KR20240007891A

KR20240007891A - 마가목 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20240007891A
Application number: KR1020230193453A
Authority: KR
Inventors: 이창석; 정다원; 임수진
Original assignee: 을지대학교 산학협력단
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2023-12-27
Publication date: 2024-01-17
Also published as: KR20220135556A

Abstract

본 발명은 멜라닌 합성 및 멜라닌 세포 증식을 촉진하고 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키며 강력한 항산화 활성을 나타내는 마가목 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

마가목 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating vitiligo containing mountain-ash extract as an active ingredient}

본 발명은 백반증 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 마가목 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다

마가목(mountain-ash)은 주로 아시아에서 자라는 장미과 나무이다. 잎은 길이 12~24 cm의 우상복엽으로 소엽은 5~7쌍인데 가운데 있는 소엽이 가장 크고 길이는 2.5~8 cm로 장타원형으로 예첨두, 예저이며 엽병이 없고 복거치가 있고 양면에 털이 없다. 꽃은 6~7월에 가지 끝에 지름 8~12 cm의 복산방화서에 달리며 털이 있거나 없고 지름은 6~10 mm로 백색이고 화경이 짧다. 상기 마가목은 오랫동안 민간요법으로 천식 및 신경통 치료에 사용되었으며 동의보감에는 흰머리를 검게 하고 뇌졸중과 동맥경화, 심혈관계질환 등을 치료한다고 기록되어 있다.

한편, 백반증(vitiligo)은 색소세포의 파괴로 인하여 여러 가지 크기와 형태의 백색 반점이 피부에 나타나는 후천적 탈색소성 질환으로 지금까지 정확한 원인은 밝혀지지 않았다. 백반증 환자의 약 30%에서 가족력이 발견되기 때문에 유전적 요인이 의심되고 있고 스트레스, 외상, 일광 화상 등이 백반증 발생에 보조적으로 작용하는 원인으로 알려져 있다. 가장 중요한 발병 원인으로는 자기 자신의 면역기능이 자신의 색소세포를 이물질로 잘못 인식하고 파괴시킨다는 자가면역설, 비정상적인 기능을 가진 신경 세포가 화학물질을 분비하여 주변의 색소세포에 손상을 일으킨다는 신경체액설, 멜라닌 세포가 스스로 파괴되어 백반증이 생긴다고 하는 색소세포 자가파괴설 등이 유력하다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2021-0006090호는 명칭 멀구슬 나무 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대해 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 백반증 치료를 위해 멀구슬 나무 열매 추출물을 이용하는 것으로 마가목 추출물을 이용한 백반증 치료용 조성물에 관한 연구는 아직 미개척 분야이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 멜라닌 합성 및 멜라닌 세포 증식을 촉진하고 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키며 강력한 항산화 활성을 나타내는 마가목 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 마가목(Sorbus commixta) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 마가목(Sorbus commixta) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 개선용 화장료 조성물이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 마가목 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 치료용 약학적 조성물은 종래 치료제와 달리 부작용이 없고 멜라닌 합성 및 멜라닌 세포 증식에 효과적이고 염증성 사이토카인의 발현이 감소되며 우수한 라디칼 소거 활성을 나타냄에 따라 멜라닌 세포이상과 자가면역질환이 원인인 백반증 치료에 효과적인 조성물로 활용가능하다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1a는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 B16 세포에 48시간 동안 처리 후 상기 세포의 증식을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 세포 증식은 cck-8 분석으로 측정하였고 데이터는 평균 ± SD로 표시하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs 대조군.
도 1b는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 B16 세포에 처리 후 멜라닌 함량을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 멜라닌의 유도를 확인하기 위해 멜라닌 세포 자극 호르몬(α-MSH, 100 nM)을 양성 대조군으로 사용했다. 세포 단백질 및 세포 수로 보정하여 멜라닌 함량을 분석하였고 48 웰 플레이트에서 세포 용해물의 색상을 관찰하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 vs 대조군.
도 1c는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물 처리에 의한 멜라닌 증가를 관찰한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 마가목 가지 에탄올 추출물은 20 μg/ml의 농도로 B16 세포(5.0 x 10³)에 처리 후 6 웰 플레이트에서 배양하였고 α-MSH(100 nM)는 양성 대조군으로 사용하였으며 72 시간 후 광학 현미경(scale bar; 100 ㎛)으로 촬영 하였다.
도 2a는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 NHDF 세포에 처리 후 생존력을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 추출물은 3.125 ~ 200 μg/ml의 농도로 처리하였다 (*** P < 0.001).
도 2b는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 NHDF 세포에 처리 후 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 mRNA 수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 추출물은 25 ~ 100 μg/ml의 농도로 처리하였고 mRNA 수준은 GAPDH로 정량화하였다.
도 2c는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 NHDF 세포에 처리 후 IL-6 및 IL-8의 발현을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 추출물은 12.5 ~ 100 μg/ml의 농도로 처리하였고 TNF-α(10 ng/ml)로 24시간 배양 기간 동안 자극했다.
도 2d는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 HaCaT 세포에 48시간 동안 처리 후 cck-8 키트를 사용하여 생존력을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2e는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 HaCaT 세포에 처리 후 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 mRNA 수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 추출물은 2.5 ~ 20 μg/ml의 농도로 처리하였고 mRNA 수준은 GAPDH로 정량화하였다.
도 2f는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 HaCaT 세포에 처리 후 IL-6 및 IL-8의 생산을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 상기 추출물은 3.125,6.25,12.5 및 25 μg/ml의 농도로 처리하였고 TNF-α(10 ng/ml)로 24시간 배양 기간 동안 자극했다. (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs. 대조군/ ^### P < 0.001 vs. TNF-α).
도 3a는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 NHDF 세포에 처리하고 TNF-α(10 ng/ml)로 10분 동안 처리한 후 ERK, JNK, p38 및 총 ERK, JNK 및 p38의 인산화 단백질 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴 블랏 겔 사진이다. 상기 추출물은 12.5, 25, 50 및 100 μg/ml의 농도로 처리하였다.
도 3b는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 NHDF 세포에 처리하고 TNF-α(10 ng/ml)로 30분 동안 처리한 후 인산화 IκBα 및 총 IκBα의 단백질 수준을 분석한 결과를 나타내는 웨스턴 블랏 겔 사진이다. 상기 추출물은 12.5,25,50 및 100 μg/ml의 농도로 처리하였다.
도 4는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물 처리에 따른 DPPH 라티칼 소거능을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 아스코르브산을 양성대조군으로 사용하였고 데이터는 평균 ± SD(n = 3)로 표시하였다(* P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001 vs CTL).

