KR101621499B1 - 속수자 추출물을 포함한 매트릭스 메탈로프로티나제의 발현을 증가시키기 위한 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

속수자 추출물을 포함한 매트릭스 메탈로프로티나제의 발현을 증가시키기 위한 조성물 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

속수자 추출물을 포함한 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키기 위한 조성물, 세포의 매트릭스 메탈로프로티나제의 발현을 증가시키는 방법, 및 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물을 제공한다.

Description

속수자 추출물을 포함한 매트릭스 메탈로프로티나제의 발현을 증가시키기 위한 조성물 및 그의 용도{Composition for increasing matrix metalloproteinase expression comprising Euphorbia lathyris extract and use thereof}
속수자 추출물을 포함한 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키기 위한 조성물, 세포의 매트릭스 메탈로프로티나제의 발현을 증가시키는 방법, 및 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부에서부터 순서대로 표피, 진피, 및 피하 조직의 3개 층으로 크게 구분된다. 피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 제 기관을 기온 및 습도 변화, 자외선, 기타 물리적, 화학적인 외부 환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온 조절 등의 생체항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 피부의 구성층 중 표피는 인체 내부의 수분 증발을 방지하는 중요한 역할을 한다. 표피는 외부로부터 순서대로 각질층, 과립층, 유극층, 및 기저층으로 구분되며, 각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고 각질세포 사이의 세포간 지질들은 모르타르와 같은 역할로 작용하여 피부 장벽을 구성한다(J. Invest. Dermatol. 80 (Suppl.), 44-49. 1983).
과증식흉터(hypertrophic scar)와 켈로이드(Keloids)는 유전적으로 민감한 개인에게서 피부손상에 반응하여 일어나는 병적인 상처치유 과정이고, 피부 섬유아세포의 과증식과 세포외기질 (ECM, Extracellular Matrix)의 주성분인 콜라겐 등의 축적으로 특징지어진다. 임상적으로 켈로이드는 상처의 경계면 너머로 자라기를 계속하는 양성종양의 특성을 가지며, 치료에 저항성을 나타낸다고 알려져 있다.
피부의 주요 구조 단백질로 진피 층의 70-80%를 차지하고 있는 콜라겐과 콜라겐을 분해하는 결합조직 분해효소인 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)는 세포외 기질의 역동적인 리모데링에 매우 중요한 역할을 하고 있다. 또한, 매트릭스 메탈로프로티나제의 조직 저해제(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase: TIMP-1)는 조직에서 MMP-1의 저해제이다. 콜라겐의 양은 MMP와 TIMP 사이의 밸런스에 의해 타이트하게 조절된다. 만약, 조직에서 MMP-1의 발현을 유도하는 물질이 있다면, 이 물질은 피부과섬유화억제 또는 과증식흉터나 켈로이드의 치료 또는 예방에 매우 바람직한 후보가 될 수 있을 것이다.
속수자는 학명이 Euphorbia lathyris Linne로서 대극과 (Euphorbiaceae)에 속하는 두해살이 초본류로 이명으로 천금자로 불리기도 한다. 속수자는 지중해와 서남아시아 원산이며 약용식물이다. 높이 1 m 내외이며 털이 없고, 자르면 진이 나오고 짙은 녹색이며 흰 가루로 덮인다. 잎은 밑에서는 어긋나고 위에서는 마주나며 가장자리가 밋밋하다. 꽃이 달리는 마디의 잎은 포(苞)이고, 꽃간이 보이는 것은 꽃이삭이며 여름에 핀다. 열매는 삭과로 둥글고 지름 1 cm정도이며 3개의 능선이 있다. 한방에서는 이 종자를 속수자라 하며 기름을 짜고 난 찌꺼기를 이뇨제, 하제, 부종, 복수, 월경정지 및 식중독에 사용한다. 주성분은 esculetin으로 조추출물 200 mg 중 80 mg이 함유되어 있다고 보고되었다(Yu et al., SePu 2010 28:809-812).
그러나, 속수자 추출물이 MMP의 발현을 촉진시키는 것에 대하여는 알려진 바 없다.
일 양상은 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 세포의 매트릭스 메탈로프로티나제의 발현을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 속수자 (Euphorbia lathyris) 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.
상기 속수자 추출물은 세포에서 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키기에 유효한 양으로 포함될 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 조성물 당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg일 수 있다. 상기 조성물은 인 비트로 또는 개체 중의 세포에서 MMP의 발현을 증가시키기 위한 것일 수 있다. 개체 중의 세포는 예를 들면 콜라겐의 침적에 의하여 섬유화가 진행되고 있는 부위, 또는 콜라겐의 침적에 의하여 섬유화가 과도하게 진행되어 섬유증을 보이는 부위에 위치하는 것일 수 있다. 콜라겐의 침적에 의하여 섬유화가 진행되고 있는 부위는 치유가 진행되고 있는 상처 부위일 수 있다. 상기 콜라겐은 타입 I 콜라겐일 수 있다.
