KR102248259B1

KR102248259B1 - 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 조성물

Info

Publication number: KR102248259B1
Application number: KR1020200053489A
Authority: KR
Inventors: 모상현; 이정훈; 서효현; 장성주; 이삭; 이상준; 김재영; 이진형
Original assignee: 주식회사 바이오에프디엔씨
Priority date: 2020-05-04
Filing date: 2020-05-04
Publication date: 2021-05-06

Abstract

본 발명은 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부노화 예방, 피부 보호, 및 피부상태 개선용 화장료 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 피부 적용에 안전하고, 피부노화 방지 및 피부상태 개선에 효과적이고 피부 장벽 강화로 피부를 보호할 수 있으며 상처 치유 효과가 우수한바 천연물 유래 기능성 화장품, 의약품, 의약외품 등으로 제공될 수 있다.

Description

콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 조성물{Composition for skin improvement comprising Soybean plant cell-derived exosomes as an active ingredient}

본 발명은 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부노화 예방, 피부 보호, 및 피부상태 개선용 화장료 조성물 등에 관한 것이다.

피부 노화의 원인은 나이의 증가와 자외선, 미세먼지, 스트레스 등 요인이 주요 원인이다. 피부 노화는 시간 의존성 자연노화에 따른 내인성 노화(intrinsic aging)와 외부적 요인에 의한 외인성 노화(extrinsic aging)로 로 구분되며, 외인성 노화의 대표는 자외선에 의한 광노화(phtoaging)가 있다. 내인성 노화의 원인으로서 나이의 증가는 섬유아세포의 작용과 세포의 수를 감소하게 하며, 결과적으로 섬유성분의 합성량 감소와 구조가 느슨해져 탄력이 저하된다. 또한, 피부세포 내 수분이 소실되면 각질층 구조의 변화를 일으켜 노화의 원인이 된다.

한편, 광노화는 자외선에 의해 유발되는 것으로서 자외선에 의한 활성 산소종 발생 증가가 콜라겐 분해를 촉진하는 MMPs(Matrix metalloproteinase)의 발현을 유도하고 세포 수를 감소시키는 등의 작용으로 피부 탄력 저하 등의 노화를 유발한다.

피부(skin)는 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하조직(subcutaneous tissue)으로 이루어진다. 피부의 바깥층인 표피는 중층편평상피(stratified squamous epithelium)로 구성되며, 외부 환경에 대한 신체의 보호 장벽으로 작용한다. 표피는 바깥에서부터 각질층(stratum corneum), 투명층(stratum lucidum), 과립층(stratum granulosum), 유극층(stratum spinosum) 및 기저층(stratum basale)으로 나뉜다. 진피는 표피와 피하조직(subcutaneous tissue) 사이의 층으로서, 유두층(papillary dermis) 및 망상층(reticular dermis)으로 나뉘며, 표피에는 없는 혈관, 콜라겐, 엘라스틴 섬유, 모공, 입모근, 피지선, 한선, 여러 가지 감각신경, 섬유아세포 및 대식세포 등이 존재하며 피부 중 가장 많은 부위를 차지한다.

피부탄력에 중요한 Collagen (Type I, II, III, IV, V)은 전구물질의 형태 (pro-collagen)로 합성되며, 진피층의 80~90%의 비율로 존재하는 주요 구조 단백질이다. 콜라겐은 피부재생, 피부 함수율, 상처치유 및 주름개선 등에 있어서 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 자외선으로부터 피부 손상을 막아주고 수분을 다량 함유할 수 있는 기능이 있어 진피에 수분을 공급하는 역할을 수행하여 주름 예방 및 탄력적인 피부를 유지하는데 필수적인 요소이다. 또한, 상처가 생겼을 때 섬유아세포의 지속적인 콜라겐 생성은 상처 부위를 메꾸어 상처 치유 작용을 한다.

한편, 엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 또한, 성체 줄기세포에서 분리되는 엑소좀의 상처 치료, 피부 개선 등의 효과가 알려져 있다.

엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 동물의 줄기세포에서 분리되는 엑소좀은 포함된 인자가 목적 이외의 효과를 나타낼 수 있으며, 엑소좀의 분리에 있어 줄기세포가 포함될 수 있다는 점에서 안정성의 문제가 있다. 그러나, 동물세포 유래 엑소좀의 안정성 문제는 식물세포의 엑소좀을 이용하는 것으로 해결될 수 있다. 이에, 식물세포의 엑소좀에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직 미진한 상태이다.

본 발명자들은 콩의 식물세포를 유도하고 이로부터 엑소좀을 분리하여 콩 식물세포 유래 엑소좀의 다양한 활성을 연구하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2018-0062854

