CN114344289A - 一种具有抗衰老活性的组合物及其制剂和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种具有抗衰老活性的组合物及其制剂，以及在抗衰老及衰老相关症状中的应用。具体而言，本发明所述的组合物主要由GPX4激动剂和15‑LOX抑制剂组成，并辅以维生素E发挥协同作用。其中GPX4激动剂包括6‑姜酚、8‑姜酚和10‑姜酚中的一种或多种；15‑LOX抑制剂包括槲皮素、黄芩素、丁香油酚、川陈皮素、甜橙黄酮、橘皮素中的一种或多种。所述组合物及其制剂能够缓解年龄相关的皮肤自然衰老和外界不良因素导致的皮肤加速衰老；同时对认知记忆能力减退、免疫功能下降等机体衰老相关的症状具有一定的疗效并且没有明显的副作用。

Description

一种具有抗衰老活性的组合物及其制剂和用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种具有抗衰老活性的组合物及其制备和用途。
背景技术
生物体中的细胞、组织和器官会伴随着年龄的增长而逐渐老化，从而使机体表现为多系统的整体性衰老，其中最直观的就是皮肤衰老。皮肤是人体最大(面积和重量)的器官，占体重的15％，成人约有2平方米的皮肤面积。皮肤具有重要的屏障作用，防御有害微生物和毒素的入侵，保护机体免受紫外线辐射，且不具渗透性的角质层阻碍水分的丢失。此外，皮肤还有免疫调节、体温调节、合成维生素D和分泌排泄等生物功能。然而，皮肤处在复杂的外部环境，易受到各种外界刺激而老化。皮肤老化是一个多因素过程，会影响其组织形态和生物学功能，由内在因素如年龄，遗传，激素等和外在因素如紫外线暴露，环境污染等多种因素导致。皮肤衰老伴随着明显的迹象，如皮肤变得薄而干燥，细皱纹，弹性下降，色素沉着，头发变白和脱发等。
神经系统进行性减退也是机体衰老的重要特征，伴随认知能力和记忆力的减退。细胞水平上表现为神经元细胞的损伤，而神经元是构成突触的重要结构，负责神经递质的分泌和神经信号的传导。此外，在外界不良因素或遗传因素干扰下神经元与突触的过度损伤还容易导致多种神经退行性疾病，如阿尔兹海默症和帕金森症。因此，减缓神经系统的衰老是预防神经退行性疾病的一个主要手段，通过防止衰老预防或缓解认知系统的损伤和神经退行性疾病的发生发展显得至关重要。
除此之外，人体的衰老还表现为免疫系统的衰退、伤口修复愈合能力下降、感染多发、行动力下降、胃肠道消化功能下降等症状。随着生活水平的提高人的寿命逐渐增加，尤其在发达国家人的平均寿命多达到80岁以上，陷入人口老龄化的困扰。更重要的是，老年人因机体功能衰退而导致的疾病给养老和医疗系统带来了非常沉重的负担。因此，研究开发新型抗衰方法和策略具有重要的社会意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种延缓衰老的方法，更具体地，一种具有抗衰老活性的组合物及其制备和用途。
近年来的研究表明，活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)是诱导机体衰老的重要因素。具有高度氧化性的ROS可以氧化机体的蛋白质和DNA等生物大分子，还可以氧化细胞膜磷脂导致脂质过氧化物的累积。除此之外，细胞和组织内的磷脂还可以直接被氧化酶如15-LOX氧化产生脂质过氧化物，而机体内唯一能清除脂质过氧化物的酶是GPX4。
因此，GPX4激动剂可以增强内源性抗氧化酶GPX4的活性，增强机体脂质过氧化物的清除，15-LOX抑制剂可以抑制内源性脂氧合酶15-LOX的活性，降低脂质过氧化物的产生。同时辅以外源性小分子还原剂如维生素E等可直接清除脂质过氧化的累积，是降低机体内氧化应激与氧化损伤的重要策略，可用于缓解皮肤老化、记忆力减退、免疫力下降等衰老症状。
具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
在第一个方面中，本发明提供了一种具有抗衰老活性的组合物，所述组合物包含GPX4激动剂和15-LOX抑制剂和以及维生素E，其中，所述GPX4激动剂增强内源性抗氧化酶GPX4的活性，增强机体脂质过氧化物的清除，所述15-LOX抑制剂抑制内源性脂氧合酶15-LOX的活性，降低脂质过氧化物的产生，同时辅以小分子还原剂维生素E直接清除脂质过氧化的累积，三者协同发挥作用。
作为可选的方式，在上述组合物中，所述GPX4激动剂选自6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚中的一种或多种；所述15-LOX抑制剂选自槲皮素、黄芩素、丁香油酚、川陈皮素、甜橙黄酮、橘皮素中的一种或多种。
优选地，在所述组合物中，所述GPX4激动剂、所述15-LOX抑制剂和所述维生素E的质量比为1:0.8-1.2:0.2-0.6。