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "마가목(Mountain-ash)"은 장미과의 낙엽활엽소교목으로 학명은 Sorbus commixta이다. 높이 10 m까지 자라는 낙엽소교목이지만 고산지대에서는 2~3 m의 관목상으로 자라고 어린가지에 털이 거의 없으며 2년지는 흑갈색으로 되고 수간은 회색으로 되며 큰 피목이 있다. 한방에서 마가목의 수피는 마아피라 하여 기관지염, 류마티스 관절염, 중풍, 위염, 보신, 골통에 사용하며, 열매는 차로 이용하거나 생식할 수 있다. 우리나라에서는 제주도 남부지방, 지리산, 덕유산, 속리산, 설악산 등에 분포하고 있다. 마가목 가지는 민간적으로 기침, 신경통, 천식, 기관지의 치료에 사용하거나 강장제로서 이용되었다. 마가목가지에 함유된 성분으로 카테친-7-Ο-베타-디-자이로피라노사이드(catechin-7-Ο-β-D-xylopyranoside), 카테친-7-Ο-베타-디-아피오퓨라노사이드(catechin-7-Ο-β-D-apiofuranoside), 푸루나신(prunasin), 루페논(lupenone), 루페올(lupeol) 등이 알려져 있으며 혈중 알코올 농도를 유의성 있게 감소시키며 혈관계 염증성 질환 예방, 항동맥경화, 항염증효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 마가목의 활성 성분 중에서 카테친-7-Ο-베타-디-자이로피라노사이드(catechin-7-Ο-βD- xylopyranoside)와 카테친-7-Ο-베타-디-아피오퓨라노사이드(catechin-7-Ο-β-D-apiofuranoside)는 강한 항산화효과를 가진 성분이라고 보고하고 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "백반증(vitiligo)"은 멜라닌 세포의 사멸이나 괴사로 인해 다양한 크기 및 형태의 백색반이 피부에 나타나는 후천성 탈색소 질환이다. 백반증 환자는 표피의 멜라닌 세포의 활성을 잃었지만, 모낭의 외부 모근초의 멜라노블라스트 세포는 영향을 받지 않는다. 전 세계적으로 인구의 약 1%에서 나타나는 비교적 흔한 질환으로, 인종이나 지역에 따른 차이는 없다. 발생 연령은 10~30세에 가장 많고, 95%의 경우 40세 이전에 발병하고, 환자의 30%에서 가족력이 있다. 백반증의 임상 양상으로는 다양한 크기의 둥글거나 불규칙한 모양의 흰색 반점이 나타나고, 초기에는 탈색 정도가 뚜렷하지 않으나 시간이 경과하면서 뚜렷해지는 경우가 많으며, 정상피부와의 경계가 뚜렷하지 않을 수도 있으나 정상피부색 보다도 진하면서 뚜렷하게 나타날 수 있다.