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 콩 식물세포 유래 엑소좀을 포함하는 피부노화 예방, 피부 보호, 피부상태 개선, 상처 치료, 및 항염증용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부노화 예방용 및/또는 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 피부노화는 내인성 노화 및/또는 외인성 노화이고, 자외선에 의한 광노화를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 청색광 또는 자외선에 의한 세포사멸을 감소시킴으로서 광노화를 예방할 수 있으며, 피부 온도를 낮추어 열노화를 예방할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 각질형성세포에서 항균 펩타이드인 LL37(CAMP, Cathelicidin-related antimicrobial peptides) 및 hBD-2(human β-Defensin-2)의 발현을 증진시켜 피부의 세균감염을 예방하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 세포의 환경 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 LEA(Late embryogenesis abundant) 단백질의 발현을 증진시켜 환경 스트레스에 대한 피부노화를 억제 또는 개선하는 것일 수 있으며, 상기 환경 스트레스는 자외선, 먼지, 황사, 바람, 및/또는 온도(열)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 자외선에 의한 COX-2(Cyclooxygenase-2) 및 iNOS(Inducible nitric oxide synthase)의 발현 증가를 억제시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부상태개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 피부상태 개선은 피부탄력 증진, 보습, 미백, 피부진정, 모공축소, 피지분비감소, 및/또는 여드름 개선일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 멜라닌 형성에 기여하는 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 섬유아세포의 콜라겐 합성을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 아쿠아포린-3(Aquaporin-3) 및/또는 필라그린(filaggrin)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 COX-2(Cyclooxygenase-2) 및 iNOS(Inducible nitric oxide synthase)의 발현 증가를 억제하여 여드름을 예방 또는 개선하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 콩 식물세포 유래 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상처 치료용 약물의 제조를 위한 콩 식물세포 유래 엑소좀의 용도를 제공한다.

본 발명은 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하여 피부 적용에 안전하고, 피부노화 방지 및 피부상태 개선에 효과적이고 피부 장벽 강화로 피부를 보호할 수 있으며 상처 치유 효과가 우수한바 천연물 유래 기능성 화장품, 의약품, 의약외품 등으로 제공될 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 콩 식물세포 유래 엑소좀을 TEM(transmitted electron microscopy)으로 촬영한 사진이다.

본 발명자들은 동물세포 유래의 엑소좀의 안전성 문제를 해결하고 피부상태 개선에 보다 효과적인 물질을 탐색한 결과, 콩 식물세포 유래 엑소좀을 이용하여 피부노화 억제, 피부상태 개선 등의 피부와 관련된 전임상적 평가를 수행하고 그 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 콩잎에 상처를 내고 암배양하여 콩 식물세포를 유도하고, 고체상태에서 계대배양 후 액체배양하여 콩 식물세포 배양액을 준비하고 상기 배양액을 원심분리한 후 엑소좀을 추출하여, 콩 식물세포 유래 엑소좀이 피부에 미치는 영향을 확인하였다(실시예 1 및 2 참조).

먼저, 본 발명자들은 콩 식물세포 유래 엑소좀의 안정성을 확인하기 위하여 각질형성세포에 농도별 콩 식물세포 유래 엑소좀을 처리하고 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 콩 식물세포 유래 엑소좀은 모든 농도에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 이는 콩 식물세포 유래 엑소좀이 피부 자극 유발 가능성이 매우 낮고 안전한 물질로서 화장료 조성물 적용에 안전함을 의미한다(실험예 1 참조).

이어서, 본 발명자들은 콩 식물세포 유래 엑소좀의 피부 보호 효과를 확인하고자 하였다. 자외선은 MPPs을 활성화시켜 콜라겐 분해를 유도할 뿐만 아니라 세포사멸을 유도한다. 또한, 청색광(blue light)는 가시광선 중에서 파장이 가장 짧고 강한 에너지를 갖고 있다. 이에, 자외선과 청색광을 각질형성세포에 조사하고 콩 식물세포 유래 엑소좀을 농도별로 처리한 후 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, 콩 식물세포 유래 엑소좀 처리 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가함을 확인할 수 있었다. 이로부터, 콩 식물세포 유래 엑소좀은 자외선 및 청색광으로부터 세포를 보호하여 자외선 및 청색광에 의한 세포사멸을 감소시킬 수 있음을 의미한다(실험예 2 및 3 참조).

피부장벽(skin barrier)는 표피이 가장 바깥쪽인 각질층에 위치하여 외부로부터 피부를 보호하는 물리적 방어벽 역할을 수행하고, 수분 손실을 방지하는 수분장벽, 및 항균 펩타이드(antimicrobial peptide) 분비를 통한 화학적 장벽의 기능을 수행한다. LL37(CAMP, Cathelicidin-related antimicrobial peptides) 및 hBD-2(human β-Defensin-2)는 항균 펩타이드로 피부장벽에서 세균의 침투를 예방한다. 또한, 필라그린(filaggrin)은 표피의 케라틴 결합 단백질로서 각질세포의 막단백질 결합에 관여하여 피부장벽의 유지 및 강화에 기여한다.

본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 콩 식물세포 유래 엑소좀을 처리한 각질형성세포에서 LL37, hBD-2, 및 필라그린의 발현 증가를 확인하였는바, 콩 식물세포 유래 엑소좀은 피부장벽을 강화하여 피부를 보호할 수 있음을 알 수 있다(실험예 4 및 7 참조).

LEA(Late embryogenesis abundant) 단백질은 외부 환경 스트레스로부터 세포를 보호하는 것으로서 LEA 단백질의 발현이 증가할수록 세포의 환경 스트레스에 대한 내성이 높다고 볼 수 있다. 본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 콩 식물세포 유래의 처리 농도 의존적으로 LEA 단백질의 발현량을 증가시켜 세포의 환경 스트레스에 대한 내성 증진 효과를 가짐을 확인할 수 있었다(실험예 6 참조).

