KR101225114B1

KR101225114B1 - 봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101225114B1
Application number: KR1020100002264A
Authority: KR
Inventors: 한상미; 이광길; 여주홍; 이양구; 한충섭
Original assignee: 동성제약주식회사; 대한민국(관리부서:농촌진흥청장)
Priority date: 2010-01-11
Filing date: 2010-01-11
Publication date: 2013-01-22
Also published as: KR20110082335A

Abstract

본 발명은 봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 피부 상의 기미 및 주근깨 제거에 효과적이며, 각종 피부 질환, 특히 염증성 피부질환과 병원균으로 인하여 발생할 수 있는 무좀과 같은 피부질환을 사전 예방하고 제거, 치료하기 위한 화장품 및 비누, 정제, 캡슐, 밴드, 연고 형태 등의 의약품을 특징으로, 다양한 성분으로 이루어진 봉독은 미백 효과가 우수하며, 염증 발생을 억제할 뿐만 아니라 항균, 살균작용이 우수하여 피부 미백과 피부질환 예방 및 치료에 효과적인 조성물에 관한 것이다.

Description

봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부질환 예방 및 치료용 조성물{Composition for whitenings and treating skin damage or disease comprising bee venom}

본 발명은 봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

피부질환은 사람을 포함하는 동물의 피부에서 나타나는 모든 이상소견을 말한다. 피부는 신체의 표면을 덮고 있으므로 자외선과 같은 외부로부터의 자극이나 여러 병원체에 직접 접촉될 기회가 많고, 체내로부터 영향을 강하게 받는다. 또한, 유전, 염증, 양성 및 악성 종양, 호르몬, 외상, 퇴행변성 등의 병적 변화에 영향을 받으므로 다양한 원인에 의하여 질환이 유발된다. 염증성 피부질환이란 피부 상피내에 일련의 임상적 징후와 증상이 유발되는 질환을 말한다. 염증성 피부질환으로는 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhoic dermatitis) 및 여드름 등이 알려져 있다. 비만세포는 아토피성 피부염과 같은 다양한 염증성 피부질환의 병인론에 관여하는데, 비만세포는 피부에 존재하면서 다양한 염증성 세포활성물질을 분비한다. 비만세포는 면역학적 또는 비면역학적 자극으로 활성화 된 후, 히스타민(Histamin), β-헥소사미니데이즈(hexosaminidase), 프로테아제(protease), 아데노신(adenosine), 가수분해효소와 프로테오글리칸(proteoglycan)을 포함한 다양한 매개물질을 분비한다. 아토피성 피부염과 같은 염증성 피부질환의 치료를 위해서 주로 스테로이제, 항히스타민제, 비타민 연고, 부신피질 호르몬제가 사용되어왔다. 그러나, 이러한 약물은 임상효과의 탁월함과 동시에 다양한 부작용을 발현하는 약제들이다. 따라서, 보다 부작용이 적고 안전성이 높아 안심하고 사용할 수 있는 약제의 개발이 절실히 요구된다.

무좀은 곰팡이의 일종인 백선균이 원인이 되어 손발에 생기는 피부병으로 고온 다습한 여름철에 주로 손과 발에 발생하였으나, 생활환경, 직업, 면역상태 및 무좀균의 종류 등에 따라 신체의 어느 부위에나 발생이 가능하다. 일반적으로 무좀균은 피부의 각질을 파고들어가기 때문에 완치가 상당히 어렵고 따라서 종래의 무좀약으로는 일시적인 효과는 볼 수 있지만 재발 가능성이 큰 것으로 알려져 있다. 또한, 비듬은 피부사상균이 원인으로 생기는 피부병으로 두피가 건조해지면서 각질이 일어나 심한 가려움증을 수반하기도 하며, 특히 모발에 기름기가 많고, 두피에 피지 분비량이 많은 지루성 비듬은 모발에 먼지가 잘 달라붙어 지저분하고 냄새가 발생되는 것으로 확실한 원인조차 밝혀지지 않고 있다. 비듬의 치료에는 징크피리티이온(Zincpyrithiione)을 이용하고 있으나, 안전성 등에 대한 우려로 인하여 그 사용이 제한되고 일부에 국한하여 사용되고 있는 실정이다. 또한, 이 물질이 지속적으로 체내에 축적될 경우 만성독성, 발암성, 돌연변이 유발성 등으로 인하여 인체에 부작용이 적은 천연물질을 이용한 추출물의 항균력에 관한 연구가 많이 진행되고 있으나, 합성보존료에 비해 그 효과가 떨어지는 경향이 있으며, 추출물 자체가 맛, 향 및 색택에 많은 영향을 미치므로 아직까지 무좀과 비듬의 치료에 실요화되지 못하고 있는 실정이다.

