KR100915711B1 - 보습, 항염증, 항세균 또는 항알레르기용 조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유효성분으로서, ⅰ) 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 혼합추출물, 및 ⅱ) 지장수를 함유하는 보습, 항염증, 항세균 또는 항알레르기용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 두피 및 피부의 수분을 유지하거나 염증, 세균 또는 알레르기 반응으로 인한 질병이나 이로 인한 손상을 예방, 치료 또는 개선할 수 있으며, 인체에 부작용이 없다.

Description

보습, 항염증, 항세균 또는 항알레르기용 조성물 및 그의 제조방법{Moisturizing, anti-inflammatory, antibacterial or anti-allergic compositions, and preparation methods thereof}

본 발명은 보습, 항염증, 항세균 또는 항알레르기용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 유효성분으로서, ⅰ) 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 혼합추출물, 및 ⅱ) 지장수를 함유하여 두피 및 피부의 수분을 유지하거나 염증, 세균 또는 알레르기 반응으로 인한 질병이나 이로 인한 손상을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

고삼(Sophorae Radix)은 이뇨, 이질, 해열, 습진, 위출혈 등에 쓰이는 생약재이다. 산지는 한국과 중국, 일본 등지이며 성분으로는 수종의 퀴놀리지딘 알칼로이드(quinolizidine alkaloid), 플라보노이드(flavonoid), 사포닌(saponin) 등이 보고되어있다.

녹차(Green tea)는 기능성 성분으로서 카테킨 및 카테킨산화물 등의 폴리페놀과 카페인, 아미노산류, 사포닌, 미네랄 등을 함유하고 있으며, 이들은 항산화, 항암, 항돌연변이, 혈중콜레스테롤 저하, 혈압상승 억제, 혈당상승 억제, 면역능력 저하억제 등의 생리활성 효과를 나타낸다. 이들 기능성 성분 중 카테킨(Catechin)은 1902년 Perkin 등에 의하여 에피카테킨(epicatechin)과 함께 마호가니 나무로부터 최초로 확인된 물질로서, 현재까지 함유된 카테킨류로서는 (+)-카테킨(C)과 (-)-에피카테킨(EC), (-)-에피갈로카테킨-3-갈레이트(EGCG), (+)-에피갈로카테킨(EGC) 및 (-)-에피카테킨 갈레이트(ECG)의 5 성분이 알려져 있다. 특히 이들 화합물은 항암작용이나 고혈압 및 동맥경화 억제작용 등을 갖는 것으로 밝혀졌다.

백복령은 동의보감에 의하면 "입맛을 좋게 하고 구역을 멈추며 마음과 정신을 안정시킨다. 폐위로 담이 막힌 것을 낫게 하며 신장에 있는 나쁜 기운을 몰아내며 소변을 잘 나오게 한다. 수종과 임병(淋病)으로 오줌이 막힌 것을 잘 나오게 하며 소갈을 멈추게 하고 건망증을 낫게 한다."고 적혀 있다. 복령에는 복령당(茯笭糖)이라는 펙틴이 84% 들어 있다. 물에 녹이면 복령은 98%의 포도당으로 바뀐다. 또한 철, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 나트륨, 인, 셀렌 등이 들어 있다. 이 밖에 단백질, 지방, 레시틴 등이 들어 있다. 약리실험에서 이뇨작용, 혈당량 저하작용, 진정작용 등이 밝혀졌다. 복령의 다당류는 면역 부활작용, 항암작용을 나타낸다.

익모초의 성분으로는 전초에 알칼로이드(레오누린, 레오누리딘, 스타히드린)가 있고, 쓴맛물질, 피토스테린, 정유, 사포닌, 기름, 역한냄새물질, 수지, 루틴, 유기산, 쿠마린 등이 있다. 약리작용으로 수추출액은 중추신경계통의 진정작용이 있다. 레오누린은 진정, 혈압강하, 강심, 이뇨 작용을 한다. 레오누린과 스타히드린은 실험동물의 자궁을 긴장시키고 수축회수를 늘리며, 스타히드린은 레오누린보다 자궁에 대한 작용을 나타내는 반면에, 레오누린은 스타히드린보다 진정, 혈압강하, 강심, 이뇨 작용을 나타낸다.

어성초의 주성분은 데카노일-아세트알데히드(decanoyl-acetaldehyde)이며 그 밖에 쿠에르치트린, 이소쿠에르치트린, 미루세네, 라우릴-알데히드, 메틸-엔-닐케톤, 카르릭-에시드 등이 있다. 약리작용으로는 항암, 이뇨, 강심, 해독, 정장, 거담, 진통, 지혈, 조직재생, 피부미용, 미발 등이 있으며 설파민의 4만 배에 이르는 살균력을 가지고 있다. 어성초의 또 다른 효능은 강력한 항세균 작용으로, 특히 폐렴균이나 황색포도상구균, 이질균, 대장균 등에 대해 강한 세균증식 억제작용을 한다. 또한 병원세포의 발육억제 효과도 뛰어나다.

천궁(Cnidium officinale Makino)은 휘발성 정유를 함유하고 있으며 주성분은 크니디라이드(cnidilide), 크니디움락톤(cnidiumlactone), 리구스틸라이드(ligustilide) 등이다. 천궁의 약효는 혈액 순환개선, 생리통, 관상동맥질환으로 인한 흉부동통, 맹장염으로 인한 복통완화, 감기로 인한 두통과 편두통의 완화, 진정, 진통, 강장, 부인병, 위통, 두통, 어지러움 등에 폭넓게 사용된다.

측백나무(Tunja orientalis)는 동북아시아 및 한국의 남부에 자생하는 나무로서 열매는 약용으로 쓰인다. 측백엽에는 히노키티올(hinokitiol)이라는 물질이 함유되어있는데, 이는 방향족의 트로폴론(tropolone) 화합물로서 강력한 살균 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 이 물질은 열, 산, 알칼리, 공기 등에 장기간 저장하여도 상당히 안정하며 유전 독성도 없다고 알려져 있다. Inamori 등은 히노키티올이 그람양성균에 대하여 강한 항세균 활성을 보인다고 하였고, Arima 등은 활성 산소를 억제한다고 하였다.

한련초(Eclipta alba L)는 지혈, 배농과 머리카락이 희어지는데 약용하고 있다. 성분으로는 잎으로부터 데스메틸웨델로락톤(desmethyl-wedelolactone)과 웨델로락톤(wedelolactone)이 분리 보고되었고, 전초로부터 티오펜(thiophene) 유도체로 2-[부타딘-(1,3)-일]-5-[부텐-(3)-인-(1)-일]-티오펜 등이 분리 보고되었다. 또한 한련초에서 나오는 즙 성분은 색깔이 없다가 차츰 검게 바뀌는데, 이는 웨델로락톤이란 성분으로서 모발을 검게하며 암세포의 성장을 억제하는 효능도 있다.