한편, 아쿠아포린 (aquaporine: AQP)은 세포 내로 물 분자를 능동적으로 수송하는 막단백질이며, 그 중에서 아쿠아포린-3은 물과 글리세롤을 선택적으로 통과시키는 단백질의 일종으로서 피부 보습과 상처 치유에 중요 역할을 수행하고, 상술한 필라그린(filaggrin)은 피부장벽의 유지 및 강화 이외에도 보습기능을 수행한다.

본 발명자들은 구체적인 실험을 통해 콩 식물세포 유래 엑소좀이 AQP-3 및 filaggrin의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, 콩 식물세포 유래 엑소좀은 농도 의존적으로 상기 유전자의 발현을 증가시킴을 확인하였으며, 이로부터 콩 식물세포 유래 엑소좀이 피부보습 및 피부장벽 강화 효과가 있음을 알 수 있다(실험예 7 참조).

또한, 본 발명자들은 콩 식물세포 유래 엑소좀이 진피층의 주요 구조 단백질인 콜라겐의 생합성을 유도하는지 확인한 결과, 콩 식물세포 유래 엑소좀은 농도의존적으로 콜라겐의 합성량을 증가시킴을 알 수 있었다(실험예 8 참조). 이로부터, 콩 식물세포 유래 엑소좀이 피부탄력 증진 및 주름개선에 기여할 수 있음을 알 수 있다. 한편, 상처 부위에서 콜라겐의 생성 증가는 상처 치료에 도움이 된다.

또한, 본 발명자들은 콩 식물세포 유래 엑소좀과 헤모글로빈을 혼합하여 헤모글로빈 침전 정도를 통해 모공 축소 효과를 확인하고자 하였다. 그 결과, 콩 식물세포 유래 엑소좀의 농도 의존적으로 헤모글로빈의 침전이 증가하였고, 이를 통해 콩 식물세포 유래 엑소좀에 우수한 모공수축 효과가 있음을 알 수 있었다(실험예 9 참조).

멜라닌(melanin)은 기미나 주근깨를 유발하는 색소로 티로시나아제(tyrosinase)는 멜라닌 색소의 형성에 기여한다. 본 발명자들은 콩 식물세포 유래 엑소좀의 미백 효과를 확인하기 위하여 콩 식물세포 유래 엑소좀의 티로시나아제 활성 억제 효과를 확인하였다. 그 결과, 식물세포 유래 엑소좀은 농도 의존적으로 티로시나아제의 활성을 효과적으로 억제하여 미백효과가 있음을 알 수 있었다(실험예 10 참조).

한편, 피부의 온도가 높아지면 열로 인해 수분이 증발되어 콜라겐이 감소되고 콜라겐을 분해하는 MMPs가 증가하여 피부의 탄력이 저하되는 열노화가 발생한다. 본 발명자들은 농도를 달리하여 콩 식물세포 유래 엑소좀을 포함시켜 화장수를 제조하고 피부에 적용하여 쿨링 효과를 확인한 결과, 콩 식물세포 유래 엑소좀의 농도 의존적으로 피부 진정 효과를 나타내어 콩 식물세포 유래 엑소좀에 열노화 방지 효과가 있음을 알 수 있었다(실험예 11 참조).

아울러, 본 발명자들은 열노화 방지 효과 확인실험의 화장수를 이용한 패널테스트 결과 콩 식물세포 유래 엑소좀의 피지 억제 효과와 여드름 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다(실험예 12 및 13 참조).

또한, 본 발명자들은 콩 식물세포 유래 엑소좀이 콜라겐 생성 증진 이외에도 상처 치유에 미치는 영향을 확인하기 위하여 wound healing assay를 수행하였다. 그 결과, 콩 식물세포 유래 엑소좀은 세포의 증식 및 이동을 촉진시켜 상처 치유에 효과가 있음을 알 수 있었다(실험예 14 참조).

한편, COX-2(Cyclooxygenase-2)과 iNOS(Inducible nitric oxide synthase)는 염증에 관여하는 인자로서, 본 발명자들은 자외선으로 COX-2 및 iNOS의 발현 증가를 유도하고 콩 식물세포 유래 엑소좀을 처리하여 상기 2종 유전자의 발현 증가 정도가 비처리군과 비교하여 현저하게 감소됨을 확인하였다. 상기 결과로부터 콩 식물세포 유래 엑소좀은 염증 억제 효과가 있음을 알 수 있으며, 이로부터 여드름 개선에 상기 엑소좀을 이용할 수 있다(실시예 15 참조).

또한, 본 발명자들은 콩 식물세포 유래 엑소좀은 피부세포의 자가 포식 반응을 활성화 시키고 에너지 증진 효과가 있음을 확인하였는바, 콩 식물세포 유래 엑소좀은 건강한 피부 유지를 위해 이용될 수 있다.

상기로부터 본 발명자들은 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 피부노화 예방 또는 개선의 용도, 피부상태의 개선 용도, 피부보호, 상처 치료 및 항염증의 용도에 제공할 수 있다.

본 발명에서 피부노화는 시간 의존성 자연노화에 의한 내인성 노화와 자외선, 바람, 온도, 공해(황사, 미세먼지 등), 자외선 등에 의한 외인성 노화를 포함하며, 내인성 노화는 피부탄력 저하 및 주름 생성을 포함한다.