상기 조성물은 섬유화 (fibrogenesis)를 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 섬유화는 콜라겐의 침적에 의하여 야기되는 것일 수 있다. 상기 콜라겐은 타입 I 콜라겐일 수 있다. 용어 "섬유화 (fibrogenesis)"는 기관 또는 조직에서 섬유 (fiber) 또는 섬유상 조직 (fibrous tissue)이 발생 또는 증식되는 것을 나타낸다. 섬유화는 치유 (healing)와 같은 섬유 또는 섬유상 조직의 정상적 침적 과정뿐만 아니라 섬유 또는 섬유상 조직이 과도하게 침적되거나 정상조직 위로 퍼지거나 정상 조직을 치환하는 것과 같은 병리적 상태 (pathological state)을 형성하는 과정 또는 그 상태를 나타낼 수 있다. 본 명세서에서는 용어 "섬유증 (fibrosis)" 또는 "섬유성 질병 (fibrotic disease)"은 치유 (healing)와 같은 섬유 또는 섬유상 조직의 정상적 침적 과정 또는 상태로부터 비정상적 과정 또는 상태를 구분하기 위하여 사용된다. 상기 섬유 또는 섬유상 조직은 타입 I 콜라겐의 침적에 의한 것일 수 있다.
상기 조성물은 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.
용어 "섬유증"은 기관 또는 조직의 정상적인 성분으로서 섬유 조직의 형성과는 반대로, 회복성 또는 반응성 과정으로서 기관 또는 조직에서 과량의 섬유성 결합 조직이 형성되거나 발달하는 과정을 설명하기 위하여 명세서를 통하여 사용된다. 섬유화는 통상적으로 섬유아세포의 퇴행 (예, 펄프 (pulp)의 섬유증) 및 증식에 의한 섬유조직 형성 과정일 수 있다. 또한, 섬유화는 섬유성 결합 조직이 정상적인 평활근 또는 기타 정상 기관 조직으로 확산되거나 대체하는 비정상적인 상태일 수 있다. 섬유화는 심장, 폐, 복강, 및 신장에서 가장 통상적일 수 있지만, 다른 곳에서도 일어날 수 있다. 섬유화에 의해 발생하는 수많은 질병 상태 또는 질환이 있으며, 예를 들어, 간 섬유증 (알코올성, 바이러스성, 자가면역, 대사성 및 유전적), 신장 섬유증(예, 만성 염증, 감염 또는 II형 당뇨병으로부터 발생), 폐 섬유증 (특발성 또는 독성입자를 포함한 환경오염 (environmental insults), 유육종증 (sarcoidosis), 석면증 (asbestosis), 과민성 폐렴 (hypersensitivity pneumonitis), 결핵을 포함한 세균 감염, 의약 등으로부터 발생하는 것), 췌장의 섬유증 (예를 들어, 알코올 남용 및 췌장의 만성 염증 질환으로부터 발생), 전신성 강피증 (scleroderma) (많은 기관의 섬유화를 야기하는 자가면역 질환), 황반 변성, 심장 섬유증 (cardiac fibrosis), 췌장과 폐의 낭포성 섬유증, 특히 어린이에서, 근육내 주사의 합병증으로 발생할 수 있는, 주사 섬유증, 심내막심근 섬유증 (endomyocardial fibrosis), 전신성 특발성 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 종격막 섬유증 (mediastinal fibrosis), 골수섬유증 (myelofibrosis), 복막후 섬유증 (retroperitoneal fibrosis), 진행성 종괴성 섬유증 (progressive massive fibrosis) (석탄 작업자의 폐 섬유증의 합병증), 신원성 전신 섬유증 (nephrogenic systemic fibrosis), 결절성 상피하 섬유증 (예, 양성 섬유성 조직구종), 늑막 섬유증, 외과시술 (예, 외과적 임플란트)의 결과로서의 섬유증, 증식성 섬유증, 파이프스템 섬유증, 섬유소후섬유증, 각 섬유증, 및 방사선 섬유증 등이 있다.
상기 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병은 간, 폐, 심장, 신장, 피부, 또는 그 조합에 존재하는 것일 수 있다.
