CN108697706B - 黑色素分解抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抑制角化细胞中的黑色素的分解并增强皮肤和毛发的黑色素蓄积的黑色素分解抑制剂。角化细胞的黑色素分解抑制剂以选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上作为有效成分。

Description

黑色素分解抑制剂
技术领域
本发明涉及一种抑制角化细胞中的黑色素的分解的黑色素分解抑制剂。
背景技术
作为决定皮肤或毛发的颜色的因素，已有各种报告，其中，认为存在于表皮的黑色素的量或质对皮肤或毛发的颜色有很大贡献。即，皮肤或毛发的颜色的形成受到黑色素产生细胞(黑色素细胞)中的被称为黑色素体的细胞小器官中产生的黑色素向表皮或毛囊的角化细胞转送并向表皮或毛发全体扩散的影响大。
因此，通过增强黑色素产生或抑制黑色素分解等，角化细胞中的黑色素量增加时，皮肤褐色化，毛发黑色化。
最近，本申请人还发现，自噬干预角化细胞内的黑色素动态，角化细胞中的黑色素量与自噬活性相关(专利文献1)。据此可以认为，通过抑制自噬活性，角化细胞中的黑色素的分解被抑制，能够使皮肤和毛发颜色黑化。
在皮肤中，作为褐斑、雀斑的原因之一，已知由于皮肤的紫外线暴露的刺激、激素异常或遗传要素等，存在于皮肤内的黑色素细胞被活化而使黑色素产生变得旺盛，因此，目前已开发了抑制黑色素产生或者减少所产生的黑色素的美白剂。但另一方面，在欧美，希望褐色的肌肤的情况也很多，在日本，近年来也流行以年轻人为中心，敢于接受日光浴或屋内的紫外线照射，在欧美，利用日光浴床(tanning bed)的人工的晒黑也依然盛行。另外，也有关于紫外线的有害性的启蒙活动，现状是以二羟丙酮为主要成分的自晒黑剂(selftanning agent)已上市。
这样的过度的紫外线照射对皮肤造成大的损伤，也有导致皮肤癌的发生的危险，另外，在自晒黑剂中，其作用是利用角质层的美拉德反应而使皮肤褐色化，因此在色泽或色泽的稳定性和紫外线防御能力的提高无望等效果方面被指出问题。
另一方面，白发是因毛母黑色素产生细胞的变化而黑色素减少的生理的老化现象之一，但其发生机理尚未阐明。作为使白色化的头发向黑发转变的方法，已完成了很多防止或改善白发的成分等的报告，但现状是，在有效性和安全性方面都无法获得充分的效果，利用染发剂的染发成为主要行为。
因此想到了，若找到直接作用于角化细胞而使黑色素量增加或蓄积的成分，则能够促进本身黑色素所具有的生物体防御能力，预防皮肤的损伤，并实现肌肤的褐色化和白发的防止或改善。
已报告了，苯乙双胍(Phenformin)是作为经口糖尿病药被开发的双胍系药剂，在人胚胎肝细胞(HEK 293T细胞)中，通过AMPK(AMP活化蛋白激酶，AMP-activated proteinkinase)的活化而使自噬活化(非专利文献1)。
另外，小檗碱(Berberine)是黄檗或黄连等植物所含的苄基异喹啉生物碱的1种，由于具有对肠内有害细菌的杀菌作用、胆汁分泌作用等，已被用于腹泻等的治疗。还报告了，小檗碱具有AMPK活化作用(非专利文献2)，具有抗氧化和抗炎症作用，已使用含有小檗碱多的三棵针(Barberry root)作为以白斑治疗为目的的混合草药的1种(非专利文献3)。
另外，氯胍(Proguanil)是用于疟疾的治疗和预防的抗疟剂之一，是世界中能够长年使用的安全性高的药剂。
然而，全然不知苯乙双胍、小檗碱和氯胍具有角化细胞的黑色素分解抑制作用。
专利文献1：国际公开第2013/162012号
非专利文献1：Egan DF,et al.(2011)Science,331:456-461
非专利文献2：Jeong HW,et al.(2009)Am J Physiol Endocrinol Metab,296:E955-964
非专利文献3：Jimi Yoon,Young-Woo Sun and Tae-Heung Kim(2011).Complementary and Alternative Medicine for Vitiligo,Vitiligo–Management andTherapy,Dr.Kelly KyungHwa Park(Ed.),ISBN:978-953-307-731-4,InTech,Availablefrom:http://www.intechopen.com/books/vitiligo-management-and-therapy/complementary-andalternative-medicine-for-vitiligo
发明内容
本发明涉及以下的1)～5)。
1)一种角化细胞的黑色素分解抑制剂，其以选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上作为有效成分。
2)一种角化细胞的自噬抑制剂，其以选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上作为有效成分。
3)一种皮肤或毛发颜色黑化剂，其以选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上作为有效成分。
4)一种白发预防或改善剂，其以选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上作为有效成分。
5)一种皮肤外用剂，其含有氯胍或其盐。
附图说明
[图1]苯乙双胍(Phenformin)的肤色黑化作用。A：拉美裔(Hispanic)；B：非裔美国人(African American)；C：非裔美国人(African American)。
[图2]苯乙双胍(Phenformin)的黑色素蓄积作用。A：拉美裔(Hispanic)；B：非裔美国人(African American)。
[图3]A：苯乙双胍(Phenformin)的Pmel17蛋白量增加作用。B：苯乙双胍(Phenformin)的LC3-II和p62蛋白量增加作用。
[图4]苯乙双胍(Phenformin)的肤色黑化作用(用量依赖性)。
[图5]小檗碱(Berberine)的肤色黑化和黑色素蓄积作用(白种人(Caucasian))。
[图6]小檗碱(Berberine)的肤色黑化和黑色素蓄积作用(非裔美国人(AfricanAmerican))。
[图7]小檗碱(Berberine)的自噬抑制作用(表皮细胞)。
[图8]苯乙双胍(Phenformin)、小檗碱(Berberine)和白毛茛(Goldenseal)的黑色素体分解抑制作用。
[图9]黄檗提取物和黄连提取物的肤色黑化作用。
[图10]苯乙双胍(Phenformin)的毛色黑化作用。
[图11]苯乙双胍(Phenformin)的自噬抑制作用。
[图12]氯胍的用量依赖的肤色黑化效果。