또한, 본 발명에서 피부상태 개선은 피부의 탄력 증진, 미백, 보습, 쿨링효과에 의한 피부진정, 모공축소, 피지분비감소, 및 여드름 예방 또는 개선을 포함한다.

본 발명의 콩 식물세포 유래 엑소좀은 청색광 및 자외선으로부터 세포를 보호하고, LEA 단백질의 발현을 증가시켜 환경 스트레스에 대한 세포 자체의 저항력을 증가시킬 수 있으며, 콜라겐 생성을 증가 피부의 내인성 및 외인성 노화를 예방 또는 개선하고 피부를 보호할 수 있다. 또한, 본 발명의 콩 식물세포 유래 엑소좀은 피부세포의 자가포식을 활성화시키고 피부장벽을 유지 및 강화시켜 피부를 보호하고 건강한 피부 상태 유지에 기여할 수 있다.

본 명세서에서 노화의 예방은 노화를 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 노화의 개선은 노화의 증상 정도를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 엑소좀(exosome)은 엔도좀(endosome)에서 기원한 미세소포체(microvesicle)로서, 콩 식물세포에서 분비되는 막 구조의 소포체(vesicle)이다.

본 발명의 화장료 조성물은 콩 식물세포 유래 엑소좀 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분을 포함할 수 있으며, 그 비제한적인 예로는 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료가 있으며, 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 콩 식물세포 유래 엑소좀은 wound healing assay에서 세포의 증식 및 이동을 증가시켜 상처 치유에 효과적인바, 상처 치유를 목적으로 약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있으며, 자외선에 의한 염증인자의 발현 감소 효과로부터 염증 예방 또는 완화를 위한 목적으로 약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 제형을 가질 수 있다.

상기 피페로닐산을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 피하, 정맥, 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 피부에 도포하여 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[실시예]

실시예 1: 콩 식물세포 유도

본 발명에 사용된 콩잎(제주자원식물연구소에서 구입)을 70 % 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 다시 소독액 (30 % 락스 + Tween 20)으로 20분 소독한 후 멸균수로 3회 수세하여, 콩의 잎을 날카로운 칼을 이용하여 단번에 상처를 내어 1 mg/L 2,4-D, 3 % Sucrose 및 agar 8 g/L 가 포함된 기본 MS(Murashige and Skoog) 배지 (Duchefa 社, Cat No. M0221)에서 25 ℃, 습도 70 %의 생장상 조건으로 암배양하여 초기 콩 식물세포를 유도하였다. 배지는 1 N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 고체상태에서의 계대배양은 2주간으로 진행하였고, 액상 대량배양은 온도 조건 23±2 ℃, 습도 70 % 배양실 조건에서 20 L 생물반응기(Bioreactor)(㈜삼성과학 社)에 공기공급량 0.1 vvm 정도로 5주간 배양하여 콩 식물세포 배양액을 준비하였다.

실시예 2: 콩 식물세포배양액 유래의 엑소좀 분리

실시예 1과 같이 분리된 콩 식물세포 배양액을 1000g에서 10분, 3000g에서 20분, 10,0000g에서 40분동안 순차적으로 원심분리하고, 상층액만을 취하여 150,000g에서 90분간 다시 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액은 버리고 펠렛(pellet)을 취하여 엑소좀을 분리하였다. 그리고 pellet(엑소좀)을 1 ml의 PBS로 용해하여 준비하였다.

[실험예]

실험예 1: 세포 독성 확인 (MTT assay)

본 발명의 조성물이 피부 세포에서 독성을 일으켜 피부자극이 유발되는지 알아보기 위해, MTT assay를 진행하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포(keratinocyte, 각질형성세포), Detroit 세포(fibroblast, 섬유아세포)를 각각 10 % FBS(Fetal Bovine Serum), 1 % Antibiotic-Antimycotic이 함유된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium)과 함께 96-well plate에 분주하고, 5 % CO2, 37 ℃의 조건인 항온기에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 5 mg/mL MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 용액을 각 well에 4 μL씩 첨가하고, 4시간 동안 배양하여 반응시켰다. 배양액을 제거한 다음 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용액 100 μL씩 첨가하여 세포를 용해시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

구 분	처리농도 (%)	HaCaT 세포생존율 (%)	Detroit 세포생존율 (%)
대조군	-	100	100
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	102	98
	5	101	99
	10	99	98
	20	97	96

상기 표 1로 확인되는 바와 같이, 콩 식물세포 유래 엑소좀은 0.5~ 20 % 처리 농도에서 keratinocyte와 fibroblast 피부세포 내 독성을 보이지 않고, 자극이 없어 피부 자극 유발 가능성이 낮은 안전한 물질임을 확인하였다.

