JP4377728B2

JP4377728B2 - 抗炎症活性を有する新規ロスマリン酸誘導体

Info

Publication number: JP4377728B2
Application number: JP2004088661A
Authority: JP
Inventors: みどり夏目; 寛森永; 奈緒美越阪部; 星吾馬場
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2004-03-25
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2024-03-25
Also published as: JP2005272362A

Description

本発明は、ロスマリン酸誘導体および、その医薬品用途、飲食品用途、特に炎症性疾患の治療に適用される医薬品並びに抗炎症効果を有する飲食品に関する。更に詳細には、炎症時に誘導されるシクロオキシゲナーゼ２（以下ＣＯＸ２と称する）の誘導抑制活性を有するロスマリン酸誘導体に関する。

近年の研究でリウマチや感染症といった炎症性疾患のみならず、動脈硬化・糖尿病あるいはガンなどの生活習慣病の発症にも分子レベルでの炎症性反応が深く関わっていることが明らかとなってきた。炎症性刺激によって生成されたTNF-a・IL-1・IFN・TGFなどのサイトカインはCOX2を誘導する。シクロオキシゲナーゼ（COX）の別名はプロスタグランジンエンドペルオキシダーゼといい、シスの二重結合を有するアラキドン酸に2分子の酸素を導入添加し、15位にヒドロペルオキシド結合を有するプロスタグランジンG2を経て、プロスタグランジンE2（以下PGE2と称する）を合成する重要な酵素である。PGE2は血管透過性を亢進し、炎症を増悪させる。COXは1型（COX1）と2型（COX2）の2種類のアイソザイムが知られている。COX1は、ほとんどの組織や細胞で常に発現している。一方、COX2は腎臓に発現している他は、単球や血管内皮細胞がリポ多糖（LPS）などの炎症性刺激を受けた際に発現し、この酵素のmRNA量と酵素量が増大し、誘導合成される。最近の研究でCOX2を抑制し、慢性的な炎症反応を軽減することが種々の生活習慣病の予防につながることが分かってきている。

前記PGE2の生成抑制のために、現在我々はアスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド系抗炎症薬を常用している。しかしながら、これらの薬物はCOX1とCOX2のうち、恒常的に発現しているCOX1の活性を抑制し、このため生成経路が共通であるプロスタサイクリンの生成も抑制されてしまう（特許文献１、非特許文献１、非特許文献2参照）。
特開2004-2454号公報 Giovanni de Gaestanoet al. Trends in Pharmacological Sciences Vol.24 245-252, 2003 Marc Ouelletet al. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 14583-14588, 2001 プロスタサイクリンは胃液分泌を抑制したり、血管を弛緩させる活性を持つため、これら非ステロイド系抗炎症薬には胃腸障害などの重篤な副作用が報告され、特にアメリカにおいてはこの副作用によって年間1から2万人の死亡が確認されている。

従って、本発明は抗炎症作用があり、かつ副作用が少ない、COX２の発現を抑制する新規な化合物を提供することを目的としている。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、新規なロスマリン酸誘導体が優れた、シクロオキシゲナーゼ2発現抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（1）3,3’−O−ジメチル−ロスマリン酸及びその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物。

（2）一般式（I）で表されるロスマリン酸誘導体を有効成分とするシクロオキシゲナーゼ2発現抑制組成物。

［式中、R₁、R₂、R_３、R₄は、Hまたは、メチル基を表す。但し、ロスマリン酸を除く。］
（3）一般式（I）で表されるロスマリン酸誘導体が3−O−メチル−ロスマリン酸、4−O−メチル−ロスマリン酸、または3,3’−O−ジメチル−ロスマリン酸である（2）記載のシクロオキシゲナーゼ2発現抑制組成物。

本発明の化合物は、副作用が少なく、シクロオキシゲナーゼ２の誘導の抑制作用を有することにより抗炎症作用を供する極めて有用な物である。

本発明の一般式(I)で表されるロスマリン酸誘導体で、R₁〜R₄は水素またはメチル基であるが、メチル基である数は好ましくは1〜2がよい。

［式中、R₁、R₂、R_３、R₄は、Hまたは、メチル基を表す。但し、ロスマリン酸を除く。］
例えば、一般式(I)で表されるロスマリン酸誘導体で、R₁がメチル基で、R₂〜R₄が水素である3−O−メチル−ロスマリン酸、R₂がメチル基で、R₁、R₃、R₄が水素である4−O−メチル−ロスマリン酸、R₁及びR₄がメチル基で、R₂及びR₃が水素である3,3’−O−ジメチル−ロスマリン酸が挙げられる。

本発明による化合物は、その薬学的に許容される塩とすることができる。このような塩の好ましい例としては、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩などが挙げられる。

また、本発明による化合物は溶媒和物とすることができる。このような溶媒和物としては、水和物、アルコール和物、アセトン和物が挙げられる。

一般式（1）で表されるロスマリン酸誘導体を製造する方法は、ロスマリン酸を原料として、化学合成的なメチル化法と酵素合成的なメチル化法が挙げられる。

本発明において化学合成的なメチル化法としては、ロスマリン酸エチルエステルを原料として、ジアゾメタンによるメチル化反応を利用する製造方法やジメチル硫酸を用いたメチル化反応を利用する製造方法が挙げられる。

また、本発明における酵素合成的なメチル化法とは次のような方法である。ロスマリン酸とS-アデノシル-L-メチオニンを原料としてカテコールメチルトランスフェラーゼと37℃でインキュベートすることにより製造する。ロスマリン酸とS-アデノシル-L-メチオニンの比は1：5〜1：20、好ましくは1:10〜1：15がよい。また、S-アデノシル-L-メチオニンは一度に添加せずに数回に分けて添加するのがよい。反応時間は1〜48時間で、好ましくは12〜24時間がよい。または、植物中から抽出することによってロスマリン酸誘導体を得ることができる。製造された本発明化合物に対しては、一連の反応終了後に、通常公知の分離・精製手段を駆使して単離することができる。たとえば、抽出、分配、カラムクロマトグラフィーなどによって、本発明化合物を取得することができる。

本発明の一般式（1）で表されるロスマリン酸誘導体並びにそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物は、炎症性メデイエーターであるプロスタグランジンE2（PGE2)の合成に関与するCOX2の発現を抑制する作用がある。従って、各種炎症性疾患の予防または治療薬として適用可能である。

よって、本発明によれば、本発明の一般式（1）で表されるロスマリン酸誘導体並びにそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物の有効量を、薬学的に許容される担体とともに含んでなる、医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、具体的には、急性肝炎、慢性関節リウマチ、細菌感染などによって惹起される炎症の予防または治療薬として用いられる。また、アトピー性皮膚炎、喘息、花粉症、鼻炎等のアレルギー性疾患の予防または治療薬としても適用可能である。

医薬品組成物として用いる場合には、前記の化合物並びにそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物は、経口または非経口（例えば、静注、筋注、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で、ヒトおよびヒト以外の動物に投与することができる。

投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には主とし静注、筋注等の注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠などの経口剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水性坐剤などのいずれかの製剤形態に調製することができる。

これらの各種製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、崩壊剤としては、例えば澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウムなどが、結合剤としては、例えばメチルセルロースまたはその塩、エチルセルロース、アラビアゴム。ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤としては、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などが、その他の添加剤としては、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどがそれぞれ挙げられる。

また、本発明の一般式（1）で表されるロスマリン酸誘導体並びにそれらの薬学的に許容される塩および溶媒和物は飲食品に添加して前記の医薬組成物と同様な疾患の予防または治療のための飲食品組成物としても提供できる。
飲食品組成物として用いる場合の飲食品の形態としては、栄養ドリンク、清涼飲料水、紅茶、緑茶などの飲料、キャンデー、クッキー、錠菓、チューインガム、ゼリー状などの菓子の他、麺、パン、米飯、ビスケットなどの穀類加工品、ソーセージ、ハム、かまぼこ等の練り製品、バター、ヨーグルトなどの乳製品、ふりかけ、調味料などが挙げられる。
医薬組成物または飲食品組成物中の本発明による化合物の含量は、その剤形または飲食品の形態により異なるが、通常全組成物中0.1〜100重量％、好ましくは1〜95重量％、程度である。

投与量は、用法、飲食品の形態、患者の年齢、性別、疾患の相違、症状の程度等を考慮して適宜決定されるが、アレルギー症などの炎症剤としては通常成人1日1人当り1〜400ｍｇ、好ましくは5〜200ｍｇの投与量であり、これを1日1回または数回に分けて投与することができる。

ラットを用いた経口急性毒性試験
ラットに3−O−メチル−ロスマリン酸、４−O−メチル−ロスマリン酸、3，3’−O−ジメチル−ロスマリン酸を200mg/kgの濃度でSD系ラット雄性6匹に経口投与を実施し、死亡または一般状態の異常が認められないことを確認している。

ラットを用いた50日間経口連続投与試験
ラットに3−O−メチル−ロスマリン酸、４−O−メチル−ロスマリン酸、3，3’−O−ジメチル−ロスマリン酸を100mg/kgでSD系ラット雄性6匹に50日間連続経口投与を実施し、一般状態、体重増加、血清生化学に以上がないことを確認している。

