JPWO2017138652A1 - メラニン分解抑制剤 - Google Patents
メラニン分解抑制剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2017138652A1 JPWO2017138652A1 JP2017567019A JP2017567019A JPWO2017138652A1 JP WO2017138652 A1 JPWO2017138652 A1 JP WO2017138652A1 JP 2017567019 A JP2017567019 A JP 2017567019A JP 2017567019 A JP2017567019 A JP 2017567019A JP WO2017138652 A1 JPWO2017138652 A1 JP WO2017138652A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- salt
- berberine
- proguanil
- skin
- keratinocytes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
- A61K8/4906—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom
- A61K8/4926—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom having six membered rings
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
- A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/4375—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having nitrogen as a ring heteroatom, e.g. quinolizines, naphthyridines, berberine, vincamine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
- A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
- A61K31/4741—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having oxygen as a ring hetero atom, e.g. tubocuraran derivatives, noscapine, bicuculline
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/29—Berberidaceae (Barberry family), e.g. barberry, cohosh or mayapple
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/71—Ranunculaceae (Buttercup family), e.g. larkspur, hepatica, hydrastis, columbine or goldenseal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/71—Ranunculaceae (Buttercup family), e.g. larkspur, hepatica, hydrastis, columbine or goldenseal
- A61K36/718—Coptis (goldthread)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/75—Rutaceae (Rue family)
- A61K36/756—Phellodendron, e.g. corktree
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/87—Vitaceae or Ampelidaceae (Vine or Grape family), e.g. wine grapes, muscadine or peppervine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
- A61K8/41—Amines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
- A61K8/43—Guanidines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
- A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
- A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q5/00—Preparations for care of the hair
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q5/00—Preparations for care of the hair
- A61Q5/10—Preparations for permanently dyeing the hair
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
- A61K2800/78—Enzyme modulators, e.g. Enzyme agonists
- A61K2800/782—Enzyme inhibitors; Enzyme antagonists
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Birds (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
ケラチノサイトにおけるメラニンの分解を抑制し、皮膚及び毛髪のメラニン蓄積を亢進するメラニン分解抑制剤の提供。ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
Description
本発明は、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解を抑制する、メラニン分解抑制剤に関する。
皮膚や毛髪の色を決定する因子として様々なものが報告されているが、その中でも、表皮に存在するメラニンの量や質が、皮膚や毛髪の色に大きく寄与すると考えられている。すなわち、皮膚や毛髪の色の形成は、メラニン産生細胞(メラノサイト)中のメラノソームと呼ばれる細胞小器官中でつくられたメラニンが、表皮や毛包のケラチノサイトへと転送されて表皮や毛髪全体へと広がることに大きく影響を受けるとされる。
したがって、メラニン産生の亢進やメラニン分解の抑制等により、ケラチノサイトにおけるメラニン量が増加すれば、皮膚は褐色化し、毛髪は黒色化する。
したがって、メラニン産生の亢進やメラニン分解の抑制等により、ケラチノサイトにおけるメラニン量が増加すれば、皮膚は褐色化し、毛髪は黒色化する。
また、最近、本出願人は、ケラチノサイト内におけるメラニン動態にオートファジーが関与し、ケラチノサイトにおけるメラニン量とオートファジーの活性が相関することを見出している(特許文献1)。これによれば、オートファジーの活性を抑制することにより、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解が抑制され、皮膚や毛髪色の黒化が可能であると考えられる。
皮膚においては、シミ、ソバカスの原因の一つとして、皮膚の紫外線暴露による刺激、ホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在するメラノサイトが活性化されメラニン産生が盛んになることが知られていることから、従来、メラニン産生を抑制したり、産生したメラニンを減少させたりする美白剤が開発されてきた。しかし一方で、欧米においては、褐色の肌を望む場合も多く、わが国においても、近年の若年層を中心に、敢えて日光浴や屋内での紫外線照射を受けることが流行し、欧米においては依然としてタンニング・ベッドによる人工的な日焼けも盛んに行われている。また、紫外線の有害性に関する啓蒙活動もあり、ジヒドロキシアセトンを主成分とするセルフタンニング剤が出回っているのが現状である。
このような過度の紫外線照射は皮膚に大きなダメージを与え、皮膚癌の発生を招くおそれもあり、またセルフタンニング剤においても、その作用は角層のメイラード反応により皮膚を褐色化させていることから、色合いや色合いの安定性及び紫外線防御能の向上は望めない等、効果の面で問題が指摘されている。
一方、白髪は、毛母メラニン産生細胞の変化によってメラニンが減少する生理的老化現象の一つであるが、その発生機序は未だ解明されていない。白色化した髪を黒髪へと変化させる方法としては、白髪を防止又は改善する成分等の報告が数多くなされているものの、いずれも有効性や安全性の点で十分なものは得られておらず、染毛剤による染毛が中心となっているのが現状である。
従って、ケラチノサイトに直接作用してメラニン量を増加又は蓄積させる成分が見出されれば、本来メラニンが持つ生体防御能を促進させて皮膚のダメージを予防すると共に、肌の褐色化や白髪の防止又は改善が実現できると考えられる。
フェンホルミン(Phenformin)は、経口糖尿病薬として開発されたビグアナイド系薬剤であり、ヒト胚性肝細胞(HEK 293T細胞)において、AMPK(AMP-activated protein kinase)の活性化を介してオートファジーを活性化することが報告されている(非特許文献1)。
また、ベルベリン(Berberine)は、キハダやオウレンなどの植物に含まれるベンジルイソキノリンアルカロイドの1種であり、腸内有害細菌に対する殺菌作用、胆汁分泌作用等を有することにより下痢症等の治療に使用されている。また、ベルベリンにAMPK活性化作用があること(非特許文献2)、抗酸化及び抗炎症作用を有し、ベルベリンを多く含むBarberry rootが、白斑治療を目的とした混合ハーブの1つとして使用されていることが報告されている(非特許文献3)。
また、ベルベリン(Berberine)は、キハダやオウレンなどの植物に含まれるベンジルイソキノリンアルカロイドの1種であり、腸内有害細菌に対する殺菌作用、胆汁分泌作用等を有することにより下痢症等の治療に使用されている。また、ベルベリンにAMPK活性化作用があること(非特許文献2)、抗酸化及び抗炎症作用を有し、ベルベリンを多く含むBarberry rootが、白斑治療を目的とした混合ハーブの1つとして使用されていることが報告されている(非特許文献3)。
また、プログアニル(Proguanil)は、マラリアの治療および予防に用いられる抗マラリア剤の一つで、世界中で長年使用されてきた安全性の高い薬剤である。
しかし、フェンホルミン、ベルベリン及びプログアニルにケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制作用があることは全く知られていない。
本発明は、以下の1)〜5)に係るものである。
1)ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
2)ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
3)ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
4)ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
5)プログアニル又はその塩を含有する皮膚外用剤。
1)ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
2)ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
3)ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
4)ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
5)プログアニル又はその塩を含有する皮膚外用剤。
本発明は、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解を抑制し、皮膚又は毛髪のメラニン蓄積を亢進するメラニン分解抑制剤を提供することに関する。
本発明者らは、皮膚又は毛髪におけるメラニン量を増加させる物質を探索したところ、フェンホルミン、ベルベリン及びプログアニルが、ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性抑制作用及びメラニン分解抑制作用を有し、ケラチノサイトにおけるメラニンの蓄積を亢進させることを見出した。
本発明によれば、皮膚又は毛髪におけるメラニンの蓄積を亢進し、皮膚の褐色化や白髪の防止・改善を図ることができる。
本発明におけるフェンホルミン及びベルベリンは、下記式で示される。
本発明において、フェンホルミンの塩としては、製薬上許容される塩であればよく、例えば無機酸(塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等)や有機酸(酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸等)の塩が挙げられるが、好ましくは塩酸塩である。また、フェンホルミンは水和物又は溶媒和物の形態をとっていてもよい。
フェンホルミン又はその塩は、Sigma−Aldrich社などの一般試薬メーカーより入手可能である。
ベルベリンの塩としては、例えば、塩酸、硫酸、タンニン酸等の塩を例示できるが、好ましくは塩酸塩(塩化ベルベリン)である。
ベルベリン又はその塩は、生薬として利用されるキハダ、オウレンの他、ゴールデンシール、バーベリー、オレゴングレープ等に豊富に含まれており、これらの植物から抽出、精製することにより容易に高純度のものを得ることができる(13改正日本薬局方解説書,C-405頁)。
したがって、本発明において、ベルベリン又はその塩は、ベルベリン又はその塩を含有する植物の抽出物を用いてもよい。ベルベリン又はその塩を含有する植物としては、例えばミカン科のキハダ(学名:Phellodendron amurense、樹皮の薬用名:オウバク)、キンポウゲ科のオウレン(学名:Coptis japonica)、キンポウゲ科のゴールデンシール(goldenseal、学名:Hydrastis canadensis)、メギ科のバーベリー(学名:Berberis vulgaris)、メギ科のオレゴングレープ(学名:Berberis aquifolium)等が挙げられる。
ベルベリン又はその塩は、生薬として利用されるキハダ、オウレンの他、ゴールデンシール、バーベリー、オレゴングレープ等に豊富に含まれており、これらの植物から抽出、精製することにより容易に高純度のものを得ることができる(13改正日本薬局方解説書,C-405頁)。