발명의 상세한 설명:

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 추출물은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출로 제조될 수 있고 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합물로 추출한 것일 수 있으며 상기 저급알코올은 부틸렌글리콜, 메탄올, 에탄올 또는 프로판올일 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용 제형을 가질 수 있고 상기 피부 외용 제형은 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형을 가질 수 있다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 추출물은 마가목 가지에 추출용매를 가하여 각각 추출하는 추출물 제조단계; 상기 추출물을 여과하는 여과단계; 및 상기 여과단계의 여과된 용액을 증발시킨 후 농축액을 동결건조하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 마가목(Sorbus commixta) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 개선용 화장료 조성물이 제공된다.

상기 화장료 조성물에 있어서, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렝징워터, 팩, 스프레이, 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구용 제제, 주사용 제제 또는 외용제의 형태로 제형화될 수 있다. 상기 외용제 조성물은 크림, 젤, 연고, 유화액, 현탁액, 분무제 및 경피 전달성 패치제로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다. 상기 외용제는 1일당 0.1 내지 100 ㎎의 양으로 도포될 수 있으며, 구체적으로 1일당 1 내지 50 ㎎의 양으로 도포될 수 있고, 1일 1 내지 수회, 구체적으로 1일 1 내지 3회 도포될 수 있다. 백반증 증상이 나아질 때까지 도포할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 용어 "개체"란 는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환축 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환축의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 1 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명이 기능성 화장료 조성물로 제공되는 경우, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 에센스 또는 피부 점착타입 화장료의 제형으로, 또는 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 등의 경피 투여형 제형으로 제제화될 수 있다. 또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있다.

멜라닌(melanin) 색소는 피부색을 결정하며 자외선을 흡수하여 피부를 보호하는 역할을 한다. 멜라닌 색소를 생성하는 멜라닌 세포(melanocyte)는 멜라노블라스트(melanoblast)에서 유래하는데, 멜라노블라스트가 자극을 받아 멜라닌 세포로 분화되면, 티로시나아제가 활성화되어 세포 내 함유되어 있는 티로신을 DOPA(3,4-dihydroxyL-phenyl-alanine)로 변화시키고, 이어서 DOPA는 도파옥시다제(dopaoxidase)라는 효소의 작용으로 도파퀴논(dopaquinone)이라는 물질로 변한 후, 일련의 화학반응을 거쳐 멜라닌이 된다. 멜라닌 세포는 멜라닌을 만든 후 피부 상층부의 표피 조직까지 이동하여, 표피 조직에 존재하는 각질 형성 세포(keratinocyte)로 멜라닌을 전달한다. 세포 이동 과정에서 멜라닌 색소는 멜라노좀(melanosome)에 저장되어 운반되는데, 생성 초기에는 색이 없다가 점차 상층부로 이동하면서 4-5 단계에 걸쳐 검은 색소로 채워져, 완전한 색소를 띤 성숙한 멜라닌 과립이 된다.

