CN116782944A

CN116782944A - 用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物

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Publication number: CN116782944A
Application number: CN202180076900.2A
Authority: CN
Inventors: 中西春霞; 浅田和希; 小原达矢; 室山幸太郎
Original assignee: House Wellness Foods Corp
Current assignee: House Wellness Foods Corp
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2021-11-16
Publication date: 2023-09-19
Also published as: JPWO2022102788A1; CA3201984A1; WO2022102788A1; US20240016789A1

Abstract

本发明提供一种具有增强肾上腺髓质素的基因表达的作用的组合物。本发明的一个以上的实施方式涉及含有TRPV1激动剂及TRPA1激动剂作为有效成分的、用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物。作为TRPV1激动剂，能够示例选自辣椒素、6‑生姜酚、6‑姜辣素及胡椒碱中的一种以上。作为TRPA1激动剂，能够示例选自异硫氰酸烯丙酯、肉桂醛、二烯丙基二硫醚、ASP7663及氧脂素中的一种以上。

Description

用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物。

背景技术

肾上腺髓质素是具有扩张血管作用的循环调节肽。有报道指出，肾上腺髓质素由循环系统、消化系统等各种脏器产生，具有扩张血管、血管新生、抗菌作用、抗肠炎、保护胃粘膜、抑制血栓形成等重要的生理活性(专利文献1)。

TRP(transient receptor potential，瞬时受体电位)通道是供钠离子、钙离子等阳离子通过的离子通道分子。TRP通道由温度变化、机械刺激、氧化应激等而活化。TRP通道中鉴定出很多同系物，TRP通道超级家族包括六个亚家族。TRPV1属于TRPV亚家族。TRPA1属于TRPA亚家族。

在专利文献1中，记载了含有来自人参(＝高丽人参)的化合物和来自干姜的化合物和/或来自山椒的化合物为有效成分的肾上腺髓质素产生增强剂。

在非专利文献1中，记载了：作为一种中药的大建中汤(包含山椒、干姜、高丽人参)促进肾上腺髓质素从肠道上皮细胞中释放，由此具有促进肠道中的血流的作用；以及大建中汤及作为其成分之一的6-生姜酚具有促进肾上腺髓质素从肠道上皮细胞中释放的作用，该作用会被TRPA1的拮抗剂抑制。

在专利文献2中，记载了一种含有针对TRP钙通道蛋白质的激动剂作为有效成分的脂肪细胞分化诱导剂、及用于预防及改善脂肪细胞的分化异常所导致的疾病的功能性食品。作为TRP钙通道蛋白质的具体例，记载了TRPV1、TRPV4、TRPM8及TRPA1。作为所述激动剂的具体例，记载了辣椒素、薄荷醇、异硫氰酸烯丙酯、肉桂醛及大蒜素。

在专利文献3中，记载了一种口腔护理组合物的味道改善方法，该方法包括将TRPV1活化因子与金属盐等异味消除物质混合。作为TRPV1活化因子的具体例，记载了辣椒素(capsaicin)、生姜酚(shogaol)、姜辣素(gingerol)、胡椒碱(peperine)等。

在专利文献4中，记载了一种用于治疗末梢中枢神经系统病症、疼痛性肌肉收缩等的组合物，该组合物包含TRPV1通道活化剂、TRPA1通道活化剂、ASIC通道活化剂或它们的组合。作为TRPV1通道活化剂的具体例，记载了辣椒素、姜辣素等。作为TRPA1通道活化剂的具体例，记载了异硫氰酸烯丙酯(isothiocyanate)、肉桂醛(cinnamaldehyde)、二烯丙基硫醚(diallyl disulfide)、山椒醇等。

在专利文献5中，记载了一种含有脂肪酸作为有效成分的TRPA1刺激剂，该脂肪酸具有一种以上的官能团，该官能团的碳原子数为12～26，且具有一种以上的碳-碳双键，并选自由羟基或过氧化氢基构成的组。在专利文献5中，记载了：该TRPA1刺激剂作为食品添加剂添加在食品中，以调节及改善味觉。在专利文献5中，记载了：所述脂肪酸能够作为氧脂素(oxylipin)从植物中提取，作为所述脂肪酸的具体例，记载了选自下述构成的组中的至少一种：(10E,12Z)-9-羟基-10,12-十八碳二烯酸、(9Z,11E)-13-羟基-9,11-十八碳二烯酸、(9Z,11E,15Z)-13-羟基-9,11,15-十八碳三烯酸、(10E,12Z)-9-过氧羟基-10,12-十八碳二烯酸、(9Z,11E)-13-过氧羟基-9,11-十八碳二烯酸、(9Z,11E,15Z)-13-过氧羟基-9,11,15-十八碳三烯酸、(5Z,8Z,11Z,13E)-15-过氧羟基-5,8,11,13-二十碳四烯酸、(4Z,7Z,10Z,13Z,15E,19Z)-17-过氧羟基-4,7,10,13,15,19-二十二碳六烯酸、(9Z)-12-羟基-9-十八烯酸及(9E)-12-羟基-9-十八烯酸。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2009/104248