したがって、本発明において、ベルベリン又はその塩は、ベルベリン又はその塩を含有する植物の抽出物を用いてもよい。ベルベリン又はその塩を含有する植物としては、例えばミカン科のキハダ(学名:Phellodendron amurense、樹皮の薬用名:オウバク)、キンポウゲ科のオウレン(学名:Coptis japonica)、キンポウゲ科のゴールデンシール(goldenseal、学名:Hydrastis canadensis)、メギ科のバーベリー(学名:Berberis vulgaris)、メギ科のオレゴングレープ(学名:Berberis aquifolium)等が挙げられる。
抽出に用いられる植物の部位は、特に限定されず、例えば全草、葉、茎、芽、花、蕾、木質部、樹皮、地衣体、根、根茎、仮球茎、球茎、塊茎、種子、果実等、又はそれらの組み合わせが挙げられる。これらのうち、キハダの場合は樹皮が、オウレン、ゴールデンシール、バーベリー及びオレゴングレープの場合は根又は根茎が好ましく用いられる。
本発明に用いるベルベリン又はその塩を含有する植物の抽出物の製造方法は、特に限定はなく、ベルベリン又はその塩を含有する植物を公知の方法で抽出することにより得ることができる。本発明では各種抽出溶媒による溶媒抽出法により製造した抽出物が好ましく用いられる。
抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれも用いることができるが、ベルベリン又はその塩の抽出効率の観点から、極性溶媒が好ましく用いられる。極性溶媒の具体例としては、例えば、水、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノール、tert−ブタノール、1−ペンタノール、1−ヘキサノール、1−ヘプタノール、1−オクタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、1,4−ブチレングリコール、グリセリン等の1価〜3価のアルコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。これらの溶媒は、一種又は二種以上を組み合わせて使用することができる。本発明においては、物性(抽出効率、安定性)、安全性および汎用性の点から、水、1価〜3価のアルコール、又は1価〜3価のアルコールの水溶液が好ましく用いられ、さらに1価〜3価のアルコールとしてはエタノール、メタノール、1,3−ブチレングリコール、グリセリンが好ましく用いられる。
抽出溶媒の使用量は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されないが、例えば、植物の乾燥質量1gに対し、1〜1000mL、好ましくは5〜100mL等を例示することができる。
抽出条件は、十分な抽出効率が得られる条件であれば特に限定されない。抽出期間(時間)は、例えば、1時間以上、好ましくは1日以上、30日間以下、好ましくは14日間以下等を例示することができる。抽出温度は、0℃以上,使用する溶媒の沸点以下で実施することが好ましく、より好ましくは常温から使用溶媒の沸点以下の温度範囲を例示することができる。ただし、加圧条件下において実施する場合には、抽出温度は使用溶媒の沸点に限定されることなく、抽出効率に鑑みて適宜、最適な温度を設定することができる。
上記植物抽出物は、例えば化粧品や医薬品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。また、必要に応じて、液液分配、固液分配、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができる。
上記植物抽出物は、例えば化粧品や医薬品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。また、必要に応じて、液液分配、固液分配、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができる。
上記の抽出物はそのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、水−エタノール混液、水−プロピレングリコール混液、水−1,3−ブチレングリコール混液等の溶剤で溶解・希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
本発明におけるプログアニルは、下記式で示される1−(p−クロロフェニル)−5−イソプロピルビグアニドを指す。
本発明において、プログアニルの塩としては、製薬上許容される塩であればよく、例えば無機酸(塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等)や有機酸(酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸等)の塩が挙げられるが、好ましくは塩酸塩である。また、プログアニルの水和物又は溶媒和物も本発明のプログアニルに含めるものとする。
プログアニル又はその塩は商業的に入手可能であり、例えば、プログアニル・塩酸塩が、Sigma−Aldrich社などのメーカーより市販されている。
後記実施例に示すように、フェンホルミン又はその塩、ベルベリン又はその塩、及びベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、プログアニル又はその塩(「本発明の化合物」と称する)は、ヒトケラチノサイトにおいて、メラノソーム量の指標となるPmel17タンパク質量(Murase D, Hachiya A, Takano K, Hicks R, Visscher MO, Kitahara T, Hase T, Takema Y, Yoshimori T (2013). Autophagy has a significant role in determining skin color by regulating melanosome degradation in keratinocytes. J Invest Dermatol 133:2416-2424.)を増加させ、メラニンの蓄積を亢進し、当該皮膚色を黒化する作用を有する。
また、フェンホルミン又はその塩、ベルベリン又はその塩、及びベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、LC3−II及びp62タンパク質の蓄積を亢進する。LC3−II及びp62タンパク質は、オートファジーに必要なタンパク質であり、オートファジーによって生成、分解されることから、オートファジー活性のマーカーとして用いられている(Mizushima N, Yoshimori T (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545.)。したがって、斯かる2つのタンパク質の蓄積を亢進する本発明の化合物は、オートファジー抑制作用を有するものと考えられる。
プログアニル又はその塩についても、オートリソゾームにおけるタンパク質分解を阻害するChloroquine diphosphate存在下でのLC3−IIの蓄積を抑制することから、オートファジー抑制作用を有するものと考えられる。なお、この場合、LC3−II自身がオートファジーで分解されるため、詳細には、分解阻害剤による分解阻害時のLC3−IIの蓄積がオートファジー活性のマーカーとなる(Mizushima N, Yoshimori T (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545.)。
そして、ケラチノサイト内におけるメラニンの分解にはオートファジーが関与することが明らかにされていることから(前記特許文献1)、本発明の化合物による、ケラチノサイトにおけるメラニン量の蓄積・増加、それによる皮膚色の黒化は、オートファジーの活性が抑制され、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解が抑制されたことに基づくと考えられる。
また、フェンホルミン又はその塩、ベルベリン又はその塩、及びベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、LC3−II及びp62タンパク質の蓄積を亢進する。LC3−II及びp62タンパク質は、オートファジーに必要なタンパク質であり、オートファジーによって生成、分解されることから、オートファジー活性のマーカーとして用いられている(Mizushima N, Yoshimori T (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545.)。したがって、斯かる2つのタンパク質の蓄積を亢進する本発明の化合物は、オートファジー抑制作用を有するものと考えられる。
プログアニル又はその塩についても、オートリソゾームにおけるタンパク質分解を阻害するChloroquine diphosphate存在下でのLC3−IIの蓄積を抑制することから、オートファジー抑制作用を有するものと考えられる。なお、この場合、LC3−II自身がオートファジーで分解されるため、詳細には、分解阻害剤による分解阻害時のLC3−IIの蓄積がオートファジー活性のマーカーとなる(Mizushima N, Yoshimori T (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545.)。
そして、ケラチノサイト内におけるメラニンの分解にはオートファジーが関与することが明らかにされていることから(前記特許文献1)、本発明の化合物による、ケラチノサイトにおけるメラニン量の蓄積・増加、それによる皮膚色の黒化は、オートファジーの活性が抑制され、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解が抑制されたことに基づくと考えられる。
したがって、本発明の化合物を、動物、好ましくはヒトに投与することにより、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解抑制、オートファジーの抑制、皮膚又は毛髪色の黒化、白髪の予防又は改善が可能となる。
すなわち、本発明の化合物は、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、及び白髪予防又は改善剤となり、メラニン分解抑制のため、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制のため、皮膚又は毛髪色黒化のため、及び白髪の予防又は改善のために使用することができる。
ここで、「ケラチノサイトにおけるオートファジーの抑制」とは、ケラチノサイトにおいて、オートファジー活性の抑制、特にオートファジー経路におけるファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長のステップの活動を抑制することにより、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させることを意味する。
尚、オートファジーの活性は、LC3−II及びp62タンパク質の蓄積量の他、リソソーム阻害剤の添加又は未添加において、斯かるタンパク質のターンオーバーを測定するフラックス・アッセイによっても測定・評価することができる。
尚、オートファジーの活性は、LC3−II及びp62タンパク質の蓄積量の他、リソソーム阻害剤の添加又は未添加において、斯かるタンパク質のターンオーバーを測定するフラックス・アッセイによっても測定・評価することができる。
また、「皮膚又は毛髪色黒化」とは、メラニン産生能を有する皮膚又は毛髪において、メラニン量を増加してその色を暗色化させることを意味する。したがって、例えば尋常性白斑のようなメラニン産生能を喪失した皮膚に対する皮膚色の回復を含むものではない。
すなわち、本発明のケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、及び皮膚又は毛髪色黒化剤は、尋常性白斑の治療剤にはならないが、尋常性白斑の治療剤と併用することにより、メラニン分解を抑制し皮膚色を黒化するために使用することは可能であり、本発明においては斯かる使用態様を制限するものではない。
すなわち、本発明のケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、及び皮膚又は毛髪色黒化剤は、尋常性白斑の治療剤にはならないが、尋常性白斑の治療剤と併用することにより、メラニン分解を抑制し皮膚色を黒化するために使用することは可能であり、本発明においては斯かる使用態様を制限するものではない。
本明細書において、本発明の化合物のヒトへの使用は、治療的使用であってもよく、又は美容目的での使用を含む非治療的使用であってもよい。
「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。本発明の化合物の非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色の黒化のための使用、例えばエステティシャン、美容師等による使用等が挙げられる。
また、本明細書において、「改善」とは、症状又は状態の好転、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、個体における症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の症状の発症の危険性を低下させることをいう。
「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。本発明の化合物の非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色の黒化のための使用、例えばエステティシャン、美容師等による使用等が挙げられる。
また、本明細書において、「改善」とは、症状又は状態の好転、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、個体における症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の症状の発症の危険性を低下させることをいう。
また、本発明の化合物は、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤を製造するために使用することができる。
本発明のケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、及び白髪予防又は改善剤は、メラニン分解抑制、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制、皮膚又は毛髪色の黒化、又は白髪予防又は改善を目的とした、医薬品、医薬部外品若しくは化粧品であり得、又は当該医薬品、医薬部外品若しくは化粧品を製造するための原料又は素材であり得る。
上記医薬品又は医薬部外品は、その投与形態は任意であり、経口投与、非経口投与の何れでもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形製剤、ならびにエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体製剤が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、外用、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、貼付等の各製剤が挙げられる。好ましくは、当該医薬品又は医薬部外品は、皮膚外用剤の形態であるのが好ましく、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の形態が挙げられる。
