JP2016138063A - Ｔｒｐｖ４活性阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】ＴＲＰＶ４（Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4）活性阻害剤、及びＴＲＰＶ４活性阻害剤の効能を生かし、またその投与の手段としての、過活動膀胱の予防又は改善剤を提供する。【解決手段】ピペリンを有効成分とする、ＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防若しくは改善剤。【選択図】なし

Description

本発明は、ＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤に関する。

ＴＲＰＶ４（Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4）は、温度感受性TRPチャネルを構成するタンパク質の１つである。ＴＲＰＶ４は、腎、肺、膀胱、心臓、皮膚、脳、消化管など幅広い組織で発現しており、異なった幅広い生理的役割を果たしていると考えられている。

腎の遠位尿細管上皮細胞には特に強くＴＲＰＶ４が発現しており、ＴＲＰＶ４の作用により尿の浸透圧や流量が感知されることが示唆されている（非特許文献１参照）。また、ＴＲＰＶ４は膀胱の機能に関与することが報告されている（非特許文献２参照）。すなわち、膀胱内側の膀胱上皮細胞にはＴＲＰＶ４が存在し、尿が溜まって膀胱上皮細胞が伸展した場合に、ＴＲＰＶ４などにより構成されるＴＲＰＶチャネルを介して、細胞内にカルシウムが流入する。このカルシウムの流入によってＡＴＰが細胞から放出され、膀胱の膨らみが神経に伝わる。
また、ＴＲＰＶ４が排尿間隔に及ぼす影響は、TRPチャネルを構成する他のタンパク質よりも大きいことが報告されている（非特許文献３参照）。
したがって、ＴＲＰＶ４活性を阻害することにより、尿意の増加及び排尿頻度の増加を特徴とする過活動膀胱に対する予防又は改善効果をもたらすことが期待されている。

これまでに、カテキンなどのフラボノイド化合物に、ＴＲＰＶ４活性の阻害作用があることが知られている（特許文献１参照）。
一方、ピペリンは、ＴＲＰＶ１のアゴニスト、バニロイド受容体のアゴニストであることが報告されている（特許文献２及び３参照）。しかし、ピペリンがＴＲＰＶ４活性阻害作用を有することや、過活動膀胱の予防又は改善に有用であることは知られていない。

特開２０１４−２４８０９号公報 国際公開第２０１１／００６０７３号パンフレット 国際公開第２００８／０４０３６０号パンフレット

Tian W.，Am．J．Physiol．Renal．Physiol.，2004，287，p．F17-F24 Nilius B.，Physiol．Rev.，2007，87，p．165-217 Gevaert T.，J．Clin．Invest.，2007，117，p．3453-3462

本発明は、ＴＲＰＶ４活性を阻害する、ＴＲＰＶ４活性阻害剤の提供を課題とする。
また本発明は、ＴＲＰＶ４活性阻害剤の効能を生かし、またその投与の手段としての、過活動膀胱の予防又は改善剤の提供を課題とする。

本発明者等は上記課題に鑑み、ＴＲＰＶ４活性を阻害する素材について鋭意検討を行った。その結果、ピペリンが、ＴＲＰＶ４活性を阻害する作用を有することを見出した。よってこの化合物が、過活動膀胱の予防又は改善に有用であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。

本発明は、ピペリンを有効成分とする、ＴＲＰＶ４活性阻害剤に関する。
また本発明は、ピペリンを有効成分とする、過活動膀胱の予防又は改善剤に関する。

本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤は、ＴＲＰＶ４活性を効果的に阻害することができる。
また本発明の過活動膀胱の予防又は改善剤は、ＴＲＰＶ４チャネルが活性化されることによって生じる過活動膀胱を予防又は改善することができる。

本明細書において「ＴＲＰＶ４」とは、「Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4」を意味する。そしてこのＴＲＰＶ４は、ヒトにおいてTRPV4遺伝子によってコードされているタンパク質である。
ＴＲＰＶ４は、膀胱内側の膀胱上皮細胞に存在する。尿が溜まって膀胱上皮細胞が伸展した場合、ＴＲＰＶチャネルを介して細胞内にカルシウムが取り込まれ、これによってＡＴＰが細胞表面から放出され、膀胱の膨らみが神経に伝達される。したがって、ＴＲＰＶ４の活性を阻害することにより、過活動膀胱を予防又は改善することができる。