更优选地，在所述组合物中，所述GPX4激动剂、所述15-LOX抑制剂和所述维生素E的质量比为1:1:0.5。
作为可选的方式，在上述组合物中，所述GPX4激动剂和所述15-LOX抑制剂还包括上文所述各种活性成分来源的提取物或分离物，或者所述GPX4激动剂和所述15-LOX抑制剂是通过化学方法或生物方法合成获取的。
本发明所述GPX4激动剂可以通过制备生姜提取物实现，生姜提取物同样具有较强的GPX4激动活性。
在一个实施方式中，本发明通过如下方案制备所述生姜提取物，具体步骤如下，将生姜用水清洗数遍后，挑选优良生姜后阴干。将生姜切碎成0.5×0.5cm的组织小块，加20至50倍量的60-80％乙醇溶液，热回流提取2-6次，每次提取1-2小时，合并提取液，减压抽滤得滤液，旋蒸浓缩后干燥得生姜提取物。
如上述热回流提取2-6次，优选为3-4次；所述提取时间为1-2小时/次，优选为1.5小时/次；所述乙醇提取液体积为20-50倍量，优选为30-40倍；所述提取乙醇浓度为60-80％，优选为65-75％。
基于以上技术方案制备的生姜提取物以重量百分比计总姜酚含量为2.0-2.5％，6-姜酚的含量为0.5-0.7％，8-姜酚的含量0.1-0.2％，10-姜酚含量0.2-0.3％。
鉴于所制备姜提取物是以食品、药品和护肤用品作为最终产品开发，故从安全性角度考虑提取溶剂尽量选择水和乙醇为宜，但并不仅限于此，当然使用其他有机溶剂提取所得提取物能够通过常规手段去除有机残留，也在本发明的考虑之内。
就上述醇提取法而言，除乙醇外还可以使用甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇等低级醇。所述有机溶剂包括但不限于丙酮、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、苯和石油醚等。
当然为了提高所述提取物的提取效率，可以将原料进行挤压、粉碎或研磨处理；也可以在回流期间给予超声、微波或搅拌处理；也可以加入酶处理，包括但不仅限于纤维素酶、果胶酶；也可以使用亚临界或超临界提取法。
在第二个方面中，本发明提供了一种具有抗衰老活性的制剂，所述制剂包含上述第一个方面所述的组合物，以及适宜的载体或辅料。
作为可选的方式，在上述制剂中，所述制剂为口服剂型、外用剂型或注射剂型。
作为可选的方式，在上述制剂中，所述口服剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液、肠溶片、颗粒剂、糖浆剂、滴丸、水蜜丸、散剂、合剂、煎膏剂、酒剂、露剂、酊剂、舌下含片等。所述外用剂型包括但不限于软膏、栓剂、硬质软膏、搽剂、滴眼液、油剂、乳膏、气雾剂、喷雾剂等。注射给药方式包括但不限于皮下注射、静脉注射、肌肉注射或腹腔注射等。
或者，可根据化妆品、护肤品、日常洗护用品的常规工艺将本发明组合物制备成相应的爽肤水、保湿乳、面膜、面霜、粉饼、沐浴露、香皂、粉底液、粉底霜、精华液、护手霜、身体乳、洗手液、洗发水、护发素、洁面膏、洗面奶、防晒霜、润肤膏、雪花膏、营养液、香水等。
在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的组合物或者上述第二个方面所述的制剂在制备抗衰老以及衰老相关症状的产品中的用途。
作为可选的方式，在上述用途中，所述产品是药物、保健品、功能性食品或化妆品。
作为可选的方式，在上述用途中，所述衰老以及衰老相关症状选自衰老、年龄相关的记忆力减退、认知障碍、神经衰弱、痴呆或年龄相关的免疫力下降。
优选地，衰老是皮肤衰老。
更优选地，皮肤衰老是皮肤皱纹、弹性下降或色素沉着。
本发明所述组合物、制剂和用途对以下情况有效：体外培养的皮肤细胞、离体的皮肤细胞或组织以及体内的皮肤细胞、组织或器官存在的衰老或衰老相关的损伤状态；年龄相关的自然老化的皮肤衰老或紫外、污染、营养不良、毒素累积、氧化刺激、心理压力、睡眠不足等外界不良因素引起的皮肤老化及其相关症状。
本发明所述组合物、制剂和用途对衰老的改善效果同样对如下衰老相关的分子结构或功能改变具有疗效，包括但不限于端粒的缩短、DNA的损伤、线粒体变异、ATP产生下降、抗氧化物质减少、染色质重构、SA-β半乳糖苷酶活性增加。
本发明所述组合物、制剂和用途可以用于抗皮肤衰老的应用。研究发现本发明所述组合物、制剂和用途可显著延缓皮肤组织的衰老，对年龄相关的自然衰老和紫外加剧的快速衰老均有疗效。本发明所述组合物、制剂和用途能够增加表皮和真皮的厚度，增加成纤维细胞的增殖能力，促进细胞外基质成分的合成与分泌，增加真皮中透明质酸的含量，促进胶原蛋白的合成，减少胶原蛋白的糖基化修饰和氧化损伤。此外，本发明所述组合物、制剂和用途还能降低皮肤的皱纹的深度，提高皮肤组织含水量和皮肤弹性，增强皮肤的屏障功能。本发明所述组合物、制剂和用途同时可以降低皮肤组织中SA-β标记阳性的细胞数量，降低衰老细胞的含量。
