JP6787754B2 - メラニン分解促進剤 - Google Patents
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したがって、メラニン産生の抑制やメラニン分解の促進等により、ケラチノサイトにおけるメラニン量が低下すれば、皮膚や毛髪の色は明るくなる。
1)16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするメラニン分解促進剤。
2)16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする美白剤。
3)16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするシミ若しくはソバカスの予防又は改善剤。
4)16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
5)16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする細胞内メラニン低減剤。
したがって、16−メチルオクタデカン酸又はその塩を、動物、好ましくはヒトに投与することでメラニン分解を促進し、メラニンを低減することにより、皮膚の美白、シミ若しくはソバカスの予防又は改善、或いは皮膚色素沈着の予防又は改善が可能となる。
「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための本発明の化合物の使用、例えばエステティシャン、美容師等による使用等が挙げられる。
また、本明細書において、「改善」とは、症状又は状態の好転、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、個体における症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の症状の発症の危険性を低下させることをいう。
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、好ましくは、皮膚の美白を所望するヒト、シミ若しくはソバカスの予防又は改善を所望するヒト、皮膚色素沈着の予防又は改善を所望するヒトである。
<2>16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする美白剤。
<3>16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするシミ若しくはソバカスの予防又は改善剤。
<4>16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
<5>16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする細胞内メラニン低減剤。
<7>美白剤を製造するための、16−メチルオクタデカン酸又はその塩の使用。
<8>シミ若しくはソバカスの予防又は改善剤を製造するための、16−メチルオクタデカン酸又はその塩の使用。
<9>皮膚色素沈着の予防又は改善剤を製造するための、16−メチルオクタデカン酸又はその塩の使用。
<10>細胞内メラニン低減剤を製造するための、16−メチルオクタデカン酸又はその塩の使用。
<12>美白に使用するための16−メチルオクタデカン酸又はその塩。
<13>シミ若しくはソバカスの予防又は改善に使用するため16−メチルオクタデカン酸又はその塩。
<14>皮膚色素沈着の予防又は改善に使用するための16−メチルオクタデカン酸又はその塩。
<15>細胞内メラニン低減に使用するための16−メチルオクタデカン酸又はその塩。
<17>美白方法であって、それを必要とする対象に16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<18>シミ若しくはソバカスを予防、改善、又は治療する方法であって、それを必要とする対象に16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<19>皮膚色素沈着を予防、改善、又は治療する方法であって、それを必要とする対象に16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<20>細胞内メラニン低減方法であって、それを必要とする対象に16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
<22>上記<16>〜<20>において、上記方法は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚美白のための非治療的な方法である。
16-メチルオクタデカン酸は、特開2008−255050号公報の実施例1に記載された方法により合成し、10mMとなるようにエタノール(EtOH)に溶解した。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞(Human Epidermal Keratinocytes,neonatal(HEKn) lightly;ケラチノサイト)はThermo Fisher Scientific社より購入した。メラノーマ細胞株MNT−1細胞は、Dr. Natali(University La Sapienza,Rome,Italy)より供与いただいた。ケラチノサイトは培地用増殖添加剤(Humedia−KG)(倉敷紡績)を添加した表皮角化細胞用増殖培地(Epilife)(Thermo Fisher Scientific)中で37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。MNT−1細胞の増殖用培地として、AIM−V培地とFetal Bovine Serum(FBS)をそれぞれ10%(v/v)含むRPMI1640培地(いずれもThermo Fisher Scientific)を使用し、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。
MNT−1細胞からメラノソーム画分を所定の方法(Murase et al. (2013) J Invest Dermatol,133:2416−2424.)により単離調製した。具体的には、175cm2フラスコに培養しコンフルエントに達したMNT−1細胞を0.05% Trypsin/EDTA(Thermo Fisher Scientific)で回収し、Phosphate−Buffered Saline(DPBS、no calcium、no magnesium;Thermo Fisher Scientific)(以下、PBSと略記)にて洗浄した。続いて、2mLのLysis buffer(0.1M Tris−HCl、pH7.5、1% Igepal CA−630、0.01% SDS)を加えて穏やかに混合し、4℃にて1時間振盪攪拌した。この細胞溶解液を1.5mLマイクロチューブに分注し、1,000gにて10分間(4℃)遠心して、上清を回収した。本遠心操作を計2回繰り返し、得られた上清を続いて20,000gにて10分間(4℃)遠心した。最後にペレットをPBSで洗浄し、同条件で遠心操作を計2回繰り返して得られたペレットをメラノソーム画分(melanosome−rich fraction)とした。