ここで、「ＴＲＰＶ４活性の阻害」とは、受容体であるＴＲＰＶ４の活性を抑制することを指す。具体的には、ＴＲＰＶ４刺激物質がＴＲＰＶ４に結合することによって発現する活性、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を抑制又は阻害することを意味する。
また本明細書における「過活動膀胱」とは尿意切迫感を必須とした症状症候群であり、通常頻尿や切迫性尿失禁を伴うものを指す。

本明細書において「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
また、本明細書において「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。
さらに本明細書において「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。

本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤は、下記構造式のピペリン（1-[5-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-1-オキソ-2,4-ペンタジエニル]ピペリジン）を有効成分とする。また、ピペリンを適用することで、ＴＲＰＶ４活性を阻害すること、及び過活動膀胱を予防又は改善することができる。

本発明で用いる前記化合物は、市販品であってもよいし、常法に基づき製造することもできる（例えば、G．Raman et al.，Ind．Eng．Chem．Res.，2002，vol．41，p．2966-2976参照）。なお前記化合物には、幾何異性体、光学異性体、立体異性体などの異性体が存在する。ここで、本発明で用いる化合物は前記構造式の化合物に限定するものではなく、これらの化合物の異性体も包含する。さらに、本発明で用いる化合物は、いずれかの異性体であっても、異性体の混合物であってもよい。

後述の実施例で実証するように、ピペリンは、ＴＲＰＶ４活性を阻害する。具体的には、ＴＲＰＶ４刺激物質（ＴＲＰＶ４作動薬、アゴニスト）の存在下で、TRPV4遺伝子による形質転換細胞（ＴＲＰＶ４発現細胞）とピペリンとを接触させた場合、ＴＲＰＶ４刺激物質による細胞内の陽イオン量の流入を抑制するという、ＴＲＰＶ４活性を阻害する作用を有する。したがってピペリンは、ＴＲＰＶ４活性の阻害に有用である。

本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤の形態は適宜選択することができる。例えば、前記有効成分単体を本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防又は改善剤として用いてもよい。あるいは、前記有効成分と、薬学的に許容される担体とを含む本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防又は改善剤を医薬組成物として使用してもよい。あるいは、本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防又は改善剤を化粧料組成物に含有させてもよい。

医薬組成物を調製する場合は、通常、前記有効成分と好ましくは薬学的に許容される担体を含む製剤として調製する。薬学的に許容される担体とは、一般的に、前記有効成分とは反応しない、不活性の、無毒の、固体又は液体の、増量剤、希釈剤又はカプセル化材料等をいい、例えば、水、エタノール、ポリオール類（例えば、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン、及びポリエチレングリコール等）、適切なそれらの混合物、植物性油などの溶媒又は分散媒体などが挙げられる。

医薬組成物は、経口により、非経口により、例えば、口腔内に、皮膚に、皮下に、粘膜に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に、膣内に、肺に、脳内に、眼に、又は鼻腔内に投与される。経口投与製剤としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ペレット剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤及び吸入剤などが挙げられる。非経口投与製剤としては、坐剤、保持型浣腸剤、点滴剤、点眼剤、点鼻剤、ペッサリー剤、注射剤、口腔洗浄剤、並びに軟膏、クリーム剤、ローション、ゲル剤、制御放出パッチ剤及び貼付剤などの皮膚外用剤などが挙げられる。医薬組成物は、徐放性皮下インプラントの形態で、又は標的送達系（例えば、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン注入、ポリマーマトリックス、リポソーム及びミクロスフェア）の形態で、非経口で投与してもよい。

医薬組成物はさらに医薬分野において慣用の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用できる。長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸等が挙げられる。必要に応じてその他の添加剤や薬剤、例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ヒドロタルサイト等）、胃粘膜保護剤（合成ケイ酸アルミニウム、スクラルファート、銅クロロフィリンナトリウム等）を加えてもよい。