专利文献2：日本特开2006-199647号公报

专利文献3：日本特表2012-524792号公报

专利文献4：日本特表2017-513864号公报

专利文献5：日本特开2014-076979号公报

非专利文献

非专利文献1：Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304：G428-G436，2013

发明内容

本发明的课题在于提供一种具有增强肾上腺髓质素的基因表达的作用的组合物。

本发明人等发现，含有TRPV1激动剂及TRPA1激动剂作为有效成分的组合物具有增效增强肾上腺髓质素基因的表达的作用，从而完成了以下的本发明。

(1)一种用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物，含有TRPV1激动剂及TRPA1激动剂作为有效成分。

(2)根据(1)所述的组合物，其中，TRPV1激动剂为选自辣椒素、6-生姜酚、6-姜辣素及胡椒碱中的一种以上。

(3)根据(1)或(2)所述的组合物，其中，TRPA1激动剂为选自异硫氰酸烯丙酯、肉桂醛、二烯丙基二硫醚、ASP7663及氧脂素中的一种以上。

(4)一种TRPV1激动剂及TRPA1激动剂在制造用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物中的用途。

(5)根据(4)所述的用途，其中，所述用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物是用于在生物体内或生物体外增强细胞的肾上腺髓质素基因表达的组合物。

(6)根据(5)所述的用途，其中，所述细胞为小肠道上皮细胞等上皮细胞。

(7)一种TRPV1激动剂及TRPA1激动剂用于制造用于增强肾上腺髓质素基因表达的药物的用途。

(8)根据(7)所述的用途，其中，所述用于增强肾上腺髓质素基因表达的药物为用于在人、非人哺乳动物等对象中，实现选自增加血流、抗菌作用、抗肠炎、保护胃粘膜及抑制血栓形成中的一种以上的效果的药物。

(9)一种增强肾上腺髓质素基因的表达的方法，其中，包括向需要或期待肾上腺髓质素基因表达增强的人、非人哺乳动物等对象给药TRPV1激动剂及TRPA1激动剂。

(10)一种治疗或预防所述疾病或症状的方法，其中，包括包括向需要或期待对可通过肾上腺髓质素基因表达增强改善的疾病或症状进行治疗或预防的人、非人哺乳动物等对象给药TRPV1激动剂及TRPA1激动剂。

(11)根据(10)所述的方法，其中，所述疾病或症状为选自可通过增加血流而改善的疾病或症状、微生物导致的疾病或症状、肠炎、可通过保护胃粘膜而改善的疾病或症状、以及可通过抑制血栓形成而改善的疾病或症状中的一种以上。

(12)一种在体内或体外增强细胞的肾上腺髓质素基因的表达的方法，包括在生物体内或生物体外向细胞提供TRPV1激动剂及TRPA1激动剂。

(13)根据(12)所述的方法，其中，所述细胞为小肠道上皮细胞等上皮细胞。

(14)一种TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的组合，用于在人、非人哺乳动物等对象中增强肾上腺髓质素基因的表达的用途。

(15)根据(14)所述的组合，其中，所述组合为包含TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的组合物、或包含彼此不混合的TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的试剂盒。

(16)一种TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的组合，用于在人、非人哺乳动物等对象中治疗或预防可通过肾上腺髓质素基因表达增强改善的疾病或症状的用途。

(17)根据(16)所述的组合，其中，所述疾病或症状为可通过增加血流而改善的疾病或症状、微生物导致的疾病或症状、肠炎、可通过保护胃粘膜而改善的疾病或症状、以及可通过抑制血栓形成而改善的疾病或症状中的一种以上。

(18)根据(16)或(17)所述的组合，其中，所述组合为包含TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的组合物、或包含彼此不混合的TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的试剂盒。

(19)一种TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的组合，用于在体内或体外增强细胞的肾上腺髓质素基因的表达的用途。

(20)根据(19)所述的组合，其中，所述细胞为小肠道上皮细胞等的上皮细胞。

(21)根据(19)或(20)所述的组合，其中，所述组合为包含TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的组合物、或包含彼此不混合的TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的试剂盒。