한편 백반증(vitiligo)은 멜라닌 세포의 사멸이나 괴사로 인해 다양한 크기 및 형태의 백색반이 피부에 나타나는 후천성 탈색소 질환이다. 백반증 환자는 표피의 멜라닌 세포가 활성을 잃었지만, 모낭의 외부 모근초의 멜라노블라스트 세포는영향을 받지 않는다. 전 세계 인구의 약 1%에서 나타나는 비교적 흔한 질환으로, 인종이나 지역에 따른 차이는 없다. 백반증의 임상 양상으로는 다양한 크기의 둥글거나 불규칙한 모양의 흰색 반점이 나타나고, 초기에는 탈색 정도가 뚜렷하지 않으나 시간이 경과하면서 뚜렷해지는 경우가 많으며, 정상피부와의 경계가 뚜렷하지 않을 수도 있으나 정상피부색보다도 진하면서 뚜렷하게 나타날 수 있다. 드문 경우 가려움을 유발하기도 하며, 털이 있는 부위, 특히 머리카락, 눈썹부위에 흰 반점이 나타나는 경우는 흰 털이 자라나는 경우도 있다. 본 발명에서는 여러 원인 중 멜라닌 세포의 파괴, 자가 면역 및 산화 스트레스 원인에 초점을 두고 상기 백반증에 대한 마가목 가지 추출물의 약리학적 효능을 조사하였다. 마가목은 주로 줄기 추출물의 항산화, 항염증에 대해 연구되어 왔다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2017-0024700호는 마가목 열매 추출물을 유효성분으로 하는 비만, 당뇨 또는 비 알코올성 지방간 질환 치료, 개선 또는 예방용 조성물에 대해 개시하고 있고 대한민국 공개특허 제2016-0107496호는 마가목 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 대해 개시하고 있다. 그러나 마가목의 가지 추출물에 대한 백반증 치료 효과에 대한 연구는 현재까지 전무하다.

이에 본 발명자들은 먼저 마가목 가지 에탄올 추출물을 제조한 후 멜라닌 세포(B16)에 상기 추출물을 처리한 다음 세포를 관찰한 결과 멜라닌 생성 및 세포 증식에 효과적임을 확인하였다. 그 후, 염증성 사이토카인의 조절을 확인하기 위해서, 염증성 질환에서 중요한 역할을 하는 TNF-α로 각질세포(HaCaT)와 섬유아세포(NHDF)에 자극하여 ELISA, RT-PCR 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 그 결과 섬유아세포 (NHDF)와 각질세포(HaCaT)에서 IL-6, IL-8 및 TNF-α의 mRNA 수준이 감소하였고 ELISA 실험에서도 IL-6 및 IL-8의 단백질 수준을 현저하게 감소하였으며 추가 메커니즘을 확인한 결과 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물은 TNF-α 자극된 NHDF 세포에서 ERK인산화를 억제하는 것으로 나타났다. 또한 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내어 멜라닌 세포를 산화적 스트레스로부터 보호하는 효과도 확인하였다. 따라서 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물은 멜라닌 세포의 증식과 멜라닌을 촉진하며, 염증성 사이토카인의 단백질과 mRNA수준을 감소시켜 백반증 치료를 위한 우수한 약리학적 효능을 확인하였다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시 예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

재료 및 방법

추출 방법

본 발명에서 사용된 마가목 가지는 함양군 마천면 창원리 지리산에서 채집 하였고 분쇄한 가지 160g에 80% 에탄올 추출 2L로 48시간 동안 추출했다. 그 후 메쉬망 1차 필터와 2차 진공필터 및 농축 과정을 통해 여과된 추출물을 분말로 만든 다음 72시간 동안 동결건조 하였다.

세포 배양

본 발명에서 사용된 마우스 흑색종 세포주 B16은 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Welgen, korea) 및 1% Penicillin-Streptomycin Mixture (Lonza, Basel, Switzerland)를 포함하는 배지에서 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다. 또한 인간각질세포주 HaCaT는 Dulbecco modified Eagle medium(DMEM; Welgen, korea)에 10% 우태아 혈청(FBS; Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 1% Penicillin-Streptomycin Mixture(Lonza, Basel, Switzerland)에서 마찬가지로 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다. 아울러, 일차 인간섬유아세포인 NHDF는 (PromCell, Heidelberg, Germany) 섬유아세포 성장 배지 2(Ready-to-use) (PromCell, Heidelberg, Germany)에서 배양했다.

세포 독성 평가

세포 독성은 CCK-8 분석(DOJINDO, Tokyo, Japan)을 사용하여 평가하였다. 구체적으로 B16 세포를 96 웰 플레이트(1.0 x 10⁴세포/well)에 파종하였고 마가목 가지 에탄올 추출물을 다양한 농도(3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 ㎍/ml)로 처리 후 세포를 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 플레이트 세포의 각 웰에 CCK-8 용액 10 ㎕를 추가하였고 인큐베이터에서 상기 플레이트를 1시간 배양하였다. 이어서 흡광도는 Synergy™ HTX Multi-Mode Microplate Reader (Bioteck, Winooski, VT, USA)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다. 상기 HaCaT 및 NHDF 세포를 96 웰 플레이트(1.0 x 10⁴세포/well)에 파종 후 마가목 추출물로 24시간 및 48시간 동안 처리하였다.