上記化粧品の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアジェル、ヘアクリーム、トリートメント、ヘアスプレー、エアゾルムース、シャンプー、リンス等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられる。
上記医薬品、医薬部外品若しくは化粧品に係る製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明の化合物を、製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等と共に混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明の化合物の他、それぞれ医薬品、医薬部外品、化粧品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
当該製剤組成物中の本発明のフェンホルミン又はその塩、ベルベリン又はその塩、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、プログアニル又はその塩の含有量は、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、一般的に好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.05質量%以上、さらに好ましくは0.1質量%以上、且つ好ましくは10質量%以下、より好ましく5質量%以下、さらに好ましくは2質量%以下であり、また好ましくは0.01〜10質量%、より好ましくは0.05〜5質量%、さらに好ましくは0.1〜2質量%である。
上記製剤組成物によるフェンホルミン又はその塩、ベルベリン又はその塩、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、プログアニル又はその塩の投与量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人(60kg)1人当たり1日、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、例えば好ましくは0.1mg以上、より好ましくは1mg以上、さらに好ましくは5mg以上であり、且つ好ましくは5,000mg以下、より好ましくは1,000mg以下、さらに好ましくは500mg以下である。また、好ましくは0.1〜5,000mg、より好ましくは1〜1,000mg、さらに好ましくは5〜500mgである。
化粧品のような外用剤の塗布による投与の場合、100cm2当たりの1回の投与量は、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、好ましくは0.01mg以上、より好ましくは0.05mg以上、さらに好ましくは0.1mg以上であり、且つ好ましくは10mg以下、より好ましくは5mg以下、さらに好ましくは2mg以下である。また、好ましくは0.01〜10mg、より好ましくは0.05〜5mg、さらに好ましくは0.1〜2mgである。
化粧品のような外用剤の塗布による投与の場合、100cm2当たりの1回の投与量は、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、好ましくは0.01mg以上、より好ましくは0.05mg以上、さらに好ましくは0.1mg以上であり、且つ好ましくは10mg以下、より好ましくは5mg以下、さらに好ましくは2mg以下である。また、好ましくは0.01〜10mg、より好ましくは0.05〜5mg、さらに好ましくは0.1〜2mgである。
また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、1日1回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、好ましくは、皮膚の褐色化、白髪の予防又は改善を所望するヒトである。通常は、上記の効果発現を期待する部位に直接適用することが好ましい。上記の効果発現を期待する部位としては、皮膚の褐色化の場合、紫外線防御能を向上させたい部位や、審美面から皮膚を褐色化させたい部位、例えば、日常的に紫外線や人目に晒される機会の多い顔や手足等の皮膚やセルフタンニング剤を投与する皮膚が挙げられる。また、白髪の予防又は改善の場合、毛が生えている皮膚が挙げられ、特に毛が生えている頭部の皮膚が好ましい。
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、好ましくは、皮膚の褐色化、白髪の予防又は改善を所望するヒトである。通常は、上記の効果発現を期待する部位に直接適用することが好ましい。上記の効果発現を期待する部位としては、皮膚の褐色化の場合、紫外線防御能を向上させたい部位や、審美面から皮膚を褐色化させたい部位、例えば、日常的に紫外線や人目に晒される機会の多い顔や手足等の皮膚やセルフタンニング剤を投与する皮膚が挙げられる。また、白髪の予防又は改善の場合、毛が生えている皮膚が挙げられ、特に毛が生えている頭部の皮膚が好ましい。
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
<1>ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
<2>ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
<3>ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
<4>ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
<5>プログアニル又はその塩を含有する皮膚外用剤。
<6>上記<5>において、皮膚外用剤中のプログアニル又はその塩の含有量は、プログアニル換算で、好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.05質量%以上、さらに好ましくは0.1質量%以上、且つ好ましくは10質量%以下、より好ましく5質量%以下、さらに好ましくは2質量%以下であり、また好ましくは0.01〜10質量%、より好ましくは0.05〜5質量%、さらに好ましくは0.1〜2質量%である。
<2>ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
<3>ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
<4>ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
<5>プログアニル又はその塩を含有する皮膚外用剤。
<6>上記<5>において、皮膚外用剤中のプログアニル又はその塩の含有量は、プログアニル換算で、好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.05質量%以上、さらに好ましくは0.1質量%以上、且つ好ましくは10質量%以下、より好ましく5質量%以下、さらに好ましくは2質量%以下であり、また好ましくは0.01〜10質量%、より好ましくは0.05〜5質量%、さらに好ましくは0.1〜2質量%である。
<7>ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<8>ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<9>皮膚又は毛髪色黒化剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<10>白髪予防又は改善剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<8>ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<9>皮膚又は毛髪色黒化剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<10>白髪予防又は改善剤を製造するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<11>ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上。
<12>ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上。
<13>皮膚又は毛髪色黒化に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上。
<14>白髪予防又は改善に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上。
<15>上記<11>〜<14>において、使用濃度は、フェンホルミン、ベルベリン、或いはプログアニル換算で、好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.05質量%以上、さらに好ましくは0.1質量%以上、且つ好ましくは10質量%以下、より好ましく5質量%以下、さらに好ましくは2質量%以下であり、また好ましくは0.01〜10質量%、より好ましくは0.05〜5質量%、さらに好ましくは0.1〜2質量%である。
<12>ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上。
<13>皮膚又は毛髪色黒化に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上。
<14>白髪予防又は改善に使用するための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上。
<15>上記<11>〜<14>において、使用濃度は、フェンホルミン、ベルベリン、或いはプログアニル換算で、好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.05質量%以上、さらに好ましくは0.1質量%以上、且つ好ましくは10質量%以下、より好ましく5質量%以下、さらに好ましくは2質量%以下であり、また好ましくは0.01〜10質量%、より好ましくは0.05〜5質量%、さらに好ましくは0.1〜2質量%である。
<16>ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<17>ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<18>皮膚又は毛髪色黒化のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<19>白髪予防又は改善のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<20>上記<16>〜<19>において、使用濃度は、フェンホルミン、ベルベリン、或いはプログアニル換算で、好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.05質量%以上、さらに好ましくは0.1質量%以上、且つ好ましくは10質量%以下、より好ましく5質量%以下、さらに好ましくは2質量%以下であり、また好ましくは0.01〜10質量%、より好ましくは0.05〜5質量%、さらに好ましくは0.1〜2質量%である。
<21>上記<16>〜<20>において、上記使用は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色黒化又は白髪予防又は改善のための非治療的な使用である。
<17>ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<18>皮膚又は毛髪色黒化のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<19>白髪予防又は改善のための、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上の使用。
<20>上記<16>〜<19>において、使用濃度は、フェンホルミン、ベルベリン、或いはプログアニル換算で、好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.05質量%以上、さらに好ましくは0.1質量%以上、且つ好ましくは10質量%以下、より好ましく5質量%以下、さらに好ましくは2質量%以下であり、また好ましくは0.01〜10質量%、より好ましくは0.05〜5質量%、さらに好ましくは0.1〜2質量%である。
<21>上記<16>〜<20>において、上記使用は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色黒化又は白髪予防又は改善のための非治療的な使用である。
<22>ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<23>ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<24>皮膚又は毛髪色黒化方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<25>白髪予防又は改善方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<26>上記<22>〜<25>において、投与又は摂取量は、成人(60kg)1人当たり1日、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、好ましくは0.1mg以上、より好ましくは1mg以上、さらに好ましくは5mg以上であり、且つ好ましくは5,000mg以下、より好ましくは1,000mg以下、さらに好ましくは500mg以下である。また、好ましくは0.1〜5,000mg、より好ましくは1〜1,000mg、さらに好ましくは5〜500mgである。
<27>上記<22>〜<25>において、外用剤の塗布による100cm2当たりの1回の投与量は、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、好ましくは0.01mg以上、より好ましくは0.05mg以上、さらに好ましくは0.1mg以上であり、且つ好ましくは10mg以下、より好ましくは5mg以下、さらに好ましくは2mg以下である。また、好ましくは0.01〜10mg、より好ましくは0.05〜5mg、さらに好ましくは0.1〜2mgである。
<28>上記<22>〜<27>において、上記方法は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色黒化又は白髪予防又は改善のための非治療的な方法である。
<23>ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<24>皮膚又は毛髪色黒化方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<25>白髪予防又は改善方法であって、それを必要とする対象にベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<26>上記<22>〜<25>において、投与又は摂取量は、成人(60kg)1人当たり1日、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、好ましくは0.1mg以上、より好ましくは1mg以上、さらに好ましくは5mg以上であり、且つ好ましくは5,000mg以下、より好ましくは1,000mg以下、さらに好ましくは500mg以下である。また、好ましくは0.1〜5,000mg、より好ましくは1〜1,000mg、さらに好ましくは5〜500mgである。