(22)一种药品组合物、饮食品组合物或化妆品组合物，含有：

相对于组合物总量，合计优选为0.1～95质量％，更优选为1～50质量％的TRPV1激动剂及TRPA1激动剂；以及

作为药品、饮食品或化妆品可以接受的一种以上的其它成分。

(23)根据(22)所述的药品组合物、饮食品组合物或化妆品组合物，其中，相对于TRPV1激动剂1摩尔，TRPA1激动剂优选为0.1～100摩尔，更优选为0.1～50摩尔，更优选为0.1～20摩尔，更优选为0.2～5摩尔，特别优选为0.2～3摩尔。

(24)根据(22)或(23)所述的药品组合物、饮食品组合物或化妆品组合物，其中，所述一种以上的其它成分为选自甜味料、酸味料、维生素类、矿物质类、增粘剂、乳化剂、抗氧化剂、水、色素、香料、保存剂、防腐剂、防霉剂、及进一步的生理活性物质中的一种以上。

(25)一种用于细胞培养的培养基组合物，包含：

一种以上的培养基成分、TRPV1激动剂、以及TRPA1激动剂。

(26)根据(25)所述的培养基组合物，其中，TRPV1激动剂的浓度为1～100μM，TRPA1激动剂的浓度为1～300μM。

(27)根据(25)或(26)所述的培养基组合物，其中，相对于TRPV1激动剂1摩尔，TRPA1激动剂优选为0.1～100摩尔，更优选为0.1～50摩尔，更优选为0.1～20摩尔，更优选为0.2～5摩尔，特别优选为0.2～3摩尔。

(28)根据(4)～(27)中任一项方案，其中，TRPV1激动剂为选自辣椒素、6-生姜酚、6-姜辣素及胡椒碱中的一种以上。

(29)根据(4)～(28)中任一项方案，其中，TRPA1激动剂为选自异硫氰酸烯丙酯、肉桂醛、二烯丙基二硫醚、ASP7663及氧脂素中的一种以上。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请第2020-189986号的公开内容。

根据本发明，提供一种具有增强肾上腺髓质素基因的表达的作用的组合物。

附图说明

图1用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM辣椒素、单独经过30μM或60μM AITC、以及经过30μM辣椒素和30μM或60μM AITC的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图2用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM辣椒素、单独经过30μM或60μM肉桂醛、以及经过30μM辣椒素和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图3用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM辣椒素、单独经过30μM或60μM二烯丙基二硫醚、以及经过30μM辣椒素和30μM或60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图4用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过0μM辣椒素、单独经过10μM或20μM ASP7663、以及经过30μM辣椒素和10μM或20μM ASP7663的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图5用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过5μM6-生姜酚、单独经过30μM或60μM AITC、以及经过5μM6-生姜酚和30μM或60μM AITC的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图6用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过5μM6-生姜酚、单独经过30μM或60μM肉桂醛、以及经过5μM6-生姜酚和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图7用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过5μM6-生姜酚、单独经过30μM或60μM二烯丙基二硫醚、以及经过5μM6-生姜酚和30μM或60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图8用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过5μM 6-生姜酚、单独经过10μM或20μM ASP7663、以及经过5μM 6-生姜酚和10μM或20μM ASP7663的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图9用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM 6-姜辣素、单独经过30μM或60μM AITC、以及经过30μM 6-姜辣素和30μM或60μM AITC的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图10用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM 6-姜辣素、单独经过30μM或60μM肉桂醛、以及经过30μM 6-姜辣素和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图11用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM 6-姜辣素、单独经过60μM二烯丙基二硫醚、以及经过30μM 6-姜辣素和60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图12用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM 6-姜辣素、单独经过10μM或20μM ASP7663、以及经过30μM 6-姜辣素和10μM或20μM ASP7663的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图13用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM胡椒碱、单独经过30μM或60μM AITC、以及经过30μM胡椒碱和30μM或60μM AITC的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图14用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM胡椒碱、单独经过30μM或60μM肉桂醛、以及经过30μM胡椒碱和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图15用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM胡椒碱、单独经过30μM或60μM二烯丙基二硫醚、以及经过30μM胡椒碱和30μM或60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图16用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过30μM胡椒碱、单独经过10μM或20μM ASP7663、以及经过30μM胡椒碱和10μM或20μM ASP7663的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的、肾上腺髓质素的针对β肌动蛋白的相对mRNA表达量。