실험예 2: 자외선으로부터 피부세포 보호 효과 확인

HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 UVB를 조사하고, 정제수를 첨가한 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. UV 조사에 사용할 광원으로는 302 nm 파장의 자외선을 방출하는 ultraviolet crosslinker (Ultra-Violet Products 社, Cat No. CL-1000)을 사용하였다. 이어 자외선 유도에 의한 피부세포의 손상을 보호하는지 확인하고자 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

구분	자외선 조사여부	처리농도(%)	세포생존율 ( %)
대조군	-	-	100
대조군	+	-	49
콩 식물세포 유래 엑소좀		0.5	55
		5	59
		10	68
		20	70

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 콩 식물세포 유래 엑소좀의 처리 농도가 증가함에 따라 자외선을 조사한 대조군과 비교하여 세포 생존율(Cell Vialbility)가 증가함을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 청색광(Blue Light)에 의한 피부세포 보호 효과 확인

본 발명의 조성물이 사람이 볼 수 있는 가시광선 중 가장 파장이 짧고 강한 에너지를 갖고 있는 Blue Light의 조사로부터 피부세포를 보호하는지 알아보고자, 460 nm 파장을 방출하는 Topview 5450 SMD LED (ITSWELL 社, Cat No. IWS-L5056-VRI-K3)를 사용하여 세포생존율을 측정하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 460 nm 파장을 10 mJ/cm²로 조사하고, 정제수를 첨가한 대조군과 시험 물질인 조성물을 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 Blue Light 유도 후의 피부세포의 생존률을 측정하기 위해 MTT assay를 진행하였다.

구 분	Blue Light	처리농도 (%)	세포생존율 (%)
대조군	-	-	100
대조군	+	-	62
콩 식물세포 유래 엑소좀		0.5	75
		5	82
		10	89
		20	93

상기 표로 확인되는 바와 같이, 콩 식물세포 유래 엑소좀은 가시광선 영역대인 Blue Light 영역대의 빛을 특이적으로 반사시켜 차단하는 것이 가능하여 피부를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 4: 피부 면역 개선 및 방어력 증진 확인

본 발명의 조성물이 항균 효능을 가진 펩타이드 LL37(CAMP, Cathelicidin-related antimicrobial peptides) 및 hBD-2(human β-Defensin-2)의 활성을 통해 피부 면역과 방어력을 증진시키는 지 확인하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험 물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. LL37과 hBD-2의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다. RNA isolation과 cDNA 합성을 위해 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO 社, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, 10 μL stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird™ SYBR qPCR Mix (TOYOBO 社, Cat. QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen 社의 QuantiTect　primer assays (LL37; Cat. QT00010458, hBD-2; Cat. QT00204617)이며 시료의 LL37, hBD-2 mRNA 발현량은 GADPH (Cat. QT01192646)로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응 시킨 후에, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

구 분	처리농도 (%)	LL37 유전자 발현율	hBD-2 유전자 발현율
대조군	-	1	1
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	1.5	1.3
	5	1.8	1.7
	10	2.5	2.2
	20	2.9	3.1

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀은 피부세포에서 LL37과 hBD-2의 발현을 증가시켜 피부 면역과 방어력 증진에 기여하는 것을 확인하였다.

실험예 5: 자가 포식 활성 발현 확인

본 발명의 조성물의 세포 내 조절과정에서 불필요하거나 기능하지 않는 자신의 소기관이나 세포 구성성분을 자연적으로 분해하는 자가 포식 활성 효능을 알아보고자, 오토파지 형성에 관여하는 LC-3(Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3)의 발현양 변화를 조사하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험 물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. LC-3의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다. RNA isolation과 cDNA 합성을 위해 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO 社, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, 10 μL stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird™ SYBR qPCR Mix (TOYOBO 社, Cat. QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen 社의 QuantiTect　primer assays (LC-3; Cat. QT00055069)이며 시료의 LC-3 mRNA 발현량은 GADPH (Cat. QT01192646)로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응 시킨 후에, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

구 분	처리농도 (%)	LC-3 유전자 발현율
대조군	-	1
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	1.8
	5	2.2
	10	2.5
	20	2.9

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀은 피부세포에서 LC-3 발현을 증가시켜 자가 포식 활성화에 기여하는 것을 확인하였다.

실험예 6: LEA 발현 증가에 따른 항스트레스 효과 확인

LEA(Late embryogenesis abundant)는 발현 정도가 높을수록 스트레스에 대한 내성이 증가하여 세포 손상으로부터 보호하는 것으로 알려졌다. 이하 실험에서는 콩 식물세포 유래 엑소좀이 세포의 스트레스 내성 증진 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 콩 식물세포 유래 엑소좀 처리에 따른 LEA 단백질의 발현 변화를 관찰하였다.

구체적으로, HaCaT 세포를 6-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험 물질인 조성물을 세포에 처리하고, 이후 24시간 동안 세포를 추가 배양하고, LEA 단백질 발현양을 측정하기 위해 In-Cell ELISA Colorimetric Detection kit (Invitrogen 社, Cat No. 62200)를 사용하였다. 배양이 끝난 세포의 배지를 제거하고, 100 μL fixing solution으로 15분간 상온에서 배양하여 세포를 고정시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL의 Permeabilization solution을 넣고 15분간 상온에서 반응 시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL Quenching solution을 넣고 20분간 상온에서 반응 시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL Blocking solution을 넣고 30분간 상온에서 반응 시켰다. 용액을 제거하고 LEA 1차 항체 50 μL를 첨가하여 4 ℃에서 24시간 반응시켰다. 항체 제거 후 PBS로 세척하고, HRP conjugated 2차 항체 50 μL를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후 항체 제거하여 PBS로 세척을 한 뒤, 100 μL의 TMB substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후 100 μL stop solution (1 N H2SO4)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

구분	처리농도(%)	LEA Protein content (%)
대조군	-	100
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	103
	5	112
	10	123
	20	129

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀은 LEA 단백질의 발현양을 증가시켜 세포 손상을 보호함을 확인하였다.

