KR20190018318A - 애플민트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 저색소증 개선 및 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 조성물 - Google Patents

애플민트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 저색소증 개선 및 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 애플민트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 저색소증 개선 및 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 Nrf-2 (Nuclear erythroid 2-related factor) 활성화를 촉진함으로써 피부 저색조증을 개선시킬 뿐만 아니라 자외선으로부터 피부를 보호하는 효능을 가진다. 또한, 애플민트 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

Description

애플민트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 저색소증 개선 및 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 조성물{A composition for improving skin hypochromatism and protecting the skin from ultraviolet comprising apple mint extracts}
본 발명은 애플민트 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 저색소증 개선 및 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Nrf-2 (Nuclear erythroid 2-related factor) 활성화를 촉진함으로써 피부 저색조증을 개선 및 예방하고, 자외선으로부터 피부를 보호할 수 있는 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부환경과 몸의 장벽역할을 하는 기관으로써, 외부적인 또는 내부적인 스트레스요인에 의해서 항상 노출되어있다. UV, 제노바이오틱스(xenobiotics), 알러젠, 온도 등에 의해서 발생하는 산화스트레스에 의해 ROS(Reactive Oxygen Species)가 과도하게 생성되면, 레독스(redox) 상태의 불균형을 초래되고, 지질, 단백질(효소), 및 DNA에 산화적 손상이 일어나고, 이로 인해 세포사멸 및 세포대사의 기능 저하가 초래된다(Scharfetter-Kochanek et al., Biol Chem. 1997;378:1247-1257). 이들에 의해서 피부 노화, 염증반응을 촉진되고 더 나아가 피부암으로 발달될 수 있다(Wlaschek et al., J Photoch Photobio B. 2001;63:41-51).
피부는 산화스트레스의 방어기작으로써 각질세포를 포함한 표피세포 전반에 주로 존재하는 세포질 보호기작 유전자인 Nrf-2(Nuclear erythroid 2-related factor)의 발현을 조절한다(Ling al., J Immunol. 2004;173:3467-3481.). Nrf-2는 일정한 수준의 양이 생합성은 되지만, Nrf-2-Keap1-Cul3 complex에 의해서 세포질에서 그 양이 조절된다. Keap1에 의해서 부착되고 Cul3에 의해서 분해되어 Nrf-2 양이 적은 수준이다. 하지만, 산화스트레스 조건하에서는 Keap1의 잔기에 산화가 유도되고, 이로 인해 Nrf-2-Keap1-Cul3 complex에서 Nrf-2가 분리되어 안정화됨으로써 핵에 축적될 수 있고, Maf protein과 결합하여 타켓 유전자의 발현을 촉진하게 된다.
Nrf-2는 ARE(antioxidant responsive element) 서열을 가진 phase II 디톡스 효소인 GST (glutathione S-transferase), NQO1 (quinone reductase NAD(P)H), UST (UDP-glucuronosyltransferases), EPHX (epoxide hydrolase), GCL (c-glutamylcysteine ligase), HO-1(heme oxygenase-1), GR(glutathione reductase), TrxR(thioredoxin reductase), CAT(catalase), SOD(superoxide dismutase) 등의 발현을 촉진시킨다(Kensler et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2007;47:89-116). 이를 통해, 산화스트레스로부터 피부세포를 보호할 수 있게 된다.
Nrf-2　활성화는 UV로부터 피부세포를 보호할 수 있다. 마우스에서 Nrf-2를 과발현시키면, UVB 조사에 의한 세포사멸에 대한 저항성이 높아진다(Kokot et al., Endocrinology. 2009;150:3197-3206). 각질세포주인 HaCaT은 퀘르세틴, 켐프페롤(kaempferol)과 같은 플라보노이드를 처리하면 UV에 대한 보호작용이 일어나는데, 이때 Nrf-2의 양이 증가하여 세포 생존성을 높여준다(Kang et al., Exp Mol Med. 2008;40:208-219). 브로콜리나 양배추에서 추출된 SFN(sulforaphane)은 Keap1의 변형을 통해 Nrf-2-Keap1-Cul3 complex로부터 활성화된 Nrf-2를 세포질에 방출시킴으로써, 항산화효소인 NQO1, HO-1, cGCS의 발현을 증가시킨다고 각질세포 HaCaT 실험에서 알려졌다(Saw et al., Mol Carcinog. 2011;50:479-486). 마우스 세포주 SKH-1에서 UV 조사에 의해 유도된 암 발병률이 SFN에 의해서 감소된다고 알려졌다(Dickinson et al., Can Res. 2009;69:7103-7110). 또한, 임상연구에서 SFN을 처리후에 UV를 조사하면 홍반이 90%이상 감소하는 것으로 조사되었다(Talalay et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104:17500-17505).
