JP6910187B2 - Trpv4活性抑制剤 - Google Patents
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Description
したがって、TRPV4活性を抑制することにより、IBSを予防又は改善することが期待される。
また、ロズマリン酸の代謝産物としてヒト尿中に排出されるジメチルロズマリン酸は、シクロオキシゲナーゼ2の誘導抑制活性を有し、抗炎症作用があることが報告されている(特許文献3)。
しかし、ロズマリン酸やジメチルロズマリン酸がTRPV4活性抑制作用を有することや、IBSの予防又は改善に有用であることは全く知られていない。
1)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPV4活性抑制剤。
2)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
3)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPV4活性抑制用食品。
4)ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善用食品。
ジメチルロズマリン酸は、後記製造例に示すとおり、例えば下記の反応スキームに従って合成することができる。
したがって、ジメチルロズマリン酸、その前駆体であるロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物(以下、「本発明の化合物」とも称する)は、TRPV4活性抑制剤となり、TRPV4活性抑制のため、或いはTRPV4活性抑制剤を製造するために使用できる。
したがって、TRPV4活性抑制剤は、IBSの予防又は改善剤として、IBSに対する予防又は改善のために使用することができると考えられる。
また、本発明の食品には、一般飲食品のほか、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の化合物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、1日1回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
<1>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPV4活性抑制剤。
<2>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
<3>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPV4活性抑制用食品。
<4>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善用食品。
<6>過敏性腸症候群の予防又は改善剤を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上の使用。
<7>TRPV4活性抑制用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上の使用。
<8>過敏性腸症候群の予防又は改善用食品を製造するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上の使用。
<10>過敏性腸症候群の予防又は改善に使用するための、ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上。
<12>ロズマリン酸、ジメチルロズマリン酸及びそれらの塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する過敏性腸症候群の予防又は改善方法。
製造例 ジメチルロズマリン酸の合成
(1)試薬
3−(3−メトキシ−4−ヒドロキシフェニル)乳酸ナトリウム(1)(ラセミ混合物)は東京化成より、フェルラ酸(3)は和光純薬工業より、それぞれ購入して使用した。
反応終了後、ろ過、ろ過残渣を塩化メチレン(25mL)で洗浄し、ろ液と洗浄液を併せ、減圧濃縮を行った。これに塩化メチレン 20mLとH2O 20mLを加え、分層後、塩化メチレン層を回収した。水層は、さらに塩化メチレン 5mLで3回抽出し、回収した。回収した塩化メチレン層を併せて、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮した(988.2mg)。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物(2)の精製品513mg(無色、油状、収率82%)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。
カラム: Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム:INJECT COLUMN S [YAMAZEN]
溶離液:ヘキサン / 酢酸エチル = 95 / 5 (4min) 95 / 5 (11min) 74 / 26 (14min) 74 / 26
流速:20mL / min、分取時間:29min、分取容量:12mL / 本、48本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.(fr.43-53)を減圧濃縮、乾燥。
反応終了後、減圧濃縮し、再度H2O 25mLに溶解後、2N塩酸および濃塩酸を添加して、pH=0とした。これを酢酸エチル(25mL)で5回抽出した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、減圧濃縮した(687.5mg)。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物(4)の精製品221.4mg(無色、油状、収率37%)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。
カラム: Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム:INJECT COLUMN M [YAMAZEN]
溶離液:
1%酢酸 in ヘキサン / 1%酢酸 in 酢酸エチル = 100 / 0 (4min) 100 / 0 (11min) 84 / 16 (24min) 84 / 16 (0min) 80 / 20 (7min) 80 / 20
流速:20mL / min、分取時間:46min、分取容量:12mL / 本、77本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.(fr.48-75)を減圧濃縮、乾燥。