[图13]氯胍的表皮黑色素沉着的蓄积。
[图14]氯胍在黑色素细胞单独培养体系中对黑色素细胞的多巴氧化酶活性和细胞呼吸链活性的影响((A)、(C)黑色素细胞(浅(lightly))；(B)、(D)黑色素细胞(深(darkly)))。
[图15]氯胍在黑色素细胞单独培养体系中对细胞内黑色素量的影响((A)黑色素细胞(浅(lightly))；(B)黑色素细胞(深(darkly)))。
[图16]氯胍在包含角化细胞和黑色素细胞的共培养体系中对黑色素细胞的多巴氧化酶活性和细胞呼吸链活性的影响((A)、(C)黑色素细胞(浅(lightly))；(B)、(D)黑色素细胞(深(darkly)))。
[图17]氯胍对角化细胞的黑色素分解活性的影响。
[图18]氯胍对角化细胞的自噬活性的影响。
具体实施方式
本发明提供一种抑制角化细胞中的黑色素的分解并增强皮肤或毛发的黑色素蓄积的黑色素分解抑制剂。
本发明人对增加皮肤或毛发的黑色素量的物质进行探索后发现，苯乙双胍、小檗碱和氯胍具有角化细胞中的自噬的活性抑制作用和黑色素分解抑制作用，增强角化细胞中的黑色素的蓄积。
根据本发明，能够增强皮肤或毛发的黑色素的蓄积，实现皮肤的褐色化和白发的防止和改善。
本发明的苯乙双胍和小檗碱由下述式表示。
Figure BDA0001761602560000051
在本发明中，作为苯乙双胍的盐，可以是制药上允许的盐，例如可以列举无机酸(盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸等)、或有机酸(乙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸等)的盐，优选为盐酸盐。另外，苯乙双胍也可以形成水合物或溶剂合物的形态。
苯乙双胍或其盐能够由Sigma-Aldrich公司等的一般试剂制造商获得。
作为小檗碱的盐，例如可以例示盐酸、硫酸、丹宁酸等的盐，优选为盐酸盐(氯化小檗碱)。
除了作为生药利用的黄檗、黄连以外，小檗碱或其盐还富含于白毛茛、小檗、俄勒冈葡萄等中，通过从这些植物中提取、精制，能够容易地得到高纯度的物质(13修正日本药典解说书，C-405页)。
因此，在本发明中，小檗碱或其盐也可以使用含有小檗碱或其盐的植物的提取物。作为含有小檗碱或其盐的植物，例如可以列举芸香科的黄檗(学名：Phellodendronamurense；树皮的药用名：黄檗)、毛茛科的黄连(学名：Coptis japonica)、毛茛科的白毛茛(goldenseal；学名：Hydrastis canadensis)、小檗科的小檗(学名：Berberis vulgaris)、小檗科的俄勒冈葡萄(学名：Berberis aquifolium)等。
用于提取的植物的部位没有特别限定，例如可以列举全草、叶、茎、芽、花、蕾、木质部、树皮、地衣体、根、根茎、假球茎、球茎、块茎、种子、果实等或它们的组合。这些中，黄檗的情况下，优选使用树皮，黄连、白毛茛、小檗和俄勒冈葡萄的情况下，优选使用根或根茎。
本发明所使用的含有小檗碱或其盐的植物的提取物的制造方法没有特别限定，能够按照公知的方法对含有小檗碱或其盐的植物进行提取而得到。在本发明中，优选使用利用各种提取溶剂的溶剂提取法制造的提取物。
用于提取的溶剂可以使用极性溶剂、非极性溶剂的任意种，从小檗碱或其盐的提取效率的观点考虑，优选使用极性溶剂。作为极性溶剂的具体例，例如可以列举水、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、甘油等1元～3元的醇、聚乙二醇等。这些溶剂可以使用一种，或者组合使用两种以上。在本发明中，从物性(提取效率、稳定性)、安全性和通用性方面考虑，优选使用水、1元～3元的醇、或1元～3元的醇的水溶液，另外，作为1元～3元的醇，优选使用乙醇、甲醇、1,3-丁二醇、甘油。
提取溶剂的使用量只要是可以得到充分的提取效率的条件，就没有特别限定，例如相对于植物的干燥质量1g，可以例示1～1000mL、优选5～100mL等。
提取条件只要是可以得到充分的提取效率的条件，就没有特别限定。提取期间(时间)例如可以例示1小时以上、优选1日以上、30日以下、优选14日以下等。提取温度可以例示0℃以上、优选在所使用的溶剂的沸点以下实施、更优选常温至使用溶剂的沸点以下的温度范围。其中，在加压条件下实施时，提取温度并不限定于使用溶剂的沸点，可以根据提取效率适当设定最适的温度。
上述植物提取物只要适合于例如化妆品、医药品上能够允许的标准并发挥本发明的效果，也可以是粗精制物。另外，根据需要，能够利用液液分配、固液分配、活性炭处理、离子交换树脂处理等的公知的技术，实施惰性杂质的除去、脱臭、脱色等的处理。
上述的提取物既可以直接使用，也可以将该提取物稀释、浓缩或者冻结干燥后调制成粉末或膏状而使用。另外，冻结干燥后使用时，也可以利用常用于提取的溶剂、例如水、乙醇、丙二醇、水-乙醇混合溶液、水-丙二醇混合溶液、水-1,3-丁二醇混合溶液等溶剂溶解、稀释后使用。另外，也可以内包于脂质体等的囊泡或微胶囊等后使用。
本发明的氯胍是指下述式所示的1-(对氯苯基)-5-异丙基双胍。
Figure BDA0001761602560000071
在本发明中，作为氯胍的盐，可以是制药上允许的盐，例如可以列举无机酸(盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸等)、或有机酸(乙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸等)的盐，优选为盐酸盐。另外，氯胍的水合物或溶剂合物也包含在本发明的氯胍中。
氯胍或其盐能够在商业上获得，例如，氯胍·盐酸盐已由Sigma-Aldrich公司等制造商销售。
如下述实施例所示，苯乙双胍或其盐、小檗碱或其盐、以及含有小檗碱或其盐的植物提取物、氯胍或其盐(称为“本发明的化合物”)具有在人角化细胞中增加作为黑色素体量的指标的Pmel17蛋白质量(Murase D,Hachiya A,Takano K,Hicks R,Visscher MO,Kitahara T,Hase T,Takema Y,Yoshimori T(2013).Autophagy has a significant rolein determining skin color by regulating melanosome degradation inkeratinocytes.J Invest Dermatol 133:2416-2424.)、增强黑色素的蓄积并使该肤色黑化的作用。
另外，苯乙双胍或其盐、小檗碱或其盐、以及含有小檗碱或其盐的植物提取物增强LC3-II和p62蛋白质的蓄积。LC3-II和p62蛋白质是自噬所需的蛋白质，因自噬而生成、分解，因此用作自噬活性的标记(Mizushima N,Yoshimori T(2007).How to interpret LC3immunoblotting.Autophagy 3:542-545.)。因此可以认为，增强上述2种蛋白质的蓄积的本发明的化合物具有自噬抑制作用。