<27>上記<22>〜<25>において、外用剤の塗布による100cm2当たりの1回の投与量は、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、好ましくは0.01mg以上、より好ましくは0.05mg以上、さらに好ましくは0.1mg以上であり、且つ好ましくは10mg以下、より好ましくは5mg以下、さらに好ましくは2mg以下である。また、好ましくは0.01〜10mg、より好ましくは0.05〜5mg、さらに好ましくは0.1〜2mgである。
<28>上記<22>〜<27>において、上記方法は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色黒化又は白髪予防又は改善のための非治療的な方法である。
<29>上記<1>〜<4>、<7>〜<28>において、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、オレゴングレープ、キハダ、オウレン、バーベリー又はゴールデンシールの抽出物である。
<30>上記<29>において、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、オレゴングレープの根若しくは根茎、キハダの樹皮、オウレンの根若しくは根茎、バーベリーの根若しくは根茎又はゴールデンシールの根若しくは根茎の抽出物である。
<31>上記<1>〜<4>、<7>〜<20>において、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、極性溶媒による抽出エキスである。
<32>上記<31>において、極性溶媒は水、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノール、tert−ブタノール、1−ペンタノール、1−ヘキサノール、1−ヘプタノール、1−オクタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、1,4−ブチレングリコール、グリセリン等の1価〜3価のアルコール、ポリエチレングリコール、又はこれら溶媒の一種又は二種以上を組み合わせである。
<33>上記<31>において、極性溶媒は水、1価〜3価のアルコール、又は1価〜3価のアルコールの水溶液である。
<34>上記<33>において、1価〜3価のアルコールはエタノール、メタノール、1,3−ブチレングリコール、グリセリンである。
<30>上記<29>において、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、オレゴングレープの根若しくは根茎、キハダの樹皮、オウレンの根若しくは根茎、バーベリーの根若しくは根茎又はゴールデンシールの根若しくは根茎の抽出物である。
<31>上記<1>〜<4>、<7>〜<20>において、ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物は、極性溶媒による抽出エキスである。
<32>上記<31>において、極性溶媒は水、メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノール、tert−ブタノール、1−ペンタノール、1−ヘキサノール、1−ヘプタノール、1−オクタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、1,4−ブチレングリコール、グリセリン等の1価〜3価のアルコール、ポリエチレングリコール、又はこれら溶媒の一種又は二種以上を組み合わせである。
<33>上記<31>において、極性溶媒は水、1価〜3価のアルコール、又は1価〜3価のアルコールの水溶液である。
<34>上記<33>において、1価〜3価のアルコールはエタノール、メタノール、1,3−ブチレングリコール、グリセリンである。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
<評価サンプルの調製>
・フェンホルミン(Phenformin)は、Sigma-Aldrich社から購入し、DMSOに溶解した上で、培地中に指定の濃度で添加した。
・ベルベリン(Berberine)は、Santa Cruz Biotechnology社から購入し、DMSOに溶解した上で、培地中に指定の濃度で添加した。
・ゴールデンシール抽出物(Goldenseal extract)は、Making Cosmetics, Inc.から購入し、培地中に指定の濃度で添加した。ゴールデンシールの根を抽出部位として使用し、グリセリン水溶液による抽出で得られた固形分20%の抽出物である。
・オウバク抽出物(OUBAKU Liquid B)は、キハダ樹皮の抽出物であり、一丸ファルコス社から入手し、培地中に指定の濃度で添加した。1,3−ブチレングリコールによる抽出で得られた固形分1.25%の抽出物である。
・オウレン抽出物(OUREN Liquid B)は、オウレン根茎の抽出物であり、一丸ファルコス社から入手し、培地中に指定の濃度で添加した。1,3−ブチレングリコールによる抽出で得られた固形分0.5%の抽出物である。
・プログアニル(Proguanil)は、プログアニル塩酸塩(Proguanil hydrochloride)(以下、単に「プログアニル」と称する)を、Sigma−Aldrichより購入し、DMSOに溶解した上で、培地中に所定の濃度で添加した。
・フェンホルミン(Phenformin)は、Sigma-Aldrich社から購入し、DMSOに溶解した上で、培地中に指定の濃度で添加した。
・ベルベリン(Berberine)は、Santa Cruz Biotechnology社から購入し、DMSOに溶解した上で、培地中に指定の濃度で添加した。
・ゴールデンシール抽出物(Goldenseal extract)は、Making Cosmetics, Inc.から購入し、培地中に指定の濃度で添加した。ゴールデンシールの根を抽出部位として使用し、グリセリン水溶液による抽出で得られた固形分20%の抽出物である。
・オウバク抽出物(OUBAKU Liquid B)は、キハダ樹皮の抽出物であり、一丸ファルコス社から入手し、培地中に指定の濃度で添加した。1,3−ブチレングリコールによる抽出で得られた固形分1.25%の抽出物である。
・オウレン抽出物(OUREN Liquid B)は、オウレン根茎の抽出物であり、一丸ファルコス社から入手し、培地中に指定の濃度で添加した。1,3−ブチレングリコールによる抽出で得られた固形分0.5%の抽出物である。
・プログアニル(Proguanil)は、プログアニル塩酸塩(Proguanil hydrochloride)(以下、単に「プログアニル」と称する)を、Sigma−Aldrichより購入し、DMSOに溶解した上で、培地中に所定の濃度で添加した。
実施例1 ヒト皮膚組織における皮膚黒化作用
(1)米国スキンバンクNational Disease Research Interchange(NDRI)から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を購入した。ヒト皮膚組織は、皮下脂肪を切除した後に、ナイフで約1cm×約1cmの片に細断し、6−well plateを使用して37℃ 5%CO2下にて培養した。Fetal Bovine Serum(FBS)を10%(v/v)含むAdvanced−DMEM培地(いずれもLife Technologies)を培養に用いた。
(1)米国スキンバンクNational Disease Research Interchange(NDRI)から、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を購入した。ヒト皮膚組織は、皮下脂肪を切除した後に、ナイフで約1cm×約1cmの片に細断し、6−well plateを使用して37℃ 5%CO2下にて培養した。Fetal Bovine Serum(FBS)を10%(v/v)含むAdvanced−DMEM培地(いずれもLife Technologies)を培養に用いた。
(2)上記(1)の方法で調製されたヒト皮膚組織を6−well plateに静置し、フェンホルミンを終濃度300μMで培地中に添加して、組織培養を開始した。2〜3日毎に培地交換を行った。6日後又は8日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。
1名のHispanic及び2名のAfrican Americanに由来する皮膚組織(Hispanic:培養8日後の皮膚組織、African American:培養6日後の皮膚組織)を用いて評価した結果、いずれの培養実験においてもフェンホルミンによって明らかな皮膚色の黒化が誘導された(図1A−1C)。
1名のHispanic及び2名のAfrican Americanに由来する皮膚組織(Hispanic:培養8日後の皮膚組織、African American:培養6日後の皮膚組織)を用いて評価した結果、いずれの培養実験においてもフェンホルミンによって明らかな皮膚色の黒化が誘導された(図1A−1C)。
(3)次に、培養後の皮膚組織を用いて、Fontana−Masson染色によりメラニンの沈着を観察した。同染色には、American Mastertech Scientific,Inc.社製のFontana−Masson Stain Kitを使用した。
Hispanic(図1Aの皮膚)及びAfrican American(図1Bの皮膚)の皮膚組織において、フェンホルミン処理により表皮におけるメラニンの顕著な蓄積が認められた(図2A及び2B)。拡大像で示したように、フェンホルミンを添加することで、表皮の基底層のみならず、有棘層や顆粒層に至るまで、メラニンがより広範囲に沈着している様子が観察された。
Hispanic(図1Aの皮膚)及びAfrican American(図1Bの皮膚)の皮膚組織において、フェンホルミン処理により表皮におけるメラニンの顕著な蓄積が認められた(図2A及び2B)。拡大像で示したように、フェンホルミンを添加することで、表皮の基底層のみならず、有棘層や顆粒層に至るまで、メラニンがより広範囲に沈着している様子が観察された。
実施例2 ヒト皮膚組織におけるメラニン蓄積亢進作用
また、実施例1(1)の方法で調製されたAfrican Americanに由来する皮膚組織を6−well plateに静置し、フェンホルミンの存在下又は非存在下で6日間培養し、皮膚組織から抽出したタンパク質を用いて、メラノソームを構成する主要なタンパク質であるPmel17のタンパク質量をWestern−blotting法にて解析した。1次抗体として、マウス抗ヒトPmel17抗体(DAKO)を用いた。2次抗体として、ヤギ抗マウスIgG抗体を使用し、ECL prime試薬(GE Healthcare)とODYSSEY Fc Imaging System(LICOR)を用いてシグナルを検出した。内部標準として、β−actinタンパク質を同様に検出した。メラニン沈着の誘導に一致して、フェンホルミンによるPmel17タンパク質の増加も認められた(図3A)。
また、実施例1(1)の方法で調製されたAfrican Americanに由来する皮膚組織を6−well plateに静置し、フェンホルミンの存在下又は非存在下で6日間培養し、皮膚組織から抽出したタンパク質を用いて、メラノソームを構成する主要なタンパク質であるPmel17のタンパク質量をWestern−blotting法にて解析した。1次抗体として、マウス抗ヒトPmel17抗体(DAKO)を用いた。2次抗体として、ヤギ抗マウスIgG抗体を使用し、ECL prime試薬(GE Healthcare)とODYSSEY Fc Imaging System(LICOR)を用いてシグナルを検出した。内部標準として、β−actinタンパク質を同様に検出した。メラニン沈着の誘導に一致して、フェンホルミンによるPmel17タンパク質の増加も認められた(図3A)。
実施例3 ヒト皮膚組織におけるオートファジー抑制作用
さらに、実施例1(1)の方法で調製されたAfrican Americanに由来する皮膚組織を6−well plateに静置し、異なる濃度のフェンホルミンの存在下又は非存在下で4日間培養し、皮膚組織から抽出したタンパク質を用いたWestern−blotting解析により、オートファゴソーム膜に局在し、オートファジーによって最終的に分解されるLC3−II及びp62タンパク質の発現量を定量した。1次抗体としてマウス抗ヒトLC3抗体(Cosmo Bio)及びウサギ抗ヒトp62抗体(MBL International)を用いた。フェンホルミン添加によって、両マーカーに蓄積が認められたことから、オートファジーの抑制が示唆された(図3B)。
さらに、実施例1(1)の方法で調製されたAfrican Americanに由来する皮膚組織を6−well plateに静置し、異なる濃度のフェンホルミンの存在下又は非存在下で4日間培養し、皮膚組織から抽出したタンパク質を用いたWestern−blotting解析により、オートファゴソーム膜に局在し、オートファジーによって最終的に分解されるLC3−II及びp62タンパク質の発現量を定量した。1次抗体としてマウス抗ヒトLC3抗体(Cosmo Bio)及びウサギ抗ヒトp62抗体(MBL International)を用いた。フェンホルミン添加によって、両マーカーに蓄積が認められたことから、オートファジーの抑制が示唆された(図3B)。
実施例4 ヒト皮膚組織における皮膚色黒化作用(用量依存性)
実施例1(1)の方法で調製されたヒト皮膚組織を6−well plateに静置し、フェンホルミンを終濃度100、200、300μMで培地中に添加して、組織培養を開始した。4日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。4日間処理することによって、認知可能な黒化が用量依存的に観察された(図4)。なお、皮膚色の変化と相関したメラニン沈着も、Fontana−Masson染色によって確認済みである(データ非掲載)。
実施例1(1)の方法で調製されたヒト皮膚組織を6−well plateに静置し、フェンホルミンを終濃度100、200、300μMで培地中に添加して、組織培養を開始した。4日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。4日間処理することによって、認知可能な黒化が用量依存的に観察された(図4)。なお、皮膚色の変化と相関したメラニン沈着も、Fontana−Masson染色によって確認済みである(データ非掲載)。
また、実施例1(1)の方法で調製されたCaucasianとAfrican Americanに由来する皮膚組織を6−well plateに静置し、ベルベリンをCaucasian由来皮膚に対しては、終濃度10、30μMで、African American由来皮膚に対しては、終濃度30、100μMで培地中に添加して、組織培養を開始した。6日後又は4日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。
いずれの検体においても、ベルベリンの用量依存的に皮膚色の黒化が誘導され、表皮層におけるメラニン沈着を伴っていることを組織染色によっても確認した(図5及び6)。