상백피(Armeniacea, Apricot)의 주요 성분으로는 청산배당체, 어미그달린(amygdalin), 어미그달라제(amygdalase)가 있으며, 진해평천 및 해열 작용이 뛰어나다. 특히, 항종양 작용이 많이 보고되고 있으며, 흰쥐의 자궁경부암을 억제시키고, 치료가 진행되어 생존율을 증가시킨다. 또한 염증억제 효과가 있다.

석류피는 일찍이 강장제로 알려져 왔고, 특히 고혈압과 동맥경화 예방에 효과를 나타낸다. 또한 촌충의 구제, 설사, 이질, 구내염, 장출혈 등에 효과가 있는 것으로 알려져 왔으며, 동의 치료에서는 탄닌이 많아 수렴성 건위약으로 쓰여 왔다. 석류의 약효에 있어서 주요한 유효성분은 알칼로이드인 이소펠레티에린(isopelletierine)이며, 그 외 탄닌인 퓨니칼린(punicalin), 퓨니칼라긴(punicalagin) 등과 이눌린(inuline), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 말산(malic acid) 등이 알려져 있다. 국내에서 석류에 대한 연구로는 석류씨 중에 퓨니신산(punicic acid), 에스트로겐(estrogen), 에스트라디올(estradiol), β-시토스테롤(β-sitosterol)의 생리활성 및 섭취효과에 대한 연구와 미생물 생성억제 효과, 석류추출물의 항산화 화합물(ellagic acid) 및 항세균 활성에 대한 보고와 에스트로겐류에 관한 연구 등이 있다.

지장수는 우리 몸에 좋은 칼륨, 마그네슘, 나트륨, 인과 철 등이 다량 함유되어 있어 자연으로 귀화하는 중요한 역할을 하며 음식 및 공해로 인한 독을 제거하여 신진대사를 원활히 해준다. 산해경에 지장수는 죽지 않는 물로 기록되어 있다. 해독작용을 하므로 중독되어 번민하는 것을 풀고, 그 외의 어육독, 약물제균 등 모든 종류의 독을 해독해 준다. 물의 성질은 차고 달며, 독은 없다. 물속에 미네랄이 풍부히 녹아있고 용존 산소량이 커 피부에도 좋은 역할을 하므로, 아토피 증상 등에 도움이 되며 몸속의 해독작용으로 인해 공해에 찌든 우리 몸을 건강하게 되살리는데 좋다.

염증이란 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출(渗出), 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변(病變)을 일컫는다. 중이염(中耳炎) 등과 같이 끝자가 염(炎)으로 되어 있는 것 외에, 전염성 질환(결핵, 매독, 이질, 디프테리아 등) 등에서 볼 수 있는 병변의 총칭으로, 대부분의 병이 이것에 속한다. 원인은 기계적 상해작용, 온도, 방사선 등의 물리적 인자, 독물 등의 화학적 인자, 세균감염 등의 기생체에 의한 것 등이며 이 중 세균에 의한 것이 가장 많다. 이러한 주요 원인 외에도, 여러 부수적 요인과 개체의 소인(素因)이나 면역 등에 의하여 그 발생은 복잡하다. 경과로 보아 급성, 아급성 또는 만성으로 나뉜다. 염증을 분류하면, ① 변질성 염증, ② 삼출성 염증: 장액성 염증·섬유소성 염증·화농성 염증·출혈성 염증·부패성 염증·카타르성 염증, ③ 증식성 염증, ④ 특이성 염증: 결핵증·매독·나병·방선균증(放線菌症)·비저(鼻疽) 등이 있다.

염증에 관여하는 인자로 EGF(Epidermal Growth Factor)는 표피성장인자로서 혈소판에서 생성되며, 창상치유 초기에 많은 양이 발견된다. 신장, 침샘, 눈물샘에서 생성되기 때문에 소변과, 타액, 눈물에서 고농도로 발견되며, 그 기능은 혈관신생작용으로 혈관 내피세포의 분열을 촉진하여 혈관 재생을 돕고, 진피조직의 섬유아세포를 자극하여 콜라겐 분비를 촉진하여 육아조직을 채우며, 상피세포의 분열 및 이동을 촉진하여 재상피화를 일으킨다. PDGF(Platelet Derived Growth Factor)는 혈소판(가장 많이 분비), 대식세포, 혈관내피세포, 섬유아세포에서 생성되며, 섬유아세포와 혈관평활근에 대한 강한 화학유인물질과 분열촉진물질, 세포외 기질에 매우 중요한 섬유결합소(Fibronectin)와 히알루론산의 생성을 촉진, 창상치유에 중요한 콜라겐 분해효소의 생성에 관여하고, 상피, 내피세포에는 PDGF 수용체가 없어, 간접적으로 신생혈관의 생성을 촉진하는 기능을 가지고 있다. 여러 성장인자 중에서도 특히, 형질전환성장인자-β 슈퍼훼밀리(Transforming growth factor-β(TGF-β) superfamily)는 구조상 유사한 많은 단백질들로 구성되어 있다. 이들은 이합체(dimer)로서, 호르몬 혹은 중재자(mediator) 역할을 한다. TGF-β는 분자량 25 kDa의 동종이형질체로 여러 종류의 세포와 조직에서 초기 발생의 조절, 세포주기의 조절, 세포 증식 및 분화, 이동, 생존, 세포외기질의 생산, 면역 체계, 혈관 생성과 혈구세포 생산, 세포사 유도, 골격 형성, 상처 치유 등을 조절하는 다기능성 사이토카인으로 알려져 있다. TGF-β에는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 세 가지 이성질체가 있으며, 이들은 세포막 수용체인 TGF-β 수용체 타입 Ⅰ(TGFβR-Ｉ) 및 TGF-β 수용체 타입 Ⅱ(TGFβR-Ⅱ)의 이질 복합 수용체를 통해 신호를 전달한다. 또한 혈관상피성장인자(VEGF)는 동종이형질의 당단백질로 상처 부위에서 혈관 신생을 자극하는 것으로 알려진 가장 일반적이고 효과적인 성장인자이다. 따라서 VEGF는 많은 혈관 조직들에서 발현되며, 상피세포에 특이적인 마이토젠(mitogen)으로 상피세포의 이동과 증식을 유도하고, 혈관의 투과성을 증가시키는 역할을 한다고 알려져 있다. 이들의 효과는 단백질-티로신 키나제 도메인을 가지고 있는 상피세포 수용체 Flt-1과 Flk-1/KDR을 통해 조절된다.