ケラチノサイトを12−ウェルプレートに7×104cells/ウェル(1mL/ウェル)の細胞密度で播種し、3日後に175cm2フラスコ1本分に培養したMNT−1細胞から得られたメラノソーム画分を1枚分のプレート(12−ウェル分)に対して均等量添加した。その翌日に培地を交換し、16−メチルオクタデカン酸を終濃度で1、3、5μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で2日間培養した。コントロールとしては、同量のEtOHを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Epilife(増殖添加剤(Humedia−KG)のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン及びアンフォテリシンB含有、ヒト上皮細胞成長因子(hEGF;Human Epidermal Growth Factor)及びウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)不含)を使用した。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いて1.5mLマイクロチューブに細胞を回収した。各チューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃、60分間の処理により細胞を溶解し、室温下において、21,640gで10分間の遠心処理により得られた上清の405nmの波長の吸光度を測定し、ウェル当たりのメラニン量を算出した。その結果、EtOHのみを添加したコントロールと比較して、16−メチルオクタデカン酸は細胞内のメラニン量を濃度依存的に減少させることがわかった(図1;棒グラフ)。また、Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いたBCA(ビシンコニン酸)法により、Bovine Serum Albumin(BSA)を標準物質として上清のタンパク量を測定した結果、16−メチルオクタデカン酸はウェル当たりのタンパク量には影響を与えないことを確認した(図1;折れ線グラフ)。
(1)細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮メラニン細胞(Human Epidermal Melanocytes,neonatal,lightly pigmented donor(HEMn−LP);メラノサイト)、表皮メラニン細胞用増殖培地(Medium254)、その培地用増殖添加剤(HMGS)はThermo Fisher Scientific社より購入した。メラノサイトは、37℃、5Vol%CO2の条件下で培養した。
メラノサイトを1.5×104cells/ウェル(100μL/ウェル)の細胞密度で96−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Medium254(増殖添加剤(HMGS)のうち、ウシ胎児血清(FBS;Fetal Bovine Serum)、塩基性線維芽細胞成長因子(hFGF−B;Human Fibroblast growth factor−basic)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)含有、ホルボール12−ミリスチン酸13−アセテート(PMA;phorbol 12−myristate 13−acetate)不含)を用いた。2日後、16−メチルオクタデカン酸を終濃度で0.5、1、3、5、10μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で4日間培養した。コントロールとしては、同量のEtOHを添加した。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで3回洗浄して、抽出Buffer(0.1M Tris−HCl(pH:7.2)、1% NP−40、0.01% SDS)を20μL/ウェル、Assay Buffer(4%ジメチルホルムアミド、100mM Sodium phosphate−buffered(pH:7.1))を20μL/ウェル添加した。4℃にて2時間かけて細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行ったが、その活性測定は、MBTH法(Winder A. et al.,1991,Eur. J. Biochem. 198:317−326)を基本とした次に示す方法で行った。すなわち、可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記Assay Bufferを80μL、20.7mM MBTH(3−メチル−2−ベンゾチアゾリノン ヒドラゾン)水溶液を60μL、基質として5mM L−DOPA(L−ジヒドロキシフェニルアラニン)水溶液を40μL加え、37℃にて30分間反応させた後、505nmの波長の吸光度を測定した。
その結果、EtOHのみを添加したコントロールと比較して、16−メチルオクタデカン酸がメラニン生成のメカニズムに深く関与しているドーパオキシダーゼ活性を抑制することはなかった(図2)。
メラノサイトを2×105cells/ウェル(2mL/ウェル)の細胞密度で6−ウェルプレートに播種した。この時の試験用培地としては、Medium254(増殖添加剤(HMGS)のうち、ウシ胎児血清(FBS;Fetal Bovine Serum)、塩基性線維芽細胞成長因子(hFGF−B;Human Fibroblast growth factor−basic)、ハイドロコーチゾン、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン及びウシ脳下垂体抽出物(BPE;Bovine Pituitary Extract)含有、ホルボール12−ミリスチン酸13−アセテート(PMA;phorbol 12−myristate 13−acetate)不含)を用いた。2日後、16−メチルオクタデカン酸を終濃度で0.5、1、3、5、10μMになるように添加し、37℃、5Vol%CO2の条件下で5日間培養した。コントロールとしては、同量のEtOHを添加した。なお、培地交換は3日に1度行った。培養終了後、細胞の培養プレートをPBSで洗浄し、セルスクレーパーを用いて1.5mLマイクロチューブに細胞を回収した。各チューブに2M NaOHを150μL加えた後100℃、60分間の処理により細胞を溶解し、室温下において、21,640gで10分間の遠心処理により得られた上清の405nmの波長の吸光度を測定し、メラニン量を算出した。その結果、EtOHのみを添加したコントロールと比較して、16−メチルオクタデカン酸は細胞内のメラニン量を濃度依存的に減少させることがわかった(図3)。なお、細胞内のメラニン量はBovine Serum Albumin(BSA)を標準物質としたBCA(ビシンコニン酸)法により測定したタンパク質量に対する相対値で示した。
Claims (5)
- 16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするメラニン分解促進剤。
- 16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする美白剤。
- 16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とするシミ若しくはソバカスの予防又は改善剤。
- 16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする皮膚色素沈着の予防又は改善剤。
- 16−メチルオクタデカン酸又はその塩を有効成分とする細胞内メラニン低減剤。
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