기미는 일반적으로 멜라닌 색소가 침착되어 생성되는 것으로서 기미의 원인으로는 여성호르몬 복용, 자외선 노출, 스트레스, 유전 등이다. 현재, 기미의 발생에 대한 예방은 물론 그 치료가 중요시되고 있는데, 그 예방으로는 햇볕으로 인한 자외선 노출을 줄이고 체내에 노폐물이 쌓이지 않도록 주의를 기울여야 하며 일단 발생된 기미를 제거하는데 있어서는 어떠한 부작용도 없이 기미를 완전히 제거하는 것이 바람직하여 또한 그 치료기간이 짧을수록 바람직하다. 이러한 기미를 제거하기 위한 종래의 치료법으로는 내복약 및 외용제가 있으나 기미가 완전히 소실되지 않고 부분적으로 남아있을 수 있다는 점, 부작용을 유발할 수 있다는 점에서 오히려 기미의 악화를 초래할 수 있다.

국내산 꿀벌(Apis mellifera)의 봉독은 전기충격법을 이용한 봉독채집 장치를 이용하여 꿀벌의 피해 없이 순수한 봉독만을 다량으로 채취하여, 이물질을 제거한 후 동결 건조하여 정제 봉독을 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 봉독에는 다양한 성분이 복합적으로 구성되어 있는데 이들 성분들은 항염증과 항균작용, 진통작용, 면역증강 등의 역할을 한다.

피부 미백 및 피부질환에 대한 봉독의 효과에 대해서는 아직 연구 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 봉독이 β-헥소사미니데이즈 방출 억제로 인한 아토피성 피부염과 같은 염증성 피부질환의 예방과 치유뿐 아니라 백선균에 의해 발생되는 무좀, 사상균이 원인인 비듬의 치료, 멜라닌 생성을 억제하여 기미 및 피부 미백에 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 질환 예방 및 치료용 조성물도 포함한다.

본 발명에 따른 봉독을 함유한 피부질환 예방 및 치료뿐만 아니라 미백 효과를 갖는 봉독을 함유한 화장품 및 의약품을 개발로 인하여 국민의 삶의 질이 향상되리라 생각되며, 국내산 봉독의 고부가가치 용도 개발로 인한 양봉농가의 소득증대에 기여할 것이다.

도 1은 비만세포에 대한 봉독의 세포독성을 나타낸 것이다.
도 2는 봉독의 아토피 피부염의 원인인 β-헥소사미니데이즈 방출 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3a는 봉독의 아토피 피부염의 원인인 염증 유발인자 TNF-α 과발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 3b는 봉독의 아토피 피부염의 원인인 염증 유발인자 IL-8 과발현 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 봉독의 티로시나제 활성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 봉독의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 피부 상의 기미 및 주근깨 제거에 효과적이며, 각종 피부 질환, 특히 염증성 피부질환과 병원균으로 인하여 발생할 수 있는 무좀과 같은 피부질환을 사전 예방하고 제거, 치료하기 위한 화장품 및 비누, 정제, 캡슐, 밴드, 연고 형태 등의 의약품을 특징으로, 다양한 성분으로 이루어진 봉독은 미백 효과가 우수하며, 염증 발생을 억제할 뿐만 아니라 항균, 살균작용이 우수하여 피부 미백과 피부질환 예방 및 치료에 효과적인 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 봉독은 염증성 피부질환, 특히 아토피 피부염의 원인 중에 하나인 β-헥소사미니데이즈 응집 저해와 활성화된 비만세포에서 과발현되는 염증관련 사이토카인인 TNF-α 와 IL-8의 발견을 강하게 억제하였다. 또한, 봉독은 기미와 주근깨의 원인인 멜라닌의 생성 및 티로시나제 활성을 억제함으로써 미백 효과를 보였다. 무좀의 원인균으로 알려진 백선균과 비듬의 원인균인 피부사상균에 대하여 봉독 조성물은 강한 항균력을 갖고 있었다.