COX2の発現量の測定
単球細胞（ヒト由来U937細胞）を培養し、ホルボールミリステートアセテートを添加してマクロファージに分化させた後、リポ多糖（LPS）を添加し、炎症性刺激を与え、37℃、24時間、5％CO2インキュベーターで培養する。LPSとDMSOを添加した群を対照群とし、LPSと同時に試験する化合物をある一定の濃度になる量を添加し、一定時間インキュベート後、細胞中のRNAを回収する。その後RT-PCR法（非特許文献３、非特許文献４参照）により、COX2のmRNA量を定量する。対照群の発現するmRNA量を1.00としたとき、1より小さければCOX2の発現量は抑制されたと判断する。
Livak KJ et al. Methods. Vol.25(4):402-8 2001. Haslett JN et al. Proc Natl Acad SciVol.99(23):15000-5 2002.

以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
（実施例1） 3−O−メチル−ロスマリン酸と4−O−メチル−ロスマリン酸の調製
20ｍMシステイン、2ｍM塩化マグネシウムを含有した燐酸バッファー200ｍｌにカテコールメチルトランスフェラーゼ（COMT）を4000ユニット溶解し37℃で10分間プレインキュベーションした。この溶液に7.1ｍMのS-アデノシル-L-メチオニン500ｍｌと1ｍMのロスマリン酸を添加した。これらの溶液を添加後、2時間と4時間経過後に7.1ｍMのS-アデノシル−Ｌ−メチオニン200ｍｌずつを加えた。反応開始24時間後に、メタノールを添加し酵素反応を終了させ、その後、反応液からメタノールを除去し、20%メタノール溶液に再溶解した。この溶液を、固相抽出カラム（ＤＳＣ18 20ｍｌチューブスペルコシル）を通し、水とメタノールのステップワイズグラジェントによって、分画した。90％メタノール画分をさらにＨＰＬＣによって精製し、3−O−メチル−ロスマリン酸と4−O−メチル−ロスマリン酸をそれぞれ10ｍｇを得た。

3−O−メチル−ロスマリン酸の^１H―核磁気共鳴スペクトラム(CD₃OD:D₂O=7:3、400MHz)
7.20（2H, d, Ar）,6.85（5H, d, Ar）,7.10（6H, ｄｄ, Ar）7.57（7H, d, メチレン−CH=）, 6.36（8H, d, メチレン−CH=）, 3.32（10H, s, O-CH₃）, 6.76(2’H, d, Ar), 6.75(5’H, d, Ar), 6.68(6’H, dd, Ar), 3.11(7’bH, dd, CH₂), 5.08(8’H, dd, CH)

3−O−メチル−ロスマリン酸の¹³C―核磁気共鳴スペクトラム(CD₃OD:D₂O=7:3、100MHz)
127.9(C1),111.8(C2),149.1(C3), 149.7(C4), 116.4(C5), 124.1(C6), 146.8(C7), 115.7(C8), 169.4(C9), 56.6(C10), 131.3(C1’), 117.7(C2’), 145.5(C3’), 144.3(C4’), 116.5(C5’), 122.0(c
7),38.4(C7’), 78(C8’), 56.4(C’10)
LC-MS（M-H=373）

4−O−メチル−ロスマリン酸の^１H―核磁気共鳴スペクトラム(CD₃OD:D₂O=7:3、400MHz)
7.10（2H, d, Ar）, 6.98（5H, d, Ar）, 7.09（6H,ｄｄ, Ar）, 7.53（7H, d, メチレン−CH=）, 6.34（8H, d, メチレン−CH=）, 3.89（10H, s , O-CH₃）,6.81(2’H, d , Ar), 6.74(5’H, d, Ar), 6.68(6’H, dd, Ar), 2.93(7’aH, dd, CH₂), 3.10(7’bH, dd, CH₂), 5.05(8’H, dd, CH)

4−O−メチル−ロスマリン酸の¹³C―核磁気共鳴スペクトラム(CD₃OD:D₂O=7:3、100MHz)
128.7(C1),114.7(C2),147.1(C3), 151.3(C4), 112.7(C5), 123.2(C6), 146.5(C7), 116.3(C8), 169.3(C9), 56.6(C10), 131.3(C1’), 117.7(C2’), 145.4(C3’), 144.2(C4’), 116.5(C5’), 122.0(c
7),38.4(C7’), 77.7(C8’), 56.4(C’10)
LC-MS（M-H=373）