化粧料組成物を調製する場合、その形態は適宜選択することができ、溶液、乳液、粉末、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ゲル、タブレット等の固形、エアゾール、ミスト、カプセル及びシート等任意の形態とすることができる。また、化粧料組成物の製品形態も任意であり、例えば、洗顔料、メーク落とし、化粧水、美容液、パック、乳液、クリーム及びサンスクリーン等のスキンケア化粧料、ファンデーション、化粧下地、口紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、アイブロー、頬紅及びネイルエナメル等のメイクアップ化粧料、ヘアシャンプー、ヘアリンス、整髪料、染毛料及び育毛剤等の毛髪化粧料、石鹸、ボディソープ、デオドラント化粧料及び浴用剤等のボディ洗浄料、歯磨剤及び洗口剤等の口腔化粧料、香水等の芳香化粧料等が挙げられる。また、この化粧料は、日本の薬事法上、化粧品及び医薬部外品のどちらに属しても良い。

化粧料組成物は、化粧品、医薬部外品及び医薬品等に慣用される他の成分、例えば、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、水溶性高分子、増粘剤、皮膜剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール、糖、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルジョン、ｐＨ調整剤、皮膚栄養剤、ビタミン、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、水等を必要に応じて配合し、常法により製造することができる。
その他の化粧料組成物に配合可能な成分としては、例えば、防腐剤（エチルパラベン、ブチルパラベン等）、消炎剤（例えば、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸誘導体、サリチル酸誘導体、ヒノキチオール、酸化亜鉛、アラントイン等）、美白剤（例えば、アスコルビン酸及びその誘導体、胎盤抽出物、ユキノシタ抽出物、アルブチン等）、各種抽出物（例えば、オウバク、オウレン、シコン、シャクヤク、センブリ、バーチ、セージ、ビワ、ニンジン、アロエ、ゼニアオイ、アイリス、ブドウ、ヨクイニン、ヘチマ、ユリ、サフラン、センキュウ、ショウキュウ、オトギリソウ、オノニス、ニンニク、トウガラシ、チンピ、トウキ、海藻等）、賦活剤（例えば、ローヤルゼリー、感光素、コレステロール誘導体等）、血行促進剤（例えば、ノニル酸ワレニルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、ニコチン酸β−ブトキシエチルエステル、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、タンニン酸、α−ボルネオール、ニコチン酸トコフェロール、イノシトールヘキサニコチネート、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、ベラパミル、セファランチン、γ−オリザノール等）、抗脂漏剤（例えば、硫黄、チアントール等）、抗炎症剤（例えば、トラネキサム酸、チオタウリン、ヒポタウリン等）及び殺菌剤（例えば、トリクロサン、塩化セチルピリジニウム、チモール類、塩化ベンザルコニウム等）等が挙げられる。

前記医薬組成物及び化粧料組成物は、口腔用組成物、外用組成物、内服組成物などの形態で適用することができる。

本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤は、食料、飲料、飼料、ペットフードに添加したり配合して使用することができる。あるいは、ＴＲＰＶ４活性の阻害により治療、予防又は改善しうる疾患又は状態の治療、予防又は改善等をコンセプトとしてその旨を表示した飲食品、すなわち、健康食品、機能性食品、病者用食品及び特定保健用食品などに添加したり配合して使用することができる。前記の、健康食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品は、具体的には、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、流動食等の各種製剤形態として使用することができる。製剤形態の食品は、医薬製剤と同様に製造することができ、前記有効成分と、食品として許容できる担体、例えば適当な賦形剤（例えば、でん粉、加工でん粉、乳糖、ブドウ糖、水等）等とを混合した後、慣用の手段を用いて製造することができる。さらに、スープ類、ジュース類、乳飲料、茶飲料、コーヒー飲料、ココア飲料、ゼリー状飲料、スポーツ飲料、ダイエット飲料などの液状食品組成物、プリン、ヨーグルトなどの半固形食品組成物、パン類、うどんなどの麺類、クッキー、チョコレート、キャンディ、ガム、せんべいなどの菓子類、ふりかけ、バター、ジャムなどのスプレッド類等に、本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防又は改善剤を添加したり配合して、食品組成物を製造することができる。