본 발명자들은 인체에 안전하고 부작용을 일으키지 않으면서도 우수한 보습, 항염증, 항세균, 항알레르기 작용을 갖는 조성물을 개발해내기 위하여, 지속적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 혼합추출물, 및 지장수의 배합 사용 시 이들 각각을 개별적으로 사용하는 경우에 비해 현저히 우수한 효과를 거둘 수 있다는 새롭고도 놀라운 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 유효성분으로서, ⅰ) 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 혼합추출물, 및 ⅱ) 지장수를 함유하는, 보습, 항염증, 항세균 또는 항알레르기용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 유효성분으로서, ⅰ) 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 혼합추출물, 및 ⅱ) 지장수를 함유하는, 보습, 항염증, 항세균 또는 항알레르기용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한

⑴ 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피를 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출하거나, 초음파 또는 초임계 유체 추출법으로 추출하여 혼합추출물을 수득하고;

⑵ 황토, 백토, 적토 또는 이들의 혼합물을 정제수에 혼합한 후 여과하여 지장수를 수득하고;

⑶ 단계 ⑴의 혼합추출물과 단계 ⑵의 지장수를 혼합한 후 여과하는:

단계를 포함하는, 상기 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 혼합추출물, 및 지장수의 배합 사용에 의해 이들 각각을 개별적으로 사용하는 경우에 비해 현저히 우수한 보습, 항염증, 항세균 및 항알레르기 효과를 거둘 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 인체에 무해하고 안전하다.

도 1은 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피, 석류피 각각의 추출물, 및 지장수를 개별 처리 시, 상기 추출물을 혼합 처리 시(TOHEX), 상기 추출물을 혼합한 후 지장수와 배합 처리 시(TOHEX + 지장수) 세포증식 촉진효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고;

도 2는 과산화수소 손상에 의한 세포의 반치사 농도의 측정결과를 나타낸 그래프이며;

도 3은 TOHEX-지장수의 과산화수소에 의해 손상된 세포의 성장회복 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고;

도 4는 세포주에서 TOHEX-지장수 처리 시 TGF, EGF, PDGF 및 VEGF 발현량 측정결과를 나타낸 그래프이며;

도 5는 실험동물에서 TOHEX-지장수 처리 시 TGF, EGF, PDGF 및 VEGF 발현량 측정결과를 나타낸 그래프이고;

도 6은 세포주에서 TOHEX-지장수 처리 시 단백질 키나제 C 억제효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이며;

도 7은 실험동물에서 TOHEX-지장수 처리 시 단백질 키나제 C 억제효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고;

도 8은 TOHEX-지장수의 항균력 측정결과를 나타낸 그래프이며;

도 9a는 TOHEX-지장수 처리 시 상대적인 경피수분 손실량 측정결과를 나타낸 그래프이고;

도 9b는 TOHEX-지장수 처리 시 상대적인 경피수분량 측정결과를 나타낸 그래프이며;

도 10은 TOHEX-지장수 처리 시 세라마이드 생성량 측정결과를 나타낸 그래프이고;

도 11은 TOHEX-지장수 처리 시 체중변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 혼합추출물, 및 지장수의 배합 사용에 의해 이들 각각을 개별적으로 사용하는 경우에 비해 현저히 우수한 보습, 항염증, 항세균 및 항알레르기 효과를 거둘 수 있다는 것을 최초로 밝혀내었다.

본 발명에 사용되는 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피, 석류피는 자연에 존재하는(naturally-occurring) 것을 사용하는 것이 바람직하나, 1차 가공된 것(예를 들어, 자연적 또는 인공적으로 건조하거나 찐 것 등)이라도 무방하다. 지장수의 경우 토양, 천연암석, 해수 등 자연에 존재하는 황토, 백토, 적토 등을 사용하는 것이 바람직하며, 이를 미세분말로 분쇄하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 혼합추출물은 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피를 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출하거나, 초음파 또는 초임계 유체 추출법으로 추출하여 얻어진 것일 수 있으며, 바람직하게는 정제수와 에탄올의 혼합용매로 추출하여 얻어진다. 이때 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피, 석류피를 혼합한 후 이를 추출하는 것이 바람직하나, 각각의 생약을 개별적으로 추출한 후 혼합하여도 무방하다. 따라서, 본 발명의 혼합추출물은 상기 생약들을 혼합한 후 추출한 추출물은 물론 각각의 생약을 추출한 후 혼합한 추출물을 포함하는 것이다. 바람직하게는, 혼합추출물은 건조, 예를 들어 동결건조하여 사용될 수 있다. 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 중량비는 바람직하게는 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2이고, 보다 바람직하게는 0.7~1.5 : 0.7~1.5 : 0.7~1.5 : 0.7~1.5 : 0.7~1.5 : 0.7~1.5 : 0.7~1.5 : 0.7~1.5 : 0.7~1.5 : 0.7~1.5이며, 가장 바람직하게는 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1이다.

본 발명에서 지장수는 황토, 백토, 적토 또는 이들의 혼합물을 정제수에 바람직하게는 1 : 0.1~100, 보다 바람직하게는 1 : 1~10, 가장 바람직하게는 1 : 5의 중량비로 혼합한 후 여과하여 얻어지는 것이다.

본 발명에서, 혼합추출물 및 지장수를 각각 0.001∼20중량%로 함유하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 혼합추출물은 바람직하게는 0.001~20중량%, 보다 바람직하게는 0.1~10중량%로 함유되며, 지장수는 바람직하게는 0.01~20중량%, 보다 바람직하게는 0.1~10중량%로 함유된다. 특히, 혼합추출물과 지장수의 중량비는 1:1∼10인 것이 바람직하고, 예를 들어 1:5이다.

본 발명의 조성물은 추가로, 영양을 공급하는 역할을 할 수 있는 글루코스, 키실로스, 만노스, 아라비노스 등의 단당류 및 말토스, 슈크로스, 셀로비오스, 트레할로스 등의 이당류 등의 당류들로부터 1종 이상을 포함할 수 있으며, 이들의 양은 전체 조성물의 0.01 내지 1중량%가 바람직하다.

본 발명의 조성물의 적용대상에는 특별한 제한이 없는 바, 본 조성물은 인간이나 사육 또는 애완동물에게 적용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 또는 화장학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 추가로 함유하여 단위 투여 제형(unit dosage form)으로 제형화될 수 있다. 본 조성물은 경피(transdermally) 또는 경구로(orally) 투여될 수 있고, 특히 피부 또는 두피에 적용될 수 있으며, 이를 위해 로션제, 연고제, 젤제, 크림제, 패치제, 분무제, 정제, 환제, 분말, 새세이(sachet), 엘릭시르(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 또는 연질 또는 경질 캡슐로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 연고, 크림, 로션, 스프레이, 비누 및 화장품으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 용량은 성별, 연령, 증세, 질병상태 등을 고려하여 적절히 결정되어야 하며, 예를 들어 1~10 ㎎/일, 특히 5~10 ㎎/일의 용량범위로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 우수한 보습, 항염증, 항세균 또는 항알레르기 효과를 나타내는바, 염증, 세균 또는 알레르기로 인한 질병이나 이로 인한 손상, 특히 아토피 피부염 또는 이로 인한 2차 감염, 여드름, 비듬 또는 습진을 예방, 치료 또는 개선하는데 효과적으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 조성물의 제조

⑴ 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 10가지 혼합 추출물(Ten Oriental Herbs Extract; TOHEX) 제조

한국의 한약 재료상에서 구입한 10가지 재료를 분말화하여 같은 중량비로 혼합하여 에탄올:증류수=40:60의 비로 혼합된 용매를 사용하여 추출한 후 동결건조하여 사용하였다.