关于氯胍或其盐，由于抑制阻碍自噬溶酶体的蛋白质分解的二磷酸氯喹(Chloroquine diphosphate)存在下的LC3-II的蓄积，也被认为具有自噬抑制作用。另外，在这种情况下，LC3-II自身因自噬而分解，详细而言，利用分解抑制剂的分解抑制时的LC3-II的蓄积成为自噬活性的标记(Mizushima N,Yoshimori T(2007).How to interpret LC3immunoblotting.Autophagy 3:542-545.)。
并且已经明确，自噬干预角化细胞内的黑色素的分解(上述专利文献1)，因此可以认为，本发明的化合物引起的角化细胞中的黑色素量的蓄积和增加、由此产生的肤色的黑化是基于自噬活性被抑制、角化细胞中的黑色素的分解被抑制的现象。
因此，通过将本发明的化合物向动物、优选人给药，角化细胞中的黑色素的分解抑制、自噬的抑制、皮肤或毛发颜色的黑化、白发的预防或改善成为可能。
即，本发明的化合物可以作为角化细胞的黑色素分解抑制剂、角化细胞的自噬抑制剂、皮肤或毛发颜色黑化剂、以及白发预防或改善剂，用于黑色素分解抑制，用于角化细胞中的自噬抑制，用于皮肤或毛发颜色黑化，以及用于白发的预防或改善。
其中，“角化细胞中的自噬的抑制”是指，在角化细胞中通过抑制自噬活性、特别是抑制自噬路径中的吞噬泡(phagophore)的产生、吞噬泡的伸长或成长的步骤的活动而增加该角化细胞中的黑色素量。
另外，除了LC3-II和p62蛋白质的蓄积量以外，在添加或未添加溶酶体阻碍剂时，利用测定上述蛋白质周转(protein turnover)的通量测定法(flux assay)，也能够测定和评价自噬活性。
另外，“皮肤或毛发颜色黑化”是指，在具有黑色素产生能力的皮肤或毛发中，增加黑色素量而使其颜色暗色化。因此，不包括针对例如寻常性白斑那样的丧失了黑色素产生能力的皮肤的肤色的恢复。
即，本发明的角化细胞的黑色素分解抑制剂、角化细胞的自噬抑制剂、以及皮肤或毛发颜色黑化剂不作为寻常性白斑的治疗剂，但通过与寻常性白斑的治疗剂并用，能够用于抑制黑色素分解而使肤色黑化，在本发明中，并不限制这样的使用方式。
在本说明书中，本发明的化合物对人的用途可以是治疗用途，或者也可以是包括出于美容目的的用途的非治疗用途。
“非治疗”不包括医疗行为，即不包括对人进行手术、治疗或诊断的方法，更具体而言，是不包括医师或医务工作者或者接受了医师的指示的人对人实施手术、治疗或诊断的方法的概念。作为本发明的化合物的非治疗用途，可以列举出于美容或审美目的的皮肤或毛发颜色的黑化的用途，例如美学家、美容师等的使用等。
另外，在本说明书中，“改善”是指症状或状态的好转、症状或状态恶化的防止或延迟、或者症状或状态发展的逆转、防止或延迟。
另外，在本说明书中，“预防”是指个体的症状发作的防止或延迟、或者降低个体的症状发作的危险性。
另外，本发明的化合物可以用于制造角化细胞的黑色素分解抑制剂、角化细胞的自噬抑制剂、皮肤或毛发颜色黑化剂、或者白发预防或改善剂。
本发明的角化细胞的黑色素分解抑制剂、角化细胞的自噬抑制剂、皮肤或毛发颜色黑化剂、以及白发预防或改善剂可以是以黑色素分解抑制、角化细胞的自噬抑制、皮肤或毛发颜色的黑化、或者白发预防或改善为目的的医药品、准医药品或者化妆品，或者可以是用于制造该医药品、准医药品或者化妆品的原料或原材料。
关于上述医药品或准医药品，其给药方式是任意的，可以是经口给药、非经口给药的任一种。作为用于经口给药的剂型，例如可以列举片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂那样的固体制剂以及酏剂、糖浆和悬浮液那样的液体制剂，作为用于非经口给药的剂型，可以列举注射、外用、经皮、经粘膜、经鼻、经肠、吸入、栓剂、贴剂等的各种制剂。优选该医药品或准医药品优选为皮肤外用剂的形态，具体而言，可以列举软膏、乳剂、乳液、洗剂、凝胶、气雾剂、膏药、胶带、喷雾剂等形态。
作为上述化妆品的形态，可以列举乳剂、乳液、洗剂、悬浮液、凝胶、粉、护肤剂、面膜、膏药、棒、饼、生发液、护发液、发胶、发膏、护发营养液、喷发定型剂、气溶胶摩丝、洗发液、护发素等化妆品中能够使用的任意的形态。
按照一般的制造法，将本发明的化合物与制剂上能够允许的载体、例如各种油剂、表面活性剂、凝胶化剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、醇、水、螯合剂、增粘剂、紫外线吸收剂、乳化稳定剂、pH调节剂、色素、香料等一起混合、分散后，加工成所希望的形态，由此能够分别得到上述医药品、准医药品或者化妆品所涉及的制剂组合物。另外，在这些制剂组合物中，除了本发明的化合物以外，分别根据医药品、准医药品、化妆品等制剂的种类，在不损害本发明的效果的范围内，还可以适当配合适宜的植物提取物、杀菌剂、保湿剂、抗菌剂、清凉剂等药效成分。
该制剂组合物中的本发明的苯乙双胍或其盐、小檗碱或其盐、含有小檗碱或其盐的植物提取物、氯胍或其盐的含量以苯乙双胍、小檗碱或氯胍换算计，通常优选为0.01质量％以上，更优选为0.05质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上，并且优选为10质量％以下，更优选为5质量％以下，进一步优选为2质量％以下，还优选为0.01～10质量％，更优选为0.05～5质量％，进一步优选为0.1～2质量％。
上述制剂组合物的苯乙双胍或其盐、小檗碱或其盐、含有小檗碱或其盐的植物提取物、氯胍或其盐的给药量可以是能够达成本发明的效果的量。该给药量可以根据对象者的状态、体重、性别、年龄或其他的主要因素而变动，成人(60kg)每1人1日以苯乙双胍、小檗碱或氯胍换算计，例如优选为0.1mg以上，更优选为1mg以上，进一步优选为5mg以上，并且优选为5,000mg以下，更优选为1,000mg以下，进一步优选为500mg以下。另外，优选为0.1～5,000mg，更优选为1～1,000mg，进一步优选为5～500mg。
利用化妆品那样的外用剂的涂布进行给药时，每100cm2的1次给药量以苯乙双胍、小檗碱或氯胍换算计，优选为0.01mg以上，更优选为0.05mg以上，进一步优选为0.1mg以上，并且优选为10mg以下，更优选为5mg以下，进一步优选为2mg以下。另外，优选为0.01～10mg，更优选为0.05～5mg，进一步优选为0.1～2mg。
另外，该制剂可以根据任意的摄取和给药计划进行摄取和给药，优选分为1日1次～数次、数周～数月持续给药。