本发明所述组合物、制剂和用途可以用于抗神经衰老的应用。研究发现本发明所述组合物、制剂和用途可显著改善年老小鼠的认知能力。通过水迷宫测试发现本发明组合物、制剂和用途可以减少年老小鼠找到平台的时间，增加小鼠穿越平台的频率和运动速度，表明本发明组合物、制剂和用途对学习认知能力的改善，同时形态学上能够改善小鼠海马区域细胞排列疏松、核固缩的特征。以上暗示本发明组合物、制剂和用途对痴呆的预防或治疗作用。
本发明所述组合物、制剂和用途可以用于改善衰老状态下免疫力低下的应用。研究发现本发明所述组合物、制剂和用途可显著改善年老大鼠的免疫功能。本发明所述组合物、制剂和用途可以提高年老大鼠的脾脏指数和胸腺指数，增加脾脏中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量。以上暗示本发明所述组合物、制剂和用途对免疫力的提升作用，有助于增加年老状态下机体对外界病原体的提抗力和清除力。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明所述组合物、制剂和用途能够缓解年龄相关的皮肤自然衰老和外界不良因素导致的皮肤加速衰老；同时对认知记忆能力减退、免疫功能下降等机体衰老相关的症状具有一定的疗效并且没有明显的副作用。本发明组合和制剂可用于制备抗衰老相关的食品、保健品、医药品及其组成物以及化妆品，具有广阔的应用市场。
附图说明
图1：原代人皮肤成纤维细胞的提取和鉴定。其中，(A)提取的原代人皮肤成纤维细胞的光学显微照片；(B)FSP-1抗体免疫荧光实验鉴定原代人皮肤成纤维细胞。
图2：8-姜酚与GPX4蛋白对接模式图。
图3：6-姜酚与GPX4蛋白对接模式图。
图4：10-姜酚与GPX4蛋白对接模式图。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1：原代人皮肤成纤维细胞的提取和鉴定
原代人皮肤成纤维细胞(Human dermal fibroblast,HDF)由成年健康男性包皮组织提取得到，提取过程具体如下：在超净台内用含有青霉素-链霉素的PBS溶液多次清洗组织，随后将组织放入75％的乙醇消毒1-2min。然后再换到新的有青霉素-链霉素的PBS缓冲溶液中进行清洗。清洗结束后，使用镊子和剪刀除去皮下结缔组织；将皮肤组织剪成1cm×1cm的大小，放入含有dispase II的缓冲盐溶液的培养皿中，4℃孵育过夜；将组织从冰箱拿出，放入超净台，使用镊子和剪刀进行表皮和真皮的分离。随后将分离好的真皮组织切成约3mm×3mm的小块，小心地放入培养瓶中，将真皮接种至培养瓶，然后加入2mL完全培养基，置于培养箱进行培养。培养期间注意补液和换液，并在镜下观察细胞的爬出情况。
将提取的成纤维细胞进行鉴定，成纤维细胞特异性蛋白1(fibroblast-specificprotein 1,FSP-1)是S100超家族的一种细胞质钙结合蛋白，文献报道FSP-1是皮肤成纤维细胞特有的marker蛋白，因此使用FSP-1抗体对所提取细胞进行免疫荧光检测鉴定。结果如图1所示，所提取的细胞为FSP-1表达阳性细胞，阴性对照HacaT细胞无FSP-1蛋白表达。
实施例2：
将人皮肤成纤维细胞在体外传代培养，构建自发的自然细胞衰老模型。具体操作为：将提取的人成纤维细胞铺于6孔板中(50×104个细胞/孔)，使用含有10％FBS的DMEM培养基进行维持培养。当细胞密度达到80-90％时，用胰酶将细胞消化收集，并取出1/4的细胞继续培养于6孔板中。通过以上方式将细胞传代40次后，采用SAβ-Gal染色(pH 6.0)法测定衰老细胞的数量和比例。需要说明的是，对照组(自然衰老)使用正常的培养基传代培养，其余组的培养基中分别含有8-姜酚(μM)、槲皮素(10μM)以及维生素E(VE)中的一种或多种。
SA-β-Gal染色具体步骤如下：细胞用PBS溶液清洗2遍(每次约30秒)后，加入固定液室温固定5分钟；弃去固定液，PBS清洗3遍；加入新鲜配制的染色工作液，放入37℃无CO2的生化培养箱内孵育过夜，光学显微镜观察拍照并计算SAβ-Gal阳性细胞数。
结果如表1所示，8-姜酚、槲皮素和VE在同一剂量下均能延缓皮肤细胞的自然衰老。值得注意的是，采用金正均q值计算协同指数发现q>1，说明组合物之间进行组合能够发挥协同作用，增强抗衰老作用。三者复合使用可将抗衰老活性发挥至最大，可将衰老细胞数从88.9％降至23.1％，对于人体细胞随着年龄增加而老化具有潜在的改善作用。
表1：人皮肤成纤维细胞SA-βGal阳性细胞率
Figure BDA0003495231430000081
实施例3：