상기 섬유증은 간 섬유증, 폐 섬유증, 과민성 폐렴, 신장 섬유증, 간질성 섬유증, 전신성 강피증, 황반 변성, 췌장 섬유증, 비장의 섬유증, 심장 섬유증, 종격막 섬유증, 골수 섬유증, 심내막 심근 섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 외과 수술의 섬유성 합병증, 주사 섬유증, 흉터 (scar), 또는 그 조합인 것일 수 있다. 상기 흉터는 과증식성 흉터 (hypertrophic scarrring), 켈로이드 흉터 (keloid scarring), 또는 그 조합인 것일 수 있다.
상기 2차 질병은 경변증 (cirrhosis), 미만성 폐실질 질환 (diffuse parenchymal lung disease), 정관수술 후 통증 증후군, 류마티스성 관절염, 또는 그 조합인 것일 수 있다.
상기 속수자 추출물은 속수자 뿌리, 잎, 꽃, 과실, 전초, 또는 그 조합으로부터 추출된 것일 수 있다. 상기 속수자 추출물은 건조 추출물일 수 있다.
상기 속수자 추출물은 친수성 용매 (hydrophilic solvent) 예를 들면, 물, 알콜 또는 그 조합에 의하여 추출된 것일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C10의 하나이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C4의 알콜일 수 있다. 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 또는 그 조합인 것일 수 있다.
상기 속수자 추출물은 조추출물, 분획물, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조추출물은 상기 속수자를 추출 용매와 접촉시켜 얻어지는 것으로서 특정 성분을 포함하는 것으로 분리하지 않을 것을 말한다. 상기 분획물은 상기 조추물에 대하여 특정 성분을 포함하는 물질을 분리한 것을 말한다. 상기 분리는 유기 용매를 사용한 분리, 크로마토그래피 또는 여과일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, HPLC, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 추출은 상기 속수자를 상기 추출 용매 중에 첨가하고 인큐베이션하는 것일 수 있다. 상기 속수자는 세절되거나 분쇄되어 미분화된 입자의 형태를 가질 수 있다. 상기 속수자는 건조되거나 세척된 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30℃ 내지 환류 온도, 40℃ 내지 환류 온도, 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 또는 65℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 추출 시간은 추출 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 추출 시간은 2 내지 4시간, 예를 들면 2.5 내지 3.5 시간일 수 있다. 상기 추출 용매는 속수자의 5 내지 15배, 예를 들면, 5 내지 13배, 5 내지 11배, 8 내지 15배, 8 내지 13배, 8 내지 11배, 또는 9 내지 11배일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있다. 얻어진 조추출물은 여과, 농축 및 건조될 수 있다. 상기 건조는 감압 건조될 수 있다.
상기 조추출물은 유기 용매를 사용하여 더 추출될 수 있다. 상기 유기용매는 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 부탄올, 아세톤, 아세토니트릴 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 추출은 상기 조추출물을 상기 유기 용매 중에 첨가하고 인큐베이션하는 것일 수 있다. 추출 조건은 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30℃ 내지 환류 온도, 40℃ 내지 환류 온도, 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 또는 65℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 추출 시간은 추출 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 추출 시간은 2 내지 4시간, 예를 들면 2.5 내지 3.5 시간일 수 있다. 상기 추출 용매는 속수자의 5 내지 15배, 예를 들면, 5 내지 13배, 5 내지 11배, 8 내지 15배, 8 내지 13배, 8 내지 11배, 또는 9 내지 11배일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있다. 얻어진 추출물은 여과, 농축 및 건조될 수 있다. 상기 건조는 감압 건조될 수 있다.
상기 추출은 조추출물, 또는 그 분획물을 HPLC하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 HPLC는 반분취 (semi-preparative) HPLC일 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예컨대 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.
상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 MMP는 콜라게나제 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 MMP는 MMP1, MMP8, MMP13, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물은 자외선 A 조사와 함께 투여하기 위한 것일 수 있다. 자외선 A는 315nm 내지 400nm의 파장을 갖는 것일 수 있다. 자외선 A 조사는 상기 조성물 투여 전, 동시, 또는 후에 이루어지는 것일 수 있다. 자외선 A 조사가 상기 조성물 투여전 또는 후에 이루어지는 경우, 상기 조사와 투여의 시간 간격은 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분, 10 분, 5 분, 3 분, 2 분, 또는 1 분 이내일 수 있다.
상기 조성물은 피부에 존재하는 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 화장용 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 피부에 존재하는 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 식품용 조성물일 수 있다.
다른 양상은 상기한 바와 같은 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 접촉은 인 비트로 또는 인 비보에서의 접촉일 수 있다. 상기 인 비트로 접촉은 상기 조성물과 세포를 액체 매질 중에서 인큐베이션하는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 액체 매질은 물, 버퍼, 세포 배양 또는 유지용 배지, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 비 비보에서의 접촉은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 섬유증이 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.
상기 방법은 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 섬유증은 간 섬유증, 폐 섬유증, 과민성 폐렴, 신장 섬유증, 간질성 섬유증, 전신성 강피증, 황반 변성, 췌장 섬유증, 비장의 섬유증, 심장 섬유증, 종격막 섬유증, 골수 섬유증, 심내막 심근 섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 외과 수술의 섬유성 합병증, 주사 섬유증, 흉터 (scar), 또는 그 조합인 것일 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.
상기 투여는 속수자 추출물을 개체당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 개체에 자외선 A를 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 자외선 A는 315nm 내지 400nm의 파장을 갖는 것일 수 있다. 자외선 A 조사는 상기 조성물 투여 전, 동시, 또는 후에 이루어지는 것일 수 있다. 자외선 A 조사가 상기 조성물 투여전 또는 후에 이루어지는 경우, 상기 조사와 투여의 시간 간격은 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분, 10 분, 5 분, 3 분, 2 분, 또는 1 분 이내일 수 있다. 상기 개체에 자외선 A를 조사하는 것은 피부와 같은 개체의 외부 표면뿐만 아니라, 내부에 대하여도 조사할 수 있다. 상기 조사는 카테터와 같은 기구의 도움을 받아 이루어질 수 있다.
다른 양상은 속수자 (Euphorbia lathyris) 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물을 제공한다.
상기 속수자 추출물은 세포에서 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키기에 유효한 양으로 포함될 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 조성물 당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg일 수 있다. 상기 조성물은 인 비트로 또는 개체 중의 세포에서 MMP의 발현을 증가시키기 위한 것일 수 있다. 개체 중의 세포는 예를 들면 콜라겐의 침적에 의하여 섬유화가 진행되고 있는 부위, 또는 콜라겐의 침적에 의하여 섬유화가 과도하게 진행되어 섬유증을 보이는 부위에 위치하는 것일 수 있다. 콜라겐의 침적에 의하여 섬유화가 진행되고 있는 부위는 치유가 진행되고 있는 상처 부위일 수 있다. 상기 콜라겐은 타입 I 콜라겐일 수 있다.
용어 "섬유증"은 기관 또는 조직의 정상적인 성분으로서 섬유 조직의 형성과는 반대로, 회복성 또는 반응성 과정으로서 기관 또는 조직에서 과량의 섬유성 결합 조직이 형성되거나 발달하는 과정을 설명하기 위하여 명세서를 통하여 사용된다. 섬유화는 통상적으로 섬유아세포의 퇴행 (예, 펄프 (pulp)의 섬유증) 및 증식에 의한 섬유조직 형성 과정일 수 있다. 또한, 섬유화는 섬유성 결합 조직이 정상적인 평활근 또는 기타 정상 기관 조직으로 확산되거나 대체하는 비정상적인 상태일 수 있다. 섬유화는 심장, 폐, 복강, 및 신장에서 가장 통상적일 수 있지만, 다른 곳에서도 일어날 수 있다. 섬유화에 의해 발생하는 수많은 질병 상태 또는 질환이 있으며, 예를 들어, 간 섬유증 (알코올성, 바이러스성, 자가면역, 대사성 및 유전적), 신장 섬유증(예, 만성 염증, 감염 또는 II형 당뇨병으로부터 발생), 폐 섬유증 (특발성 또는 독성입자를 포함한 환경오염 (environmental insults), 유육종증 (sarcoidosis), 석면증 (asbestosis), 과민성 폐렴 (hypersensitivity pneumonitis), 결핵을 포함한 세균 감염, 의약 등으로부터 발생하는 것), 췌장의 섬유증 (예를 들어, 알코올 남용 및 췌장의 만성 염증 질환으로부터 발생), 전신성 강피증 (scleroderma) (많은 기관의 섬유화를 야기하는 자가면역 질환), 황반 변성, 심장 섬유증 (cardiac fibrosis), 췌장과 폐의 낭포성 섬유증, 특히 어린이에서, 근육내 주사의 합병증으로 발생할 수 있는, 주사 섬유증, 심내막심근 섬유증 (endomyocardial fibrosis), 전신성 특발성 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 종격막 섬유증 (mediastinal fibrosis), 골수섬유증 (myelofibrosis), 복막후 섬유증 (retroperitoneal fibrosis), 진행성 종괴성 섬유증 (progressive massive fibrosis) (석탄 작업자의 폐 섬유증의 합병증), 신원성 전신 섬유증 (nephrogenic systemic fibrosis), 결절성 상피하 섬유증 (예, 양성 섬유성 조직구종), 늑막 섬유증, 외과시술 (예, 외과적 임플란트)의 결과로서의 섬유증, 증식성 섬유증, 파이프스템 섬유증, 섬유소후섬유증, 각 섬유증, 및 방사선 섬유증 등이 있다.
상기 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병은 간, 폐, 심장, 신장, 피부, 또는 그 조합에 존재하는 것일 수 있다.
상기 섬유증은 간 섬유증, 폐 섬유증, 과민성 폐렴, 신장 섬유증, 간질성 섬유증, 전신성 강피증, 황반 변성, 췌장 섬유증, 비장의 섬유증, 심장 섬유증, 종격막 섬유증, 골수 섬유증, 심내막 심근 섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 외과 수술의 섬유성 합병증, 주사 섬유증, 흉터 (scar), 또는 그 조합인 것일 수 있다. 상기 흉터는 과증식성 흉터 (hypertrophic scarrring), 켈로이드 흉터 (keloid scarring), 또는 그 조합인 것일 수 있다.
상기 2차 질병은 경변증 (cirrhosis), 미만성 폐실질 질환 (diffuse parenchymal lung disease), 정관수술 후 통증 증후군, 류마티스성 관절염, 또는 그 조합인 것일 수 있다.
상기 속수자 추출물은 속수자 뿌리, 잎, 꽃, 과실, 전초, 또는 그 조합으로부터 추출된 것일 수 있다. 상기 속수자 추출물은 건조 추출물일 수 있다.
상기 속수자 추출물은 친수성 용매 (hydrophilic solvent) 예를 들면, 물, 알콜 또는 그 조합에 의하여 추출된 것일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C10의 하나이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C4의 알콜일 수 있다. 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 또는 그 조합인 것일 수 있다.
상기 속수자 추출물은 조추출물, 분획물, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 조추출물은 상기 속수자를 추출 용매와 접촉시켜 얻어지는 것으로서 특정 성분을 포함하는 것으로 분리하지 않을 것을 말한다. 상기 분획물은 상기 조추물에 대하여 특정 성분을 포함하는 물질을 분리한 것을 말한다. 상기 분리는 유기 용매를 사용한 분리, 크로마토그래피 또는 여과일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, HPLC, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 추출은 상기 속수자를 상기 추출 용매 중에 첨가하고 인큐베이션하는 것일 수 있다. 상기 속수자는 세절되거나 분쇄되어 미분화된 입자의 형태를 가질 수 있다. 상기 속수자는 건조되거나 세척된 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30℃ 내지 환류 온도, 40℃ 내지 환류 온도, 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 또는 65℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 추출 시간은 추출 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 추출 시간은 2 내지 4시간, 예를 들면 2.5 내지 3.5 시간일 수 있다. 상기 추출 용매는 속수자의 5 내지 15배, 예를 들면, 5 내지 13배, 5 내지 11배, 8 내지 15배, 8 내지 13배, 8 내지 11배, 또는 9 내지 11배일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있다. 얻어진 조추출물은 여과, 농축 및 건조될 수 있다. 상기 건조는 감압 건조될 수 있다.
상기 조추출물은 유기 용매를 사용하여 더 추출될 수 있다. 상기 유기용매는 에틸아세테이트, 헥산, 디클로로메탄, 부탄올, 아세톤, 아세토니트릴 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 추출은 상기 조추출물을 상기 유기 용매 중에 첨가하고 인큐베이션하는 것일 수 있다. 추출 조건은 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 인큐베이션은 실온 내지 환류 온도에서 교반 또는 교반 없이 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션 온도는 선택되는 용매에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 실온 내지 환류 온도, 30℃ 내지 환류 온도, 40℃ 내지 환류 온도, 50℃ 내지 환류 온도, 60℃ 내지 환류 온도, 또는 65℃ 내지 환류 온도일 수 있다. 상기 추출 시간은 추출 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 추출 시간은 2 내지 4시간, 예를 들면 2.5 내지 3.5 시간일 수 있다. 상기 추출 용매는 속수자의 5 내지 15배, 예를 들면, 5 내지 13배, 5 내지 11배, 8 내지 15배, 8 내지 13배, 8 내지 11배, 또는 9 내지 11배일 수 있다. 상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있다. 얻어진 추출물은 여과, 농축 및 건조될 수 있다. 상기 건조는 감압 건조될 수 있다.
상기 추출은 조추출물, 또는 그 분획물을 HPLC하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 HPLC는 반분취 (semi-preparative) HPLC일 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예컨대 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.
