JP6054102B2 - 一酸化窒素産生促進又は誘導剤 - Google Patents

Description

本発明は、一酸化窒素産生を促進又は誘導する剤に関する。

生体内では一酸化窒素は、一酸化窒素合成酵素 (NOS) によってアルギニンと酸素とから合成される。一酸化窒素は細胞内の可溶型グアニル酸シクラーゼを活性化してサイクリックGMP (cGMP) を合成させることによりシグナル伝達に関与する。この機構を介して一酸化窒素は生体内の様々な器官で種々の機能の発現を担っている。

例えば、血管内皮は一酸化窒素をシグナルとして周囲の平滑筋を弛緩させ、それにより動脈を拡張させて血流量を増やす。この作用は、ニトログリセリン、亜硝酸アミル、一硝酸イソソルビド（5-ISMN,アイトロール(R)）などの亜硝酸誘導体の心臓病の治療の基本的な作用機構である。これらの亜硝酸化合物は血流内で一酸化窒素に変化し、心臓の冠動脈を拡張させて血液供給を増やす。
また、発毛剤ミノキシジル（商品名：リアップ）は cGMP分解を抑制して毛細血管の血流量を増やす。一酸化窒素は陰茎の勃起機構にも係わっており、やはり cGMP分解抑制薬であるシルデナフィル（商品名：バイアグラ）はこのメカニズムを利用したものである。

一酸化窒素を気管内に吸入させることにより、肺動脈の血管平滑筋を弛緩させ、肺高血圧を改善させることができる。特に新生児の新生児遷延性肺高血圧や、開心術後の心臓の負荷軽減、原発性肺高血圧症の治療などに利用される。

免疫系に於いては、マクロファージは病原体を殺すために一酸化窒素を産生する。
特に細菌感染に伴い細菌細胞壁由来のリポポリサッカライド（LPS、エンドトキシン）が、マクロファージの一酸化窒素産生を刺激し、その結果血管内皮細胞の産生する一酸化窒素の30倍以上の大量な一酸化窒素が全身的に産生され、その結果急激な血圧低下や微小血栓の形成などを伴う敗血症を発症する。敗血症の進展に伴って、全身の線溶系異常がおこり、播種性血管内凝固症候群（DIC）が誘発され、その結果多臓器不全を起こして死に至る場合もある。すなわち敗血症に伴う一酸化窒素に係わる免疫系の異常は、そのまま線溶系の異常につながっている。

このように、一酸化窒素の生物機能は多岐にわたっており、一酸化窒素の生体内での分泌を制御することで種々の疾患の治療や予防効果が期待できる。このためいくつかの提案がすでになされている。特許文献１（特開２０１０−２５４５８９号公報）には、一酸化窒素の前駆物質であるシトルリンやアルギニン又はアルギノコハク酸を投与して、ドライマウス患者の一酸化窒素分泌量を増加させ、それによってドライマウスやドライアイを改善しようとする試みが提案されている。特許文献２（特開２００８−２５５０７５号公報）はハイペロサイドとイソクエルシトルリンの混合物を投与して、血管内皮細胞の一酸化窒素分泌を促進させることによって血管内皮機能を改善し動脈硬化や高血圧の予防を行う試みが提案されている。また特許文献３（特開２０００−２９０１９８号公報）には一酸化窒素の産生を抑制することで、血管の透過性と血管の拡張を抑制し、花粉症によるくしゃみや鼻汁の分泌を抑制しようという試みが提案されている。
特許文献４（特開２００３−３３５６８９号公報）には、上述したNOS阻害作用を有するプロポリスを一酸化窒素合成酵素阻害剤として利用し、敗血症やエンドトキシンショックなど各種疾患の治療に利用できることが開示されている。特許文献５（特開平１１−３１０５３０号公報）にはケリドニン、コリノリン、サンギナリン、プロトピン、コリダリン、ベルベリン誘導体等を一酸化窒素産生抑制剤として使用し、敗血症性ショック、低血圧症、炎症性組織障害、虚血性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、慢性関節リウマチまたはインスリン依存性糖尿病の予防・治療剤として利用することが提案されている。また特許文献６（特開平１１−２２２４３５号公報）には、Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２，３，４−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドを前述のNOS阻害剤として利用したエンドトキシンショックの治療剤が提案されている。

特開２０１０−２５４５８９号公報 特開２００８−２５５０７５号公報 特開２０００−２９０１９８号公報 特開２００３−３３５６８９号公報 特開平１１−３１０５３０号公報 特開平１１−２２２４３５号公報