최근 연구에 의하면, Nrf-2-ARE 기전은 산화스트레스 상황에서 피부 대사과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. Nrf-2-ARE 기전은 산화스트레스를 감지하여 phase II 디톡스 효소들의 발현을 높여준다. 멜라노세포에서는 산화스트레스에 의해서 백반증이 발생한다고 알려져 있다. 산화스트레스 방어기작인 Nrf-2가 멜라노세포의 대사에도 중요한 역할을 한다. 백반증을 가진 사람들은 Nrf-2의 발현이 낮은 것으로 조사되었고, Nrf-2의 활성에 따라서 백반증의 정도의 차이가 있다고 보고되었다(Amin et al., BMC Microbiol. 2013;13:158, Jian et al., J Invest Dermatol. 2014;134(8):2221-30). 이러한 백반증의 정확한 원인은 밝혀져 있지 않으나 심리적인 스트레스, 정신적인 충격, 일광화상, 사고나 수술 등의 물리적인 외상을 받은 후, 임신, 내부 장기 이상이나 기타 질병 후에 생긴 경우가 많이 보고되어 있다. 활성산소인 과산화수소(hydrogen peroxide ; H2O2)가 역시 백반증의 원인으로 알려져 있다(Schallreuter et al., Exp Dermatol. 2008;17(2):139-40). 멜라닌세포의 칼슘 항상성과 카테콜아민 생성 증가 등으로 표피 내의 과산화수소가 증가하며, 백반증 환자에서는 과산화수소를 제거하는 분해효소(catalase)가 부족해 멜라닌 세포가 활성산소에 쉽게 손상되어 면역학적인 공격대상이 된다(Schallreuter et al., J Invest Dermatol 97:1081-5, 1991).
한편, 애플민트(Mentha Suaveolens)는 다년생에 속하는 허브식물이며, 민트속에 속한 박하 중 하나이다. 이 식물은 다양하게 이용되어 왔는데, 통증완화와 쿨링효과를 가지고 있어 벌레 물린 곳이나 벌에 쏘였을 때 사용되었다. 또한, 뇌를 맑게 해주는 효과가 있어서 간질증상 완화에 사용되었다. 애플민트 잎은 소화를 촉진시켜 복통이나 장문제가 있을 때 차로 복용을 한다. 또한, 항암효과가 있는 것으로 알려져 있다. 잎에는 각종 이온, 칼륨, 칼슘, 비타민 A, C등을 함유하고 있다. 그러나 지금까지, 애플민트가 Nrf-2-ARE 기전을 활성화하는지에 관련된 연구는 진행된 바는 없다.
이에 본 발명자들은 애플민트에 대한 Nrf-2-ARE 기전에 있어서의 활성여부를 관찰한 결과 애플민트가 Nrf-2 활성화를 촉진시킬 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 Nrf-2 (Nuclear erythroid 2-related factor)의 활성화를 촉진함으로써 피부 저색조증 개선 효과를 가지고 자외선으로부터 피부 보호효과를 가질 뿐만 아니라 인체 안전성이 우수한 물질을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 저색소증 개선 또는 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에서 애플민트 추출물을 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.
본 발명의 애플민트 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 애플민트 추출물은 애플민트를 건조한 다음 분말화하여 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 이용하여 추출한 다음, 감압 여과하여 제조할 수 있다. 이 때 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용하며, 더욱 바람직하게는 70% 에탄올을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 애플민트 추출물은 조성물 총 중량을 기준으로 하여 0.00001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 30 중량%, 가장 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 애플민트 추출물의 함량이 0.00001 중량% 미만일 때는 피부 저색조증 개선효과 및 자외선으로부터 피부를 보호하는 효과가 미약하고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과증가가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 저색소증 개선을 위한 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 세포독성이 거의 없으면서 자외선으로부터 피부세포를 보호하며, 특히 자외선으로부터 피부를 보호하는 기능을 하는 멜라닌 세포를 활성화시켜 피부보호 효능을 발휘하며, 자외선으로부터 보호효과는 통상적인 피부 보호용도(피부진정효과, 피부흑화유도 효과, 피부암예방효과)를 포함하는 것으로 해석된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "저색소증 개선"은 멜라닌 세포나 멜라닌 색소 합성기능에 이상이 생겨 멜라닌 생성이 감소되어 야기되는 백반증, 백모 등의 피부 트러블을 개선하는 작용을 의미한다.
본 발명의 피부 저색소증 개선을 위한 조성물에서, 애플민트 추출물은 인간 유래 멜라닌 세포의 멜라닌 생성을 증가시키고, 안정성이 높으며, 피부 자극 유발 등의 부작용이 거의 없다.
본 발명의 구체적인 하나의 실시양태에 따르면, 애플민트 추출물은 Nrf-2 활성화를 촉진함으로써 피부 저색소증을 개선할 수 있으며, 자외선에 의해 유도된 각질 형성세포의 세포사를 억제시킬 뿐만 아니라 백반증 및 백모 예방 효과가 우수하다.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서는 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 애플민트 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서는 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 애플민트 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서는 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 애플민트 추출물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 애플민트 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 애플민트 추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 Nrf-2 (Nuclear erythroid 2-related factor) 활성화를 촉진함으로써 피부 저색조증을 개선시킬 뿐만 아니라 자외선으로부터 피부를 보호하는 효능을 가진다. 또한, 애플민트 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 각질형성세포(Human Keratinocyte)에서 애플민트 추출물의 Nrf-2 활성 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 애플민트 추출물 제조
애플민트 지상부를 채취하여 이물질 및 불순물이 완전히 제거되도록 깨끗이 세척한 후, 원물 40 g에 정제수 2 L를 넣고 멸균기에서 열수추출하였다. 상층액은 농축기를 이용하여 농축한 뒤, 동결건조하여 분말화하였다. 분말화된 추출물을 100 mg/mL의 농도로 멸균된 증류수에 녹인 뒤, 0.2 μm 공극크기의 수용성 시린지 필터(syringe filter)를 거친 뒤 실험에 사용하였다.
<실시예 2> Nrf-2 활성시험
Nrf-2 전사인자 활성을 측정하기 위하여, Nrf-2가 결합하는 프로모터의 ARE (Antioxidant response elements)에 루시퍼라제 유전자가 함유된 ARE-LUC 벡터(Promega, Madison, WI, USA)를 삽입한 각질형성세포(Human Keratinocyte) HaCaT 세포주를 이용하였다. HaCaT 세포는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신과 200 μg/ml 하이그로마이신-B 가 포함된 DMEM 배지가 들어있는 60 mm 배양접시 (Culture dish)에 35 X 104 Cell을 접종하여 5 % CO2, 37℃ 조건의 배양기에 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 1% FBS가 포함된 DMEM 배지에 50 μg/ml으로 희석시킨 실시예 1의 애플민트 추출물을 처리하고 24시간 배양하였다.
실험은 상업적으로 판매되는 루시퍼라제 분석 키트(Promega, E1500)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 애플민트 추출물 처리 24시간 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 뒤 세포 배양 용리액 (Promega, E153A)을 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물은 12,000g, 4℃ 조건에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 이용하였다.
수득된 상층액 20 μl 와 루시퍼라제 분석 기질 100 μl를 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더기 (Infinite f200, Tecan)를 이용하여 형광세기를 측정하였다. 양성 대조군으로는 삼차뷰틸하이드로퀴논(t-butylhydroquinone, tBHQ) 3uM을 처리한 HaCaT 세포를 사용하고 음성 대조군으로는 D.W를 처리한 HaCaT 세포를 사용하였다. 그 결과를 하기 도 １에 나타내었다.