作为上述化妆品、医药品或准医药品的适用对象，只要需要，就没有特别限定，优选为期望皮肤的褐色化、白发的预防或改善的人。通常，优选直接适用于期待显现上述的效果的部位。作为期待显现上述的效果的部位，皮肤的褐色化的情况下，可以列举想要提高紫外线防御能力的部位，或者为了审美而想使皮肤褐色化的部位，例如日常暴露于紫外线或引人注目的机会多的脸或手足等的皮肤或给予自晒黑剂的皮肤。另外，白发的预防或改善的情况下，可以列举生长有毛发的皮肤，特别优选生长有毛发的头部的皮肤。
关于上述的实施方式，在本发明中，进一步公开以下的方式。
＜1＞一种角化细胞的黑色素分解抑制剂，其中，以选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上作为有效成分。
＜2＞一种角化细胞的自噬抑制剂，其中，以选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上作为有效成分。
＜3＞一种皮肤或毛发颜色黑化剂，其中，以选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上作为有效成分。
＜4＞一种白发预防或改善剂，其中，以选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上作为有效成分。
＜5＞一种皮肤外用剂，其中，含有氯胍或其盐。
＜6＞在上述＜5＞中，皮肤外用剂中的氯胍或其盐的含量以氯胍换算计，优选为0.01质量％以上，更优选为0.05质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上，并且优选为10质量％以下，更优选为5质量％以下，进一步优选为2质量％以下，还优选为0.01～10质量％，更优选为0.05～5质量％，进一步优选为0.1～2质量％。
＜7＞选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上在用于制造角化细胞的黑色素分解抑制剂中的用途。
＜8＞选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上在用于制造角化细胞的自噬抑制剂中的用途。
＜9＞选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上在用于制造皮肤或毛发颜色黑化剂中的用途。
＜10＞选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上在用于制造白发预防或改善剂中的用途。
＜11＞用于在角化细胞的黑色素分解抑制中使用的选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上。
＜12＞用于在角化细胞的自噬抑制中使用的选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上。
＜13＞用于在皮肤或毛发颜色黑化中使用的选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上。
＜14＞用于在白发预防或改善中使用的选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上。
＜15＞在上述＜11＞～＜14＞中，使用浓度以苯乙双胍、小檗碱或氯胍换算计，优选为0.01质量％以上，更优选为0.05质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上，并且优选为10质量％以下，更优选为5质量％以下，进一步优选为2质量％以下，还优选为0.01～10质量％，更优选为0.05～5质量％，进一步优选为0.1～2质量％。
＜16＞选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上在用于角化细胞的黑色素分解抑制中的用途。
＜17＞选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上在用于角化细胞的自噬抑制中的用途。
＜18＞选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上在用于皮肤或毛发颜色黑化中的用途。
＜19＞选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上在用于白发预防或改善中的用途。
＜20＞在上述＜16＞～＜19＞中，使用浓度以苯乙双胍、小檗碱或氯胍换算计，优选为0.01质量％以上，更优选为0.05质量％以上，进一步优选为0.1质量％以上，并且优选为10质量％以下，更优选为5质量％以下，进一步优选为2质量％以下，还优选为0.01～10质量％，更优选为0.05～5质量％，进一步优选为0.1～2质量％。
＜21＞在上述＜16＞～＜20＞中，上述用途优选为出于美容或审美目的的用于皮肤或毛发颜色黑化或者白发预防或改善的非治疗用途。
＜22＞一种角化细胞的黑色素分解抑制方法，该方法包括对需要抑制角化细胞的黑色素分解的对象以有效量给药或摄取选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上的步骤。
＜23＞一种角化细胞的自噬抑制方法，该方法包括对需要抑制角化细胞的自噬的对象以有效量给药或摄取选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上的步骤。
＜24＞一种皮肤或毛发颜色黑化方法，该方法包括对需要黑化皮肤或毛发颜色的对象以有效量给药或摄取选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上的步骤。
＜25＞一种白发预防或改善方法，该方法包括对需要预防或改善白发的对象以有效量给药或摄取选自含有小檗碱或其盐的植物提取物、小檗碱或其盐、氯胍或其盐、以及苯乙双胍或其盐中的1种以上的步骤。
＜26＞在上述＜22＞～＜25＞中，给药或摄取量以苯乙双胍、小檗碱或氯胍换算计，成人(60kg)每1人1日优选为0.1mg以上，更优选为1mg以上，进一步优选为5mg以上，并且优选为5,000mg以下，更优选为1,000mg以下，进一步优选为500mg以下。另外，优选为0.1～5,000mg，更优选为1～1,000mg，进一步优选为5～500mg。
＜27＞在上述＜22＞～＜25＞中，涂布外用剂的每100cm2的1次给药量以苯乙双胍、小檗碱或氯胍换算计，优选为0.01mg以上，更优选为0.05mg以上，进一步优选为0.1mg以上，并且优选为10mg以下，更优选为5mg以下，进一步优选为2mg以下。另外，优选为0.01～10mg，更优选为0.05～5mg，进一步优选为0.1～2mg。
＜28＞在上述＜22＞～＜27＞中，上述方法优选为出于美容或审美目的的用于皮肤或毛发颜色黑化或者白发预防或改善的非治疗方法。