멜라닌 함량 측정

본 발명자들은 멜라닌 함량 측정을 위해 B16 세포를 48웰 플레이트에 2.0 x 10⁴세포/well의 밀도로 하루 동안 배양했다. 그 후, 상기 B16 세포에 표시된 농도(2.5, 5, 10 및 20 ㎍/ml)의 마가목 가지 에탄올 추출물로 72시간 동안 처리하였다. 그 후 1N NaOH(200 ㎕)를 첨가하고 60℃에서 30분간 가열하였다. 상기 세포 내 멜라닌 함량은 각각의 용해물(100 ㎕)을 96웰 플레이트에 넣고 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 각 샘플의 단백질 농도는 Pierce ™ BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 의해 정량화하였고 세포 내 멜라닌과 단백질의 양은 백분율 값으로 표시하였다.

효소면역정량법 (ELISA)

본 발명자들은 HaCaT 및 NHDF 세포(5.0 x 10⁴세포/well)를 24 웰 플레이트에 처리 후 3시간 동안 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 처리하였다. 자극은 TNF-α(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였고 48시간 후, 제조사의 지침에 따라 ELISA kit(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 배지 내 IL-6 및 IL-8 단백질을 분석했다.

Real-time PCR

PCR 증폭을 위해 mRNA는 Trizol 시약(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 HaCaT 및 NHDF 세포로부터 준비하였다. 제조사의 지침 (promega, Madison, WI, USA)에 따라 GoScript™ Reverse Transcription System을 사용하여 역전사를 수행하였고 증폭 반응은 iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, California, USA)를 사용하여 15 μl의 혼합물에서 수행하였고 사이클은 예열을 위해 3분 동안 95℃, 10초 동안 95℃, 15초 동안 60℃, 30초 동안 72℃에서 39 사이클로 수행하였다. 모든 PCR은 대조군 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)(Bio-Rad, BR186qHsaCED0038674-1000)로 표준화하였고 프라이머는 IL-6(Bio-Rad, BR186qHsaCID0020314-1000), IL-8(Bio-Rad, BR186qHsaCED0046633-1000) 및 TNF-α(Bio-Rad, BR186qHsaCED0037461-1000)를 이용하였다.

웨스턴 블랏

웨스턴 블랏 분석을 위해 HaCaT 및 NHDF 세포를 6 웰 플레이트(15.0 x 10⁴ 세포/well)에 24시간 동안 처리한 다음 다양한 농도 (2.5-20 μg/mL)의 마가목 가지 에탄올 추출물로 3시간 동안 전 처리하였고 TNF-α(10 ng/mL) 10분 동안 자극하였다. 그 후 상기 세포를 차가운 PBS로 세척하였고 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액(Cell Signaling Technology, MA, USA)에서 용해된 세포 용해물은 아이스박스에 저장하였다. 그 후 상기 세포 용해물은 4℃에서 20분 동안 12,000rpm의 조건으로 원심분리하였고 단백질 농도는 BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 정량화하였다. 이를 위해 총 단백질 30 ㎍을 10% SDS-PAGE에 로딩하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 다음 상기 막을 실온에서 1시간 동안 TBS에서 5% 탈지유로 차단하였다. 그 후, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, IκBα, p-IκBα, NF-κB, β-actin(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)에 대한 1차 항체를 처리하고 4℃ TBST(Tris-buffered saline-0.1 % Tween-20)로 3회 세척한 후, 2차 항체를 처리하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 마지막으로 Enhanced Chemiluminescence(ECL 솔루션, Bio-rad, California, USA)를 사용하여 시각화하였고 이미지는 iBright™ CL750 Imaging System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 수득하였다.

라디칼 소거 능력 측정

본 발명자들은 2,2-diphenylpicrylhydrazyl(DPPH) 라디칼(radical) 소거에 대한 항산화 효과를 Blois 방법으로 측정하였다. 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물 10 ㎕에 0.1 mM 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 용액 190 ㎕를 첨가 후 암실에서 10분간 배양하였고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계 분석

본 발명의 모든 분석은 3회 반복 수행하였고 수득한 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시하였다. 그룹 간 차이의 통계적 유의성은 양면 학생 t-test를 사용하여 평가하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001은 통계적으로 유의한 것으로 표시하였다.