いずれの検体においても、ベルベリンの用量依存的に皮膚色の黒化が誘導され、表皮層におけるメラニン沈着を伴っていることを組織染色によっても確認した(図5及び6)。
実施例5 ベルベリンのオートファジー抑制作用
ベルベリンによる皮膚色黒化作用の解明の一環として、表皮細胞のオートファジーに及ぼす影響を調べた。6−well plateに播種した表皮細胞に対して、ベルベリンを終濃度10、30、60μMで培地中に添加して、24時間培養した。タンパク質を抽出し、Western−blotting解析により、オートファジーのマーカーであるLC3−IIとp62タンパク質の発現量を解析した。ベルベリンの添加によって、用量依存的なLC3−II及びp62タンパク質の蓄積が観察されたことから、オートファジー抑制作用が示唆された(図7)。
ベルベリンによる皮膚色黒化作用の解明の一環として、表皮細胞のオートファジーに及ぼす影響を調べた。6−well plateに播種した表皮細胞に対して、ベルベリンを終濃度10、30、60μMで培地中に添加して、24時間培養した。タンパク質を抽出し、Western−blotting解析により、オートファジーのマーカーであるLC3−IIとp62タンパク質の発現量を解析した。ベルベリンの添加によって、用量依存的なLC3−II及びp62タンパク質の蓄積が観察されたことから、オートファジー抑制作用が示唆された(図7)。
実施例6 メラノソーム分解抑制作用
フェンホルミンとベルベリンによる皮膚色黒化作用の解明の一環として、これらの成分が表皮細胞のメラノソーム分解に及ぼす影響を調べた。表皮細胞は、米国スキンバンクNational Disease Research Interchange(NDRI)から入手した包皮組織より、所定の方法にて単離・培養した。メラノソームを、所定の方法によりMNT−1細胞株より調製し(Murase et al. (2013) J Invest Dermatol, 133:2416-2424.)、一定量のメラノソームを表皮細胞に添加し、24時間培養した。6−well plateの1 wellあたり、35cm2の面積で培養したMNT−1細胞株から調製したメラノソームを添加した。細胞をPBSで洗浄した後、メラノソームを取り込ませた表皮細胞に対して、フェンホルミンを終濃度100、200μMで、ベルベリンを終濃度10、30、60μMで、及びベルベリンを多く含むゴールデンシール抽出物を終濃度0.2、0.5%(v/v)で添加して、更に24時間培養した。タンパク質を抽出し、Western−blotting解析により、メラノソームを構成する主要なタンパク質であるPmel17の発現量を解析した。いずれの成分の添加においても用量依存的なPmel17タンパク質の蓄積が観察されたことから、メラノソーム分解抑制作用が示唆された(図8)。
フェンホルミンとベルベリンによる皮膚色黒化作用の解明の一環として、これらの成分が表皮細胞のメラノソーム分解に及ぼす影響を調べた。表皮細胞は、米国スキンバンクNational Disease Research Interchange(NDRI)から入手した包皮組織より、所定の方法にて単離・培養した。メラノソームを、所定の方法によりMNT−1細胞株より調製し(Murase et al. (2013) J Invest Dermatol, 133:2416-2424.)、一定量のメラノソームを表皮細胞に添加し、24時間培養した。6−well plateの1 wellあたり、35cm2の面積で培養したMNT−1細胞株から調製したメラノソームを添加した。細胞をPBSで洗浄した後、メラノソームを取り込ませた表皮細胞に対して、フェンホルミンを終濃度100、200μMで、ベルベリンを終濃度10、30、60μMで、及びベルベリンを多く含むゴールデンシール抽出物を終濃度0.2、0.5%(v/v)で添加して、更に24時間培養した。タンパク質を抽出し、Western−blotting解析により、メラノソームを構成する主要なタンパク質であるPmel17の発現量を解析した。いずれの成分の添加においても用量依存的なPmel17タンパク質の蓄積が観察されたことから、メラノソーム分解抑制作用が示唆された(図8)。
実施例7 オウバクエキスとオウレンエキスの皮膚色黒化作用
実施例1(1)の方法で調製されたAfrican Americanに由来する皮膚組織を6−well plateに静置し、オウバクエキスとオウレンエキスを終濃度1%(V/V)で培地中に添加して、組織培養を開始した。6日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。
いずれの検体においても、オウバクエキスとオウレンエキスの添加によって皮膚色の黒化が誘導され、表皮層におけるメラニン沈着を伴っていることを組織染色によっても確認した(図9)。
実施例1(1)の方法で調製されたAfrican Americanに由来する皮膚組織を6−well plateに静置し、オウバクエキスとオウレンエキスを終濃度1%(V/V)で培地中に添加して、組織培養を開始した。6日後の皮膚組織の外観を観察し、写真を撮影した。
いずれの検体においても、オウバクエキスとオウレンエキスの添加によって皮膚色の黒化が誘導され、表皮層におけるメラニン沈着を伴っていることを組織染色によっても確認した(図9)。
実施例8 フェンホルミンの毛色黒化作用
ヒト毛包は、米国の皮膚科医より入手した外科手術由来の正常ヒト頭皮組織(Caucasian由来)より、外科的に単離した。単離したヒト毛包は37℃ 5%CO2下にて、William E培地にinsulin(Sigma−Aldrich)を20μg/ml、hydrocortisone(Sigma−Aldrich)を40ng/ml、L−glutamine(Life Technologies)を2mM、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液(Life Technologies)を1%(v/v)添加した培地で培養した(いずれも終濃度)。単離したヒト毛包を24−well plateに静置し、フェンホルミンを終濃度200μMで培地中に添加して、組織培養を開始した。培養1日後と3日後に培地交換し、5日後の毛包組織をOCTコンパウンド(TissueTek)で包埋して凍結した。これらの毛包組織を用いて、Fontana−Masson染色によりメラニンの沈着を観察した。フェンホルミン処理によって、培養した毛包組織に明らかな毛色の黒化が誘導された(図10)。
ヒト毛包は、米国の皮膚科医より入手した外科手術由来の正常ヒト頭皮組織(Caucasian由来)より、外科的に単離した。単離したヒト毛包は37℃ 5%CO2下にて、William E培地にinsulin(Sigma−Aldrich)を20μg/ml、hydrocortisone(Sigma−Aldrich)を40ng/ml、L−glutamine(Life Technologies)を2mM、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液(Life Technologies)を1%(v/v)添加した培地で培養した(いずれも終濃度)。単離したヒト毛包を24−well plateに静置し、フェンホルミンを終濃度200μMで培地中に添加して、組織培養を開始した。培養1日後と3日後に培地交換し、5日後の毛包組織をOCTコンパウンド(TissueTek)で包埋して凍結した。これらの毛包組織を用いて、Fontana−Masson染色によりメラニンの沈着を観察した。フェンホルミン処理によって、培養した毛包組織に明らかな毛色の黒化が誘導された(図10)。
実施例9 フェンホルミンのヒト毛包におけるオートファジー抑制作用
実施例8の方法で培養したヒト組織培養毛包からタンパク質を抽出し、Western−blotting解析により、オートファジーのマーカーであるLC3−IIとp62タンパク質の発現量を解析した。フェンホルミンの添加によって、LC3−II及びp62タンパク質の蓄積が観察されたことから、オートファジー抑制作用が示唆された(図11)。
実施例8の方法で培養したヒト組織培養毛包からタンパク質を抽出し、Western−blotting解析により、オートファジーのマーカーであるLC3−IIとp62タンパク質の発現量を解析した。フェンホルミンの添加によって、LC3−II及びp62タンパク質の蓄積が観察されたことから、オートファジー抑制作用が示唆された(図11)。
実施例10:プログアニルが皮膚色に及ぼす影響
(1)組織培養
医科大学の形成外科学部門より、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。
ヒト皮膚組織は、皮下脂肪をトリミングした後に、ナイフで約1cm×1cmの大きさに小片化し、6−ウェルプレートを使用して37℃ 5Vol%CO2の条件下で培養した。培養には、Fetal Bovine Serum(FBS)を10%(v/v)含むAdvanced DMEM培地(いずれもThermo Fisher Scientific)を使用した。
(1)組織培養
医科大学の形成外科学部門より、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。
ヒト皮膚組織は、皮下脂肪をトリミングした後に、ナイフで約1cm×1cmの大きさに小片化し、6−ウェルプレートを使用して37℃ 5Vol%CO2の条件下で培養した。培養には、Fetal Bovine Serum(FBS)を10%(v/v)含むAdvanced DMEM培地(いずれもThermo Fisher Scientific)を使用した。
(2)プログアニルが皮膚色に及ぼす影響
ヒト皮膚組織を6−ウェルプレートに静置し、プログアニルを終濃度で150、180、210、240、270、300μMになるように培地中に添加した上で組織培養を実施した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。2〜3日毎に培地を交換しながら、培養開始から5日間経過後に皮膚組織の外観を観察し、写真撮影を行った。その結果、プログアニルは、用量依存的に皮膚色の黒化を誘導することを確認した(図12)。
ヒト皮膚組織を6−ウェルプレートに静置し、プログアニルを終濃度で150、180、210、240、270、300μMになるように培地中に添加した上で組織培養を実施した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。2〜3日毎に培地を交換しながら、培養開始から5日間経過後に皮膚組織の外観を観察し、写真撮影を行った。その結果、プログアニルは、用量依存的に皮膚色の黒化を誘導することを確認した(図12)。
(3)組織切片の染色及び観察
目視で認識できる程度に皮膚色の黒化が誘導された、プログアニルを終濃度で180μM添加して5日間培養した皮膚組織を用いて、Fontana−Masson染色により、メラニンの沈着を観察した。具体的には、皮膚組織を包埋したパラフィンブロックを薄切して5μm厚のパラフィン切片を作製した後、フォンタナアンモニア銀液(武藤化学)を用いて室温で2時間反応させ、メラニン顆粒を識別できるようにした。その後、ケルンエヒトロート液(武藤化学)を用いて核染色を実施した。DMSOを添加したコントロールの皮膚と比較して、プログアニル180μMを添加した皮膚では、メラニンが表皮のより広範囲で蓄積している様子が観察された(図13;上段)。また、同時にHE染色を行うことで、プログアニルを添加することで組織にダメージが誘導されていないことも確認した(図13;下段)。
目視で認識できる程度に皮膚色の黒化が誘導された、プログアニルを終濃度で180μM添加して5日間培養した皮膚組織を用いて、Fontana−Masson染色により、メラニンの沈着を観察した。具体的には、皮膚組織を包埋したパラフィンブロックを薄切して5μm厚のパラフィン切片を作製した後、フォンタナアンモニア銀液(武藤化学)を用いて室温で2時間反応させ、メラニン顆粒を識別できるようにした。その後、ケルンエヒトロート液(武藤化学)を用いて核染色を実施した。DMSOを添加したコントロールの皮膚と比較して、プログアニル180μMを添加した皮膚では、メラニンが表皮のより広範囲で蓄積している様子が観察された(図13;上段)。また、同時にHE染色を行うことで、プログアニルを添加することで組織にダメージが誘導されていないことも確認した(図13;下段)。
実施例11:プログアニルがメラノサイト単独培養系においてメラニン生成に及ぼす影響
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(Human Epidermal Melanocytes,neonatal,lightly pigmented donor(HEMn−LP)及びHuman Epidermal Melanocytes,neonatal,darkly pigmented donor(HEMn−DP);メラノサイト(lightly)及びメラノサイト(darkly))、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はThermo Fisher Scientific社より購入した。メラノサイトは、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(Human Epidermal Melanocytes,neonatal,lightly pigmented donor(HEMn−LP)及びHuman Epidermal Melanocytes,neonatal,darkly pigmented donor(HEMn−DP);メラノサイト(lightly)及びメラノサイト(darkly))、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はThermo Fisher Scientific社より購入した。メラノサイトは、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。
(2)プログアニルがメラノサイト単独培養系におけるメラノサイトのドーパオキシダーゼ活性に及ぼす影響
メラノサイト(lightly及びdarkly)を2×104cells/ウェル(100μL/ウェル)の細胞密度で96−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Medium254(増殖添加剤(HMGS)のうち、ウシ胎児血清(FBS;Fetal Bovine Serum)、塩基性線維芽細胞成長因子(hFGF−B;Human Fibroblast growth factor−basic)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)含有、ホルボール12−ミリスチン酸13−アセテート(PMA;phorbol 12−myristate 13−acetate)不含)を用いた。2日後、プログアニルを終濃度で0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で4日間培養した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、培地を全量置換し(100μL/ウェル)、アラマーブルー(Bio−Rad AbD Serotec Limited)試薬を10μL/ウェルになるように添加した。37℃、5Vol%CO2の条件下で1時間インキュベートした後、培地の蛍光強度(Ex544nm/Em590nm)を測定することで細胞呼吸鎖(増殖)活性を評価した。その後、細胞の培養プレートをPBSで3回洗浄して、抽出Buffer(0.1M Tris−HCL(pH:7.2)、1%NP−40、0.01%SDS)を20μL/ウェル、Assay Buffer(4%ジメチルホルムアミド、100mM Sodium phosphate−buffered(pH:7.1))を20μL/ウェル添加した。4℃にて2時間かけて細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行ったが、その活性測定は、MBTH法(Winder A. et al., 1991, Eur. J. Biochem. 198:317-326)を基本とした次に示す方法で行った。すなわち、可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記Assay Bufferを80μL、20.7mM MBTH(3−メチル−2−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン)水溶液を60μL、基質として5mM L−DOPA(L−ジヒドロキシフェニルアラニン)水溶液を40μL加え、37℃にて30分間反応させた後、505nmの波長の吸光度を測定した。
