | 1998-04-14 |
JP4225588B2 true JP4225588B2 (ja) | 2009-02-18 |
Family
ID=17198125
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP24978096A Expired - Fee Related JP4225588B2 (ja) | 1996-09-20 | 1996-09-20 | 皮膚タルミ改善作用の評価方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4225588B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20000076136A (ko) * | 1997-03-11 | 2000-12-26 | 스즈키 츠네시 | 피부 상태 개선제의 평가 방법 및 피부 외용제의 제조 방법 |
FR2847345B1 (fr) * | 2002-11-18 | 2005-02-18 | Oreal | Procede de criblage et/ou d'evaluation de l'activite anti-ride de produits |
JP5456349B2 (ja) * | 2009-03-30 | 2014-03-26 | 株式会社ナリス化粧品 | コラーゲンゲル収縮促進剤 |
JP2010254667A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-11-11 | Fancl Corp | コラーゲンゲル収縮剤 |
JP2011032219A (ja) * | 2009-08-03 | 2011-02-17 | Fancl Corp | コラーゲンゲル収縮剤 |
JP5572406B2 (ja) * | 2010-01-29 | 2014-08-13 | 株式会社ファンケル | コラーゲンゲル収縮剤 |
JP2012062278A (ja) * | 2010-09-16 | 2012-03-29 | Fancl Corp | リンゴ抽出物及びコラーゲントリペプチド含有美容飲料 |
JP2012082147A (ja) * | 2010-10-07 | 2012-04-26 | Fancl Corp | シリビンマルトシドを用いたコラーゲンゲル収縮剤 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2533376B2 (ja) * | 1989-06-19 | 1996-09-11 | 太陽化学株式会社 | 皮膚化粧料 |
JP3219792B2 (ja) * | 1991-09-04 | 2001-10-15 | 三省製薬株式会社 | 皮膚老化防止用外用剤 |
JPH06279294A (ja) * | 1993-03-24 | 1994-10-04 | Lion Corp | コラーゲン合成促進剤 |
-
1996
- 1996-09-20 JP JP24978096A patent/JP4225588B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH1095713A (ja) | 1998-04-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Monteiro-Riviere | Comparative anatomy, physiology, and biochemistry of mammalian skin | |
Montagna | The structure and function of skin | |
Orfanos et al. | Hair and hair diseases | |
Flint et al. | Collagen fibril diameters and glycosaminoglycan content of skins—indices of tissue maturity and function | |
JP3747412B2 (ja) | 組織工学用にデザインされた担体を製造するための水生動物起源のコラーゲンの使用並びにそれにより得られる担体及び生体材料 | |
EP1290145B1 (de) | Dreidimensionales hautmodell | |
JP4225588B2 (ja) | 皮膚タルミ改善作用の評価方法 | |
KR101353748B1 (ko) | 셀 접착성 증가에 의한 피부 경도 향상용 화장용 조성물준비에의 엑스-이솔레우실-리실-바릴-알라닐-바린-와이펩타이드의 용도 | |
Ponec et al. | Use of human keratinocyte and fibroblast cultures for toxicity studies of topically applied compounds | |
McMahon et al. | Aging effects on the elastin composition in the extracellular matrix of cultured rat aortic smooth muscle cells | |
CA1310915C (en) | Cosmetic agent and composition and method for treatment of the skin | |
Compton et al. | Cultured human sole‐derived keratinocyte grafts re‐express site‐specific differentiation after transplantation | |
Slavkin et al. | Enamel-like antigens in hagfish: possible evolutionary significance | |
Bowling et al. | Fabrication and reorganization of dermal equivalents suitable for skin grafting after major cutaneous injury | |
Knight et al. | Collagen content of uninjured skin and scar tissue in foetal and adult sheep. | |
Van Scott et al. | Sulfhydryl and disulfide in keratinization | |
JP2004018471A (ja) | Iv型、vii型コラーゲン産生促進剤および皮膚基底膜ケア用組成物 | |
KR20000029382A (ko) | 콜라겐 혼입 화장품 | |
US4983721A (en) | Solvents for collagen | |
US5064941A (en) | Collagen extracted from collagen-containing tissue | |
MacCallum et al. | The culture of oral epithelium | |
Nakano et al. | Age-related accumulation of lipofuscin in myocardium of Japanese monkey (Macaca fuscata) | |
Embery et al. | Biochemical changes in periodontal ligament ground substance associated with short-term intrusive loadings in adult monkeys (Macaca fascicularis) | |
CN113143789A (zh) | 组合物及其在皮肤护理中的应用 | |
JP2533376B2 (ja) | 皮膚化粧料 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060404 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060605 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060606 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080708 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080908 |
|
A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20081007 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081118 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081125 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111205 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111205 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111205 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121205 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121205 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131205 Year of fee payment: 5 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |