JP5969299B2 - Trpa1活性化剤 - Google Patents
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したがって、TRPA1を活性化することにより、酸素感知機構の異常によって起こる呼吸不全の予防、改善又は治療効果をもたらすと考えられる。
また、セサミンは、ゴマに含まれる主要なリグナン化合物の一種で、抗酸化作用(特許文献11)、抗疲労作用(特許文献12)等があることが報告されている。
しかし、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びセサミンがTRPA1活性亢進作用を有することや呼吸不全に有用であることは知られていない。
なお、上記ポリフェノール類は、立体異性体又はそれらの混合物の何れを用いることもできる。また、上記ポリフェノール類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよい。
また、当該ポリフェノール類を含有する植物、各種食品の抽出物や部分精製物、加工品を用いてもよく、当該抽出物や部分精製物、加工品から単離した各ポリフェノール類を用いることもできる。
TRPA1チャネルは肺に発現し、肺での酸素センサーとして機能する。すなわち、TRPA1チャネルは肺において体内に取り入れることができる酸素分圧を感知し、組織への酸素供給を厳密に制御しており、TRPA1の活性が低下すると酸素感知機構が正常に機能せず、酸素濃度の変化に対する呼吸反射が損なわれる(非特許文献2)。したがって、TRPA1を活性化することにより、酸素感知機構の異常によって起こる呼吸不全の予防、改善又は治療が可能であると考えられる。
また、本発明のポリフェノール類及びセサミンは、TRPA1活性化剤として使用することができ、さらに当該TRPA1活性化剤を製造するために使用することができる。
また、食品としては、TRPA1活性化、或いは呼吸不全の予防、改善又は治療をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等を包含する。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のポリフェノール類又はセサミンを単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
種々の形態の食品は、本発明のポリフェノール類又はセサミンを単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせることにより調製することができる。当該食品中の本発明のポリフェノール類又はセサミンの含有量(抽出物の乾燥物換算)は、通常0.001質量%以上、好ましくは0.005質量%以上、より好ましくは0.01質量%以上であり、そして10質量%以下、好ましくは5質量%以下、より好ましくは1質量%以下である。例えば、0.001〜10質量%、好ましくは0.005〜5質量%、より好ましく0.01〜1質量%が挙げられる。
<1>ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンを有効成分とするTRPA1活性化剤。
<2>TRPA1活性化剤を製造するための、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンの使用。
<3>TRPA1活性化に使用するためのヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミン。
<4>ヘスペレチン、ナリンゲニン、ケルセチン、ルテオリン、フィセチン、ゲニステイン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン、レスベラトロール及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンを、それらを必要とする対象に投与又は摂取するTRPA1活性化方法。
ヒト小腸totalRNA(BioChain社)を逆転写して得られたcDNAを鋳型にして、公開されているヒトTRPA1遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行った。
フォワードプライマー;5’- CACCATGAAGCGCAGCCTGAGGAAGATGTG-3’:配列番号1
リバースプライマー ;5’- GAGGAGCTAAGGCTCAAGATGGTGTG-3’ :配列番号2
PCR条件
a)PCR溶液組成
cDNA(Template) 15μl
5x PrimeStar GXL Buffer 10μl
dNTPs mixture (2.5mM) 4μl
PrimeStar GXL DNA Polymerase (タカラバイオ) 1μl
Forward Primer (10μM) 1μl
Reverse Primer (10μM) 1μl
Water 18μl
b)温度とサイクル条件
95℃ 2min
↓
98℃ 10sec 33 cycles
70℃ 3min
10%牛胎児血清を含むDMEM/F12培地(インビトロジェン)を用いてHEK293細胞(American Type Culture Collectionより購入)の培養を行った。HEK293細胞をT−75細胞培養用フラスコに5×105cells/Flaskで播種した。培養3日後、ヒトTRPA1発現ベクター(8μg)をTransIT-293(Mirus)を用いて細胞にトランスフェクションし1日培養した。Detachin(Genlantis)で細胞をはがし96well Optical bottom plate(Nunc)に10%牛胎児血清を含むDMEM/F12培地で1.5×104cells/90μl/wellの細胞密度で播き、さらに1日培養した。
細胞内Ca2+流入活性の測定はCalcium Kit II- fluo 4(DOJINDO)を用いて行った。fluo4-AM を含有したLoading bufferを上記の細胞に90μl/well添加し、37℃で1時間インキュベートした後、37℃でFDSS3000(浜松ホトニクス)により蛍光強度(励起波長;488nm,蛍光波長;524nm)を2秒毎に測定した。測定開始30秒後に以下に示す検体を含有する溶液(検体;終濃度の10倍濃度)を20μl/well添加し、300秒まで2秒毎に蛍光強度変化を測定した。
検体のTRPA1活性化率は次式により算出した。
活性化率(%)=[1-〔(FmaxC1/F0C1−Fmax/F0)/(FmaxC1/F0C1−FmaxC2/F0C2)〕]×100
Fmax ;検体を添加したウェルの蛍光強度最大値
FmaxC1;AITC(終濃度10μM)を添加したウェルの蛍光強度最大値
FmaxC2; DMSOのみを添加したウェルの蛍光強度最大値
F0 ;測定開始直後の検体を添加したウェルの蛍光強度
F0C1;測定開始直後のAITC(終濃度10μM)を添加したウェルの蛍光強度
F0C2;測定開始直後のDMSOのみを添加したウェルの蛍光強度
アリルイソチオシアネート(AITC)(和光純薬, TRPA1作動薬)、レスベラトロール(和光純薬)、ヘスペレチン(シグマ)、ナリンゲニン(東京化成)、ケルセチン2水和物(ナカライテスク)、ルテオリン(LKT)、フィセチン(INDOFINE)、ゲニステイン(東京化成)、セサミン(東京化成)、ダイゼイン(東京化成)、イソリキリチゲニン(東京化成)、ブテイン(東京化成)、クリシン(関東化学)、イソラムネチン(シグマ)、グリシテイン(和光純薬)、ガランギン(ExtraSynthesis)を、それぞれジメチルスルオキシド(DMSO)(ナカライテスク)で溶解し、使用した。
表1より、レスベラトロール(10,30,100μM)、ヘスペレチン(30,100μM)、ナリンゲニン(30,100μM)、ケルセチン(10,30,100μM)、ルテオリン(30,100μM)、フィセチン(30,100uM)、セサミン(30,100uM)、ゲニステイン(3,10,30μM)、ダイゼイン(3,10,30μM)、イソリキリチゲニン(1,3,10μM)、ブテイン(1,3,10μM)は各濃度においてコントロール(DMSO)に比べて、有意にTRPA1を活性化させた。一方、同じポリフェノールでもグリシテイン、クリシン、イソラムネチン、ガランギンは100μMの濃度においてもTRPA1活性化作用が認められなかった。
Claims (1)
- ゲニステイン、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ルテオリン、フィセチン、ダイゼイン、イソリキリチゲニン、ブテイン及びそれらの配糖体から選ばれるポリフェノール類、又はセサミンを有効成分とするTRPA1活性化剤。
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