その結果、DMSOのみを添加したコントロールと比較して、プログアニルがドーパオキシダーゼ活性を促進することはなかった(図14A、14B)。また、30μM以下の添加濃度域では細胞毒性は見られなかった(図14C、14D)。
メラノサイト(lightly及びdarkly)を2×104cells/ウェル(100μL/ウェル)の細胞密度で96−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Medium254(増殖添加剤(HMGS)のうち、ウシ胎児血清(FBS;Fetal Bovine Serum)、塩基性線維芽細胞成長因子(hFGF−B;Human Fibroblast growth factor−basic)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)含有、ホルボール12−ミリスチン酸13−アセテート(PMA;phorbol 12−myristate 13−acetate)不含)を用いた。2日後、プログアニルを終濃度で0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で4日間培養した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、培地を全量置換し(100μL/ウェル)、アラマーブルー(Bio−Rad AbD Serotec Limited)試薬を10μL/ウェルになるように添加した。37℃、5Vol%CO2の条件下で1時間インキュベートした後、培地の蛍光強度(Ex544nm/Em590nm)を測定することで細胞呼吸鎖(増殖)活性を評価した。その後、細胞の培養プレートをPBSで3回洗浄して、抽出Buffer(0.1M Tris−HCL(pH:7.2)、1%NP−40、0.01%SDS)を20μL/ウェル、Assay Buffer(4%ジメチルホルムアミド、100mM Sodium phosphate−buffered(pH:7.1))を20μL/ウェル添加した。4℃にて2時間かけて細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行ったが、その活性測定は、MBTH法(Winder A. et al., 1991, Eur. J. Biochem. 198:317-326)を基本とした次に示す方法で行った。すなわち、可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記Assay Bufferを80μL、20.7mM MBTH(3−メチル−2−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン)水溶液を60μL、基質として5mM L−DOPA(L−ジヒドロキシフェニルアラニン)水溶液を40μL加え、37℃にて30分間反応させた後、505nmの波長の吸光度を測定した。
その結果、DMSOのみを添加したコントロールと比較して、プログアニルがドーパオキシダーゼ活性を促進することはなかった(図14A、14B)。また、30μM以下の添加濃度域では細胞毒性は見られなかった(図14C、14D)。
(3)プログアニルがメラノサイト単独培養系におけるメラノサイトの細胞内メラニン量に及ぼす影響
メラノサイト(lightly及びdarkly)を2×105cells/ウェル(2mL/ウェル)の細胞密度で6−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Medium254(増殖添加剤(HMGS)のうち、ウシ胎児血清(FBS;Fetal Bovine Serum)、塩基性線維芽細胞成長因子(hFGF−B;Human Fibroblast growth factor−basic)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)含有、ホルボール12−ミリスチン酸13−アセテート(PMA;phorbol 12−myristate 13−acetate)不含)を用いた。翌日、プログアニルを終濃度で3、10、30μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は2〜3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いて1.5mLマイクロチューブに細胞を回収した。各チューブに2M NaOHを150 μL加えた後100℃、60分間の処理により細胞を溶解し、室温下において、21,640gで10分間の遠心処理により上清を回収した。回収した上清を405nmの波長を用いて吸光度を測定し、ウェル当たりのメラニン量を算出した。
その結果、DMSOのみを添加したコントロールと比較して、プログアニルは細胞内のメラニン量を増加させることはなかった(図15A、15B)。
メラノサイト(lightly及びdarkly)を2×105cells/ウェル(2mL/ウェル)の細胞密度で6−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Medium254(増殖添加剤(HMGS)のうち、ウシ胎児血清(FBS;Fetal Bovine Serum)、塩基性線維芽細胞成長因子(hFGF−B;Human Fibroblast growth factor−basic)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)含有、ホルボール12−ミリスチン酸13−アセテート(PMA;phorbol 12−myristate 13−acetate)不含)を用いた。翌日、プログアニルを終濃度で3、10、30μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で7日間培養した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、培地交換は2〜3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いて1.5mLマイクロチューブに細胞を回収した。各チューブに2M NaOHを150 μL加えた後100℃、60分間の処理により細胞を溶解し、室温下において、21,640gで10分間の遠心処理により上清を回収した。回収した上清を405nmの波長を用いて吸光度を測定し、ウェル当たりのメラニン量を算出した。
その結果、DMSOのみを添加したコントロールと比較して、プログアニルは細胞内のメラニン量を増加させることはなかった(図15A、15B)。
実施例12:プログアニルがケラチノサイト及びメラノサイトからなる共培養系においてメラニン生成に及ぼす影響
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(Human Epidermal Keratinocytes,neonatal(HEKn)lightly;ケラチノサイト)及び表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はThermo Fisher Scientific社より購入した。培地用増殖添加剤(Humedia−KG)は倉敷紡績より購入した。正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(Human Epidermal Melanocytes,neonatal,lightly pigmented donor(HEMn−LP)及びHuman Epidermal Melanocytes,neonatal,darkly pigmented donor(HEMn−DP);メラノサイト(lightly)及びメラノサイト(darkly))はThermo Fisher Scientific社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(Human Epidermal Keratinocytes,neonatal(HEKn)lightly;ケラチノサイト)及び表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)はThermo Fisher Scientific社より購入した。培地用増殖添加剤(Humedia−KG)は倉敷紡績より購入した。正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(Human Epidermal Melanocytes,neonatal,lightly pigmented donor(HEMn−LP)及びHuman Epidermal Melanocytes,neonatal,darkly pigmented donor(HEMn−DP);メラノサイト(lightly)及びメラノサイト(darkly))はThermo Fisher Scientific社より購入した。ケラチノサイト及びメラノサイトは、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。
(2)プログアニルが共培養系におけるメラノサイトのドーパオキシダーゼ活性に及ぼす影響
ケラチノサイトを96−ウェルプレートに1×104 cells/ウェル(100μL/ウェル)の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイト(lightly及びdarkly)を2×104 cells/ウェル(100μL/ウェル)の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、プログアニルを終濃度で0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で4日間培養を行った。この時の試験用培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF;Human Epidermal Growth Factor)以外のHumedia−KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンB)を含むEpilifeを用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、実施例11と同様の方法にて、細胞呼吸鎖(増殖)活性及びドーパオキシダーゼ活性を評価した。その結果、DMSOのみを添加したコントロールと比較して、プログアニルがドーパオキシダーゼ活性を促進することはなかった(図16A、16B)。また、30μM以下の添加濃度域では細胞毒性は見られなかった(図16C、16D)。
ケラチノサイトを96−ウェルプレートに1×104 cells/ウェル(100μL/ウェル)の細胞密度で播種し、翌日、メラノサイト(lightly及びdarkly)を2×104 cells/ウェル(100μL/ウェル)の細胞密度で播種した。さらにその翌日に、プログアニルを終濃度で0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1000μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で4日間培養を行った。この時の試験用培地としては、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF;Human Epidermal Growth Factor)以外のHumedia−KG増殖添加剤(インスリン、ハイドロコーチゾン、BPE、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンB)を含むEpilifeを用いた。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。培養終了後、実施例11と同様の方法にて、細胞呼吸鎖(増殖)活性及びドーパオキシダーゼ活性を評価した。その結果、DMSOのみを添加したコントロールと比較して、プログアニルがドーパオキシダーゼ活性を促進することはなかった(図16A、16B)。また、30μM以下の添加濃度域では細胞毒性は見られなかった(図16C、16D)。
実施例13:プログアニルが表皮角化細胞(ケラチノサイト)に及ぼす影響
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(Human Epidermal Keratinocytes,neonatal(HEKn)lightly;ケラチノサイト)はThermo Fisher Scientific社より購入した。メラノーマ細胞株MNT−1細胞は、Dr. Natali(University La Sapienza,Rome,Italy)より供与いただいた。ケラチノサイトは培地用増殖添加剤(Humedia−KG)(倉敷紡績)を添加した表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)(Thermo Fisher Scientific)中で37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。MNT−1細胞の増殖用培地として、AIM−V培地とFetal Bovine Serum(FBS)をそれぞれ10%(v/v)含むRPMI1640培地(いずれもThermo Fisher Scientific)を使用し、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(Human Epidermal Keratinocytes,neonatal(HEKn)lightly;ケラチノサイト)はThermo Fisher Scientific社より購入した。メラノーマ細胞株MNT−1細胞は、Dr. Natali(University La Sapienza,Rome,Italy)より供与いただいた。ケラチノサイトは培地用増殖添加剤(Humedia−KG)(倉敷紡績)を添加した表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)(Thermo Fisher Scientific)中で37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。MNT−1細胞の増殖用培地として、AIM−V培地とFetal Bovine Serum(FBS)をそれぞれ10%(v/v)含むRPMI1640培地(いずれもThermo Fisher Scientific)を使用し、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。