本实施例通过如下方案制备生姜提取物，具体步骤如下，将生姜用水清洗数遍后，挑选优良生姜后阴干。将生姜切碎成0.5×0.5cm的组织小块，加30倍量的70％乙醇溶液，热回流提取4次，每次提取1.5小时，合并提取液，减压抽滤得滤液，旋蒸浓缩后干燥得生姜提取物。
并通过如下方案制备沙棘叶提取物，具体步骤如下，将沙棘叶用水清洗数遍后，挑选完整优良沙棘叶后阴干。机械粉碎后加40倍量的去离子水，热回流提取4次，每次提取1.5小时，合并提取液，减压抽滤得滤液，旋蒸浓缩后干燥得沙棘叶提取物。
通过比较生姜提取物、沙棘叶提取物和VE的多种复配形式对人皮肤细胞自然老化的缓解作用来确证组合物的抗衰老效果。结果如表2所示，生姜提取物、沙棘叶提取物也能延缓皮肤细胞的自然衰老，且能够发挥协同作用，增强抗衰老作用。与VE组成的组合物具有最强的抗衰老效果。
表2：人皮肤成纤维细胞SA-βGal阳性细胞率
Figure BDA0003495231430000091
实施例4：端粒酶活性检测
使用人永生化角质细胞HaCaT细胞(购自ATCC细胞库)检测组合物对端粒酶活性的影响，具体步骤为：将HaCaT细胞铺与6孔板中，每孔50×104个细胞，待24小时细胞贴壁后，分别给与6-姜酚(10μM)、8-姜酚(10μM)、10-姜酚(10μM)以及在此基础上给予槲皮素和VE，作用48小时后，收取细胞测定细胞内端粒酶的活性。端粒酶活性通过Telomeric repeatamplification protocol(TRAP)法测定。
结果如表3所示，6-姜酚(100μM)、8-姜酚(100μM)和10-姜酚(100μM)能显著提升端粒酶的活性，同时辅以槲皮素和VE可以显著增强其对端粒酶的增加活性。
表3：HaCaT细胞端粒酶活性
Figure BDA0003495231430000092
Figure BDA0003495231430000101
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与正常对照组比较，*P<0.05具有显著性差异。
实施例5：自然皮肤衰老模型
3月龄的雌性C57BL/6J小鼠购买自广东省医学实验动物中心，饲养温度保持在25±5℃，相对湿度保持在50±10％，灯光明暗交替7:00-19:00为白昼时间、19:00-次日7:00为黑夜时间。所有小鼠均饲喂普通维持饲料和高温灭菌水，饲养至12月龄。将小鼠随机分为7组，分别为模型组、6-姜酚(25mg/kg)组、8-姜酚(25mg/kg)组、10-姜酚(25mg/kg)组以及组合物(6/8/10-姜酚(25mg/kg)+槲皮素(25mg/kg)+VE(10mg/kg))组，给药组经灌胃给与相应剂量的药物对待，每两天给药一次，模型组给与等体积的生理盐水，直至小鼠达24月龄，实验结束后将小鼠用异氟烷麻醉后处死收取背部皮肤组织，使用3月龄的小鼠皮肤作为对照样品。
样品处理：取部分样品固定于10％多聚甲醛溶液中，保存在4℃冰箱；其余皮肤组织冻存于-80℃冰箱或液氮中，用于后续指标分析。
透明质酸含量分析：用液氮充分研磨皮肤组织呈细碎状，收集到EP管中。按10％(mg/mL)加入RIPA蛋白裂解液，使用自动组织匀浆机破碎皮肤组织。破碎后将样品放置冰上继续裂解30min，期间每隔10分钟涡旋10秒；4℃12000×g离心10min，收取上清。使用透明质酸ELISA检测试剂盒测定上清中透明质酸的含量。
结果如表4所示，相较于3月龄的年轻小鼠，24月龄的年老小鼠皮肤组织中透明质酸的含量有所降低，而6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚能够恢复降低的透明质酸水平。此外，其组合物也能够进一步改善透明质酸减少的衰老特征。
表4：小鼠皮肤组织中透明质酸的含量
Figure BDA0003495231430000102
Figure BDA0003495231430000111
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与年老模型组比较，*P<0.05具有显著性差异。
胶原蛋白含量分析：用液氮充分研磨皮肤组织呈细碎状，收集到EP管中。按10％(mg/mL)加入RIPA蛋白裂解液，使用自动组织匀浆机破碎皮肤组织。破碎后将样品放置冰上继续裂解30min，期间每隔10分钟涡旋10秒；4℃12000×g离心10min，收取上清。使用胶原蛋白ELISA检测试剂盒测定上清中透明质酸的含量。
结果如表5所示，相较于3月龄的年轻小鼠，24月龄的年老小鼠皮肤组织中胶原蛋白的含量显著降低，而6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚能够增加胶原蛋白的水平。其组合物也能够更加有效地改善胶原蛋白含量下降的衰老特征。
表5：小鼠皮肤组织中胶原蛋白含量
Figure BDA0003495231430000112