실험예 7: 보습 및 피부장벽 개선 효과 확인

본 발명에 따른 조성물의 보습과 피부장벽 개선의 효능을 알아보고자, 수분/glycerol 수송체인 AQP3(Aquaporin 3)와 자연보습인자로 알려진 FLG(Filaggrin)의 발현양 변화를 알아보았다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. AQP3, FLG의 발현을 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다. RNA isolation과 cDNA 합성을 위해 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO 社, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, 10 μL stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird™ SYBR qPCR Mix (TOYOBO 社, Cat. QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen 社의 QuantiTect　primer assays (AQP3; Cat. QT00212996, FLG; Cat. QT02448138)이며 시료의 AQP3, FLG mRNA 발현량은 GADPH (Cat. QT01192646)로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응시킨 후에, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

구 분	처리농도 (%)	AQP3 유전자 발현율	FLG 유전자 발현율
대조군	-	1	1
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	1.2	1.3
	5	1.4	1.8
	10	2.3	2.2
	20	3.6	2.8

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀에 의하여 피부세포에서 AQP3과 FLG의 발현 증가를 확인하여 보습과 피부장벽 강화에 기여하는 것을 확인하였다.

실험예 8: 콜라겐 합성 증진 효과 확인

본 발명의 조성물이 주름 개선 효과가 있는지 알아보고자, 콜라겐 합성의 전구체인 PIP(Procollagen Type I C-Peptide)의 생합성양을 측정하였다. 이를 위하여 Detroit551 세포를 48-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 48시간 동안 추가 배양하였다. 이어 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 20 μL를 취해 PIP EIA Kit (Takara 社, Cat. MK101) 내 PIP 표준물질 20 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 또한 각 well에 첨가하여, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후 100 μL stop solution (1 N H2SO4)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

구 분	처리농도 (%)	콜라겐 합성능 (%)
대조군	-	100
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	108
	5	120
	10	125
	20	124

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀은 콜라겐의 생합성량을 증가시켜 주름 개선에 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실험예 9: 모공 축소 효과 확인

본 발명의 조성물이 모공 축소 효과가 있는지 알아보고자, 피부를 대신할 단백질로 헤모글로빈을 사용하여 시험하였다. 이를 위하여 1 mg/mL 헤모글로빈 용액 2 mL에 정제수를 첨가한 대조군과 시험물질인 조성물 및 양성대조군(Tannic acid)을 2 mL씩 가한 후, 30초 동안 진탕 혼합한 다음 3,500 rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 그 상등액 1 mL에 정제수 2 mL을 가하여 407 nm에서 흡광도를 측정하였다.

구 분	처리농도 (%)	헤모글로빈 침전 (%)
대조군	-	0
양성대조군	1	45
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	19
	5	28
	10	32
	20	35

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀에 의해 헤모글로빈의 침전률이 증가하여 간접적으로 모공 수축 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 10: Tyrosinase 활성 저해에 의한 미백효과 확인

본 발명에 따른 조성물의 미백 효과를 살펴보기 위하여, 멜라닌 형성에 중요한 역할을 하는 tyrosinase의 활성에 미치는 영향을 시험하였다. 96-well plate 각 well에 0.1 M Sodium phosphate buffer (pH 6.8) 50 μL와 50 μg/mL Mushroom tyrosinase를 20 μL씩 분주하고, 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험물질인 조성물 및 양성대조군(Kojic acid) 10 μL씩 첨가하였다. 그 후 1.5 mM L-Tyrosine을 각 well에 20 μL씩 넣고 혼합한 뒤, 37 ℃에서 1시간 동안 반응시키고 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.

구 분	처리농도 (%)	Tyrosinase 활성 저해율 (%)
대조군	-	0
양성대조군	200 ppm	55
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	24
	5	28
	10	30
	20	35

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀에 의해 Tyrosinase 활성 저해율이 증가하여, 간접적으로 미백 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 11: 피부 진정 효과 확인

본 발명에 의한 조성물을 적용한 에센스 제형의 피부 온도 감소율에 따른 피부 진정 효과를 알아보기 위하여, 피험자 25명의 전완부에 정사각형(2cm X 2cm)을 구획하고 제품을 각각 50 μL 양으로 도포한 뒤, 시험 전 20분간 직사광선에 노출시켰다. 측정은 컴퓨터 적외선체열감지기(Digital Infrared Thermographic Imaging; DITI)를 이용하여 0분(시료 도포 전), 5분(시료 도포 후), 10분(시료 도포 후) 간격으로 체열을 측정하고, 온도 감소율을 계산하였다.

구 분	처리농도 (%)	열 감소율 (%)
구 분	처리농도 (%)	적용 직후	5분 후	20분 후
대조군	-	7.5	3.4	1.1
콩 식물세포 유래 엑소좀	10	8.5	7.3	6.9
콩 식물세포 유래 엑소좀	20	9.2	8.6	8.1

그 결과, 대조군의 경우 시간이 흐름에 따라 피부의 열이 급격이 감소하였으나, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀에 의해서는 열 감소율이 지속적으로 유지되어 피부 진정 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 12: 피지 억제 효과 확인

본 발명에 의한 조성물을 적용한 에센스 제형의 피지 억제 효과를 확인하기 위하여, 피부 유분 측정기 (Sebum meter SM810)를 이용하여 피시험자 10명의 4주 후 피부의 피지분비량을 측정하였다. 시험은 22±2 ℃, 40±5 ％ humidity에서 이루어졌다. 지성 피부인 경우 측정값이 220 μg/cm²이상이고, 정상 피부인 경우 100∼220 μg/cm²이다.