（実施例2）３,３’−O−ジメチル−ロスマリン酸の調製
ロスマリン酸を10%含有した赤シソエキスを4g摂取したヒト尿2000ｍｌをメタノールと水によって平衡化したC18 125A waters (日本ウォーターズ株式会社製)に供し、水、5％メタノールで洗った後、80％メタノールで溶出した。80％メタノール画分を濃縮後、下記条件の分取用高速液体クロマトグラフィーによってロスマリン酸ジメチルを得た。単離精製した。溶離液は0.015％トリフルオロ酢酸含有する50％（V／V）メタノール水溶液を用い、流速は１５ｍｌ／ｍｉｎ、カラムとしては、カプセルパックUG120(φ20ｍｍ*250ｍｍ、資生堂株式会社製)を用いた。

３,３’−O−ジメチル−ロスマリン酸の^１H―核磁気共鳴スペクトラム(CD₃OD，400MHz)
7.16（2H, d, Ar）,6.78（5H, d, Ar）, 7.04（6H, ｄｄ, Ar）, 7.58（7H, d, メチレン−CH＝）, 6.35（8H, ｄ, メチレン−CH=）, 3.88（10H, s, O-CH₃）, 6.91(2’H, d, Ar), 6.69(5’H, d, Ar), 6.74(6’H, dd, Ar),3.00(7’aH, dd, CH₂), 3.16(7’bH, dd, CH₂), 5.15(8’H, dd, CH), 3.82(10’H, s, O-CH₃)
３,３’−O−ジメチル-ロスマリン酸の¹³C―核磁気共鳴スペクトラム(CD₃OD，100MHz)
127.9(C1),111.7(C2),149.4(C3), 150.5(C4), 116.4(C5), 124.0(C6), 146.7(C7), 115.8(C8), 168.8(C9), 56.4(C10), 130.8(C1’), 114.1(C2’), 148.7(C3’), 146.1(C4’), 116.0(C5’), 122.9(C7), 38.9(C7’), 77.1(C8’), 56.4(C’10)
LC-MS (M-H=387)

（実施例3）ロスマリン酸誘導体入りキャンデーの調製
下記の配合で常法に従いキャンディーを製造した。
砂糖 50.0
水飴 33.0
クエン酸 2.0
香料 0.2
4−O−メチル−ロスマリン酸 0.1
脱イオン水残部
計 100.0

（実施例4）ロスマリン酸誘導体入り清涼飲料の調製
下記の配合で常法に従い清涼飲料を製造した。
砂糖 16.0
クエン酸 0.3
アスコルビン酸 0.1
フレーバー 0.05
3−O−メチル−ロスマリン酸 0.1
脱イオン水残部
計 100.0

（実施例5）ロスマリン酸誘導体含有の錠剤の調製
下記の配合で常法に従い錠剤を製造した。
3，3’−O−ジメチル−ロスマリン酸 0.1
結晶セルロース 98.9
ショ糖脂肪酸エステル 1.0
計 100.0

（試験例1）ロスマリン酸誘導体のCOX2発現量における試験
ヒト由来単球U937細胞を12ウエルの細胞培養用プレートに2ml/ウエル(1×10⁶CELLＳ/ウエル)播種した。終濃度10nMになるようにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）を添加し、72時間３７℃、５％ＣＯ_２下のインキュベータで静置し、マクロファージに分化させた。72時間後、上清を吸引除去し、PBS（−）２mlでウオッシュした。その後、新しい培地を添加し、２４時間後５％ＣＯ_２下のインキュベータにて静置した。２４時間後リポ多糖（ＬＰＳ）を各ウエルに添加し、インキュベータで静置した。対照群は、LPSと同時にDMSOを10μl添加、試験群として、ロスマリン酸、3―O―メチル-ロスマリン酸、4−Ｏ−メチル−ロスマリン酸、３，3´−O−ジメチル−ロスマリン酸を終濃度10μＭになるように10μｌ添加して、3時間後、細胞中のRNAを回収し RT-PCRによって、ＣＯＸ２のmＲＮＡの発現量を定量した。グラフ値は、β-actinによる補正値を示す。試験結果は、図１に示されるとおりであり、本発明の化合物が、有意にＣＯＸ２の発現量を抑制する（ｔ検定：P<0.05）ことが確認された。

本発明の化合物は抗炎症作用を有することから、炎症性の疾患の治療用または予防用の薬品および飲食品として利用することが可能である。

誘導されるCOX2発現量の抑制活性を示すグラフ。

Claims

3,3’−O−ジメチル−ロスマリン酸及びその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物。
一般式（I）で表されるロスマリン酸誘導体を有効成分とするシクロオキシゲナーゼ2発現抑制組成物。

［式中、R₁、R₂、R_３、R₄は、Hまたは、メチル基を表す。但し、ロスマリン酸を除く。］
一般式（I）で表されるロスマリン酸誘導体が3−O−メチル−ロスマリン酸、4−O−メチル−ロスマリン酸、または3,3’−O−ジメチル−ロスマリン酸である請求項2記載のシクロオキシゲナーゼ2発現抑制組成物。