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与年老模型组比较，*P<0.05具有显著性差异。
SAβ-Gal是评价细胞衰老的经典指标。在生理条件下(pH 4.0–4.5)正常细胞也有表达，但在衰老细胞中溶酶体含量增加，其中的β-gal也逐渐积累，在pH 6.0的检测环境下溶酶体中的β-gal活性得以显现，从而特异性识别衰老细胞。此外，在大多数衰老细胞和组织中均检测到SAβ-gal活性，因此将其视为衰老标志物并广泛应用于衰老的检测，同样适用于皮肤衰老的评价。
皮肤组织的SA β-Gal染色过程如下：组织包埋和切片：从液氮中取出皮肤组织后，放入O.C.T.Compound中；置于-20℃冷却包埋；纵向切皮肤组织，切片厚度为8μm；组织固定：1％甲醛溶液室温固定1分钟；用PBS洗涤切片3次，每次1分钟；SA-β-Gal染色：滴加适量的SA-β-Gal染色液，37℃反应过夜；放入湿盒中，以免干液。伊红苏木素染色：用水快速清洗掉多余的染色液，随即将切片放入95％的乙醇溶液中除水5s，然后进行伊红染色2分钟，70％乙醇溶液清洗伊红染液两次，将玻片放置通风处晾干，中性树脂封片后在光学显微镜下观察拍照。
结果如表6所示，相较于3月龄的年轻小鼠，24月龄的年老小鼠皮肤组织中SA β-Gal阳性点数显著升高，而6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚能够降低SA β-Gal阳性点。其组合物也能够进一步改善SA β-Gal活性增加的衰老特征。
表6：小鼠皮肤组织中SA β-Gal的活性
组别 SA β-Gal阳性点(/mm<sup>2</sup>)
3月龄对照鼠 7.84±2.16
年老模型鼠 42.3±5.98
6-姜酚(25mg/kg) 32.9±5.67*
8-姜酚(25mg/kg) 21.7±4.23*
10-姜酚(25mg/kg) 34.1±6.48*
6-姜酚(25mg/kg)+槲皮素(25mg/kg)+VE(10mg/kg) 22.4±4.71*
8-姜酚(25mg/kg)+槲皮素(25mg/kg)+VE(10mg/kg) 15.4±4.16*
10-姜酚(25mg/kg)+槲皮素(25mg/kg)+VE(10mg/kg) 25.3±7.92*
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与年老模型组比较，*P<0.05具有显著性差异。
实施例6：紫外皮肤衰老模型
8月龄的雌性C57BL/6J小鼠购买自广东省医学实验动物中心，饲养温度保持在25±5℃，相对湿度保持在50±10％，灯光明暗交替7:00-19:00为白昼时间、19:00-次日7:00为黑夜时间。所有小鼠均饲喂普通维持饲料和高温灭菌水，适应性喂养一周后进行实验。将小鼠随机分为正常组、紫外照射模型组、6-姜酚(25mg/kg)组、8-姜酚(25mg/kg)组和10-姜酚(25mg/kg)组以及组合物(6/810-姜酚(25mg/kg)+槲皮素(25mg/kg)+VE(10mg/kg))组，给药组经灌胃给予相应剂量的药物对待，每两天给药一次，连续给药两周，正常组和模型组给与等体积的生理盐水。两周后给与紫外线照射构建皮肤衰老模型，除正常对照组外，其余小鼠每天UVB紫外照射一次，初始剂量为50mJ/cm2，第二周为100mJ/cm2，第三周为200mJ/cm2，第三周到第六周为300mJ/cm2。最后一次照射后24小时，将小鼠用异氟烷麻醉后处死收取背部皮肤组织，固定于10％多聚甲醛溶液中，保存在4℃冰箱，用于后续指标分析。
HE染色皮肤组织具体步骤如下：将烘箱温度设置为60℃，并把皮肤组织的石蜡切片放入烘箱中烤片2小时；提前倒好二甲苯，将烤好的切片立刻放入二甲苯I中，室温脱蜡5分钟；将组织切片放入二甲苯II中，继续脱蜡5分钟；进行梯度水化：无水乙醇(5分钟)-90％乙醇(5分钟)-90％乙醇(5分钟)-70％乙醇(5分钟)-蒸馏水(5分钟)-蒸馏水(5分钟)-蒸馏水(5分钟)；苏木素染色8分钟；流式冲洗，除去多余的染色液；95％乙醇浸泡3秒；伊红染色2分钟；70％乙醇清洗2次，去除多余的染色液；80％乙醇(5分钟)，90％乙醇(5分钟)，95％乙醇(5分钟)，无水乙醇(5分钟)，二甲苯I(5分钟)，二甲苯II(5分钟)；中性树脂封片，扫描显微镜进行拍照。
结果如表7所示，相较于正常对照组小鼠，UVB衰老模型小鼠皮肤组织中的表皮和真皮厚度降低，而6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚能够剂量依赖性地增加表皮和真皮的厚度。其组合物也能够进一步改善表皮和真皮变薄的衰老特征。
表7：小鼠表皮和真皮的厚度
Figure BDA0003495231430000131