本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤における前記有効成分の含有量は適宜決定できる。
例えば、本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤の総量中、前記有効成分の含有量は0.00001質量％以上が好ましく、0.0001質量％以上がより好ましく、2質量％以下が好ましく、0.2質量％以下がより好ましく、0.00001〜2質量％が好ましく、0.0001〜0.2質量％がより好ましい。

本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤の投与又は摂取対象は、好ましくは温血脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物である。本明細書において哺乳動物は、例えば、ヒト、並びにサル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの非ヒト哺乳動物が挙げられる。本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤は、ヒトへの投与に好適である。

本発明に用いる前記化合物、並びに本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤は、過活動膀胱の予防又は改善を所望する対象者に好ましく適用することができる。また、本発明に用いる前記化合物、並びに本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤は、過活動膀胱が惹起された条件下で好ましく適用することができる。さらに、本発明に用いる前記化合物、並びに本発明のＴＲＰＶ４活性阻害剤、及び過活動膀胱の予防又は改善剤は、経口投与するのが好ましい。

本発明のＴＲＰＶ４活性阻害方法、及び過活動膀胱の予防又は改善方法において、投与又は摂取することで適用する前記有効成分の有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢、素材の活性、投与又は摂取経路、投与又は摂取スケジュール、製剤形態又はその他の要因により適宜決定することができる。例えば、前記有効成分の有効量は、１日あたり、体重１ｋｇあたり、好ましくは0.1ｍｇ以上、より好ましくは0.5ｍｇ以上、好ましくは20ｍｇ以下、より好ましくは5ｍｇ以下、又は好ましくは0.1〜20ｍｇ、より好ましくは0.5〜5ｍｇである。なお前記有効成分は、１日１回〜数回に分け、又は任意の期間及び間隔で摂取・投与され得る。
また、前記有効成分の投与又は摂取は、全身への投与又は摂取でもよいし、局所への投与又は摂取でもよい。

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のＴＲＰＶ４活性阻害剤、過活動膀胱の予防又は改善剤、使用、及び方法を開示する。

＜１＞ピペリンを有効成分とする、ＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防若しくは改善剤。

＜２＞前記ＴＲＰＶ４が、ヒト由来のＴＲＰＶ４である、前記＜１＞項に記載のＴＲＰＶ４活性阻害剤。
＜３＞ＴＲＰＶ４活性を阻害することで過活動膀胱を予防又は改善する、前記＜１＞項に記載の過活動膀胱の予防若しくは改善剤。
＜４＞前記ＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防若しくは改善剤の総量中、前記有効成分の含有量が、0.00001質量％以上、好ましくは0.0001質量％以上であり、2質量％以下、好ましくは0.2質量％以下である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防若しくは改善剤。

＜５＞ＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防若しくは改善剤としての、ピペリンの使用。
＜６＞ＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防若しくは改善剤の製造のための、ピペリンの使用。
＜７＞ピペリンを、ＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防若しくは改善剤として使用する方法。
＜８＞ピペリンを適用する、ＴＲＰＶ４活性阻害方法、又は過活動膀胱の予防若しくは改善方法。
＜９＞前記ＴＲＰＶ４が、ヒト由来のＴＲＰＶ４である、前記＜５＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜１０＞ＴＲＰＶ４活性を阻害することで過活動膀胱を予防又は改善する、前記＜５＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜１１＞ピペリンを過活動膀胱の予防又は改善を所望するヒトに適用する、前記＜７＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１２＞過活動膀胱が惹起された条件下で適用する、前記＜７＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１３＞前記ＴＲＰＶ４活性阻害剤、又は過活動膀胱の予防若しくは改善剤の総量中、ピペリンの含有量が、0.00001質量％以上、好ましくは0.0001質量％以上であり、2質量％以下、好ましくは0.2質量％以下である、前記＜５＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。