これを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、標題化合物(5)の精製品151.8mg(白色、ワックス状)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィーの条件は、以下の通り。
カラム: Universal Premium L (30μm, 60Å, 3.0x16.5cm, 40g) [YAMAZEN]
インジェクトカラム:INJECT COLUMN S [YAMAZEN]
溶離液:
ヘキサン / 酢酸エチル = 87 / 13 (4min) 87 / 13 (11min) 66 / 34 (14min) 66 / 34
流速:20mL / min、分取時間:29min、分取容量:12mL / 本、48本分取
分取各Fr.をTLCにて確認後、目的Fr.(fr.34-36)を減圧濃縮、乾燥。
反応終了後、減圧濃縮した後、1N塩酸20mLで酸性化し、これを酢酸エチル(20mL)で3回抽出した。酢酸エチル層は併せて、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した(117.0mg)。これを、分取TLCにて精製し、標題化合物(B)の精製品61.4mg(白色、粉末状、収率92%)を得た。分取TLCの条件は、以下の通り。
なお以下の実施例では、合成したジメチルロズマリン酸をジメチルスルホキサイド(DMSO)で適宜希釈して評価に供した。
<分取TLCの条件>
TLC: PLC Silica gel 60 F254 (1mm, 20x20cm, #1.13895.0001) [Merck]
展開溶媒:クロロホルム / アセトン/ 88%ギ酸 = 75 / 16.5 / 8.5 200mL
脱離液:クロロホルム / アセトン / 88%ギ酸 = 75 / 16.5 / 8.5 15mL
(1)ヒトTRPV4遺伝子発現ベクターの作製
ヒト十二指腸由来細胞(Hutu−80細胞、American Type Culture Collectionより購入)から抽出したtotalRNAを逆転写して得られたcDNAを鋳型にして、公開されているヒトTRPV4遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行った。
フォワードプライマー;5’-CACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCC-3’(配列番号1)
リバースプライマー;5’-CTAGAGCGGGGCGTCATCAGTCC-3’(配列番号2)
a)PCR溶液組成
cDNA(Template) 15μL
5x PrimeStar GXL Buffer 10μL
dNTPs mixture(2.5mM) 4μL
PrimeStar GXL DNA Polymerase(タカラバイオ) 1μL
Forward Primer(10μM) 1μL
Reverse Primer(10μM) 1μL
Water 18μL
b)温度とサイクル条件
95℃ 2min
↓
98℃ 10sec 33 cycles
70℃ 2min
10%牛胎児血清を含むDMEM/F12培地(インビトロジェン社製)を用いて、ヒト子宮頸癌由来細胞株(HeLa細胞、American Type Culture Collectionより購入)の培養を行った。HeLa細胞をT−75細胞培養用フラスコに5×105cells/Flaskで播種した。培養3日後、前記(1)で作製したヒトTRPV4遺伝子発現用ベクター(8μg)をTransIT−HeLaMONSTER Transfection Kit(Mirus社製)を用いて細胞にトランスフェクションし、1日培養した。
Detachin(Genlantis社製)で細胞をはがし96well Optical bottom plate(Nunc社製)に10%牛胎児血清を含むDMEM/F12培地で1.5×104cells/90μL/wellの細胞密度で播き、さらに1日培養した。
細胞内カルシウムイオン流入活性の測定は、Calcium Kit II− fluo 4(商品名、DOJINDO)を用いて行った。Fluo4−AMを含有したLoading bufferを前記(2)で作製したヒトTRPV4発現細胞に90μL/well添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後、37℃で蛍光プレートリーダーFDSS3000(商品名、浜松ホトニクス社製)を用いて蛍光強度(励起波長:488nm、蛍光波長:524nm)を2秒毎に測定した。測定開始30秒後にTRPV4作動薬であるGSK1016790a(Sigma社製)と検体として前記製造例で調製したジメチルロズマリン酸溶液をそれぞれ測定キットの希釈bufferで希釈し、それらの混合溶液(添加直前に混合)を20μL/well添加し、300秒まで2秒毎に蛍光強度変化を測定した。なお、GSK1016790aは終濃度3nMとなるように添加した。
また、TRPV4活性抑制の陽性対照として、TRPV4の拮抗薬であるHC067047を終濃度100μMで添加した。
検体のTRPV4活性は、TRPV4作動薬であるGSK1016790aの処理によるカルシウムイオン流入率を100%として、次式により算出した。
カルシウムイオン流入率(%)=[(F300/F0)- (F300C2/F0C2) ]/[(F300C1/F0C1)- (F300C2/F0C2)]×100
F300:測定開始300秒後のGSK1016790aと検体を添加したウェルの蛍光強度
F300C1:測定開始300秒後のGSK1016790aと溶媒を添加したウェルの蛍光強度
F300C2:測定開始300秒後の溶媒のみを添加したウェルの蛍光強度
F0:測定開始直後のF300と同じウェルの蛍光強度
F0C1:測定開始直後のF300C1と同じウェルの蛍光強度
F0C2:測定開始直後の溶媒のみを添加したウェルの蛍光強度
なお、前述のとおり、ジメチルロズマリン酸は、ロズマリン酸の体内代謝産物であることから、前駆体であるロズマリン酸もTRPV4活性の抑制、過敏性腸症候群の予防又は改善に有効であると考えられる。
Claims (4)
- 3,3’−ジメチルロズマリン酸及びその塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPV4活性抑制剤。
- 3,3’−ジメチルロズマリン酸及びその塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
- 3,3’−ジメチルロズマリン酸及びその塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とするTRPV4活性抑制用食品。
- 3,3’−ジメチルロズマリン酸及びその塩若しくは溶媒和物から選択される1種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善用食品。
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