本発明の課題は、新規な一酸化窒素産生を促進又は誘導する剤を提供することである。

本発明者らは、血管内皮細胞の産生する一酸化窒素の分泌を促進又は誘導する化合物を探索したところ、ヘリピロンＡ（Helipyrone A）に強い一酸化窒素分泌促進効果を有することを発見した。
すなわち本発明の主な構成は以下のとおりである。
（１）ヘリピロンＡ（Helipyrone A）を有効成分とする一酸化窒素分泌促進剤又は誘導剤（皮膚老化改善剤、しわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラニン抑制剤の用途を除く）
（２）経口剤である（１）に記載の剤。
（３）錠剤の形態である（１）又は（２）に記載の剤。

本発明の有効成分であるヘリピロンＡ（Helipyrone A）は、血管内皮細胞の一酸化窒素の産生を促進し、一酸化窒素の生体内濃度が減少することに伴う、各種疾患や症状の予防や治療に効果を有する。

ヘリピロンＡ（Helipyrone A）の正常ヒト血管内皮細胞における一酸化窒素（NO）産生促進効果を確認したグラフである。

以下、本発明を詳細に説明する。

ヘリピロンＡ（Helipyrone A）は、次の一般式（１）で表される公知の化合物である。

ヘリピロンＡ（Helipyrone A）には、本発明の血管内皮細胞の一酸化窒素産生促進又は産生誘導のほかに、しわ抑制効果、皮膚老化改善、光老化、美白剤、メラニン生成、抗酸化、一重項酸素消去などの作用があることが知られている。ヘリピロンＡは化学合成することができる。

ヘリピロンＡは、血管内皮細胞の一酸化窒素の分泌を促進し又は誘導する。したがって各種疾患の予防治療剤として使用できる。投与にあたっては、そのまま直接使用してもよいが、種々の剤型での投与が可能であり、一般的には薬学的に許容される適当な液体担体に溶解するか若しくは分散させ、または薬学的に許容される適当な粉末担体と混合するか若しくはこれに吸着させ、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤等の経口投与剤や、座薬や点滴剤などの非経口投与剤として使用できる。投与量は患者の症状や年齢に応じて適宜変更できるが、1日当たり、ヘリピロンＡとして0.01〜1000mg/kg体重の範囲で用いればよく、更に0.1〜100mg/kg体重の範囲で用いるのが好ましい。

また、本発明の一酸化窒素産促進又は誘導剤は、通常の飲食品に抽出物を添加することもできる。例えば、チョコレート、キャンディ、ゼリー、ビスケット、チューインガム、アイスクリーム、シャーベット、氷菓、和菓子等の菓子、清涼飲料、ジュース、ウーロン茶等の飲料、畜肉加工品、魚肉・水産加工肉、乳・卵加工品、野菜加工品、穀類加工品、冷凍食品、調味料、スプレッド等の飲食品に用いることができる。添加量は、対象の飲食品に対して重量を基準として乾燥抽出物を0.01〜10%、好ましくは0.05〜5%の範囲で添加するのが好ましい。

以下、本発明を試験例、実施例により説明するが、本発明は、これらの試験例や実施例に限定されるものではない。

＜参考例＞
ヘリピロンＡの合成
[ヘリピロンＡ（Helipyrone A）の化学合成]
ヘリピロンＡ（Helipyrone A）の化学合成方法については、Esahak Ali, et al., Phytochemistry,1982,21,243-244）や国際公開第２００７／１２５８３２号公報：に開示されている。例えば、本発明では、次のように合成した。
400mLのヘキサン溶媒を用いて、四塩化チタンの存在下で化合物１ ジエチルケトン(3-pentanone)172gと化合物２ テトラヒドロ−１，４−オキサジン（terahydro-1,4-oxazine (morpholine) ）1,000gを4℃で3時間で反応させ、蒸留処理で精製し、化合物３ （Ｎ−イソプロペニル）−テトラヒドロ−１，４−オキサジン（(N-isopropenyl)- terahydro-1,4-oxazine）503.57g（収率81.1%）を得た。
ついで200mLのトルエン溶媒を用いて、化合物３ （Ｎ−イソプロペニル）−テトラヒドロ−１，４−オキサジン（(N-isopropenyl)- terahydro-1,4-oxazine）167gを化合物４ エチルマロニルクロライド（ethyl malonyl chloride）81gとメタノール−氷冷（−17℃〜−11℃）条件で反応させ、一般式２で表される化合物５を合成した。