실시예 1: 멜라닌 합성 및 증식

본 발명자들은 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물에 의한 B16 세포의 멜라닌 합성 및 증식을 조사하였다. 이를 위해 다양한 농도의 마가목 가지 에탄올 추출물을 B16 세포에 8시간 동안 처리한 후 멜라닌 합성 및 증식 효과를 확인하였다. 그 결과, 대조군과 비교하여 세포에 3.125-12.5 μg/ml 농도 범위의 마가목 가지 에탄올 추출물을 처리한 모든 실험군의 세포가 증식하였고 12.5 μg/ml의 농도로 처리한 실험군은 136%의 생존율로 가장 높은 증식 효과를 나타내었다(도 1a)

또한, 마가목 가지 에탄올 추출물 처리에 따른 멜라닌 합성 효과를 조사하기 위해 멜라닌의 양을 동일한 플레이트의 생존율(OD) 값으로 정량화하였다. 멜라닌 합성을 위한 기준 화합물로 멜라닌 세포 자극 호르몬(α-MSH)을 사용하였다. 그 결과, 20 μg/ml의 세포 외 멜라닌은 186%, 세포 내 멜라닌은 220%로 멜라닌의 양이 크게 증가했다(도 1b). 사진 데이터는 마가목 가지 에탄올 추출물을 72시간 동안 처리한 48 웰 플레이트에서 배지 색상을 보여준다. 마가목 가지 에탄올 추출물은 대조군 대비 농도의존적으로 어두운 색을 나타내었다. 아울러, 멜라닌 세포의 형태와 색상을 현미경을 통해 관찰한 결과, 대조군과 비교하여 본 발명의 마가목 가지에탄올 추출물을 처리한 멜라닌 세포는 어두운 색을 나타내었다(도 1c). 상기 결과는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물을 처리가 세포의 멜라닌 합성을 증가시킴을 시사하는 것이다.

실시예 2: 항 염증 효과 분석

본 발명자들은 TNF-α 자극 NHDF 및 HaCaT 세포에서 본 발명의 마가목 가지에탄올 추출물의 항염증 효과를 검증하였다. 섬유아세포와 각질 세포는 피부 멜라닌 세포의 기능을 조절한다. 따라서 TNF-α를 NHDF 및 HaCaT 세포에서 전-염증 자극제로 사용하여 마가목 가지 에탄올 추출물의 효과를 확인하였다. 그런 다음 IL-6, IL-8 및 TNF-α와 같은 대표적인 염증성 사이토카인의 mRNA 수준을 조사하였다.

그 결과, NHDF 세포에서 200 μg/ml의 농도 처리는 세포 독성을 나타냈다(도 2a). 또한 세포 증식 효과와 함께 100 μg/ml 농도에서 ELISA 분석을 수행한 결과 NHDF 세포에서 전처리된 마가목 가지 에탄올 추출물의 IL-6 mRNA 수준은 90%, 58%, 58% 및 30%와 같이 농도 의존적으로 유의하게 감소했다. IL-8 mRNA 수준은 100 μg/ml에서 82%로 현저하게 감소했다. TNF-α mRNA는 25 μg/ml에서 68%, 100 μg/ml에서 13%로 크게 감소했다(도 2b). 또한 마가목 가지 에탄올 추출물의 처리는 NHDF 세포에서 IL-6 및 IL-8 사이토카인의 발현을 유의하게 억제했다(도 2c). 상기 IL-6은 100 μg/ml에서 40% 감소했으며 IL-8은 100 μg ml에서 29% 감소하였다(표 1 참조).

아울러, 50 μg/ml의 농도 처리는 HaCaT 세포에서 독성을 나타내었고(도 2d) 상대적인 mRNA 수준을 분석한 결과 IL-6 mRNA 수준만 100%, 68%, 53% 및 9%로 농도의존적으로 감소하였으며(도 2e) 마가목 가지 에탄올 추출물은 12.5 및 25 μg/ml에서 IL-6 생성을 현저히 억제했고 IL-8은 12.5 μg/ml에서만 현저하게 감소했다(도 2f). 상기 TNF-α 자극 NHDF 및 HaCaT 세포에서 IL-6 및 IL-8 생성 억제율을 분석한 결과를 하기 표 1에 요약하였다. 하기 표 1에서 HaCaT 세포의 IL-6은 25 μg/ml에서 58% 감소했으며 IL-8은 12.5 μg/ml에서 24% 억제 효과를 나타내었다.