图17示出实验3评价1的结果。

图18示出实验3评价2的结果。

图19示出实验3评价3的结果。

图20示出实验3评价4的结果。

图21示出实验3评价5的结果。

图22用将对照条件下的表达量设为1时的值来表示单独经过5μM 6-生姜酚、单独经过20μM ASP7663、单独经过50μM、83.3μM、250μM精制氧脂素、以及经过5μM 6-生姜酚和50μM、83.3μM、250μM精制氧脂素的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。

具体实施方式

<TRPV1激动剂>

TRPV1激动剂只要为具有活化TRPV1(transient receptor potential vanilloid1，瞬时受体电位香草酸1)的作用的化合物，则不受特别限定，可以为天然存在的化合物，也可以为非天然存在的化合物。

在使用天然存在的TRPV1激动剂的情况下，TRPV1激动剂可以为化学合成的TRPV1激动剂，也可以为来自包含TRPV1激动剂的植物、微生物等天然原料的TRPV1激动剂。来自天然原料的TRPV1激动剂的形式不受限定，例如，可以为天然原料的形式，也可以为天然原料的提取物的形式，还可以为从天然原料中精制或浓缩而成的化合物的形式。

作为TRPV1激动剂，能够示例香草素、生物碱、α,β-不饱和二醛，优选为选自香草素及生物碱中的一种以上。

作为香草素，优选选自类辣椒素、6-生姜酚、6-姜辣素、6-姜酮酚、姜油酮及它们的衍生物中的一种以上，特别优选选自类辣椒素、6-生姜酚及6-姜辣素中的一种以上。作为类辣椒素，优选选自辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高二氢辣椒素、高辣椒素、香草壬酰胺及它们的衍生物中的一种以上，特别优选辣椒素。

作为生物碱，优选哌啶衍生物。作为哌啶衍生物，优选选自胡椒碱及其衍生物中的一种以上，特别优选胡椒碱。

<TRPA1激动剂>

TRPA1激动剂只要为具有活化TRPA1(transient receptor potential ankyrin1，瞬时受体电位锚蛋白1)的作用的化合物，则不受特别限定，可以为天然存在的化合物，也可以非天然存在的化合物。

在使用天然存在的TRPA1激动剂的情况下，TRPA1激动剂可以为化学合成的TRPA1激动剂，也可以为来自包含TRPA1激动剂的植物、微生物等天然原料的TRPA1激动剂。来自天然原料的TRPA1激动剂的形式不受特别限定，例如，可以为天然原料的形式，也可以为天然原料的提取物的形式，还可以为从天然原料中精制或浓缩而成的化合物的形式。

作为TRPA1激动剂，优选为选自异硫氰酸烯丙酯(AITC)、肉桂醛、二烯丙基二硫醚、ASP7663((2E)-2-[7-氟-1,2-二氢-1-(2-甲基丙基)-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基]乙酸)、氧脂素、二烯丙基硫醚、二烯丙基三硫醚、l-薄荷醇、大蒜素、丙烯醛、法尼基硫代水杨酸、Δ₉-四氢大麻酚、丁香酚、山椒醇、法尼基硫代乙酸、阿焦烯、樟脑、水蓼二醛及水杨酸甲酯中的一种以上，特别优选选自异硫氰酸烯丙酯(AITC)、肉桂醛、二烯丙基二硫醚、ASP7663及氧脂素中的一种以上。

以下，对氧脂素的优选方案进行说明。

氧脂素是指在体内通过包括环氧合酶、脂肪氧化酶及属于细胞色素P450的酶的多种酶的作用使多元不饱和脂肪酸氧化代谢而产生的一组化合物的总称。

氧脂素可以仅由一种化合物组成，也可以包含两种以上的化合物。

氧脂素典型地为具有一种以上的含氧官能团的脂肪酸，该含氧官能团的碳原子数为12～26，具有一种以上的碳-碳双键，选自羟基、过氧化氢基、酮基及环氧基。所述脂肪酸的碳链可以为直链或支链，也可以为部分环氧基化而成的直链或支链，但优选为直链。所述脂肪酸的碳原子数优选为16～22，更优选为18～22，更优选为18～20，最优选为18。所述含氧官能团优选为选自羟基及过氧化氢基中的一种以上，更优选为羟基。所述含氧官能团的数量优选为1或2，更优选为1。碳-碳双键的数量优选为1～6，更优选为1～3，更优选为2或3，最优选为3。所述脂肪酸也可以为盐的形式。

作为氧脂素的具体例，能够示例选自(9Z,11E,15E)-13-羟基-9,11,15-十八碳三烯酸、(7Z,13E,15Z)-12-羟基-7,13,15-十八碳三烯酸、(9Z,13E,15Z)-12-羟基-9,13,15-十八碳三烯酸、(9Z,12Z,14E)-16-羟基-9,12,14-十八碳三烯酸、及(10E,12Z,15Z)-9-羟基-10,12,15-十八碳三烯酸中的一种以上。这些氧脂素还可以为盐的形式。