따라서, 피부질환 예방 및 치료뿐만 아니라 미백 효과를 갖는 봉독을 함유한 화장품, 기능성 식품 및 의약품 개발이 가능할 것으로 본다.

본 발명에 따른 봉독 함유 조성물에서 봉독의 함량은 정제봉독 기준으로 0.0001 ～ 10 %(w/v)을 함유하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 0.01 ～ 1 %(w/v)를 함유하는 것이 적합하다. 만일 0.0001 %(w/v) 미만으로 사용하게 되면 항균 및 항염 효과가 낮아 효능이 반감될 수 있고, 10 %(w/v) 초과를 사용할 경우엔 세포 독성을 초래할 수 있다.

상기 봉독을 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부질환 예방 및 치료용으로 사용 가능하다. 상기 피부질환으로는 아토피, 무좀, 비듬 등이 바람직하다. 또한, 상기 봉독을 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부 미백용으로 사용 가능하다.

본 발명에 따른 조성물은 유효성분 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 드레싱제, 패취제, 밴드, 연고제 등의 피부외용제 또는 주사제로 가능하다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 젤라티 효소분해물의 양을 기준으로 0.1 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 30 내지 80 mg/kg이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 60 mg/kg이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

또한, 기존의 피부질환 예방 및 치료제 또는 피부미백제와 병용하여 사용하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명은 봉독을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부질환 예방 및 개선용 기능성 식품을 포함한다.

본 발명에 따른 기능성 식품은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량음료, 미네랄워터, 알코올음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.

본 발명의 봉독을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.04 중량부, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택하는 것이 바람직하다.

상기 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일주스, 과일주스음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 봉독을 유효성분으로 함유하는 화장료를 포함한다. 상기 봉독 함유 화장료는 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로숀제 및 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있다. 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알코올, 프로필렌글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸알코올 및 유동 파라핀 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료는 피부의 산화에 의한 손상, 예를 들면, 반점(갈색반), 주근깨, 피부균열, 자외선 손상(햇볕 그을림)등을 예방하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 봉독의 유효성분 측정

서양종꿀벌(Apis meliffera L.)을 봉독채집 장치를 이용하여 봉독을 채집하고, 채집한 건조봉독을 증류수로 용해, 원심분리, 여과한 후 동결 건조하여 순수한 봉독만을 얻어 실험에 사용하였다.

액체크로마토그래피(AKTA explorer, Pharmacia, USA)를 사용하여 확인하였다. Sephadex TM75 및 Source 15RPC ST 컴럼을 사용하였으며, 봉독 성분 중에 멜리틴, 아파민, 포스포리파아제 A2 함량은 다음 수학식 1로 결정하였다.

그 결과는 다음 표 1과 같다.

봉독 중에 멜리틴, 아파민, 포스포리파아제 A2 함량이 다음 표 1과 같은 범위의 정제 봉독을 사용하였다.

성분	함량
아파민(apamine)	2.8^a(2.0～3.2)^b
포스포리파아제 A2(phospholipase A2)	12.8(10.8～14.5)
멜리틴 (melittin)	50.7(48.5～67.2)
a: 평균치 b: 최고치와 최저치의 평균 범위

실시예 2 : 봉독의 아토피성 피부염 억제 활성 측정

1) 비만세포 분리 및 세포독성 측정

흰쥐 복강에 30 ㎖ 정도의 티로드 완충용액 B(137 mM NaCl, 5.3 mM 글루코스, 12 mM NaHCO₃, 2.7 mM KCl, 0.3 mM NaH₂PO₄)를 주입하고 복부를 2분 정도 마사지 한 후, 복막을 조심스럽게 열어서 파스퇴르 파이펫으로 복강 내 세포를 포함하고 있는 티로드 완충용액 B를 수거하였다. 세포 함유 용액을 150 g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 침전시키고 침전된 세포에 티로드 완충용액 B를 강하여 파이펫팅한 후, 22.5% 메트리자마이드 용액 위에 살짝 적층한 다음 400 g에서 15분 동안 원심분리하여 침전된 세포만을 얻었다. 전기 침전된 세포에 50% FBS를 함유한 α-MEM을 가하고 톨루이딘 블루염색 방법으로 비만세포가 95% 이상임을 확인하고 시험에 사용하였다.