＜29＞在上述＜1＞～＜4＞、＜7＞～＜28＞中，含有小檗碱或其盐的植物提取物为俄勒冈葡萄、黄檗、黄连、小檗或白毛茛的提取物。
＜30＞在上述＜29＞中，含有小檗碱或其盐的植物提取物为俄勒冈葡萄的根或根茎、黄檗的树皮、黄连的根或根茎、小檗的根或根茎、或者白毛茛的根或根茎的提取物。
＜31＞在上述＜1＞～＜4＞、＜7＞～＜20＞中，含有小檗碱或其盐的植物提取物是利用极性溶剂提取的提取物。
＜32＞在上述＜31＞中，极性溶剂为水、甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、甘油等1元～3元的醇、聚乙二醇或这些溶剂的一种或两种以上的组合。
＜33＞在上述＜31＞中，极性溶剂为水、1元～3元的醇或1元～3元的醇的水溶液。
＜34＞在上述＜33＞中，1元～3元的醇为乙醇、甲醇、1,3-丁二醇、甘油。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限定于此。
＜评价样品的调制＞
·苯乙双胍(Phenformin)从Sigma-Aldrich公司购入，溶解于DMSO后，以指定的浓度添加于培养基中。
·小檗碱(Berberine)从Santa Cruz Biotechnology公司购入，溶解于DMSO后，以指定的浓度添加于培养基中。
·白毛茛提取物(Goldenseal extract)从Making Cosmetics,Inc.购入，以指定的浓度添加于培养基中。是使用白毛茛的根作为提取部位并利用甘油水溶液进行提取而得到的固体成分20％的提取物。
·黄檗提取物(OUBAKU Liquid B)是黄檗树皮的提取物，从ICHIMARU PHARCOSCo.,Ltd获得，以指定的浓度添加于培养基中。是利用1,3-丁二醇进行提取而得到的固体成分1.25％的提取物。
·黄连提取物(OUREN Liquid B)是黄连根茎的提取物，从ICHIMARU PHARCOSCo.,Ltd获得，以指定的浓度添加于培养基中。是利用1,3-丁二醇进行提取而得到的固体成分0.5％的提取物。
·氯胍(Proguanil)：由Sigma-Aldrich购入氯胍盐酸盐(Proguanilhydrochloride)(以下，仅称为“氯胍”)，溶解于DMSO后，以规定的浓度添加于培养基中。
实施例1人皮肤组织的皮肤黑化作用
(1)从美国皮肤库(skin bank)National Disease Research Interchange(NDRI)购入来自外科手术的正常人皮肤组织。人皮肤组织在切除皮下脂肪后，用刀细切成约1cm×约1cm的片，使用6孔板(6-well plate)，在37℃5％CO2下进行培养。培养使用含有10％(v/v)的胎牛血清(Fetal Bovine Serum(FBS))的Advanced-DMEM培养基(均来自LifeTechnologies)。
(2)将按照上述(1)的方法调制而得到的人皮肤组织静置于6孔板(6-wellplate)，将苯乙双胍以最终浓度300μM添加于培养基中，开始组织培养。每2～3日进行培养基更换。对6日后或8日后的皮肤组织的外观进行观察并拍摄照片。
使用来自1名拉美裔(Hispanic)和2名非裔美国人(African American)的皮肤组织(拉美裔(Hispanic)：培养8日后的皮肤组织；非裔美国人(African American)：培养6日后的皮肤组织)进行评价的结果是，在所有的培养实验中，利用苯乙双胍都诱导了明显的肤色黑化(图1A-1C)。
(3)接着，使用培养后的皮肤组织，利用Fontana-Masson染色对黑色素的沉着进行观察。该染色使用American Mastertech Scientific,Inc.公司制造的Fontana-Masson染色试剂盒(Stain Kit)。
在拉美裔(Hispanic)(图1A的皮肤)和非裔美国人(African American)(图1B的皮肤)的皮肤组织中，确认了表皮的黑色素因苯乙双胍处理而显著蓄积(图2A和2B)。如放大图像所示，通过添加苯乙双胍，不仅在表皮的基底层，而且至有棘层和颗粒层，都观察到了黑色素在更大范围内沉着的情况。
实施例2人皮肤组织中的黑色素蓄积增强作用
另外，将按照实施例1(1)的方法调制而得到的来自非裔美国人(AfricanAmerican)的皮肤组织静置于6孔板(6-well plate)，在苯乙双胍的存在下或非存在下培养6日，使用从皮肤组织提取的蛋白质，利用蛋白质印迹(Western-blotting)法对作为构成黑色素体的主要的蛋白质的Pmel17的蛋白质量进行分析。作为一次抗体，使用小鼠抗人Pmel17抗体(DAKO)。作为二次抗体，使用山羊抗小鼠IgG抗体，使用ECL prime试剂(GEHealthcare)和ODYSSEY Fc Imaging System(LICOR)，对信号进行检测。作为内部标准，同样检测β-肌动蛋白(β-actin)蛋白质。与黑色素沉着的诱导一致，也确认了苯乙双胍所致的Pmel17蛋白质的增加(图3A)。
实施例3人皮肤组织中的自噬抑制作用
另外，将按照实施例1(1)的方法调制的来自非裔美国人(African American)的皮肤组织静置于6孔板(6-well plate)，在不同浓度的苯乙双胍的存在下或非存在下培养4日，利用使用从皮肤组织提取的蛋白质的蛋白质印迹(Western-blotting)分析，对局部存在于自噬体膜、因自噬而最终分解的LC3-II和p62蛋白质的表达量进行定量。作为一次抗体，使用小鼠抗人LC3抗体(Cosmo Bio)和兔抗人p62抗体(MBL International)。确认了两种标记因添加苯乙双胍而蓄积，因此暗示了自噬的抑制(图3B)。
实施例4人皮肤组织的肤色黑化作用(用量依赖性)
将按照实施例1(1)的方法调制的人皮肤组织静置于6孔板(6-well plate)，将苯乙双胍以最终浓度100、200、300μM添加于培养基中，开始组织培养。对4日后的皮肤组织的外观进行观察并拍摄照片。通过4日处理，观察到了能够识别的黑化依赖于用量(图4)。另外，与肤色的变化相关的黑色素沉着也被Fontana-Masson染色确认(数据未登载)。
另外，将按照实施例1(1)的方法调制的来自白种人(Caucasian)和非裔美国人(African American)的皮肤组织静置于6孔板(6-well plate)，针对来自白种人(Caucasian)的皮肤，将小檗碱以最终浓度10、30μM添加于培养基中，针对来自非裔美国人(African American)的皮肤，将小檗碱以最终浓度30、100μM添加于培养基中，开始组织培养。对6日后或4日后的皮肤组织的外观进行观察并拍摄照片。
在所有的检测体中，小檗碱都用量依赖地诱导了肤色的黑化，利用组织染色也确认了伴随表皮层的黑色素沉着(图5和6)。