구 분	처리농도 (%)	피부 유분량 (μg/cm²)
구 분	처리농도 (%)	0일 (사용 전)	4주 사용 후
대조군	-	231	225
콩 식물세포 유래 엑소좀	10	230	188
콩 식물세포 유래 엑소좀	20	232	164

그 결과, 대조군의 경우 4주 사용 후, 피지 유분량의 변화가 미비하였으나, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀에 의해서는 감소된 피부 유분량을 나타내어 피지 억제 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 13: 여드름 개선 효과 확인

본 발명에 의한 조성물을 적용한 화장수 제형의 여드름 개선 효과를 확인하기 위하여, 여드름이 발생한 남녀 10명을 대상으로 아침, 저녁으로 4주간 화장수를 얼굴 전체에 고르게 바르도록 하였다. 여드름 개선 효과의 판정은 실험에 참가한 본인이 느끼는 정도에 따라 하기 판정기준을 참고로 1-3점으로 시험 전 상태를 평가한 뒤 여드름 치유 효과를 평가하도록 하여 그 결과를 표에 나타내었다.

<시험 전 상태의 평가>

1 = 여드름 조금 있음 2 = 여드름 약간 있음 3 = 여드름 심함

<여드름 효과 판정>

- : 효과 거의 없음, + : 약간의 효과 있음, ++ : 많이 완화, +++ : 완전히 치유됨

구 분	0일 (사용 전)	2주 사용 후	4주 사용 후
피험자 01	3	+	++
피험자 02	2	-	++
피험자 03	2	++	++
피험자 04	2	+	++
피험자 05	1	-	+
피험자 06	2	-	++
피험자 07	1	+	+
피험자 08	2	-	+
피험자 09	3	++	++
피험자 10	2	+	+

그 결과, 2주, 4주 사용 후, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀에 의해서 대다수 피험자들에게서 여드름이 개선된 효과를 확인하였다.

실험예 14: 상처 치유 효과 확인

본 발명의 조성물이 세포 증식 및 이동성 촉진에 의한 상처 치유능이 있는지 알아보고자 Wound healing assay를 진행하였다. 이를 위하여 24-well plate 각 well에 wound healing assay 용 culture insert를 첨가하고, HaCaT 세포를 90 % < confluence로 insert 내에 70 μL씩 분주한 후 24시간 배양하였다. 이후 insert를 제거하여 0시간대에 세포 양상을 현미경 사진으로 획득하고, 정제수를 첨가한 대조군과 시험물질인 조성물 및 양성대조군(EGF)을 세포에 처리하였다. 16시간 동안 추가배양 후, 배지를 제거하고 4 % PFA(Paraformaldehyde)을 넣고 15분간 상온에서 반응시켰다. 고정 과정 후에 PBS로 3번 washing 하고, 16시간동안 추가 배양 후에 세포 양상을 현미경 사진으로 측정하였다. 치유면적의 증가율은 Image J라는 프로그램을 통해 0시간 대 및 16시간 대 세포 간격 간 면적을 측정하여 산정하였다.

구 분	처리농도 (%)	치유면적 증가율 (%)
대조군	-	15
양성대조군	100 ng/mL	34
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	18
	5	25
	10	28
	20	30

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀 처리에 의해 치유면적율이 증가하여 간접적으로 상처 치유에 기여하는 것을 확인하였다.

실험예 15: 염증 억제 효과 확인

본 발명의 조성물이 피부 염증 억제 효능이 있는지 알아보고자, 염증 반응에 관여하는 COX-2(Cyclooxygenase-2), iNOS(Inducible nitric oxide synthase)의 발현양 변화를 조사하였다. 이를 위하여 HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 UVB 조사를 통해 염증반응을 유도하고, 정제수를 첨가한 대조군과 시험 물질인 조성물을 세포에 처리하여 4시간 동안 추가 배양하였다. COX-2, iNOS의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다. RNA isolation과 cDNA 합성을 위해 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO 社, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, 10 μL stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird™ SYBR qPCR Mix (TOYOBO 社, Cat. QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen 社의 QuantiTect　primer assays (COX-2; Cat. QT00040586, iNOS; Cat. QT01323189)이며 시료의 COX-2, iNOS mRNA 발현량은 GADPH (Cat. QT01192646)로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응 시킨 후에, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

구 분	자외선	처리농도 (%)	COX-2 유전자 발현율	iNOS 유전자 발현율
대조군	-	-	0.2	0.1
대조군	+	-	1	1
콩 식물세포 유래 엑소좀		0.5	0.8	0.8
		5	0.5	0.6
		10	0.4	0.5
		20	0.3	0.4

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀은 피부세포에서 자외선이 조사된 대조군과 비교하여 COX-2와 iNOS의 발현을 감소시켜 염증 반응의 완화 효과를 확인하였다.