도 1은 각질형성세포(Human Keratinocyte)에서 애플민트 추출물의 Nrf-2 활성 촉진 효과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 애플민트 추출물 50 μg/ml을 처리한 실험군이 음성 대조군에 비하여 Nrf-2 활성이 약 4배 증가됨을 확인하였다.
<실시예 ３> 애플민트　추출물의　자외선 보호효과
애플민트　추출물이　피부내　항산화　효소를　활성화시켜　자외선에 의해 유도되는 세포독성을 예방할 수 있는지 세포생존력 시험을 통해 평가하였다.
각질형성세포는 DMEM 기본배지에 페니실린-스트렙토마이신 및 혈청으로 구성된 배지 내에서 배양하였다. 12-웰 플레이트에 well당 1 X 105 개로 접종한 후 5 % CO2, 37℃ 하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 애플민트　추출물을　농도별로　처리하였다. 처리 24시간 후 배양액을 PBS로 바꾸어주고 자외선 (UVB 20mJ)을 조사하였다. 자외선 조사 후 배양액을 다시 애플민트 추출물이 포함된 DMEM 배지로 바꾸어주고 24시간을 더 배양하고 배양 마지막 날 MTT assay를 이용해 세포생존력을 측정하였다. 애플민트　추출물의 세포 보호효과는 하기 표１에 나타내었다.
시료 처리 농도 (%) 무처리군 기준 세포생존력
무처리군 - 100
UVB 20 mJ 54
UVB+ 애플민트추출물 10　ppm 52
50 ppm 67
100 ppm 77
상기 표 1에서 보듯이, 애플민트 추출물은 자외선에 의해 유도된 각질형성 세포의 세포사를 처리농도 의존적으로 억제시키는 효과를 보였다.
< 실시예 ４> 애플민트　추출물의　백반증　예방효과　
본 실험에서는 멜라닌세포에서 H2O2에 의해 유도된 멜라닌 생성양　감소를 애플민트 추출물이 억제할 수 있는지 멜라닌　측정시험을 통해 알아보았다. 인간 표피 멜라닌세포(Human epidermal melanocytes)를 6-well plate에 well당 2X 105 개로 접종한 후 5 % CO2, 37℃ 하에서 세포가 well 바닥에 약 80 % 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 H2O2 200μM과 애플민트 추출물을 농도별로 배지에 처리한 후 5% CO2, 37℃ 하에서 ５일간 배양하였다. 배양 마지막 날 배지를 제거하고 PBS(phosphated buffer saline)로 세척한 후, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 혈구계수기(hematocytometer)를 이용하여 세포수를 측정한 후 각 처리 그룹별 세포수를 동수로 맞추어 2 mL 튜브에 나눠 담은 뒤 5,000 내지 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 펠렛을 얻었다. 이 세포 펠렛을 60℃에서 건조한 후, 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕를 넣어 60 ℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다.
이어서, 이 액을 가지고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정 수당 멜라닌 양을 구한　후　백분율로　환산하였다. 그 결과를 하기 표 ２에 나타내었다.
시료 처리 농도 (%) 무처리군 기준 멜라닌　양
무처리군 - 100
H2O2 ２00　uM 63
H2O2 + 애플민트추출물 10　ppm 69
50 ppm 74
100 ppm 82
상기 표 2에서 보듯이, 애플민트　추출물은 H2O2에 의해 감소된 멜라닌 생성량을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있다.
<실시예 ５> 애플민트 추출물의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험
애플민트 추출물이 인체피부에 안전한지 확인하기 위하여, 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다. 이를 위해 피부누적 자극시험을 실시하였다. 애플민트 추출물을 각각 0.1%, 0.5% 및 1%를 첨가한 제형을 제조하고, 이를 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗 팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적 첩포를 시행하여 애플민트 추출물이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 첩포 방법은 핀 챔버 (Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부외용제를 15 ㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 수학식 1을 이용하여 점수화하였으며, 그 결과를 하기 표 ３에 나타내었다.
Figure pat00001
반응도에서 ±는 1점, +는 2점 및 ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.