实施例5小檗碱的自噬抑制作用
作为阐明小檗碱的肤色黑化作用的一个环节，调查对表皮细胞的自噬的影响。针对接种于6孔板(6-well plate)的表皮细胞，将小檗碱以最终浓度10、30、60μM添加于培养基中，培养24小时。提取蛋白质，利用蛋白质印迹(Western-blotting)分析，对作为自噬的标记的LC3-II和p62蛋白质的表达量进行分析。观察到了LC3-II和p62蛋白质因添加小檗碱而用量依赖地蓄积，因此暗示了自噬抑制作用(图7)。
实施例6黑色素体分解抑制作用
作为阐明苯乙双胍和小檗碱的肤色黑化作用的一个环节，调查这些成分对表皮细胞的黑色素体分解的影响。利用从美国皮肤库National Disease Research Interchange(NDRI)获得的包皮组织，按照规定的方法分离、培养表皮细胞。按照规定的方法利用MNT-1细胞株调制黑色素体(Murase et al.(2013)J Invest Dermatol,133:2416-2424.)，将一定量的黑色素体添加于表皮细胞，培养24小时。向6孔板(6-well plate)的每1孔(well)添加以35cm2的面积培养的从MNT-1细胞株调制而得到的黑色素体。用PBS清洗细胞后，针对摄入了黑色素体的表皮细胞，以最终浓度100、200μM添加苯乙双胍，以最终浓度10、30、60μM添加小檗碱，以及以最终浓度0.2、0.5％(v/v)添加含小檗碱多的白毛茛提取物，然后培养24小时。提取蛋白质，利用蛋白质印迹(Western-blotting)分析，对作为构成黑色素体的主要的蛋白质的Pmel17的表达量进行分析。在所有的成分的添加中，都观察到了用量依赖的Pmel17蛋白质的蓄积，因此暗示了黑色素体分解抑制作用(图8)。
实施例7黄檗提取物和黄连提取物的肤色黑化作用
将按照实施例1(1)的方法调制的来自非裔美国人(African American)的皮肤组织静置于6孔板(6-well plate)，将黄檗提取物和黄连提取物以最终浓度1％(V/V)添加于培养基中，开始组织培养。对6日后的皮肤组织的外观进行观察并拍摄照片。
在所有的检测体中，都因黄檗提取物和黄连提取物的添加而诱导了肤色的黑化，利用组织染色也确认了伴随表皮层的黑色素沉着(图9)。
实施例8苯乙双胍的毛色黑化作用
利用由美国的皮肤科医院获得的来自外科手术的正常人头皮组织(来自白种人(Caucasian))，外科分离人毛囊。在37℃5％CO2下，利用向William E培养基中添加胰岛素(insulin)(Sigma-Aldrich)20μg/ml、氢化可的松(hydrocortisone)(Sigma-Aldrich)40ng/ml、L-谷氨酰胺(L-glutamine)(Life Technologies)2mM、青霉素/链霉素溶液(LifeTechnologies)1％(v/v)而成的培养基培养分离出的人毛囊(均为最终浓度)。将分离出的人毛囊静置于24孔板(24-well plate)，将苯乙双胍以最终浓度200μM添加于培养基中，开始组织培养。培养1日后和3日后更换培养基，将5日后的毛囊组织用OCT包埋剂(TissueTek)包埋后冻结。使用这些毛囊组织，利用Fontana-Masson染色观察黑色素的沉着。通过苯乙双胍处理，在培养后的毛囊组织中明显的毛色的黑化被诱导(图10)。
实施例9苯乙双胍的人毛囊的自噬抑制作用
从按照实施例8的方法培养后的人组织培养毛囊中提取蛋白质，利用蛋白质印迹(Western-blotting)分析，对作为自噬的标记的LC3-II和p62蛋白质的表达量进行分析。观察到了LC3-II和p62蛋白质因苯乙双胍的添加而蓄积，因此暗示了自噬抑制作用(图11)。
实施例10：氯胍对肤色的影响
(1)组织培养
由医科大学的整形外科学部门提供来自外科手术的正常人皮肤组织。
关于人皮肤组织，将皮下脂肪修整后，用刀将其小片化为约1cm×1cm的大小，使用6孔板，在37℃5Vol％CO2的条件下进行培养。培养使用含有10％(v/v)的胎牛血清(FetalBovine Serum(FBS))的Advanced DMEM培养基(均来自Thermo Fisher Scientific)。
(2)氯胍对肤色的影响
将人皮肤组织静置于6孔板，将氯胍以最终浓度150、180、210、240、270、300μM添加于培养基中，然后实施组织培养。作为对照，添加等量的DMSO。每2～3日更换培养基，并且从培养开始经过5日后，观察皮肤组织的外观并进行照片拍摄。作为其结果，确认了氯胍用量依赖地诱导肤色的黑化(图12)。
(3)组织切片的染色和观察
使用肤色的黑化被诱导至目视能够识别的程度、以最终浓度180μM添加氯胍并培养5日后的皮肤组织，利用Fontana-Masson染色观察黑色素的沉着。具体而言，将包埋有皮肤组织的石蜡块切薄而制作5μm厚的石蜡切片后，使用Fontana氨银溶液(武藤化学)，在室温下反应2小时，能够识别黑色素颗粒。之后，使用Kernechtrot液(武藤化学)，实施核染色。与添加有DMSO的对照皮肤相比，在添加有氯胍180μM的皮肤中，观察到了黑色素在表皮的更大范围内蓄积的情况(图13；上段)。另外，通过同时进行HE染色并添加氯胍，也确认了在组织中损伤没有被诱导(图13；下段)。
实施例11：氯胍在黑色素细胞单独培养体系中对黑色素生成的影响
(1)细胞培养
来自正常人新生儿包皮的表皮黑色素细胞(Human Epidermal Melanocytes,neonatal,浅色素供体(lightly pigmented donor)(HEMn-LP)和Human EpidermalMelanocytes,neonatal,深色素供体(darkly pigmented donor)(HEMn-DP)；黑色素细胞(浅(lightly))和黑色素细胞(深(darkly)))、表皮黑色素细胞用增殖培养基(Medium254)、该培养基用增殖添加剂(HMGS)从Thermo Fisher Scientific公司购入。在37℃、5Vol％CO2的条件下培养黑色素细胞。
(2)氯胍在黑色素细胞单独培养体系中对黑色素细胞的多巴氧化酶活性的影响