⑵ 지장수 제조

지장수는 자연에서 얻어진 황토 및 백토나 적토를 1:5 비율로 정제수에 혼합한 후 60∼120 rpm의 일정한 속도로 상온에서 12 시간 교반하고 10 ㎛ 여과지로 여과한 후 사용하였다.

⑶ 조성물의 제조

표 1에 나타낸 성분 및 함량을 이용하여, 각 성분을 균일하게 혼합한 후 여과하여 조성물을 제조하였다.

	성분	함량(중량%)
1	TOHEX	1.0
2	지장수	5.0
3	살리실산	0.1
4	멘톨	0.1
5	에탄올	40
6	프로필렌 글리콜	2
7	글리세린	2
8	방부제	적당량
9	산화방지제	적당량
10	정제수	100까지

비교예:

상기 표 1의 조성에서 1 및 2의 성분은 제외하고 조성물을 제조하였다.

실험예 1: 세포증식 촉진효과 측정

마우스 배아 섬유아세포인 NIH 3T3 세포를 10% 우태아혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 둘베코스 모디파이드 이글즈 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM)에서 2×10⁶ 또는 4×10⁶ 세포/㎖의 밀도를 유지하면서 37 ℃(95% O₂, 5% CO₂, 60% 습도) 항온항습 배양기에서 배양하였다. 세포의 증식촉진 실험을 위해 MTT 어세이 방법을 사용하였다. MTT 실험을 위해 96 웰 플레이트에 웰 당 2×10³ 세포/㎖의 각 세포를 분주하여 10% FBS가 포함된 배양액을 처리하였다. 배양기에서 24 시간 동안 세포를 안정화시킨 후 FBS가 포함된 배양액을 FBS가 없는 DMEM으로 갈아주고 각각 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피, 석류피 및 지장수를 처리하였다. 실험에 사용된 천연물질은 추출 후 동결건조하여 각각 100 ㎍/1 ㎖의 양으로 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 녹여 사용하였으며, 지장수는 100 ㎕/1 ㎖로 사용하였다. 48 시간 배양 후 웰 당 50 ㎕의 MTT(2 ㎎/1 ㎖ 멸균 증류수)를 첨가하여 4 시간 동안 반응시키고 DMSO를 처리하여 30 분간 흔들어준 후 엘라이자 리더(550, Bio-rad)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 추출물과 지장수를 혼합하여 처리한 경우 처리하지 않은 무처리군보다 세포의 증식이 활발해짐을 확인할 수 있었다. 특히, 혼합추출물인 TOHEX와 지장수를 동시에 처리한 경우 무처리군에 비해 122%로 증가됨을 확인할 수 있었다. 따라서 혼합추출물인 TOHEX와 지장수의 배합이 각각 처리한 경우보다 더 우수하게 세포 증식을 촉진함을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 과산화수소 손상에 의한 세포의 반치사 농도의 측정

세포에 일정한 손상을 주어 그 손상에 의한 세포의 증식을 확인하기 위하여 반치사 농도를 측정하였다. 반치사 농도(median lethal dose)란 세포의 증식율이 정상세포의 증식율과 비교하여 절반이 될 때를 의미한다. 실험예 1과 동일한 세포와 배양조건으로 세포의 반치사 농도를 측정하였다.

MTT 실험을 위해 96 웰 플레이트에 웰 당 2×10³ 세포/㎖의 각 세포를 분주하여 10% FBS가 포함된 배양액을 처리하였다. 배양기에서 24 시간 동안 세포를 안정화시킨 후 FBS가 포함된 배양액을 FBS가 없는 DMEM으로 갈아주고 각각 1 mM, 900 μM, 800 μM, 700 μM, 600 μM, 500 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM 및 100 μM의 농도로 과산화수소를 처리하였다. 1 시간 후 웰 당 50 ㎕의 MTT(2 ㎎/1 ㎖ 멸균 증류수)를 첨가하여 4 시간 동안 반응시키고 DMSO를 처리하여 30 분간 흔들어준 후 엘라이자 리더(550, Bio-rad)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 반치사 농도를 구하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 반치사 농도는 200 μM인 것으로 나타났다. 실험에서 얻어진 반치사 농도를 사용하여 세포에 손상을 가한 뒤 조성물에 의한 여러 효과를 알아보았다.

실험예 3: 과산화수소 손상에 의한 세포성장 회복효과의 측정

실험예 1과 동일한 세포와 배양조건으로 세포성장 회복효과 실험을 수행하였다. 반치사 농도인 과산화수소 200 μM를 세포에 처리하여 TOHEX와 지장수에 의한 회복능력을 확인하였다.

MTT 실험을 위해 96 웰 플레이트에 웰 당 2×10³ 세포/㎖의 각 세포를 분주하여 10% FBS가 포함된 배양액을 처리하였다. 배양기에서 24 시간 동안 세포를 안정화시킨 후 FBS가 포함된 배양액을 FBS가 없는 DMEM으로 갈아주고, 과산화수소수만 처리한 군(과산화수소), TOHEX와 지장수를 처리한 후 과산화수소수를 처리한 군(Pretreat), TOHEX와 지장수, 과산화수소수를 동시에 처리한 군(Cotreat), 과산화수소수를 처리한 후 TOHEX와 지장수를 처리한 군(Aftertreat)으로 나누어 실험하였다. 처리한 양은 TOHEX 1 ㎍, 지장수 1 ㎕였다. 그 후 24 시간 배양 후 웰 당 50 ㎕의 MTT(2 ㎎/1 ㎖ 멸균 증류수)를 첨가하여 4 시간 동안 반응시키고 DMSO를 처리하여 30 분간 흔들어준 후 엘라이자 리더(550, Bio-rad)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 모든 경우에 있어서 TOHEX와 지장수를 처리한 경우 과산화수소만 처리한 경우보다 세포의 증식능력이 증가하였다. 특히, TOHEX와 지장수를 처리한 후 과산화수소수를 처리한(Pretreat) 경우가 다른 경우보다 우수한 증식능력을 보여 주었다. 한편, 각각의 물질로 처리한 경우에는 표 2에서 보는 바와 같이 과산화수소 처리군보다는 증식력이 증가하였으나, TOHEX와 지장수를 처리한 경우보다는 증식능력이 떨어짐을 확인할 수 있었다.