상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 MMP는 콜라게나제 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 MMP는 MMP1, MMP8, MMP13, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물은 자외선 A 조사와 함께 투여하기 위한 것일 수 있다. 자외선 A는 315nm 내지 400nm의 파장을 갖는 것일 수 있다. 자외선 A 조사는 상기 조성물 투여 전, 동시, 또는 후에 이루어지는 것일 수 있다. 자외선 A 조사가 상기 조성물 투여전 또는 후에 이루어지는 경우, 상기 조사와 투여의 시간 간격은 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분, 10 분, 5 분, 3 분, 2 분, 또는 1 분 이내일 수 있다.
다른 청구항 상기한 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 방법을 제공한다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 섬유증이 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.
상기 방법은 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 섬유증은 간 섬유증, 폐 섬유증, 과민성 폐렴, 신장 섬유증, 간질성 섬유증, 전신성 강피증, 황반 변성, 췌장 섬유증, 비장의 섬유증, 심장 섬유증, 종격막 섬유증, 골수 섬유증, 심내막 심근 섬유증, 복막후 섬유증, 진행성 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 외과 수술의 섬유성 합병증, 주사 섬유증, 흉터 (scar), 또는 그 조합인 것일 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.
상기 투여는 상기 속수자 추출물을 개체당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 개체에 자외선 A를 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 자외선 A는 315nm 내지 400nm의 파장을 갖는 것일 수 있다. 자외선 A 조사는 상기 조성물 투여 전, 동시, 또는 후에 이루어지는 것일 수 있다. 자외선 A 조사가 상기 조성물 투여전 또는 후에 이루어지는 경우, 상기 조사와 투여의 시간 간격은 60 분, 50 분, 40 분, 30 분, 20 분, 10 분, 5 분, 3 분, 2 분, 또는 1 분 이내일 수 있다. 상기 개체에 자외선 A를 조사하는 것은 피부와 같은 개체의 외부 표면뿐만 아니라, 내부에 대하여도 조사할 수 있다. 상기 조사는 카테터와 같은 기구의 도움을 받아 이루어질 수 있다.
다른 양상은 상기 속수자 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 식품 조성물을 제공한다.
달리 언급이 없으면, 본 양상에 언급된 용어로서, 상기한 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키기 위한 조성물에 대한 설명에 언급된 용어와 동일한 것은, 거기에 설명된 바와 같으며 반복을 회피하기 위하여 여기에서는 별도로 기재하지 않는다.
상기 식품 조성물은 속수자 추출물 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 약학적 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제는 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
일 양상에 따른 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키기 위한 조성물에 의하면, 세포에서 MMP의 발현을 효율적으로 증가시키는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물에 의하면, 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 효과적으로 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 세포의 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키는 방법에 의하면, 세포의 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 효율적으로 증가시킬 수 있다.
다른 양상에 따른 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 예방 또는 치료하기 위한 것인 방법에 의하면, 개체의 섬유증 또는 그로부터 야기되는 2차 질병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 속수자 추출물의 제조 및 효능의 확인
본 실시예에서는 속수자로부터 속수자 추출물을 분리하고, 속수자 추출물이 MMP 발현 증가에 미치는 효과를 확인하였다.
(1) 속수자 추출물의 제조
본 발명에서 사용된 속수자는 대한민국 서울 경동시장의 한약재상에서 구입하여 사용하였다.
(1.1) 속수자-물 추출물의 제조
속수자 (Euphorbia lathyris) 종자 1 kg을 물 10 L에 담구고 3 시간 동안 초음파 기기(ENDELIN SONOREX)를 사용하여 초음파를 조사하여 속수자 추출물을 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하여 농축하여 농축물 140 g을 얻었다.
(1.2) 속수자-메탄올 추출물의 제조
속수자 종자 1 kg을 100 % 메탄올 10 L에 담구고 3 시간 동안 초음파 기기(ENDELIN SONOREX)를 사용하여 초음파를 조사하여 속수자 추출물을 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하여 농축하여 농축물 161 g을 얻었다.
(1.3) 속수자-에탄올 추출물의 제조
속수자 종자 1 kg을 100 % 에탄올 10 L에 담구고 3 시간 동안 초음파 기기(ENDELIN SONOREX)를 사용하여 초음파를 조사하여 속수자 추출물을 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 172 g을 얻었다.
(1.4) 속수자 분획의 제조
(1.2)절에서 제조한 속수자-메탄올 추출물 100 g을 500 ml의 증류수에 현탁시키고 계통학적 분획방법에 따라 동량의 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트(EtOAc),및 부탄올 (n-BuOH)로 각각 3회씩 추출하여 분획한 후 감압농축하여 메틸렌클로리드 층 5.4g, EtOAc층 10.9 g, 부탄올층 21.4 g, 및 물층 52.5 g을 획득하여 각각 MC 분획, EA 분획, Bu 분획 및 물분획으로 하였다.