化合物３と化合物４との反応は2N塩酸添加で終了させ、クロロホルム抽出後に硫酸マグネシウム乾燥処理を行った。その次に反応溶液にトルエン200mLと25%塩酸400mLを順次加えて液−液分配でトルエン層を回収した。トルエン層を0.1N塩酸400mLで洗浄し、硫酸マグネシウム乾燥処理後にトルエンを真空エバポレーターで除去して橙色油状溶液を得た。この溶液にPPA（ポリリン酸）1kgを加え、110℃〜118℃で環化して化合物５を合成した。化合物５は室温に冷却し、クロロホルム抽出で回収し、硫酸マグネシウム乾燥処理後に真空エバポレーターでクロロホルムを除去した。固形物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝50：１（ｖ／ｖ））で橙色固形の化合物５を45.7g得た。本反応の収率は18.3%であった。

この化合物５について1N塩酸の存在下でホルムアルデヒドを重合反応することで化合物６ ヘリピロンＡ（Helipyrone A）を化学合成した。化合物５の45.7gをエタノール460mLに溶解し、濃塩酸2.5mLの存在下でホルムアルデヒド（37%）247.81gを79℃で還流反応させ、結晶が析出した。この結晶をエタノール300mLで洗浄し、白色結晶としてヘリピロンＡ（Helipyrone A）を34.01g得た。本反応の収率は71.6%であった。

得られたヘリピロンＡ（Helipyrone A）の物性値を以下に示す。
外観：白色結晶
NMRスペクトル(400 MHz, 溶媒；CDCl₃)
^１H-NMR
δ＝a 1.231、b 1.969、c 2.554、d 3.616、e 11.199
¹³C NMR（400 MHz、溶媒；CDCl₃）
δ＝I→169.335（t） H→168.499（m）,G→160.160（m）,F→108.709（m）, E→101.592（t）,D→24.368（qt）,C→19.176（t）,B→11.689（qt）,A→9.476（q）

分子量：320.341g/mol（質量分析）
分子式：C₁₇H₂₀O₆ （質量分析）
融点：218−220℃

＜試験例＞
正常ヒト血管内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cells、以下HAEC）における一酸化窒素（NO）産生促進効果確認試験
正常ヒト大動脈内皮細胞（三光純薬より購入）を培養液EBM-2（添加剤EGM-2（いずれもLONZA）含有）にて継代培養し、継代数４に達した細胞を用いて効果を確認した。
平板12ウェルプレートに2×10⁴cell/wellの細胞密度で細胞を播種し、24時間37℃5%二酸化炭素インキュベーターで培養して細胞を定着させた。その後、培地をフェノールレッドフリーEBM-2に置換して、ヘリピロンＡを10μg/ml、3μg/ml、1μg/mlを添加し、さらに2時間37℃5%二酸化炭素インキュベーターで培養した。
培養終了直後の培養液を回収し、NO₂/NO₃Assay Kit FX（同仁化学）で溶液中のNitrite量を求め、一酸化窒素（NO）量として、各群n=3で測定した。

結果
図１に測定結果を示す。ヘリピロンＡは濃度依存的に血管内皮細胞の一酸化窒素産生を促進することが確認できた。

製剤処方例
以下の処方によりヘリピロンＡを含有する製剤を調製できる。
処方例１（錠剤）
ヘリピロンＡ １０．０
乳糖 ７０．０
コーンスターチ １９．０
シュガーエステル １．０

処方例２（錠剤）
ヘリピロンＡ １０．０
Ｄ−マンニトール ３５．０
乳糖 ４０．０
結晶セルロース １０．０
ヒドロキシプロピルセルロース ５．０

処方例３（散剤）
ヘリピロンＡ ２０．０
コーンスターチ ２５．０
乳糖 ５５．０

処方例４（カプセル剤）
ヘリピロンＡ ５．０
乳糖 ９３．０
ステアリン酸マグネシウム ２．０

上記成分を均一に混合し次いで造粒し、その造粒物をハードカプセルに充填した。

処方例５（シロップ剤）
ヘリピロンＡ １０．０
精製水 ６０．０
シロップ ３０．０

処方例６（錠菓）
砂糖 ７６．６
グルコース １８．０
ショ糖脂肪酸エステル ０．２
香料 ０．２
ヘリピロンＡ ５．０

処方例７（飲料）
果糖ブドウ糖液糖 ５．００
砂糖 ４．５０
酸味料 １．２８
香料 ０．２０
ヘリピロンＡ ０．０２
水 ８９．００

処方例８（飲料）
オレンジ果汁 ８０．０
砂糖 １１．７
酸味料 ２．０
香料 １．０
ヘリピロンＡ ０．０００５
水 残余

Claims (3)

1. ヘリピロンＡ（Helipyrone A）を有効成分とする一酸化窒素分泌促進剤又は誘導剤（皮膚老化改善剤、しわ改善剤、たるみ改善剤、皮膚水分量改善剤、美白剤、メラニン抑制剤の用途を除く）。
2. 経口剤である請求項１に記載の剤。
3. 錠剤の形態である請求項１又は２に記載の剤。