봉독에 대한 비만세포의 독성을 평가하기 위하여 6 웰 플리에트에 5×10⁵ cell/ml로 하여 분주하여 하루 동안 배양하여 부착시키고 새로운 배지로 교환한 다음 다양한 농도의 벌독을 처리하였다. 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양한 후 세포 생존율을 MTT(methylthiazol-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide) 시약으로 처리하여 ELISA 리더로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 봉독의 비만세포 독성을 평가하였다.

그 결과는 도 1과 같이 봉독의 용량은 1% 이하일 때는 비만세포에 대한 세포독성을 나타내지 않으나, 10%로 처리했을 경우엔 강한 세포독성을 보였다.

2) β- 헥소사미니데이즈 방출 억제 효과 측정

정제된 비만세포가 2 ×10⁵cells/㎖의 되도록 조정한 후 37 ℃에서 10분간 배양하여 세포를 안정화 시켰다. 안정화된 비만세포에 다양한 농도로 봉독를 첨가하고, 37 ℃에서 30분 동안 처리한 다음 복강 비만세포를 자극하는 컴파운드 48/80을 6.0 ㎍/㎖의 농도로 10분 동안 처리하였다. 반응 종료 후 400 g에서 원심분리하여 상층액과 세포를 분리하였다. β-헥소사미니데이즈 정량은 0.1 M 구연산염 완충액에 녹인 1 mM ρ-니트로-페닐-N-β-D-글루코사미드(ρ-nitro-phenyl-N-β-D-glucosaminide) 50 ㎕를 동량의 샘플에 37 ℃에서 1시간동안 처리한 다음 405 nm의 흡광도로 측정하였다. β-헥소사미니데이즈 생성 억제율은 다음 수학식 2로 계산하였다.

A: 봉독을 첨가하지 않았을 때의 β-헥소사미니데이즈 양

B: 봉독을 첨가했을 때의 β-헥소사미니데이즈 양

실험결과, 세포독성을 보였던 5, 10%에서는 강한 β-헥소사미니데이즈 방출 억제 효과를 보였으며, 0.01% 이상의 봉독을 처리했을 경우에도 50% 이상의 방출 억제 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 그 결과는 도 2와 같다.

3) 봉독의 TNF -α 및 IL -8 방출 억제 효과 측정

봉독이 염증성 세포활성물질인 TNF-α와 IL-8 방출 억제 효과를 알아보기 위하여, 실험예 1에서 얻어진 비만세포를 2 ×10⁵cells/㎖의 되도록 조정한 후 37 ℃에서 10분간 미리 배양한 다음, 봉독을 첨가하여 30분 동안 반응시킨 후 자극제인 PMA(paramethocyamphetamin)와 Ca-ionophore로 8시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 400 g에서 원심분리하여 상층액과 세포를 분리한 다음 분리된 상층액 중 TNF-α 및 IL-8의 단백질 수준을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 염증성 세포활성물질인 TNF-α와 IL-8 모두 비만세포가 활성화되었을 경우 봉독 처리에 의해 0.01% 이상 처리했을 경우 50% 이상 억제되는 효과를 보였다. 그 결과는 도 3과 같다.

실시예 3 : 무좀 및 비듬균에 대한 항균 작용

1) 무좀균에 대한 항균력 측정

무좀의 원인균으로 알려진 Trichophyton rubrun, Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccusum에 대한 항균 효과를 구하였다. Disc diffusion법을 이용하여 멸균된 페트리 디쉬(87×15 mm)를 이용하여 saboraud dextrose agar 배지에 무좀 균주를 각각 100 ㎕씩 도말하고, 멸균된 paper disc(8 mm)에 다양한 농도의 정제 봉독을 첨가하여 배지에 올려놓았다. 36 ℃에서 7일간 배양하여 paper disc 주위의 저해환(mm)의 크기로 항균력을 측정하였다. 봉독은 무좀을 일으키는 3종류의 원인균 모두에서 강한 항균 효과를 보였다. 그 결과는 다음 표 2와 같다.