(2) 속수자 추출물이 타입 I 콜라게나제인 매트릭스 메탈로프로티나제 -1 (MMP-1)의 생합성 및 콜라겐 생합성에 미치는 영향
신생아 포피에서 직접 분리한 1차 세포 (primary cell)인 인체 섬유아세포를 104개의 농도로 48공 평판 배양기 (48-well plate)의 각 웰에 접종하여 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum: FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM (Dulbecco' Modified Eagle Medium) 배지 중에서 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하고, 24시간 후에 (1.2) 및 (1.4)절에서 얻어진 속수자 추출물을 아래 농도대로 함유한 DMEM 배지로 갈아주고 동일하게 배양하였다. 배양 2일째 상등액을 수확해서 ELISA (AP biotech RPN2610) 방법을 사용하여 생성된 MMP-1의 양을 정량하였다. 간단히 요약하면 MMP-1에 대한 항체가 코팅된 96-well plate에 상등액을 가한 후 1차 항체인 토끼 항-MMP-1 항체와 함께 실온에서 2시간 반응시키고, PBST buffer (0.0067 M phosphate buffer pH 7.5 containing 0.033% Tween 20)로 2회 세척한 후, HRP (Horse Radish Peroxidase)가 표지된 2차 항체인 당나귀 항-토끼 항체를 가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. PBTS로 2회 세척한 후 기질인 TMB (3,3', 5,5'- Tetramethylbenzidine)를 가하고 실온에서 30분 배양한 후 산성 용액으로 반응을 정지시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
또한 동일한 상등액을 이용하여 생합성된 프로콜라겐의 양을 ELISA (Takara MK101) 방법을 사용하여 정량하였다. 간단히 요약하면 프로콜라겐에 대한 항체가 코팅된 96-well plate에 상등액을 가한 후 37℃에서 2시간 반응시키고, PBS buffer (0.0067 M phosphate buffer pH 7.5)로 3회 세척한 후, HRP (Horse Radish Peroxidase)가 표지된 1차 항체인 생쥐 항-프로콜라겐 항체를 가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. PBS로 4회 세척한 후 기질인 TMB(3,3', 5,5', Tetramethylbenzidine)를 가하고 실온에서 15분 배양한 후 산성용액으로 반응을 정지시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 값들은 아무 처리도 하지 않은 무처치군을 100으로 한 비교치를 나타내었다.
표 1은 속수자 추출물, 및 그 분획물이 MMP-1과 콜라겐의 생합성에 미치는 효능을 나타낸 것이다. 표 1에서 메탄올 추출물, 및 MC, EA, Bu는 각각 (1.2)절에서 얻어진 메탄올 추출물과 (1.4)절에서 얻어진 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트, 및 부탄올 분획물을 나타낸다.
시료 농도 MMP-1 양(%) 타입I 프로콜라겐 양 (%)
무처치군 100 100
메타올 추출물 1 ug/ml 102 101
메타올 추출물 10 ug/ml 105 99
MC 1 ug/ml 105 98
MC 10 ug/ml 108 97
EA 1 ug/ml 116 98
EA 10 ug/ml 126 97
Bu 1 ug/ml 106 95
Bu 10 ug/ml 112 98
표 1에 나타난 바와 같이, 속수자 종자 또는 상기 분획물은 타입 I 콜라게나제인 MMP-1의 생합성을 증가시키고, 프로콜라겐 생합성에는 별 영향을 미치지 않아서 진피조직의 세포외기질을 잘 분해하여 과섬유화질환, 흉터, 켈로이드의 예방 및 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.