将黑色素细胞(浅(lightly)和深(darkly))以2×104cells/孔(100μL/孔)的细胞密度接种于96孔板。作为此时的试验用培养基，使用Medium254(增殖添加剂(HMGS)中，含有胎牛血清(FBS；Fetal Bovine Serum)、碱性成纤维细胞成长因子(hFGF-B；HumanFibroblast growth factor-basic)、氢化可的松、胰岛素、运铁蛋白、肝素和牛脑垂体提取物(BPE；Bovine Pituitary Extract)，不含佛波醇12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA；phorbol12-myristate 13-acetate))。2日后，以最终浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000μM添加氯胍，在37℃、5Vol％CO2的条件下培养4日。作为对照，添加等量的DMSO。培养结束后，将培养基全部置换(100μL/孔)，以10μL/孔添加Alamar Blue(Bio-Rad AbD SerotecLimited)试剂。在37℃、5Vol％CO2的条件下培育1小时后，测定培养基的荧光强度(Ex544nm/Em590nm)，从而对细胞呼吸链(增殖)活性进行评价。之后，用PBS清洗细胞的培养板3次，以20μL/孔添加提取缓冲液(Buffer)(0.1M Tris-HCL(pH：7.2)、1％NP-40、0.01％SDS)，以20μL/孔添加检测缓冲液(Assay Buffer)(4％二甲基甲酰胺、100mM磷酸钠缓冲液(Sodiumphosphate-buffered)(pH：7.1))。4℃下用2小时使细胞溶解，进行多巴氧化酶活性的测定，该活性测定按照以MBTH法(Winder A.et al.,1991,Eur.J.Biochem.198:317-326)作为基础的下述所示的方法进行。即，向溶解后的细胞溶液的各孔中加入上述检测缓冲液(AssayBuffer)80μL、20.7mM MBTH(3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)水溶液60μL、作为基质的5mM L-DOPA(L-二羟苯丙氨酸)水溶液40μL，37℃下反应30分钟后，测定505nm波长的吸光度。
作为其结果，与只添加有DMSO的对照相比，氯胍没有促进多巴氧化酶活性(图14A、14B)。另外，在30μM以下的添加浓度域内没有看到细胞毒性(图14C、14D)。
(3)氯胍在黑色素细胞单独培养体系中对黑色素细胞的细胞内黑色素量的影响
将黑色素细胞(浅(lightly)和深(darkly))以2×105cells/孔(2mL/孔)的细胞密度接种于6孔板。作为此时的试验用培养基，使用Medium254(增殖添加剂(HMGS)中，含有胎牛血清(FBS；Fetal Bovine Serum)、碱性成纤维细胞成长因子(hFGF-B；Human Fibroblastgrowth factor-basic)、氢化可的松、胰岛素、运铁蛋白、肝素和牛脑垂体提取物(BPE；Bovine Pituitary Extract)，不含佛波醇12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA；phorbol 12-myristate 13-acetate))。次日，以最终浓度3、10、30μM添加氯胍，在37℃、5Vol％CO2的条件下培养7日。作为对照，添加等量的DMSO。其中，2～3日内进行1次培养基更换。培养结束后，用PBS清洗细胞的培养板，使用细胞刮刀将细胞回收于1.5mL微型管中。向各管中加入150μL的2M NaOH后，利用100℃、60分钟的处理溶解细胞，在室温下，以21,640g、利用10分钟的离心处理回收上清液。对于所回收的上清液，使用405nm的波长测定吸光度，算出每孔的黑色素量。
作为其结果，与只添加有DMSO的对照相比，氯胍没有增加细胞内的黑色素量(图15A、15B)。
实施例12：氯胍在包含角化细胞和黑色素细胞的共培养体系中对黑色素生成的影响
(1)细胞培养
来自正常人新生儿包皮的表皮角化细胞(Human Epidermal Keratinocytes,neonatal(HEKn)浅(lightly)；角化细胞)和表皮角化细胞用增殖培养基(Epilife)从Thermo Fisher Scientific公司购入。培养基用增殖添加剂(Humedia-KG)从仓敷纺绩购入。来自正常人新生儿包皮的表皮黑色素细胞(Human Epidermal Melanocytes,neonatal,浅色素供体(lightly pigmented donor)(HEMn-LP)和Human Epidermal Melanocytes,neonatal,深色素供体(darkly pigmented donor)(HEMn-DP)；黑色素细胞(浅(lightly))和黑色素细胞(深(darkly)))从Thermo Fisher Scientific公司购入。在37℃、5Vol％CO2的条件下培养角化细胞和黑色素细胞。
(2)氯胍在共培养体系中对黑色素细胞的多巴氧化酶活性的影响
将角化细胞以1×104cells/孔(100μL/孔)的细胞密度接种于96孔板，次日，以2×104cells/孔(100μL/孔)的细胞密度接种黑色素细胞(浅(lightly)和深(darkly))。再在其后一日，以最终浓度0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000μM添加氯胍，在37℃、5Vol％CO2的条件下进行4日培养。作为此时的试验用培养基，使用含有人上皮细胞成长因子(hEGF；Human Epidermal Growth Factor)以外的Humedia-KG增殖添加剂(胰岛素、氢化可的松、BPE、庆大霉素和两性霉素B)的Epilife。作为对照，添加等量的DMSO。培养结束后，按照与实施例11相同的方法，对细胞呼吸链(增殖)活性和多巴氧化酶活性进行评价。作为其结果，与只添加有DMSO的对照相比，氯胍没有促进多巴氧化酶活性(图16A、16B)。另外，在30μM以下的添加浓度域内没有看到细胞毒性(图16C、16D)。
实施例13：氯胍对表皮角化细胞(角化细胞)的影响
(1)细胞培养
来自正常人新生儿包皮的表皮角化细胞(Human Epidermal Keratinocytes,neonatal(HEKn),浅(lightly)；角化细胞)从Thermo Fisher Scientific公司购入。黑色素瘤细胞株MNT-1细胞由Dr.Natali(University La Sapienza,Rome,Italy)供与。在添加有培养基用增殖添加剂(Humedia-KG)(仓敷纺绩)的表皮角化细胞用增殖培养基(Epilife)(Thermo Fisher Scientific)中，在37℃、5Vol％CO2的条件下培养角化细胞。作为MNT-1细胞的增殖用培养基，使用分别含有10％(v/v)的AIM-V培养基和胎牛血清(Fetal BovineSerum(FBS))的RPMI1640培养基(均来自Thermo Fisher Scientific)，在37℃、5Vol％CO2的条件下进行培养。
(2)黑色素体部分的调制