	Pretreat		Cotreat		Aftertreat		대조군
	평균	오차	평균	오차	평균	오차	평균	오차
무처리군	-	-	-	-	-	-	1.000	0.015
과산화수소	-	-	-	-	-	-	0.483	0.044
고삼	0.692	0.051	0.611	0.101	0.511	0.049	1.018	0.008
녹차	0.672	0.091	0.594	0.121	0.502	0.073	1.019	0.009
백복령	0.654	0.072	0.581	0.094	0.491	0.109	1.013	0.016
익모초	0.633	0.083	0.537	0.130	0.499	0.063	1.014	0.025
어성초	0.672	0.042	0.601	0.089	0.488	0.093	1.013	0.017
천궁	0.667	0.093	0.595	0.129	0.497	0.083	1.024	0.030
측백	0.694	0.021	0.627	0.088	0.500	0.023	1.021	0.025
한련초	0.654	0.075	0.599	0.071	0.509	0.099	1.027	0.032
상백피	0.619	0.063	0.547	0.087	0.485	0.103	1.022	0.023
석류피	0.610	0.101	0.525	0.141	0.481	0.123	1.022	0.018
지장수	0.513	0.099	0.523	0.091	0.488	0.091	1.012	0.013
TOHEX	0.724	0.021	0.604	0.790	0.531	0.077	1.137	0.016
TOHEX+지장수	0.777	0.043	0.716	0.096	0.601	0.093	1.244	0.047

실험예 4: 세포주에서의 TGF, EGF, PDGF 및 VEGF 발현 측정

TGF, EGF, PDGF 및 VEGF의 발현정도를 웨스턴 블랏팅(western blotting)에 의해 확인하기 위하여, 실험예와 동일한 세포와 배양조건으로 반치사 농도인 과산화수소 200 μM를 세포에 처리하여 1 시간 배양한 후 TOHEX 1 ㎍, 지장수 1 ㎕를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다. 세포에서 얻은 단백질을 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후 NC(nitrocellulose membrane)에 옮겼다. 그 후 NC를 5% 탈지유를 함유한 트리스 완충 염수(TBS)로 블록킹하고, 1:1,000으로 희석한 일차 항체(항-TGF, 항-PDGF, 항-EGF 및 항-VEGF 래빗 IgG)와 1:1,000으로 희석한 이차 항체(퍼옥시다제-포접된 항-래빗 IgG)에 각각 반응시킨 후, 0.05% 트윈-20이 함유된 TBS로 세척하고, ECL 검출 키트를 이용하여 X-선 필름에 감광시켰다. 그 후 LabWork™(version 4.5.00.0)의 이미지 분석 프로그램을 사용하여 OD 값을 그래프로 나타내었다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 무처리군에 비해 모든 단백질의 발현이 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 세포의 병리학적인 이상을 회복하거나 치료하는데 효과가 있음을 나타낸다. 한편, 각각의 물질로 처리한 경우에는 표 3에서 보는 바와 같이 무처리군보다 단백질의 발현이 증가되었으나, TOHEX와 지장수를 처리한 경우보다는 떨어짐을 확인할 수 있었다.

실험예 5: 실험동물에서의 TGF, EGF, PDGF 및 VEGF 발현 측정

실험동물은 8 주령 ICR 수컷 쥐(30±3 g)로 실험 시작 전 일반 고형사료(삼양사)와 물로 자유 식이를 하였고, 폴리프로필렌 상자(453×293×247(H) ㎜, 19 ℓ)에서 1 주일간(20∼24 ℃, 습도 60∼80%)의 예비사육으로 적응기간을 두었다. 적응기간이 끝난 후 실험동물 등의 털을 제거한 후 길이 1 ㎝, 넓이 0.01 ㎠, 깊이 0.5 ㎝로 면도칼을 이용하여 상처를 내고, 직경 1 ㎝의 면적에 둥근 쇠봉을 이용하여 열상을 주었다. 실험동물군은 비교예 처리군, 실시예에 의한 조성물 처리군 및 현재 판매되고 있는 마데카솔(동국제약) 처리군으로 나누었다. 각 군은 하루 24 시간을 각각 12 시간씩 명, 암 상태로 나누어 유지하였다. 실시예와 비교예에 따라 제조된 조성물을 아침과 저녁 일정한 시간을 정하여 일정량(1 ㎖) 하루에 두 번씩 상처 부위에 도포하였다. 모든 실험은 암 상태일 때는 실험을 하지 않고 실험쥐가 안정을 취하도록 배려하였으며, 조직 채취 시에는 실험 전 24 시간 동안 회복기간을 두었다.

상기한 단백질의 발현정도를 웨스턴 블랏팅에 의해 확인하기 위하여, 실험동물을 희생시킨 후 병변부위의 조직을 취하여 작은 조각으로 가위로 절단한 후 균질화 완충용액(homogenation buffer; 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% 트리톤-X 100)으로 조직을 파쇄하였다. 실험동물 조직에서 얻은 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리한 후 NC에 옮겼다. 그 후 NC를 5% 탈지유를 함유한 트리스 완충 염수(TBS)로 블록킹하고, 1:1,000으로 희석한 일차 항체(항-TGF, 항-PDGF, 항-EGF 및 항-VEGF 래빗 IgG)와 1:1,000으로 희석한 이차 항체(퍼옥시다제-포접된 항-래빗 IgG)에 각각 반응시킨 후, 0.05% 트윈-20이 함유된 TBS로 세척하고, ECL 검출 키트를 이용하여 X-선 필름에 감광시켰다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 비교예에 비해 모든 단백질의 발현이 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 피부의 병리학적인 이상을 회복하거나 치료하는데 효과가 있음을 나타낸다.

실험예 6: 세포주에서의 항염증 효과 평가

조성물의 항염증 효과를 평가하기 위하여, 마우스 배아 섬유아세포인 NIH 3T3 세포를 사용하여 단백질 키나제 C(protein kinase C; PKC)의 억제효과를 조사하였다. 세포를 2×10⁷ 세포/㎖이 되도록 배양한 후 TOHEX 1 ㎍, 지장수 1 ㎕를 동시에 처리하여 반응시켰다. 그 후 세포를 인산완충용액(phosphate buffered saline; PBS)으로 세척한 후 초음파분쇄기용 완충용액(sonication buffer)[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 20 mM HEPES(N-[2-Hydroxyethyl] piperazin-N'-[2-ethanesulfonic] acid), 1 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1% 트리톤-X 100]과 혼합한 후 세포를 초음파파쇄기로 파쇄하였다. 단백질 키나제 C의 발현정도를 웨스턴 블랏팅에 의해 확인하기 위하여, 세포에서 얻은 단백질을 정량하고 일정량을 12% SDS-PAGE로 분리한 후 NC에 옮겼다. 그 후 NC를 5% 탈지유를 함유한 트리스 완충 용액(TBS)으로 블록킹하고, 1:1,000으로 희석한 일차 항체(PKC)와 1:1000으로 희석한 이차 항체(퍼옥시다제-포접된 항-래빗 IgG)에 각각 반응시킨 후, 0.05% 트윈-20이 함유된 TBS로 세척하고, ECL 검출 키트를 이용하여 X-선 필름에 감광시켰다.

그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, TOHEX와 지장수를 동시에 처리함으로써 단백질 키나제 C의 활성이 억제됨을 알 수 있다. 염증유발의 생화학적 경로를 보면 외부 자극에 의해 PKC 활성이 높아지고, 이어서 포스포리파제 D(phospholipase D)의 활성이 증가되면서 염증반응이 진행되는데, 본 발명의 조성물을 처리함으로써 PKC의 활성을 억제되어 잇따른 염증반응이 억제될 수 있음을 확인하였다. 한편, 각각의 물질로 처리한 경우에는 무처리군보다는 PKC 활성 억제능이 우수하였으나, TOHEX와 지장수를 처리한 경우보다는 떨어짐을 확인할 수 있었다.