구분	저해환 크기(mm)
	봉독 농도(%, w/v)
	0.0001	0.001	0.01	0.1	1	10
Trichophyton rubrun	1.0±0.1	3.2±0.1	4.5±0.2	6.4±0.1	7.5±0.1	10.2±0.1
Trichophyton mentagrophytes	2.2±0.2	5.5±0.2	9.5±0.1	12.2±0.1	15.5±0.3	25.8±0.2
Epidermophyton floccusum	1.5±0.1	2.8±0.1	5.2±0.1	6.5±0.1	7.5±0.1	12.8±0.2

2) 비듬균에 대한 항균력 측정

비듬의 원인균으로 알려진 Pityrosporum ovale에 대한 항균 효과를 구하였다. Disc diffusion법을 이용하여 멸균된 페트리 디쉬(87×15 mm)를 이용하여 saboraud dextrose agar 배지에 비듬 균주를 각각 100 ㎕씩 도말하고, 멸균된 paper disc(8 mm)에 다양한 농도의 정제봉독을 첨가하여 배지에 올려놓았다. 36 ℃에서 7일간 배양하여 paper disc 주위의 저해환(mm)의 크기로 항균력을 측정하였다. 봉독은 비듬을 일으키는 Pityrosporum ovale 원인균에서 강한 항균 효과를 보였다. 그 결과는 다음 표 3과 같다.

구분	저해환 크기(mm)
	봉독 농도(%, w/v)
	0.0001	0.001	0.01	0.1	1	10
Pityrosporum ovale	1.0±0.1	1.8±0.1	2.5±0.2	9.6±0.3	12.0±0.3	17.5±0.1

실시예 4 : 피부 미백 작용

1) 티로신의 hydroxyoation 억제 활성 측정

멜라닌 생합성에 관여하는 mushroom tyrosinase를 이용하여 봉독의 멜라닌 합성 저해 활성을 측정하였다. 0.3% 티로신 용액 50 ㎕와 다양한 농도의 봉독 수용액 50 ㎕를 96 마이크로 웰 플레이트에 넣고 분광광도계를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 mushroom tyrosinase 50 ㎕를 첨가하였다. 37 ℃에서 10분간 배양한 후, 475 nm에서 흡광도를 측정한다. 시료를 첨가하지 않은 무첨가 대조군과 활성을 비교하였으며, 다음 수학식 3에 따라 계산하였다.

그 결과는 봉독을 처리했을 경우 티로시나제 활성을 강하게 억제하였으며, 도 3과 같다.

2) 멜라닌 생성 억제 활성 측정

봉독의 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하기 위하여, B16F10 세포를 이용하여 봉독 처리 후 멜라닌 함량을 측정하였다. B16F10 세포는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. B16F10 세포를 24 웰 플레이트에 5×10₄ cell/well이 되도록 접종하여 배양하였다. 24시간 후부터, 각각 10 nM의 α-MSH(α-Melanocyte Stimulate Hormone)와 함께 다양한 농도의 봉독과 양성 대조군으로 PTH(phenylthiourea, 10 ㎍/ml)를 3일 동안 처리하였다. 배양한 세포에서 배지를 제거한 후 세포를 10 mM, pH 7.4인 PBS로 세척한 다음 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 10 mM PBS로 다시 세척하고, 4 ℃, 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻어진 cell pellet에 10% DMSO가 포함된 1 N NaOH을 첨가한 후, 60 ℃에서 3시간 동안 배양하여 멜라닌을 용해시킨 후, 405 nm에서 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 봉독은 기미와 주근깨 등의 원인이 되는 멜라닌의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었으며, 그 결과는 도 4와 같다.

실시예 5: 봉독의 독성 시험

봉독에 대한 독성을 알아보기 위하여, 봉독 0.5 ~ 5 mg/kg을 24 마리의 생쥐에게 복강 내 투여하여 행동 관찰 후 24 시간 생존 여부를 확인하였다. 그 결과, 봉독을 2 ~ 3 mg/kg을 투여한 생쥐 6 마리 중 3 마리가 생존하고 나머지 3 마리는 희생당하였음을 알 수 있었다. 반면에, 1 mg/kg 미만의 용량을 투여한 생쥐의 경우는 모두 생존하였으며, 행동 관찰상 약물을 투여하지 않았던 생쥐와 비교하여 통계학상의 유의성있는 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과를 고려할 때, 생쥐에서 봉독의 대략적인 반수가 생존할 독성 용량은 2.5 mg/kg으로 판단된다.