실험예 16: 세포의 에너지 증진 효과 확인

본 발명의 조성물이 세포 에너지 증진 효과가 있는지 알아보고자 세포가 대사과정에서 방출하는 ATP의 활성 정도를 측정하였다. 이를 위하여 Detroit 세포를 12-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험 물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 세포를 추가 배양하였다. 상기 과정을 통해 배양한 세포의 용해물을 희석한 일부 50 μL를 취해 ATP assay kit (Abcam 社, Cat. ab83355) 내 ATP 표준물질 50 μL와 함께 각각 96-well plate에 넣고 50 μL의 ATP reaction mix 용액을 또한 각 well에 첨가하여 차광한 상태에서 30분간 실온 반응시켰다. 반응이 끝난 후 570 nm에서 흡광도를 측정하고, ATP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 ATP 양을 산정하였다.

구 분	처리농도 (%)	ATP 함량 (%)
대조군	-	100
콩 식물세포 유래 엑소좀	0.5	103
	5	110
	10	119
	20	122

그 결과, 본 발명의 조성물인 콩 식물세포 유래 엑소좀 처리 농도에서 ATP 양이 증가하여 에너지 활성 증진 효과가 있음을 확인하였다.

[제조예]

본 발명의 콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.

제조예 1: 화장수

다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
글리세린	5.0
디프로필렌글리콜	3.0
히아루론산	0.5
폴리옥시에틸렌 경화피마자유	0.1
폴리에틸렌 올레일에틸	0.1
에탄올	5.0
방부제	0.15
항료	적량
착색료	적량
콩 식물세포 유래 엑소좀	10.0
정제수	to 100

제조예 2: 에센스

다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	1.0
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스쿠알란	5.0
이소세틸옥타노에이트	3.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	8.0
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	0.2
카르복시폴리머	0.22
트리에탄올아민	0.25
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
콩 식물세포 유래 엑소좀	10.0
정제수	to 100

제조예 3: 로션

다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	0.8
자기유화형모노스테아린산	1.0
밀납	0.5
스테아린산	0.5
유동파라핀	7.0
스쿠알란	5.0
마카데미아오일	3.0
이소세틸옥타노에이트	2.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	0.5
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
카르복시폴리머	0.12
트리에탄올아민	0.15
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
콩 식물세포 유래 엑소좀	10.0
정제수	to 100

제조예 4: 크림

다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

원 료 명	중량 %(w/w)
세토스테아릴알코올	3.0
자기유화형모노스테아린산	1.5
친유형모노스테아린산	1.5
밀납	0.5
유동파라핀	8.0
스쿠알란	7.0
이소세틸옥타노에이트	4.0
정제호호바유	4.0
디메틸실록산	0.3
모노스테아린산소르비탄	1.0
모노스테아린산폴리에틸렌글리콜	1.2
글리세린	6.0
프로필렌글리콜	4.0
베타인	4.0
산탄검	0.06
트리에탄올아민	0.10
방부제	0.25
향료	적량
착색료	적량
콩 식물세포 유래 엑소좀	10.0
정제수	to 100

제조예 5: 젤

다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량 %(w/w)
글리세린	4.0
프로필렌글리콜	4.0
에탄올	10
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.1
카르복시폴리머	0.30
트리에탄올아민	0.30
방부제	적량
향료	적량
착색료	적량
콩 식물세포 유래 엑소좀	10.0
정제수	to 100

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부노화 예방용 또는 피부보호용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부노화는 내인성 노화 및/또는 외인성 노화인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 자외선 또는 청색광에 의한 세포사멸을 감소시키는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 LL37(CAMP, Cathelicidin-related antimicrobial peptides) 및 hBD-2(human β-Defensin-2)의 발현을 증진시켜 피부의 세균감염을 예방하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 필라그린(filaggrin)의 발현을 증진시켜 피부장벽을 강화시키는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 LEA(Late embryogenesis abundant) 단백질의 발현을 증진시켜 환경 스트레스에 의한 피부노화를 억제하는 것이며,
상기 환경 스트레스는 자외선, 공해, 바람, 또는 온도인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 자외선에 의한 COX-2(Cyclooxygenase-2) 및 iNOS(Inducible nitric oxide synthase)의 발현 증가를 억제시키는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부상태 개선용 화장료 조성물로서,
상기 피부상태 개선은 피부탄력 증진, 보습, 미백, 피부진정, 모공축소, 피지분비감소, 및/또는 여드름 개선인 화장료 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 콜라겐 합성을 증진시키는 것인, 화장료 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 아쿠아포린-3(Aquaporin-3) 및 필라그린(filaggrin)의 발현을 증진시키는 것인, 화장료 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 저해하는 것인, 화장료 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 COX-2(Cyclooxygenase-2) 및 iNOS(Inducible nitric oxide synthase)의 발현을 억제하는 것인, 화장료 조성물.
콩 식물세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 세포 독성이 없으면서 상처 치료 또는 항염증용 약학적 조성물.
(a) 콩잎에 상처를 내고 암배양하여 콩 식물세포를 유도하는 단계;
(b) 상기 콩 식물세포를 고체상태에서 계대배양하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계 후, 액체상태에서 대량배양하는 단계; 및
(d) 상기 콩 식물세포 배양액을 순차적으로 원심분리 후 높은 RPM에서 다시 원심분리하여 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는,
콩 식물세포 유래 엑소좀 제조방법으로서,
상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부노화 예방, 피부보호, 피부상태 개선, 상처 치료 또는 항염증용인 엑소좀 제조방법.