실험예 7: 실험동물에서의 항염증 효과 평가

조성물의 항염증 효과를 평가하기 위하여, 아토피 동물모델인 NC/Nga 마우스의 피부 표피세포를 사용하여 단백질 키나제 C의 억제효과를 보았다. 표피세포를 2×10⁷ 세포/㎖이 되도록 배양한 후 실시예의 조성물을 처리한 후 반응시켰다. 그 후 실험예 6의 조건으로 실험을 수행하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 실시예에 의한 TOHEX와 지장수를 동시에 처리함으로써 PKC의 활성이 억제되어 잇따른 염증반응이 억제될 수 있음을 확인하였다. 한편, 각각의 물질로 처리한 경우에는 무처리군보다는 PKC 활성 억제능이 우수하였으나, TOHEX와 지장수를 처리한 경우보다는 떨어짐을 확인할 수 있었다.

실험예 8: 세포주에서의 면역글로불린 E(Immunoglobulin E; IgE) 농도 분석

IgE를 생산하는 인간 세포주인 U266B1 세포(림프아세포종(lymphoblastoma) 세포주)를 사용하여 TOHEX와 지장수에 의한 IgE 생산의 억제 효능을 확인하였다. U266B1 세포를 RPMI-1640 배지(15% FBS, 2 mM L-글루타민, 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트, 50 ㎍ 스트렙토마이신, 100 U/㎖ 페니실린 첨가)가 담긴 24-웰 배양 플레이트에서 37 ℃, 5% CO₂의 환경에서 배양하였다. 준비된 세포를 다시 2×10⁵ 세포/웰의 농도로 조정한 후, 먼저 면역조절 물질, 염증유발 물질과 세포파괴 물질 등의 생산을 자극하는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)(2 ㎍/㎖)로 처리하고 TOHEX 1 ㎍, 지장수 1 ㎕를 처리하였다. 대조군에는 덱사메타손(Dexamethasone, 2 μM) 또는 배지(RPMI-1640)를 처리하였다. 위와 동일한 배양 조건에서 7 일간 배양한 후에, 배지의 IgE 농도를 엘라이자 리더(PharMingen; San Diego, CA)로 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

LPS 자극	처리	IgE(IU/㎖)
-	RPMI-1640	187.1± 6.7
+	RPMI-1640	401.1± 3.9
+	TOHEX와 지장수	217.1± 10.1
+	덱사메타손	207.9± 25.4

표 4에 나타낸 바와 같이, TOHEX와 지장수를 함유하는 조성물은 대조약물인 덱사메타손과 유사한 IgE 생산 억제효과를 보였다. 이 결과로부터 면역반응이 일어나는 아토피성 피부염이나 기타 피부질환에 본 발명의 조성물을 처리함으로써 우수한 면역반응 억제효과를 거둘 수 있음을 알 수 있다.

실험예 9: 실험동물에서의 IgE 농도 분석

아토피 피부염은 알레르기 물질 등 생체에 해로운 물질이 들어왔을 때 나타나는 면역체계의 과민반응으로, 유해화학물질들이 체내에 유입되면 혈액속의 B 림프구가 항체 단백질인 IgE를 만들며 히스타민, 프로스타글란딘과 같은 화학전달물질을 방출시킨다. 따라서 본 발명에 따른 조성물이 항체 단백질의 생성을 감소시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 혈청 중의 IgE 농도를 측정하였다.

실시예 조성물과 비교예 조성물을 각각 NC/Nga 마우스에 목 부위에 피부도포(1 ㎎/일)하였다. 그 후 4 주, 8 주, 12 주차에 모세관 튜브(capillary tube)를 이용하여 마우스의 눈에서 약 100 ㎕의 혈액을 채혈한 후 혈청을 분리하여 IgE 양을 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

(단위: ㎍/㎖)

표 5에 나타낸 바와 같이, 전체 실험과정에서 실시예에 따른 조성물 처리군이 비교예에 따른 조성물 처리군에 비해 월등히 낮은 IgE 농도를 보였다. 따라서 본 발명에 따른 조성물이 알레르기 반응을 감소시키는데(치료하는데) 효과적이고 지속적임을 확인하였다.

실험예 10: 항균력 시험

TOHEX와 지장수의 피부 유해균에 대한 항균력을 측정하기 위해, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코커스종(Micrococcus sp.), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 및 비듬 원인균인 피티로스포럼 오발레(Pityrosporum ovale)를 대상으로 항균력을 검사하였다. 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항균력을 검사하기 위해서 사용한 배지는 증류수 1 ℓ에 뇌 심장 추출물(Brain Heart Infusion) 25 g, 효모 추출물 5 g, 카시톤(Casitone) 4 g, L-시스테인 HCl 1 g, 포도당 5 g, 가용성 전분 1 g, 모노포타슘 포스페이트 15 g, 황산암모늄 1 g, 황산마그네슘 0.2 g, 염화칼슘 0.02 g을 균등히 녹인 후 가압 살균한 후 사용하였고, BBL 가스팩 혐기 시스템(BBL GasPak Anaerobic System)을 이용하여 혐기조건을 형성한 후 37 ℃에서 약 3∼5 일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 균수를 측정하여 항균력을 검사하였다. 한편 스타필로코커스 아우레우스 배양에는 스타필로코커스 배지 110(Difco사)을 사용하였고, 바실러스 서브틸리스와 마이크로코커스의 배양에는 영양 아가(Nutrient Agar)를 사용하였으며, 아스퍼질러스 나이거의 배양에는 포테이토 덱스트로스 아가(Difco사, Potato Dextrose Agar)를 사용하였고, 피티로스포럼 오발레의 배양에는 펩톤 0.1%, 포도당 0.5%, 효모 추출물 0.01%, 우담즙(ox-bile) 0.4%, 글리세릴 모노스테아레이트(glyceryl monostearate) 0.05%, 전지분유 0.1%, 글리세롤이 0.1% 포함된 배지를 사용하였다.

TOHEX와 지장수를 각 농도로(예: 1 ㎍의 경우 TOHEX 1 ㎍, 지장수 1 ㎕ 사용) 사용하였다. 각각의 미생물을 배양하여 10배씩 순차적으로 희석하여 각각의 배양배지에 도말하여 배양한 후 평판배지당 약 10³∼10⁴개의 집락을 형성하는 희석배수를 결정하였다. 각각의 미생물을 배양한 후 상기의 실험에서 결정된 희석배수로 희석하였다. 이때 희석용액으로는 0.85% NaCl을 사용하였다.

상기 방법으로 준비한 시료를 시료준비에 사용한 용매에 순차적으로 희석하여 원하는 농도를 만든 후 희석한 시료를 9 ㎖의 미생물 희석용액에 1 ㎖ 첨가하고 충분히 혼합하였다. 대조군의 경우에는 시료용해에 사용한 용매를 사용하였다. 37 ℃에서 30 분∼1 시간 방치한 후(가끔 혼합해 줌) 배지에 100 ㎕씩 도말한 후 각각의 배양조건에서 배양하고 배양이 끝난 후 집락의 수를 측정하였다.