(2)メラノソーム画分の調製
MNT−1細胞からメラノソーム画分を所定の方法(Murase et al. (2013) J Invest Dermatol, 133:2416-2424.)により単離調製した。具体的には、175cm2フラスコに培養しコンフルエントに達したMNT−1細胞を0.05% Trypsin/EDTA(Thermo Fisher Scientific)で回収し、Phosphate−Buffered Saline(DPBS、no calcium、no magnesium;Thermo Fisher Scientific)(以下、PBSと略記)にて洗浄した。続いて、2mLのLysis buffer(0.1M Tris−HCL、pH7.5、1% Igepal CA−630、0.01% SDS)を加えて穏やかに混合し、4℃にて1時間振盪攪拌した。この細胞溶解液を1.5mLマイクロチューブに分注し、1,000gにて10分間(4℃)遠心して、上清を回収した。本遠心操作を計2回繰り返し、得られた上清を続いて20,000gにて10分間(4℃)遠心した。最後にペレットをPBSで洗浄し、同条件で遠心操作を計2回繰り返して得られたペレットをメラノソーム画分(melanosome−rich fraction)とした。
MNT−1細胞からメラノソーム画分を所定の方法(Murase et al. (2013) J Invest Dermatol, 133:2416-2424.)により単離調製した。具体的には、175cm2フラスコに培養しコンフルエントに達したMNT−1細胞を0.05% Trypsin/EDTA(Thermo Fisher Scientific)で回収し、Phosphate−Buffered Saline(DPBS、no calcium、no magnesium;Thermo Fisher Scientific)(以下、PBSと略記)にて洗浄した。続いて、2mLのLysis buffer(0.1M Tris−HCL、pH7.5、1% Igepal CA−630、0.01% SDS)を加えて穏やかに混合し、4℃にて1時間振盪攪拌した。この細胞溶解液を1.5mLマイクロチューブに分注し、1,000gにて10分間(4℃)遠心して、上清を回収した。本遠心操作を計2回繰り返し、得られた上清を続いて20,000gにて10分間(4℃)遠心した。最後にペレットをPBSで洗浄し、同条件で遠心操作を計2回繰り返して得られたペレットをメラノソーム画分(melanosome−rich fraction)とした。
(3)プログアニルが表皮角化細胞 (ケラチノサイト) におけるメラニン (メラノソーム) 分解に及ぼす影響
ケラチノサイトを6−ウェルプレートに2×105cells/ウェル(2 mL/ウェル)の細胞密度で播種し、3日後に175cm2フラスコ1本分に培養したMNT−1細胞から得られたメラノソーム画分を1枚分のプレート(6−ウェル分)に対して均等量添加した。その翌日に培地を交換し、プログアニルを終濃度で10、30μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で2日間培養した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Epilife(増殖添加剤(Humedia−KG)のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンB含有、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF;Human Epidermal Growth Factor)及びウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)不含)を使用した。培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer(Sigma−Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清について、Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いたBCA(ビシンコニン酸)法により、Bovine Serum Albumin(BSA)を標準物質としてタンパク量を定量した。その後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS−PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体はanti−Pmel17(Dako,1:250)を用いた。二次抗体は、anti−mouse IgG,HRP−Linked F(ab’)2 Fragment Sheep(GE Healthcare Life Science)を用いた。その後、ECL plus western blotting detection reagents(GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000(Fuji Film)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ−actinの発現は、monoclonal antibody specific for β−actin(Sigma−Aldrich,1:5000)を用いて評価した。メラノソームを取り込ませたケラチノサイトにおいて検出されたPmel17のバンドの強度は、DMSOを添加したコントロールに対して、プログアニルを処理した際に、濃度依存的に強くなっており、回収された細胞沈渣の色も濃度依存的に濃くなっていることを確認した(図17)。Pmel17はメラノソームに特異的なタンパク質であることから、ケラチノサイトに取り込まれたメラノソームの分解がプログアニルの処理により抑制されたものと考えられる。
ケラチノサイトを6−ウェルプレートに2×105cells/ウェル(2 mL/ウェル)の細胞密度で播種し、3日後に175cm2フラスコ1本分に培養したMNT−1細胞から得られたメラノソーム画分を1枚分のプレート(6−ウェル分)に対して均等量添加した。その翌日に培地を交換し、プログアニルを終濃度で10、30μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で2日間培養した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Epilife(増殖添加剤(Humedia−KG)のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンB含有、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF;Human Epidermal Growth Factor)及びウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)不含)を使用した。培養終了後、細胞をPBSで洗浄し、RIPA buffer(Sigma−Aldrich)を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清について、Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いたBCA(ビシンコニン酸)法により、Bovine Serum Albumin(BSA)を標準物質としてタンパク量を定量した。その後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってSDS−PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体はanti−Pmel17(Dako,1:250)を用いた。二次抗体は、anti−mouse IgG,HRP−Linked F(ab’)2 Fragment Sheep(GE Healthcare Life Science)を用いた。その後、ECL plus western blotting detection reagents(GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000(Fuji Film)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ−actinの発現は、monoclonal antibody specific for β−actin(Sigma−Aldrich,1:5000)を用いて評価した。メラノソームを取り込ませたケラチノサイトにおいて検出されたPmel17のバンドの強度は、DMSOを添加したコントロールに対して、プログアニルを処理した際に、濃度依存的に強くなっており、回収された細胞沈渣の色も濃度依存的に濃くなっていることを確認した(図17)。Pmel17はメラノソームに特異的なタンパク質であることから、ケラチノサイトに取り込まれたメラノソームの分解がプログアニルの処理により抑制されたものと考えられる。
(4)プログアニルが表皮角化細胞 (ケラチノサイト) のオートファジー活性に及ぼす影響
ケラチノサイトを6−ウェルプレートに1.5×105cells/ウェル(2mL/ウェル)の細胞密度で播種し、その翌日に、プログアニルを終濃度で0.3、1、3、10、30μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Epilife(増殖添加剤(Humedia−KG)のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンB含有、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF;Human Epidermal Growth Factor)及びウシ脳下垂体抽出物(BPE; Bovine Pituitary Extract)不含)を使用した。さらに翌日、LC3B Antibody Kit for Autophagy(Thermo Fisher Scientific)に付属のChloroquine diphosphateを終濃度で10μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で24時間培養した。培養終了後、上述した方法でSDS−PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は上述したKitに付属のanti−LC3B(1:1000)を用いた。二次抗体は、anti−rabbit IgG,HRP−Linked F(ab’)2 Fragment Sheep(GE Healthcare Life Science)を用いた。その後、ECL plus western blotting detection reagents(GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000(Fuji Film)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ−actinの発現は、monoclonal antibody specific for β−actin(Sigma−Aldrich,1:5000)を用いて評価した。リソソーム阻害剤であるChloroquine diphosphateの添加によって、LC3−IIの蓄積が誘導されたが、その蓄積をプログアニルは濃度依存的に緩和した(図18)。このことは、プログアニルがオートファゴソーム膜の形成より前段階でオートファジー活性を抑制したことを意味すると考えられる。したがって、プログアニルはケラチノサイトのオートファジー活性を抑制することで、ケラチノサイトにおけるメラニン分解を抑制したと考えられる。
ケラチノサイトを6−ウェルプレートに1.5×105cells/ウェル(2mL/ウェル)の細胞密度で播種し、その翌日に、プログアニルを終濃度で0.3、1、3、10、30μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。コントロールとしては、同量のDMSOを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Epilife(増殖添加剤(Humedia−KG)のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンB含有、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF;Human Epidermal Growth Factor)及びウシ脳下垂体抽出物(BPE; Bovine Pituitary Extract)不含)を使用した。さらに翌日、LC3B Antibody Kit for Autophagy(Thermo Fisher Scientific)に付属のChloroquine diphosphateを終濃度で10μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で24時間培養した。培養終了後、上述した方法でSDS−PAGE及びウェスタンブロットに供した。一次抗体は上述したKitに付属のanti−LC3B(1:1000)を用いた。二次抗体は、anti−rabbit IgG,HRP−Linked F(ab’)2 Fragment Sheep(GE Healthcare Life Science)を用いた。その後、ECL plus western blotting detection reagents(GE healthcare bioscience)を用いて発色させ、LAS4000(Fuji Film)を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ−actinの発現は、monoclonal antibody specific for β−actin(Sigma−Aldrich,1:5000)を用いて評価した。リソソーム阻害剤であるChloroquine diphosphateの添加によって、LC3−IIの蓄積が誘導されたが、その蓄積をプログアニルは濃度依存的に緩和した(図18)。このことは、プログアニルがオートファゴソーム膜の形成より前段階でオートファジー活性を抑制したことを意味すると考えられる。したがって、プログアニルはケラチノサイトのオートファジー活性を抑制することで、ケラチノサイトにおけるメラニン分解を抑制したと考えられる。
Claims (9)
- ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
- ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
- ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
- ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物、ベルベリン又はその塩、プログアニル又はその塩、及びフェンホルミン又はその塩から選ばれる1種以上を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
- ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物が、オレゴングレープ、キハダ、オウレン、バーベリー又はゴールデンシールの抽出物である、請求項1記載のケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、請求項2記載のケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、請求項3記載の皮膚又は毛髪色黒化剤、又は請求項4記載の白髪予防又は改善剤。
- ベルベリン又はその塩を含有する植物抽出物が、オレゴングレープの根若しくは根茎、キハダの樹皮又はオウレンの根若しくは根茎の抽出物である、請求項1記載のケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、請求項2記載のケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、請求項3記載の皮膚又は毛髪色黒化剤、又は請求項4記載の白髪予防又は改善剤。
- 医薬品、医薬部外品若しくは化粧品として使用する場合における当該医薬品、医薬部外品若しくは化粧品の総量に対する前記有効成分の含有量が、フェンホルミン、ベルベリン又はプログアニル換算で、0.01質量%以上10質量%以下である、請求項1記載のケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、請求項2記載のケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、請求項3記載の皮膚又は毛髪色黒化剤、又は請求項4記載の白髪予防又は改善剤。
- プログアニル又はその塩を含有する皮膚外用剤。
- 皮膚外用剤の総量に対するプログアニル又はその塩の含有量が、プログアニル換算で0.01質量%以上10質量%以下である、請求項8記載の皮膚外用剤。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662294667P | 2016-02-12 | 2016-02-12 | |
US62/294,667 | 2016-02-12 | ||
JP2016217082 | 2016-11-07 | ||
JP2016217082 | 2016-11-07 | ||
PCT/JP2017/004987 WO2017138652A1 (ja) | 2016-02-12 | 2017-02-10 | メラニン分解抑制剤 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020160104A Division JP7057404B2 (ja) | 2016-02-12 | 2020-09-24 | メラニン分解抑制剤 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017138652A1 true JPWO2017138652A1 (ja) | 2018-12-13 |
Family
ID=59563087
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017567019A Pending JPWO2017138652A1 (ja) | 2016-02-12 | 2017-02-10 | メラニン分解抑制剤 |
JP2020160104A Active JP7057404B2 (ja) | 2016-02-12 | 2020-09-24 | メラニン分解抑制剤 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020160104A Active JP7057404B2 (ja) | 2016-02-12 | 2020-09-24 | メラニン分解抑制剤 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10966911B2 (ja) |
EP (1) | EP3415147A4 (ja) |
JP (2) | JPWO2017138652A1 (ja) |
CN (1) | CN108697706B (ja) |
WO (1) | WO2017138652A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7139136B2 (ja) * | 2018-04-12 | 2022-09-20 | 小林製薬株式会社 | メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質のスクリーニング方法 |
US20210145833A1 (en) * | 2018-04-16 | 2021-05-20 | The Regents Of The University Of California | Methods and Compositions for Hair Growth by Activating Autophagy |
JP7156907B2 (ja) * | 2018-10-30 | 2022-10-19 | 花王株式会社 | オートファジー抑制剤 |
WO2020101400A1 (ko) * | 2018-11-14 | 2020-05-22 | 한국생명공학연구원 | 구아니딘 유도체를 포함하는 발모 촉진용 조성물 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0578222A (ja) * | 1991-05-01 | 1993-03-30 | Sansho Seiyaku Co Ltd | 白髪防止剤 |
JP2001288052A (ja) * | 2000-04-10 | 2001-10-16 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | チロシナーゼ活性促進剤及び白髪改善剤 |
JP2003171240A (ja) * | 2001-09-28 | 2003-06-17 | Lion Corp | 白髪予防改善剤及び毛髪有効成分のスクリーニング方法 |
JP2011074022A (ja) * | 2009-09-30 | 2011-04-14 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現促進剤 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CZ294903B6 (cs) * | 1999-04-09 | 2005-04-13 | Glaxo Group Limited | Kombinační prostředek pro léčení malárie |
JP2001342112A (ja) * | 2000-06-02 | 2001-12-11 | Shiseido Co Ltd | 皮膚外用剤 |
FR2901133B1 (fr) * | 2006-05-22 | 2013-04-26 | Oreal | Utilisation de modulateurs de la glycolyse comme agents anti-age |
MX2010012261A (es) * | 2008-05-09 | 2011-04-07 | Tolmar Inc | Proguanil para tratar enfermedades de la piel/mucosa. |
WO2010114805A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-07 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of treating cancer with phenformin |
CN102266499B (zh) * | 2011-07-07 | 2012-08-08 | 威海人太生物科技有限公司 | 一种生发药酒及其制备工艺 |
US8927517B2 (en) | 2012-04-27 | 2015-01-06 | Kao Corporation | Factors controlling skin and hair color |
-
2017
- 2017-02-10 JP JP2017567019A patent/JPWO2017138652A1/ja active Pending
- 2017-02-10 US US16/075,828 patent/US10966911B2/en active Active
- 2017-02-10 EP EP17750373.7A patent/EP3415147A4/en active Pending
- 2017-02-10 CN CN201780011011.1A patent/CN108697706B/zh active Active
- 2017-02-10 WO PCT/JP2017/004987 patent/WO2017138652A1/ja active Application Filing
-
2020
- 2020-09-24 JP JP2020160104A patent/JP7057404B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0578222A (ja) * | 1991-05-01 | 1993-03-30 | Sansho Seiyaku Co Ltd | 白髪防止剤 |
JP2001288052A (ja) * | 2000-04-10 | 2001-10-16 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | チロシナーゼ活性促進剤及び白髪改善剤 |
JP2003171240A (ja) * | 2001-09-28 | 2003-06-17 | Lion Corp | 白髪予防改善剤及び毛髪有効成分のスクリーニング方法 |
JP2011074022A (ja) * | 2009-09-30 | 2011-04-14 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現促進剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20190053994A1 (en) | 2019-02-21 |
JP2020200349A (ja) | 2020-12-17 |
CN108697706A (zh) | 2018-10-23 |
EP3415147A4 (en) | 2019-07-10 |
WO2017138652A1 (ja) | 2017-08-17 |
JP7057404B2 (ja) | 2022-04-19 |
EP3415147A1 (en) | 2018-12-19 |
CN108697706B (zh) | 2021-07-16 |
US10966911B2 (en) | 2021-04-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7057404B2 (ja) | メラニン分解抑制剤 | |
EP2152281B1 (en) | Cosmetic use of ginseng berry extract for skin whitening | |
KR101762750B1 (ko) | 무궁화의 꽃으로부터 추출된 정유를 포함하는 피부 재생용 외용제 및 화장료 조성물 | |
US9079047B2 (en) | Cosmetic composition for skin whitening | |
KR101858095B1 (ko) | 커큐민을 포함하는 강황 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백, 주름 형성 억제, 및 소양증 완화용 화장품 조성물 | |
PL220112B1 (pl) | Zastosowanie kompozycji zawierającej ekstrakt z Butea frondosa | |
CN112245348A (zh) | 一种护肤面霜及其制备方法 | |
KR101209220B1 (ko) | 생강나무 잎 추출물을 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 조성물 | |
KR102322441B1 (ko) | 녹차 잎자루 유래 추출물을 함유하는 피부 미백용 조성물 | |
KR20220153866A (ko) | 장미 유래 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물 | |
KR102030419B1 (ko) | 그라비올라를 포함하는 백발 예방 및 흑모유발 촉진용 조성물 | |
KR20090050856A (ko) | 승마 추출물의 분획추출물을 함유하는 미백화장료와 이의제조방법 | |
TWI605832B (zh) | Plant extract composition for desalinating skin and reducing melanin, pharmaceuticals and uses thereof | |
KR102626704B1 (ko) | 장미꽃잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물 | |
KR100561781B1 (ko) | 방기 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물 | |
TWI748944B (zh) | 基質金屬蛋白酶產生抑制劑 | |
KR20080056554A (ko) | 미백활성이 우수한 백삼 에틸아세테이트 분획물을 함유하는피부 미백용 조성물 | |
JP6787754B2 (ja) | メラニン分解促進剤 | |
KR20240007891A (ko) | 마가목 추출물을 유효성분으로 함유하는, 백반증 치료용 약학적 조성물 | |
KR20110110069A (ko) | 생강나무 잎 추출물을 포함하는 피부 미백 및 주름개선용 조성물 | |
KR101637935B1 (ko) | 숙근 천인국 추출물을 함유하는 피부 상태 개선용 조성물 | |
KR20230007796A (ko) | 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 | |
KR20240003869A (ko) | 왕벚나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 환경호르몬에 의한 건강 이상 개선용 조성물 | |
KR20220166356A (ko) | 모링가 페레그리나 종자 케이크의 추출물, 이의 제조 방법 및 화장품 또는 뉴트리코스메틱 조성물에서의 이의 용도 | |
JP2020033271A (ja) | 皮膚又は毛髪色黒化剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190919 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200728 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210209 |