＜１４＞ＴＲＰＶ４活性阻害方法、又は過活動膀胱の予防若しくは改善方法のために用いる、ピペリン。
＜１５＞ＴＲＰＶ４活性阻害薬、又は過活動膀胱の予防若しくは改善薬の製造のための、ピペリンの使用。
＜１６＞ＴＲＰＶ４活性の阻害、又は過活動膀胱の予防若しくは改善の非治療的な処置方法のために用いる、ピペリンの使用。
＜１７＞前記ＴＲＰＶ４が、ヒト由来のＴＲＰＶ４である、前記＜１４＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載の化合物又は使用。
＜１８＞ＴＲＰＶ４活性を阻害することで過活動膀胱を予防又は改善する、前記＜１４＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の化合物又は使用。
＜１９＞ピペリンを過活動膀胱の予防又は改善を所望するヒトに適用する、前記＜１４＞〜＜１８＞のいずれか１項に記載の化合物又は使用。
＜２０＞ピペリンを過活動膀胱が惹起された条件下で適用する、前記＜１４＞〜＜１９＞のいずれか１項に記載の化合物又は使用。
＜２１＞ピペリンを医薬組成物又は化粧料組成物の形態で適用する、前記＜１４＞〜＜２０＞のいずれか１項に記載の化合物又は使用。
＜２２＞ピペリンを食品、飲料、又は飼料の形態で適用する、前記＜１４＞〜＜２０＞のいずれか１項に記載の化合物又は使用。
＜２３＞ピペリンの含有量が、0.00001質量％以上、好ましくは0.0001質量％以上であり、2質量％以下、好ましくは0.2質量％以下である、前記＜１４＞〜＜２２＞のいずれか１項に記載の使用。

＜２４＞ピペリンを有効量適用する、非治療的なＴＲＰＶ４活性阻害方法、又は非治療的な過活動膀胱の予防若しくは改善方法。
＜２５＞前記ＴＲＰＶ４が、ヒト由来のＴＲＰＶ４である、前記＜２４＞項に記載の方法。
＜２６＞ＴＲＰＶ４活性を阻害することで過活動膀胱を予防又は改善する、前記＜２４＞又は＜２５＞項に記載の方法。
＜２７＞ピペリンを過活動膀胱の予防又は改善を所望するヒトに適用する、前記＜２４＞〜＜２６＞のいずれか１項に記載の方法。
＜２８＞過活動膀胱が惹起された条件下で適用する、前記＜２４＞〜＜２７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜２９＞ピペリンの有効量が、１日あたり、体重１ｋｇあたり、0.1ｍｇ以上、好ましくは0.5ｍｇ以上、であり、20ｍｇ以下、好ましくは5ｍｇ以下、である、前記＜２４＞〜＜２８＞のいずれか１項に記載の方法。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

試験例１ ヒトTRPV4遺伝子発現ベクターの作製
ヒト十二指腸由来細胞（Hutu-80細胞、American Type Culture Collectionより購入）から抽出したtotalRNAを逆転写して得られたcDNAを鋳型にして、公開されているヒトTRPV4遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。

＜プライマーセット＞
フォワードプライマー；5’-CACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCC-3’（配列番号１）
リバースプライマー；5’-CTAGAGCGGGGCGTCATCAGTCC-3’（配列番号２）

＜ＰＣＲ条件＞
ａ）ＰＣＲ溶液組成
cDNA（Template） １５μＬ
５×PrimeStar GXL Buffer １０μＬ
dNTPs mixture（２．５ｍＭ） ４μＬ
PrimeStar GXL DNA Polymerase（タカラバイオ） １μＬ
Forward Primer（１０μＭ） １μＬ
Reverse Primer（１０μＭ） １μＬ
Water １８μＬ
ｂ）温度とサイクル条件
９５℃ ２ｍｉｎ
↓
９８℃ １０ｓｅｃ ３３ｃｙｃｌｅｓ
７０℃ ２ｍｉｎ

得られたＰＣＲ産物をHigh Pure PCR Product Purification Kit（商品名、ロッシュ社製）用いて精製した。精製したＰＣＲ産物と、pcDNA3.1 Directional TOPO Expression Kit（商品名、インビトロジェン社製）を用いて、ヒトTRPV4遺伝子発現ベクターを作製した。