시험물질 반응이 나타난 피검자 수 평균
반응도
1주 2주 3주
1차 2차 3차 4차 5차 6차 7차 8차 9차
± ＋ ＋＋ ± ＋ ＋＋ ± ＋ ＋＋ ± ＋ ＋＋ ± ＋ ＋＋ ± ＋ ＋＋ ± ＋ ＋＋ ± ＋ ＋＋ ± ＋ ＋＋
대조군
(스쿠알렌)		 ０ - - 0 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.0０
애플민트
추출물
(0.1%)
[시험군 1]		 0 - - 0 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
애플민트
추출물
(0.5%) [시험군 2]		 0 - - 0 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.00
애플민트 추출물
(1%)
[시험군 3]		 １ - - 0 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.0９
상기 표 ３에서 시험군 1, 2 및 3 모두 ± , + 및 ++에 해당하는 사람의 수가 모두 0명이고, 평균 반응도 역시 0.00이었다. 그러므로 평균반응도가 3이하의 반응도를 나타내므로, 애플민트 추출물은 뚜렷한 누적자극 양상을 나타내지 않는 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다.
본 발명의 조성물은 하기와 같이 제제예로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제제예 1 : 화장료 제제
1-1. 유연화장수
성분 중량%
애플민트 추출물 0.01
글리세린 3.0
부틸렌 글리콜 2.0
프로필렌 글리콜 2.0
카복시비닐폴리머 0.1
에탄올 10.0
트리에탄올아민 0.1
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량 정제수 82.79
총계 100.0
1-2. 영양화장수
성분 중량%
애플민트 추출물 0.01
밀납 4.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄세스퀴올레이트 0.5
유동파라핀 5.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5.0
글리세린 3.0
부틸렌 글리콜 3.0
프로필렌 글리콜 3.0
카복시비닐폴리머 0.1
트리에탄올아민 0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 69.69
총계 100.0
1-3. 영양크림
성분 중량%
애플민트 추출물 0.01
밀납 10.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄세스퀴올레이트 0.5
유동파라핀 10.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5.0
글리세린 5.0
부틸렌 글리콜 3.0
프로필렌 글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 56.79
총계 100.0
1-4. 마사지 크림
성분 중량%
애플민트 추출물 0.01
밀납 10.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄세스퀴올레이트 0.8
유동파라핀 40.0
스쿠알란 5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 4.0
글리세린 5.0
부틸렌 글리콜 3.0
프로필렌 글리콜 3.0
트리에탄올아민 0.2
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 27.49
총계 100.0
1-5. 팩
성분 중량%
애플민트 추출물 0.01
폴리비닐알콜 13.0
소듐카복시메틸셀룰로스 0.2
알란토인 0.1
에탄올 5.0
노닐페닐에테르 0.3
방부제, 미량색소, 미량향료 및 미량정제수 81.39
총계 100.0
제제예 2 : 약제학적 제제
2-1. 산제의 제조
성분 함량(g)
애플민트 추출물 2
유당 1
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2-2. 정제의 제조
성분 함량(mg)
애플민트 추출물 100
옥수수전분 100
유당 100
스테아린산마그네슘 2
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
2-3. 캡슐제의 제조
성분 함량(mg)
애플민트 추출물 100
옥수수전분 100
유당 100
스테아린산마그네슘 2
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
이와 같이, 본 발명의 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 Nrf-2 (Nuclear erythroid 2-related factor) 활성화를 촉진함으로써 피부 저색조증을 개선시킬 뿐만 아니라 자외선으로부터 피부를 보호하는 효능을 가진다. 또한, 애플민트 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

Claims (7)

  1. 애플민트(apple mint) 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 저색소증 개선 또는 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 화장료 조성물.
  2. 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 저색소증 치료 또는 예방, 또는 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 약학적 조성물.
  3. 애플민트 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 저색소증 개선 또는 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 피부 저색소증 개선 또는 예방이 Nrf-2 (Nuclear erythroid 2-related factor)의 활성화 촉진에 의해 개선 또는 예방되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 피부 저색소증이 백반증 또는 백모인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 애플민트 추출물이 애플민트를 건조한 다음 분말화하여 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 이용하여 추출한 다음, 감압 여과하여 제조된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 애플민트 추출물은 조성물 총 중량을 기준으로 하여 0.00001 내지 50 중량%의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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대한화장품학회지., No. 25, Vol. 2, pp. 77-127 (1999)* *
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