Figure BDA0003495231430000141
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与UVB模型组比较，*P<0.05具有显著性差异。
实施例7：自然衰老小鼠认知功能
将实施例5中的小鼠在24月龄时通过水迷宫实验测试其学习认知的能力。水迷宫实验具体步骤如下：将水迷宫划分为4个象限，将隐匿平台放置在水迷宫的第一象限中，每天同一时间将受试小鼠依次由第一、二、三、四象限顺序放入水迷宫中，训练小鼠在水迷宫内找到平台的学习记忆能力，如果小鼠在2min内找到平台，则记录其逃避潜伏期，如果未找到平台，将其引上平台并停留1min，逃避潜伏期记录为2min，共训练5天。测试当天将隐匿平台从水迷宫的第一象限取走，将小鼠从第二象限放入水迷宫，记录小鼠2min内到达隐藏平台所花费的时间/潜伏逃避期/穿越平台的频率以及运动速度。
结果如表8所示，相较于正常对照组小鼠，24月龄年老小鼠的逃避潜伏期显著延长、运动速度降低、穿越平台的频率显著减少。而6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚能够减少逃避潜伏期、增加运动的速度和穿越平台的频率，其组合物也能够更加显著地改善认知和记忆能力减退的衰老特征。
表8：小鼠水迷宫测试运动参数
Figure BDA0003495231430000142
Figure BDA0003495231430000151
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与年老模型组比较，*P<0.05具有显著性差异。
实施例8：自然衰老小鼠的免疫器官指数
将实施例5中的小鼠的脾脏和胸腺称重后，与体重相比计算脾指数和胸腺指数，评估组合物及其活性成分对年老小鼠免疫器官指数的影响。结果如表9所示，相较于正常对照组小鼠，24月龄年老小鼠的的脾脏指数和胸腺指数显著降低。而6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚能够增加脾指数和胸腺指数，其组合物也能够更有效地改善免疫器官萎缩、免疫力下降的衰老特征。
表9：小鼠的脾脏指数和胸腺指数
Figure BDA0003495231430000152
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与24月龄年老模型组比较，*P<0.05具有显著性差异。
实施例9：8-姜酚、6-姜酚和10-姜酚与GPX4分子对接
GPX4三维结构的处理：从网站PDB下载GPX4的三维结构(human GPX4 U46Cmutant,hGPX4-C,Protein Data Bank(PDB)entry 2OBI)，利用分子模拟软件DiscoveryStudio构建底物的立体坐标，根据坐标在蛋白的变构位点设定对接区域。该变构位点处在底物结合位点的反面，由3个酸性氨基酸残基D21、D23和D101，2个碱性氨基酸残基K31和K90，和7个中性氨基酸残基I22、A93、A94、V98、F100、M102和F103环绕而成。
化合物结构的处理：从化合物数据库PubChem下载8-姜酚、6-姜酚和10-姜酚的三维结构，使用Open Babel软件(http://openbabel.org/wiki/Main_Page)进行结构转换、结构优化、去氢等操作，转换为可用于对接的MOL格式。
分子对接：利用Discovery Studio进行GPX4与8-姜酚、6-姜酚和10-姜酚的分子对接，计算对接能量，结果如表10所示。
表10：8-姜酚、6-姜酚和10-姜酚与GPX4分子对接结果
名称 *-CDOCKER_ENERGY *-INTERATION_ENERGY LibDockScore
8-姜酚 35.2287 37.4328 104.937
6-姜酚 32.9479 38.1396 103.528
10-姜酚 39.7565 40.9275 117.118
进一步地，通过对接模式图发现，8-姜酚能够与LYS31，ASP101形成分子间氢键，与ASP23形成疏水作用力(图2)。6-姜酚能够与LYS31，PHE100形成分子间氢键，与ASP21，VAL27，PHE103形成疏水作用力(图3)。10-姜酚能够与LYS31，LYS90形成分子间氢键，与ASP23，LYS90，ALA94形成疏水作用力(图4)。
实施例10：HPLC-MS检测姜提取物及其活性成分对GPX4酶活性的影响
GPX4蛋白表达：在HEK293细胞中过表达GPX4蛋白并将GPX4粗蛋白提取出来后，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。