제제예 1 : 드레싱제의 제조

상기 실시예 1에서 얻어진 봉독 0.1 g과 알긴산염 1 g을 골고루 혼합하고, 증류수 5 ml를 넣어 잘 섞은 후, 60 ℃ 온도의 핫플레이트 상에서 투명해질 때까지 잘 섞고 유리판으로 옮겨 유리막대를 이용하여 얇게 펴주었다. 이때, 봉독과 알긴산염 및 물의 비율은 치료하고자하는 상처 또는 화상 부위, 상태에 따라 조절이 가능하며, 드레싱의 크기, 두께, 공극 등은 어떠한 형태로든 제조 가능하다. 또한, 알긴산염을 대신하여 히알루론산 등과 같은 통상의 젤 매트릭스 재료가 사용가능하다. 이와 같이 제조된 상처 또는 화상 치료용 드레싱은 도 5와 같다.

제제예 2 : 연고제의 제조

상기 봉독을 유효성분으로 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.

[조성]

봉독 1.0 중량%, 밀납 10 중량%, 폴리솔베이트-60 5.0 중량%, 피이지-60 경화피마자유 2.0 중량%, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량%, 바셀린 5.0 중량%, 유동파라핀 10.0 중량%.

제제예 3 : 패취제의 제조

상기 봉독을 유효성분으로 이용하여 다음과 같은 조성으로 패취제를 제조하였다.

[조성]

봉독 1.2 중량%, 헥실렌글리콜 20.0 중량%, 디에킬아민 0.7 중량%, 폴리아크릴산 1.0 중량%, 아황산나트륨 0.1 중량%, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 1.0 중량%, 폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르 1.0 중량%, 점성의 파라핀 오일 2.5 중량%, 카프릴산에스테르/카프르산에스테르 2.5 중량%, 폴리에틸렌글리콜-400 3.0 중량%, 탈이온수 100 중량%.

제제예 4: 기능성 식품의 제조

<음료의 제조>

봉독 100 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제조예 5: 화장료의 제조

봉독을 유효성분으로 이용하여 다음과 같은 조성으로 에센스를 제조하였다.

[조성]

유효성분 10.0 mg, 글리세린 3.0 mg, EDTA 0.05 mg, 벤조페논-9 0.04 mg, 카르복시비닐 폴리머 0.2 mg, 트리에탄올아민 0.18 mg, 옥시도테세스-25 0.6 mg, 글리세릴모노스테아레이트 1.0 mg, 방부제 0.01 mg, 향료 0.01 mg, 정제수 잔량

Claims

서양종꿀벌(Apis meliffea L.)에서 채집한 건조 봉독의 증류수 추출물로서, 멜리틴이 48.5~67.2 중량%, 아파민이 2.0~3.2 중량%, 그리고 포스포리파아제 A2가 10.8~14.5 중량%로 함유되어 있는 상기 추출물을, Trichophyton rubrun, Trichophyton mentagrophytes 또는 Epidermophyton floccusum 균에 대한 항균 유효성분으로 0.01~1%(w/v) 함유하는 것을 특징으로 하는 무좀의 예방 및 치료용 조성물.
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서양종꿀벌(Apis meliffea L.)에서 채집한 건조 봉독의 증류수 추출물로서, 멜리틴이 48.5~67.2 중량%, 아파민이 2.0~3.2 중량%, 그리고 포스포리파아제 A2가 10.8~14.5 중량%로 함유되어 있는 상기 추출물을, Trichophyton rubrun, Trichophyton mentagrophytes 또는 Epidermophyton floccusum 균에 대한 항균 유효성분으로 0.01∼1%(w/v) 함유하는 것을 특징으로 하는 무좀의 예방 및 개선용 기능성 식품.
서양종꿀벌(Apis meliffea L.)에서 채집한 건조 봉독의 증류수 추출물로서, 멜리틴이 48.5~67.2 중량%, 아파민이 2.0~3.2 중량%, 그리고 포스포리파아제 A2가 10.8~14.5 중량%로 함유된 상기 추출물을, 티로시나제 억제 및 멜라닌 생성 억제를 위한 유효성분으로 0.01~1%(w/v) 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
서양종꿀벌(Apis meliffea L.)에서 채집한 건조 봉독의 증류수 추출물로서, 멜리틴이 48.5~67.2 중량%, 아파민이 2.0~3.2 중량%, 그리고 포스포리파아제 A2가 10.8~14.5 중량%로 함유된 상기 추출물을, 티로시나제 억제 및 멜라닌 생성 억제를 위한 유효성분으로 0.01~1%(w/v) 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 기능성 식품.
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