(3) 자외선에 의한 MMP -1의 생합성 촉진
신생아 포피에서 직접 분리한 1차 세포인 인체 섬유아세포를 104개의 농도로 48공 평판 배양기 (48-well plate)의 각 웰에 접종하여 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum: FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM (Dulbecco' Modified Eagle Medium) 배지 중에서 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하고, 24시간 후에 자외선 A (Sankyo Denki F6T5/BL lamp, UVA peak 365nm)를 15 J/cm2로 조사한 후, (1.2) 절 및 (1.4) 절에서 얻어진 속수자 추출물 또는 그 분획물을 아래 농도대로 함유한 DMEM 배지로 갈아주고 동일하게 배양하였다. 배양 2일째 상등액을 수확해서 ELISA(AP biotech RPN2610) 방법(AP biotech RPN2610) 방법 을 사용하여 생성된 MMP-1의 양을 정량하였다. 간단히 요약하면 MMP-1에 대한 항체가 코팅된 96-well plate에 상등액을 가한 후 1차 항체인 토끼 항-MMP-1 항체와 함께 실온에서 2시간 반응시키고, PBST buffer (0.0067 M phosphate buffer pH 7.5 containing 0.033% Tween 20)로 2회 세척한 후, HRP (Horse Radish Peroxidase)가 표지된 2차 항체인 당나귀 항-토끼 항체를 가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. PBTS로 2회 세척한 후 기질인 TMB (3,3', 5,5'- Tetramethylbenzidine)를 가하고 실온에서 30분 배양한 후 산성 용액으로 반응을 정지시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
또한 동일한 상등액을 이용하여 생합성된 프로콜라겐의 양을 ELISA (Takara MK101) 방법을 사용하여 정량하였다. 간단히 요약하면 프로콜라겐에 대한 항체가 코팅된 96-well plate에 상등액을 가한 후 37℃에서 2시간 반응시키고, PBS buffer (0.0067 M phosphate buffer pH 7.5)로 3회 세척한 후, HRP (Horse Radish Peroxidase)가 표지된 1차 항체인 생쥐 항-프로콜라겐 항체를 가하고 37℃에서 1시간 반응시켰다. PBS로 4회 세척한 후 기질인 TMB(3,3', 5,5', Tetramethylbenzidine)를 가하고 실온에서 15분 배양한 후 산성용액으로 반응을 정지시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 값들은 자외선 조사군을 100으로 한 비교치를 나타내었다.
표 2는 자외선 조사와 조합된 속수자 추출물 및 그 분획물이 MMP-1과 콜라겐의 생합성에 미치는 효능을 나타낸 것이다. 표 2에서 메탄올 추출물, 및 MC, EA, Bu는 각각 (1.2)절에서 얻어진 메탄올 추출물과 (1.4)절에서 얻어진 메틸렌클로리드, 에틸아세테이트, 및 부탄올 분획물을 나타낸다.
시료 농도 MMP-1 양(%) 타입I 프로콜라겐 양(%)
자외선A 조사군 100 100
메탄올 추출물 1 ug/ml 187 55
메탄올 추출물 10 ug/ml 221 45
MC 1 ug/ml 237 35
MC 10 ug/ml 324 25
EA 1 ug/ml 285 30
EA 10 ug/ml 397 18
Bu 1 ug/ml 180 52
Bu 10 ug/ml 225 41
표 2에 나타난 바와 같이, 속수자 종자 또는 상기 분획물은 자외선에 의한 타입 I 콜라게나제인 MMP-1의 생합성을 자외선A만 조사한 군보다 훨씬 증가시켜서, 자외선을 조사 시 진피조직의 세포외기질을 분해하는 효능이 증강되어 과섬유화질환, 흉터, 켈로이드의 예방 및 치료에 훨씬 더 효과적임을 알 수 있었다. 또한, MMP-1의 생합성을 증가시킴에 따라 프로콜라겐의 분해도 촉진시켜줌을 알 수 있었다.

Claims (21)

  1. 속수자 (Euphorbia lathyris) 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키기 위한 조성물로서, 흉터를 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 흉터는 과증식성 흉터 (hypertrophic scarrring), 켈로이드 흉터 (keloid scarring), 또는 그 조합인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 속수자 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜, 또는 그 조합을 용매로 하여 추출된 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 자외선 A 조사와 조합하여 투여하기 위한 것인 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 자외선 A 조사는 상기 조성물 투여 전, 동시, 또는 후에 이루어지는 것인 조성물.
  8. 속수자 (Euphorbia lathyris) 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 개체의 흉터를 예방 또는 치료하기 위한 것인 조성물.
  9. 삭제
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 흉터는 과증식성 흉터 (hypertrophic scarrring), 켈로이드 흉터 (keloid scarring), 또는 그 조합인 것인 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 속수자 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜, 또는 그 조합을 용매로 하여 추출된 것인 조성물.
  12. 청구항 8에 있어서, 자외선 A 조사와 조합하여 투여하기 위한 것인 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 자외선 A 조사는 상기 조성물 투여 전, 동시, 또는 후에 이루어지는 것인 조성물.
  14. 청구항 1, 및 4 내지 7 중 어느 하나의 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloproteinase: MMP)의 발현을 증가시키는 방법으로서, 흉터를 예방 또는 치료하기 위한 것으로서, 인 비트로 또는 사람이 아닌 개체에서 수행되는 것인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 개체에 자외선 A를 조사하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 청구항 8, 및 10 내지 13 중 어느 하나의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 흉터를 예방 또는 치료하기 위한 것인 방법으로서, 인 비트로 또는 사람이 아닌 개체에서 수행되는 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 개체에 자외선 A를 조사하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  21. 삭제
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