酶活反应：组别设置为对照组(只加底物PEOOH)，GPX4粗酶组，GPX4粗酶加相应的采用本发明方法制备的姜提取物、6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚。反应体系为：100mM Tris-HCl、5mM EDTA、0.1％Triton X-100、1.5mM NADPH、3mM GSH和底物PE-OOH(10μM)在37℃孵育30分钟。
HPLC-MS分析样品制备：每组加入600μL氯仿-甲醇(2:1，v:v)终止反应并涡旋2分钟，取有机层并用氮气吹干样品，随后用50μL质谱级甲醇溶解。
LC-MS检测SAPE-OH的产生量：赛默飞(Thermo Fisher Scientific)双三元高效液相色谱(DGLC)串联四极杆轨道阱高分辨质谱仪(Q-Exactive)。液相色谱柱型号：Luna 3μm，Silica，150×2.0mm，Phenomenex。流动相：流液相采用正相系统分离，以丙醇：正己烷：水＝285:215:5(v:v:v)为洗脱A相，丙醇：正己烷：水＝285:215:40(v:v:v)为洗脱B相，A、B两相各含10mM甲酸铵。洗脱程序如下：0min：10％B；5min：45％B；6min：100％B；13min：100％B；13.5min：10％B；18min：10％B。流速为0.35mL/min。柱温为40℃。进样量2μL。质谱条件：质谱扫描模式为负离子全扫。一级质谱扫描质量范围为400-1,800m/z，分辨率为70,000，最大注射时间600ms；MS2扫描分辨率为17,500，最大注射时间200ms，碰撞能24eV，扫描隔离窗口设置为1m/z。毛细管喷雾电压设定为3.0kV，毛细管温度为320℃，辅助器加热温度为350℃。S-lens Rf设置为60。
活性计算：计算PE-OH在30min内的生成量表示GPX4的酶活性。
结果如表11所示，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚以及生姜提取物可显著增强GPX4蛋白的过氧化物酶活性。
表11：HPLC-MS法检测GPX4酶活性
组别 GPX4相对酶活性(％)
正常对照组 99.8±3.49
6-姜酚(200μM) 130.7±6.14*
8-姜酚(200μM) 158.8±10.6*
10-姜酚(200μM) 123.9±9.41*
姜提取物(100μg/ml) 121.3±6.49*
姜提取物(200μg/ml) 132.7±11.67*
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与正常对照组比较，*P<0.05具有显著性差异。
实施例11：组合物及其成分对皮肤细胞衰老的影响
我们使用磷脂氧化诱导剂(RSL3，GPX4)构建了皮肤成纤维细胞HDF的衰老模型，并采用SA β-Gal染色(pH 6.0)法评价6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚及其相应组合物对RSL3导致HDF细胞衰老的保护作用。
SA-β-Gal染色具体步骤如下：细胞用PBS溶液清洗2遍(每次约30秒)后，加入固定液室温固定5分钟；弃去固定液，PBS清洗3遍；加入新鲜配制的染色工作液，放入37℃无CO2的生化培养箱内孵育过夜，光学显微镜观察拍照并计算SA β-Gal阳性细胞数。
结果如表12所示，磷脂氧化诱导剂导致细胞内SA β-Gal的表达明显增加，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚可以降低SA β-Gal的阳性率，其组合物能进一步抑制成纤维细胞的衰老。
表12：皮肤成纤维细胞SA-βGal阳性细胞率
Figure BDA0003495231430000181
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与磷脂氧化诱导组比较，*P<0.05具有显著性差异。
实施例12：组合物及其成分对衰老相关异染色质聚集(SAHF)形成的影响
染色质重构也是细胞衰老的重要特征。衰老细胞的细胞核内染色质发生皱缩聚集，这可以通过DAPI染色检测，染色质的皱缩表现为DAPI密集点。此外，皱缩部位会聚集一些蛋白，如第九位赖氨酸甲基化组蛋白H3(methylated lysine 9of histone H3，K9M-H3)、异染色质蛋白1(heterochromatin protein 1，HP1)和高迁移率A族蛋白(heterochromatinhigh-mobility group A proteins，HMGA)等，通过免疫荧光检测形成可见的SAHF。