試験例２ ヒトＴＲＰＶ４発現細胞の作製
１０％牛胎児血清を含むDMEM／F12培地（インビトロジェン社製）を用いて、HEK293細胞（American Type Culture Collectionより購入）の培養を行った。HEK293細胞をT-25細胞培養用フラスコに２×１０⁵cells／Flaskで播種した。培養３日後、試験例１で作製したヒトTRPV4遺伝子発現ベクター（３μｇ）をTransIT-293（Mirus社製）を用いて細胞にトランスフェクションし１日培養した。これとは別に、対照としてLacZ発現ベクター（３μｇ）をTransIT-293（Ｍｉｒｕｓ）を用いて細胞にトランスフェクションし１日培養した。Detachin（Genlantis社製）で細胞をはがし、96well Optical bottom plate（Nunc社製）に１０％牛胎児血清を含むDMEM／F12培地で１．６６×１０⁴cells／９０μＬ／wellの細胞密度で播き、さらに１日培養した。

実施例１ 細胞内Ｃａ²⁺流入活性の測定
細胞内Ｃａ²⁺流入活性の測定はCalcium Kit II-fluo 4（商品名、DOJINDO社製）を用いて行った。Fluo4-AMを含有したLoading bufferを試験例２で作製した細胞に９０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３７℃で蛍光プレートリーダーFDSS3000（商品名、浜松ホトニクス社製）を用いて蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５２４ｎｍ）を２秒毎に測定した。測定開始３０秒後にＴＲＰＶ４作動薬であるGSK1016790A（Sigma社製、１０ｎＭ（終濃度１ｎＭ））と、ＴＲＰＶ４特異的阻害薬であるHC067047（Sigma社製、１００μＭ（終濃度１０μＭ））、及び下記に示す検体溶液（終濃度の１０倍濃度）を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３００秒まで２秒毎に蛍光強度変化を測定した。

＜検体＞
GSK1016790A（Sigma社製、TRPV4作動薬）及びHC067047（Sigma社製、TRPV4特異的阻害薬）をジメチルスルオキシド(DMSO、DOJINDO社製）で溶解し、使用した。
ピペリン（Sigma社製）を溶媒（エタノール特級、和光純薬工業社製）で溶解し、使用した。
比較例として用いたナツメグ（Myristica fragrans）抽出物：ナツメグリキッドSP-77543（三栄源エフエフアイ社製）を用いた。

検体のＴＲＰＶ４活性率（％）は次式により算出した。

ＴＲＰＶ４活性化率（％）＝（F0−FmeanC2）/（FmeanC1−FmeanC2）×１００


FmeanC1：GSK1016790A（終濃度１０μＭ）を添加したウェルの蛍光強度の平均値
FmeanC2：DMSOのみを添加したウェルの蛍光強度の平均値
F0：検体を添加したウェルの蛍光強度

＜検定方法・結果＞
ＴＲＰＶ４活性は測定開始後５０〜１００秒で評価し、ＴＲＰＶ４作動薬であるGSK1016790A（終濃度１ｎＭ）を添加した場合のＴＲＰＶ４活性化率を１００％とし、コントロールであるDMSOを添加した場合のＴＲＰＶ４活性化率を０％とした。
その結果を表１に示す。

ピペリンを添加した場合の、ＴＲＰＶ４作動薬であるGSK1016790Aに対する活性化率をDunnetにより検定した。その結果、表１に示すように、ピペリン濃度がいずれの場合であっても、ＴＲＰＶ４作動薬存在下でＴＲＰＶ４活性を有意に阻害した（p<0.01）。
一方、アルカロイドを含有するとの報告がされているナツメグ抽出物（Journal of Pain Research，2013，vol．6，p．611-615）を適用しても、ＴＲＰＶ４活性は阻害されなかった。

以上のように、ピペリンを適用することにより、ＴＲＰＶ４活性が有意に阻害される。これは、ピペリンが、ＴＲＰＶ４活性の阻害に有効であることを示している。さらに、ＴＲＰＶ４活性を阻害する作用を有するピペリンは、過活動膀胱の予防又は改善に有効であることを示している。

Claims (4)

1. ピペリンを有効成分とする、ＴＲＰＶ４活性阻害剤。
2. ピペリンを有効成分とする、過活動膀胱の予防又は改善剤。
3. ピペリンを有効量適用する、非治療的ＴＲＰＶ４活性阻害方法。
4. ピペリンを有効量適用する、非治療的過活動膀胱の予防又は改善方法。