그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물은 아토피에 대한 2차 감염뿐만 아니라 여드름, 비듬 및 습진의 치료에도 유용하다 할 수 있다.

실험예 11: 실험동물에서 조성물의 피부 장벽 회복 및 보습력 측정실험

TOHEX와 지장수가 장기간의 피부손상으로 인한 피부장벽의 회복에 미치는 효과를 평가하기 위한 시험을 실시하였다. 출생 후 8∼10주가 경과한 무모생쥐(Hairless Mouse)의 등에 아세톤을 1 일 2회씩 5 일 동안 주기적으로 도포하여 실험동물의 등 피부장벽기능을 손상시킨 다음, 실시예와 비교예에서 제조한 조성물을 피부면적 10 ㎠ 당 400 ㎕의 용량으로 1 일 2회씩 3 일 동안 연속 도포하면서 스웨덴 서바메드(Servamed)사의 증발계(Evaporimeter)로 경피수분 손실량(transepidermal water loss, TEWL)을 일정 시간마다 측정하고, 그 결과를 도 9a에 나타내었다. 도 9a에 나타난 바와 같이, 상대적인 경피수분 손실량을 측정한 결과 실시예 조성물 처리군이 비교예 조성물 처리군에 비해 수분손실양이 적었다.

또한, TEWL 측정시점에 코니오미터(Corneometer, 독일 Courage Khazaka사)를 사용하여 피부 수분량을 측정하고, 그 결과를 도 9b에 나타내었다. 도 9b에 나타난 바와 같이, 실시예 조성물 처리군의 피부 수분량이 비교예 조성물 처리군보다 높았으며, 장벽 손상회복과 더불어 피부 수분량도 증가하였다.

본 발명의 조성물을 사용하는 경우 보습력이 향상되었고 지속력이 우수하였다. 따라서 아토피 피부염이나 기타 피부질환으로 발생하는 피부의 수분손실을 TOHEX와 지장수를 함유하는 본 발명의 조성물이 억제함으로써 수분손실로 인한 피부장벽의 손상을 감소시킬 수 있다.

실험예 12: 임상실험

본 발명에 따른 조성물의 아토피 피부염 치료 및 개선효과를 평가하기 위하여, 아토피 피부염 환자를 대상으로 임상실험을 실시하였다. 아토피 피부염 환자의 병변 부위 및 비병변 부위의 수분증발량, 함수정도, pH를 측정하여 피부상태를 검사한 후, 실시예에 따른 조성물을 하루 2회씩 병변부위에 2 주간 도포하여 피부상태의 개선정도를 파악하여 아토피 피부염의 치료효과를 평가하였다. 또한, 가려움증, 홍반, 염증을 동반한 상처의 완화효과를 종합적으로 분석하여 본 발명의 효과를 평가하였다. 그 결과를 표 6 및 7에 나타내었다.

(- : 이상 없음, + : 심하지 않음, +++++ : 매우 심함)

표 6에 나타낸 바와 같이, 아토피 피부염 환자의 경우 병변부와 비병변부의 수분 손실량(TEWL), 수분보유량(hydration) 및 pH가 많은 차이를 보이고 있었다. 수분 손실량의 경우에는 보통의 정상피부에 비해 병변부위의 수분 손실량이 매우 높은 것으로 나타났으며 수분 보유량도 정상의 50∼60%에 못 미쳐 피부가 매우 건조함을 알 수 있었다. 이는 피부의 수분 보호막이 매우 심하게 손상되어 수분의 증발이 심하게 일어남을 보여주는 것이다. 또한 피부의 pH도 건강한 피부의 pH 5.5 근처에서 다소 벗어나 있음을 알 수 있었다. 그러나 실시예의 조성물을 2 주간 도포함으로써 손상 받은 피부가 많이 회복되어 수분 손실량이 많이 줄어들었고, 피부의 수분 보유량도 많이 늘어 건조함이 많이 해소되었음을 알 수 있었다. 또한 실시예의 조성물을 도포함으로써 피부의 건조함이 줄어들면서 가려움증이 해소되어 긁지 않게 되었다. 또한 표 7에 나타낸 바와 같이, 환자 스스로 느끼는 가려움증은 실시예에 의한 조성물을 도포함으로써 도포 전에 비해 두드러지게 개선되었음을 알 수 있었으며, 이로 인해 홍반, 상처도 많이 치유되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 13: 본 발명에 따른 조성물의 히스타민 방출 억제효과 측정

본 발명에 따른 조성물의 히스타민 방출 억제효과를 측정하기 위하여, 아래와 같은 실험을 수행하였다.

실험동물은 12 주령된 스프라그 도울리(Sprague-Dawley)종 수컷흰쥐(평균체중 350 g)로 복강에 30 ㎖ 정도의 타이로드(Tyrode) 완충용액 B(137 mM NaCl, 5.3 mM 글루코스, 12 mM NaHCO₃, 2.7 mM KCl, 0.3 mM NaH₂PO₄)를 주입하고 복부를 90 초 정도 마사지하였다. 그 후 복막을 조심스럽게 열어 파스퇴르 피펫으로 복강 내 세포를 함유하고 있는 타이로드 완충용액 B를 수거하였다. 이어서 상기 세포 함유 용액을 150×g로 10 분 동안 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 침전된 세포에 타이로드 완충용액 B를 가하여 피펫팅한 후, 22.5% 메트리자마이드(metrizamide) 용액위에 살짝 적층하고 400×g에서 15 분 동안 원심분리하여 침전된 세포만을 얻었다. 상기 침전된 세포에 α-MEM(minimum essential medium)/50% FBS(fetal bovine serum)를 가하고, 피펫팅하여 톨루이딘 블루 염색방법을 통해 비만세포가 95% 이상이고 트립판 블루 염색에 의해 생존능력이 90% 이상임을 확인하고 실험에 사용하였다. 상기 정제된 비만세포에 α-MEM/50% FBS를 가하고 조심스럽게 피펫팅한 후, 2×10⁵ 개의 세포가 되도록 분주하였다. 세포를 안정화시키기 위하여 37 ℃에서 10 분 동안 미리 배양하고, TOHEX와 지장수를 처리하여 37 ℃에서 30 분 동안 처리하였다. 그 후 곧 바로 화합물 48/80(각각 5.0 ㎍/㎖)을 10 분 동안 처리하였다. 참고로, 화합물 48/80은 강력한 히스타민 유리 촉진제로서 N-메틸-p-메톡시페닐에틸아민(N-methyl-p-methoxyphenylethyl-amine)과 포름알데히드(formaldehyde)의 축합에 의해 생성되며, 비만세포 내로 칼슘유입을 증가시켜 세포내 칼슘 수준을 증가시키고, cAMP-포스포디에스테라제(phosphodiesterase)를 활성화시켜 세포내 cAMP 수준을 감소시킴으로써 비만세포의 탈과립을 일으키는데 주로 사용되는 물질이다. 반응 종료 후 400×g에서 원심분리하여 상층액과 세포를 분리하였다. 히스타민 정량은 OPA 스펙트로플루오로메트리(O-phthaldialdehyde spectrofluorometry) 방법으로 440 ㎚에서 측정하였으며, 히스타민 분비의 억제율을 하기 식을 이용하여 계산하였다.