我们使用DAPI和K9M-H3抗体进行免疫荧光观察SAHF的形成，观察6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚及其相应组合物对磷脂氧化诱导剂(RSL3，GPX4抑制剂)导致皮肤成纤维细胞衰老的影响。结果如表13显示，磷脂氧化诱导剂明显诱导了成纤维细胞内SAHF的形成，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚可以降低伴有SAHF的阳性细胞率，其组合物能进一步改善改善伴有SAHF形成的细胞衰老特征，显示出更强的抗衰老效果。
表13：皮肤成纤维细胞SAHF形成的水平
组别 SAHF细胞率(％)
正常对照组 5.8±2.38
磷脂氧化诱导组 42.3±4.15
6-姜酚(10μM) 22.6±5.74*
8-姜酚(10μM) 18.9±6.05*
10-姜酚(10μM) 25.3±4.28*
6-姜酚(10μM)+槲皮素(10μM)+VE(5μM) 15.4±4.93*
8-姜酚(10μM)+槲皮素(10μM)+VE(5μM) 10.1±5.73*
10-姜酚(10μM)+槲皮素(10μM)+VE(5μM) 18.6±4.26*
注：数据以Mean±SD表示，统计采用one-way ANOVA分析，与磷脂氧化诱导组比较，*P<0.05具有显著性差异。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种具有抗衰老活性的组合物，其特征在于：所述组合物包含GPX4激动剂和15-LOX抑制剂和以及维生素E，其中，所述GPX4激动剂增强内源性抗氧化酶GPX4的活性，增强机体脂质过氧化物的清除，所述15-LOX抑制剂抑制内源性脂氧合酶15-LOX的活性，降低脂质过氧化物的产生，同时辅以小分子还原剂维生素E直接清除脂质过氧化的累积，三者协同发挥作用。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述GPX4激动剂选自6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚中的一种或多种；所述15-LOX抑制剂选自槲皮素、黄芩素、丁香油酚、川陈皮素、甜橙黄酮、橘皮素中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述GPX4激动剂和所述15-LOX抑制剂还包括权利要求2中所述各种活性成分来源的提取物或分离物，或者所述GPX4激动剂和所述15-LOX抑制剂是通过化学方法或生物方法合成获取的。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：所述GPX4激动剂为生姜提取物，所述生姜提取物的制备方法包括以下步骤：将生姜用水清洗数遍后，挑选优良生姜后阴干，将生姜切碎成0.5×0.5cm的组织小块，加20至50倍量的60-80％乙醇溶液，热回流提取2-6次，每次提取1-2小时，合并提取液，减压抽滤得滤液，旋蒸浓缩后干燥得生姜提取物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述生姜提取物以重量百分比计，总姜酚含量为2.0-2.5％，6-姜酚的含量为0.5-0.7％，8-姜酚的含量0.1-0.2％，10-姜酚含量0.2-0.3％。
6.一种具有抗衰老活性的制剂，其特征在于：所述制剂包含权利要求1至5中任一项所述的组合物，以及适宜的载体或辅料。
7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于：所述制剂为口服剂型、外用剂型或注射剂型，优选地，所述口服剂型选自片剂、胶囊剂、口服液、肠溶片、颗粒剂、糖浆剂、滴丸、水蜜丸、散剂、合剂、煎膏剂、酒剂、露剂、酊剂或舌下含片，所述外用剂型选自软膏、栓剂、硬质软膏、搽剂、滴眼液、油剂、乳膏、气雾剂或喷雾剂，或者所述外用剂型选自爽肤水、保湿乳、面膜、面霜、粉饼、沐浴露、香皂、粉底液、粉底霜、精华液、护手霜、身体乳、洗手液、洗发水、护发素、洁面膏、洗面奶、防晒霜、润肤膏、雪花膏、营养液或香水。
8.权利要求1至5中任一项所述的组合物或者权利要求6或权利要求7所述的制剂在制备抗衰老以及衰老相关症状的产品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述产品是药物、保健品、功能性食品或化妆品。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的用途，其特征在于：所述衰老以及衰老相关症状选自衰老、年龄相关的记忆力减退、认知障碍、神经衰弱、痴呆或年龄相关的免疫力下降，优选地，衰老是皮肤衰老，更优选地，皮肤衰老是皮肤皱纹、弹性下降或色素沉着。
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