从MNT-1细胞，按照规定的方法(Murase et al.(2013)J Invest Dermatol,133:2416-2424.)分离调制黑色素体部分。具体而言，利用0.05％胰蛋白酶(Trypsin)/EDTA(Thermo Fisher Scientific)回收培养于175cm2烧瓶中并达到融合的MNT-1细胞，用磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline(DPBS、无钙(no calcium)、无镁(no magnesium)；Thermo Fisher Scientific))(以下，略记为PBS)清洗。接着，加入2mL的裂解缓冲液(Lysisbuffer)(0.1M Tris-HCL、pH7.5、1％Igepal CA-630、0.01％SDS)，温和地混合，4℃下振荡搅拌1小时。将该细胞溶解液分注至1.5mL微型管中，以1,000g离心10分钟(4℃)，回收上清液。重复本离心操作计2次，接着将所得到的上清液以20,000g离心10分钟(4℃)。最后用PBS清洗颗粒，在相同条件下重复离心操作计2次，将所得到的颗粒作为黑色素体部分(melanosome-rich fraction)。
(3)氯胍在表皮角化细胞(角化细胞)中对黑色素(黑色素体)分解的影响
将角化细胞以2×105cells/孔(2mL/孔)的细胞密度接种于6孔板，3日后，将由培养于1个175cm2烧瓶中的MNT-1细胞得到的黑色素体部分等量添加于1块板(6孔)。在其后一日，更换培养基，以最终浓度10、30μM添加氯胍，在37℃、5Vol％CO2的条件下培养2日。作为对照，添加等量的DMSO。另外，作为此时的试验用培养基，使用Epilife(增殖添加剂(Humedia-KG)中，含有氢化可的松、胰岛素、庆大霉素和两性霉素B，不含人上皮细胞成长因子(hEGF；Human Epidermal Growth Factor)和牛脑垂体提取物(BPE；Bovine PituitaryExtract))。培养结束后，用PBS清洗细胞，使用RIPA缓冲液(buffer)(Sigma-Aldrich)进行回收，再利用超声波处理破碎细胞。之后，以15,000rpm离心分离15分钟，对于其上清液，利用使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒(Protein Assay Kit)(Thermo Fisher Scientific)的BCA(二喹啉甲酸)法，以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin(BSA))作为标准物质，对蛋白量进行定量。之后，使各组的蛋白质量一致，按照常规方法供于SDS-PAGE和蛋白质印迹法。一次抗体使用anti-Pmel17(Dako，1：250)。二次抗体使用anti-mouse IgG,HRP-LinkedF(ab’)2Fragment Sheep(GE Healthcare Life Science)。之后，使用ECL plus westernblotting detection reagents(GE healthcare bioscience)显色，使用LAS4000(FujiFilm)使表达量可见。使用β-肌动蛋白特异性单克隆抗体(monoclonal antibody specificforβ-actin)(Sigma-Aldrich，1﹕5000)评价作为内部标准的β-肌动蛋白(β-actin)的表达。确认了在摄入了黑色素体的角化细胞中，相对于添加有DMSO的对照，对氯胍进行处理时，所检出的Pmel17的带的强度浓度依赖地变强了，所回收的细胞沉渣的颜色也浓度依赖地变浓了(图17)。由于Pmel17是对黑色素体特异的蛋白质，因此可以认为，利用氯胍的处理抑制了角化细胞所摄入的黑色素体的分解。
(4)氯胍对表皮角化细胞(角化细胞)的自噬活性的影响
将角化细胞以1.5×105cells/孔(2mL/孔)的细胞密度接种于6孔板，在其后一日，以最终浓度0.3、1、3、10、30μM添加氯胍，在37℃、5Vol％CO2的条件下进行培养。作为对照，添加等量的DMSO。另外，作为此时的试验用培养基，使用Epilife(增殖添加剂(Humedia-KG)中，含有氢化可的松、胰岛素、庆大霉素和两性霉素B，不含人上皮细胞成长因子(hEGF；Human Epidermal Growth Factor)和牛脑垂体提取物(BPE；Bovine PituitaryExtract))。再在其后一日，以最终浓度10μM添加属于LC3B自噬抗体试剂盒(Antibody Kitfor Autophagy)(Thermo Fisher Scientific)的二磷酸氯喹(Chloroquinediphosphate)，在37℃、5Vol％CO2的条件下培养24小时。培养结束后，按照上述的方法供于SDS-PAGE和蛋白质印迹法。一次抗体使用属于上述的试剂盒(Kit)的anti-LC3B(1：1000)。二次抗体使用anti-rabbit IgG,HRP-Linked F(ab’)2Fragment Sheep(GE HealthcareLife Science)。之后，使用ECL plus western blotting detection reagents(GEhealthcare bioscience)显色，使用LAS4000(Fuji Film)使表达量可见。使用β-肌动蛋白特异性单克隆抗体(monoclonal antibody specific forβ-actin)(Sigma-Aldrich，1﹕5000)评价作为内部标准的β-肌动蛋白(β-actin)的表达。利用作为溶酶体阻碍剂的二磷酸氯喹(Chloroquine diphosphate)的添加，LC3-II的蓄积被诱导，但氯胍浓度依赖地缓和了其蓄积(图18)。可以认为，这意味着氯胍在形成自噬体膜之前的阶段抑制了自噬活性。因此可以认为，氯胍通过抑制角化细胞的自噬活性而抑制角化细胞的黑色素分解。

Claims (5)

1.氯胍和/或其盐在用于制造角化细胞的黑色素分解抑制剂中的用途。
2.氯胍和/或其盐在用于制造角化细胞的自噬抑制剂中的用途。
3.氯胍和/或其盐在用于制造皮肤或毛发颜色黑化剂中的用途。
4.氯胍和/或其盐在用于制造白发预防或改善剂中的用途。
5.如权利要求1～4中任一项所述的用途，其中，
在将权利要求1所述的角化细胞的黑色素分解抑制剂、权利要求2所述的角化细胞的自噬抑制剂、权利要求3所述的皮肤或毛发颜色黑化剂或权利要求4所述的白发预防或改善剂作为医药品、准医药品或者化妆品使用时，相对于该医药品、准医药品或者化妆品的总量，所述氯胍和/或其盐的含量以氯胍换算计为0.01质量％以上10质量％以下。
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