IL-6 및 IL-8 생성 억제율

NHDF		처리	농도(㎍/ml)	IL-6(%)	IL-8(%)
		미처리		100±0.67	100±0.37
	TNF-α (10 ng/ml)		0	0±1.38^###	0±6.89^###
		STE	12.5	14±7.23^*	4±2.87
			25	17±4.33^***	8±5.15
			50	32±3.68^***	15±1.45
			100	40±3.89^***	29±4.60^*
HaCaT			미처리	100±3.17	100±5.86
	TNF-α (10 ng/ml)		0	0±13.30^###	0±7.81^###
		STE	3.125	8±2.67	20±12.82
			6.25	17±9.24	5±11.67
			12.5	23±3.17^*	24±1.24^***
			25	58±6.62^**	0±10.40

실시예 3: MAPK 및 NF-κB 신호 전달

TNF-α, IL-6 및 IL-8과 같은 전-염증성 사이토카인 및 단백질의 발현은 MAPK 및 NF-kB 경로에 의해 조절된다. 따라서 본 발명자들은 MAPK 및 NF-κB 신호 전달에 대한 마가목 가지 에탄올 추출물의 처리 효과와 TNFα 자극 NHDF 세포에서 상기 경로의 역할을 조사했다. 먼저 MAPK 신호 전달 경로의 변화를 확인하기 위해 p38, ERK 및 JNK 인산화 단백질 수준을 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물은 phospho-p38 및 phospho-JNK가 아닌 phospho-ERK 발현을 용량 의존적으로 현저히 감소시켰다(도 3a). 또한 IκBα 발현의 분자 메커니즘을 추가로 확인한 결과 IκBα 분해 및 IκBα 인산화에 대한 억제 효과는 없었다(도 3b). 상기 결과는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물은 ERK 인산화를 억제하여 TNF-α, IL-6, IL-8의 분비를 조절할 수 있지만 IκBα 신호 전달 경로에 대한 억제 효과가 없음을 시사하는 것이다.

실시예 4: 항산화 효과

본 발명자들은 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물의 항산화 효과를 조사하기 위해 DPPH 분석을 수행했다. DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내는 아스코르브산(Ascorbic acid)은 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 아스코르브산은 10 μg/ml에서 86 ± 0.21%의 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었고 마가목 가지 에탄올 추출물을 처리한 실험군은 처리에 따라 디쉬의 색상이 노란색으로 변하였고 100 μg/ml에서 86 ± 0.27%의 현저한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다(도 4). 상기 결과는 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물이 강력한 ROS 소거 효과가 있음을 시사하는 것이다.

결론적으로, 본 발명자들은 마가목 가지 에탄올 추출물을 제조 후 이를 이용한 멜라닌 세포 증식, 멜라닌 합성, 항염증 및 항산화 활성을 연구하였다. 그 결과, 마가목 가지 에탄올 추출물은 멜라닌 합성 및 멜라닌 세포 증식 촉진에 효과적이며, TNF-α로 자극된 NHDF 및 HaCaT 세포에서 IL-6, IL-8, TNF-α의 mRNA 및 단백질 수준을 감소시켰다. 또한, NHDF 세포에서 ERK 신호 전달 경로의 비활성화를 조절하였고 나아가 강력한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 따라서 본 발명의 마가목 가지 에탄올 추출물은 멜라닌 세포이상과 자가면역질환이 원인인 백반증 치료를 위한 치료제로 활용가능하다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims

마가목(Sorbus commixta) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 치료용 약학적 조성물
제1항에 있어서,
상기 추출물은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출로 제조되는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합물로 추출한 것인, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 저급알코올은 부틸렌글리콜, 메탄올, 에탄올 또는 프로판올인, 조성물.
제1항에 있어서,
피부 외용 제형을 갖는, 조성물.
제5항에 있어서,
상기 피부 외용 제형은 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형을 갖는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 마가목 가지에 추출용매를 가하여 각각 추출하는 추출물 제조단계;
상기 추출물을 여과하는 여과단계; 및
상기 여과단계의 여과된 용액을 증발시킨 후 농축액을 동결건조하는 단계를 통해 제조되는, 조성물.
마가목(Sorbus commixta) 가지 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 개선용 화장료 조성물.
제8항에 있어서,
유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렝징워터, 팩, 스프레이, 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖는, 화장료 조성물.