억제율(%)=[(A-B)× 100]/A

A: 약물을 부가하지 않았을 때의 히스타민 양

B: 약물을 부가하였을 때의 히스타민 양

그 결과를 표 8에 나타내었다.

	히스타민 분비 억제율(%)
무처리(식염수)	-
실시예	21.11± 3.4
비교예	4.15± 1.1

표 8에 나타낸 바와 같이, 화합물 48/80에 의하여 유도된 복강 비만세포로부터 히스타민의 분비가 TOHEX 및 지장수에 의해서만 약 21% 억제됨을 확인할 수 있었다. 따라서 아토피성 피부염이나 면역과 염증반응이 수반되는 기타 피부질환에 TOHEX 및 지장수를 처리함으로써 그 반응을 억제할 수 있음을 확인하였다.

실험예 14: 세라마이드 생성능 측정

세포간지질의 구성 성분들 중 하나인 세라마이드의 생성능을 측정하였다. 실시예와 비교예에서 얻어진 조성물을 각각 NC/Nga 마우스에 목 부위에 피부도포(1 ㎎/일)하였다. 그 후 7 일 동안 조성물과 비히클로 처리한 실험동물의 피부 조직을 8 ㎜ 펀치로 절편하여 0.25% 트립신(Trypsin)을 함유한 PBS 용액이 담겨있는 페트리 디쉬(Petri Dish)에 진피가 아래로 가도록 하여 담근 다음 상온에서 120 분 동안 방치하였다. 표피층을 조직에서 분리하고, 증류수로 세척한 후 여과지를 이용하여 물기를 제거한 뒤 중량을 측정하였다. 거의 건조된 각질을 블라이 다이어(Bligh-Dyer) 용액(메탄올:클로로포름:물=4:2:1.6) 5 ㎖에 넣어 교반한 후 24 시간 동안 방치한 다음, 부유액을 모으고, 다시 각질층을 포함하고 있는 침전물에 클로로포름과 메탄올 혼합용액(클로로포름:메탄올=2:1)을 4 ㎖ 첨가하여 교반한 후, 별도로 모아 둔 부유액과 함께 여과지로 여과하였다. 여과액에 다시 증류수 6 ㎖를 넣어 교반한 후, 2,000 rpm으로 10 분간 원심분리한 하층액만을 취해 35 ℃에서 질소가스로 건조시키고 클로로포름과 메탄올 혼합용액(클로로포름:메탄올=2:1) 일정량에 녹여 보관하였다. 일정량을 실리카겔 TLC 판에 점적하고, 표 9과 같은 조성비의 전개 용매로 전개하였다. TLC 판을 전개시킨 후 각 밴드의 크기를 측정하였다.

	전개용매 조성(㎖)	용매이동거리(㎝)
1차	클로로포름 50 아세톤 20 메탄올 30	5
2차	클로로포름 75 아세톤 5 메탄올 25	7
3차	클로로포름 72 에테르 6 에틸아세테이트 20 메탄올 2	9

무처리군의 세라마이드 생성량을 1로 하여 환산한 각 처치군의 세라마이드 생성량을 도 10에 나타내었다. 도 10으로부터, 무처리군이나 비교예 조성물 처리군에 비해 실시예 조성물 처리군에서는 세라마이드 생성량이 26% 증가한 것을 알 수 있다. 이상의 결과로부터, 본 발명에 따른 조성물은 세라미이드 생성량을 증가시킴으로써 피부의 장벽기능을 강화하여 각질층에 물리적 자극을 최소화시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 아토피성 피부염이나 피부장벽의 손상으로 인한 피부질환의 개선 및 치료에 사용될 수 있는 것으로 확인되었다.

실험예 15: 피부 자극 및 독성 실험

이상의 모든 실험에서 동물이나 사람에게 피부 자극에 의한 부작용은 관찰되지 않았으며, 20 마리의 4 주령 마우스(ICR 계)에게 2 달 동안 TOHEX(10 ㎍) 및 지장수(1 ㎖)를 포함한 물을 자유식이하였을 경우(실험예), 사망한 동물은 없는 것으로 확인되었다. 체중변화는 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타난 바와 같이, 체중은 TOHEX와 지장수를 먹이지 않은 경우와 마찬가지로 증가하였다.

Claims (16)

1. 유효성분으로서,

   ⅰ) 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피를 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출하여 얻어진 혼합추출물, 및

   ⅱ) 지장수를 함유하는, 항알레르기용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피의 중량비는 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2 : 0.5~2인, 항알레르기용 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 지장수는 황토, 백토, 적토 또는 이들의 혼합물을 정제수에 혼합한 후 여과하여 얻어지는 것인, 항알레르기용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 혼합추출물 및 지장수를 각각 0.001~10중량%로 함유하는, 항알레르기용 화장료 조성물.
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 피부 또는 두피에 적용하기 위한, 항알레르기용 화장료 조성물.
8. 제7항에 있어서, 연고, 크림, 로션, 스프레이, 비누 및 화장품으로 사용되는, 항알레르기용 화장료 조성물.
9. 제1항에 있어서, 인간이나 사육 또는 애완동물에게 적용하기 위한, 항알레르기용 화장료 조성물.
10. 삭제
11. 삭제
12. 제1항에 있어서, 아토피 피부염 또는 이로 인한 2차 감염을 예방 또는 개선하기 위한, 항알레르기용 화장료 조성물.
13. ⑴ 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피를 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출하여 혼합추출물을 수득하고;

    ⑵ 황토, 백토, 적토 또는 이들의 혼합물을 정제수에 혼합한 후 여과하여 지장수를 수득하고;

    ⑶ 단계 ⑴의 혼합추출물과 단계 ⑵의 지장수를 혼합한 후 여과하는:

    단계를 포함하는, 제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항 내지 제9항, 및 제12항 중 어느 한 항에 따른 항알레르기용 화장료 조성물의 제조방법.
14. 유효성분으로서,

    ⅰ) 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피를 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출하여 얻어진 혼합추출물, 및

    ⅱ) 지장수를 함유하는, 보습용 화장료 조성물.
15. 유효성분으로서,

    ⅰ) 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피를 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출하여 얻어진 혼합추출물, 및

    ⅱ) 지장수를 함유하는, 항염증용 화장료 조성물.
16. 유효성분으로서,

    ⅰ) 고삼, 녹차, 백복령, 익모초, 어성초, 천궁, 측백엽, 한련초, 상백피 및 석류피를 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출하여 얻어진 혼합추출물, 및

    ⅱ) 지장수를 함유하는, 항세균용 화장료 조성물.