另外，作为氧脂素的具体例，可以为选自具有以下的物理化学性状的、12位碳上追加有一个羟基的十八碳三烯酸、以及(9Z,11E,15E)-13-羟基-9,11,15-十八碳三烯酸，(9Z,12Z,14E)-16-羟基-9,12,14-十八碳三烯酸、及(10E,12Z,15Z)-9-羟基-10,12,15-十八碳三烯酸中的一种以上。具体而言，所述12位碳上追加有一个羟基的十八碳三烯酸可以为(7Z,13E,15Z)-12-羟基-7,13,15-十八碳三烯酸和/或(9Z,13E,15Z)-12-羟基-9,13,15-十八碳三烯酸。这些氧脂素也可以为盐的形式。

(1)外观：淡黄色透明的糖浆状固体

(2)HR MS[M+H]+：m/z 293.2116

(3)分子式C₁₈H₃₀O₃

(4)溶解性：乙醇、甲醇、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、DMSO

(5)紫外吸收光谱：λmax nm 230(80％CH₃CN中)

(6)1H NMR光谱1H-NMR(500MHz，氯仿-D)δ0.99(t,J＝7.7Hz),1.38-1.27(m),1.60-1.66(m),2.04(m),2.17-2.23(m),2.28-2.36(m),4.21(q,J＝6.3Hz,1H),5.35-5.40(m),5.42-5.47(m),5.53-5.58(m),5.68(dd,J＝15.2,6.6Hz),5.94(t,J＝11.2Hz),6.52(dd,J＝15.2,11.2Hz)

(7)13C NMR光谱13C-NMR(126MHz，氯仿-D)δ178.5,134.9,134.7,133.7,127.2,126.0,124.5,72.3,35.4,33.9,29.5,29.1,29.0,27.4,24.7,21.2,14.3。

氧脂素可以为来自植物、微生物、动物等天然原料的物质，也可以为化学合成的物质，优选为来自天然原料、特别是植物的物质。作为所述植物，特别优选柠檬草(学名：Cymbopogon citratus)。

氧脂素优选为含有氧脂素的、柠檬草等植物自身或植物提取物的形式，特别优选为植物的提取物。在使用植物自身的情况下，能够使用植物体的叶、茎、根等部位。

氧脂素还可以为从含有氧脂素的天然原料中精制或浓缩而来的化合物。从天然原料中精制或浓缩而来的氧脂素可以为天然原料中所含的氧脂素中的一种以上特定的化合物精制或浓缩而成的物质，也可以为植物原料中所含的全部氧脂素精制或浓缩而成的物质。

含有氧脂素的植物提取物能够通过使用提取介质对植物原料进行提取操作来制备。含有氧脂素的植物提取物优选为植物的疏水性提取物。作为提取介质，能够利用例如有机溶剂、水、热水等溶剂、超临界二氧化碳等超临界流体，特别优选溶剂。作为溶剂，特别优选使用乙醇、己烷、氯仿等疏水性有机溶剂、或者这些的混合溶剂，特别优选乙醇和/或己烷。在通过溶剂提取制造提取液的情况下，将植物原料浸渍在适量的溶剂(例如以重量标准计相对于植物原料为0.5～100倍量)中，适当搅拌或静置，使溶剂可溶性成分溶出在溶剂中。提取时间不受特别限定，可以为5分钟～24小时、例如15分钟～15小时。提取温度不受特别限定，可以为0℃～125℃、例如15℃～50℃。提取后，将包含溶剂可溶性成分的溶剂组分和细胞壁等固体组分通过固液分离方式(例如离心分离、过滤(硅藻土过滤等))分离，获得溶剂组分作为提取液。可以将从得到的提取液或提取液中除去溶剂而得到的浓缩物直接用作含氧脂素提取物，也可以使用根据需要对所述提取液或浓缩物进一步进行浓缩、溶剂分级、色谱法(柱色谱法，气相色谱法、高速液体色谱法(HPLC)、超临界流体色谱法等)和/或重新结晶等进一步的精制处理以将氧脂素精制或浓缩而成的处理物。用于提取的植物原料的部位不受特别限定，可以为叶、茎、根等部位，优选为干燥的植物原料。用于制备例如含有氧脂素的柠檬草提取物的柠檬草的原料优选为柠檬草的叶和/或茎的干燥物。用于提取的植物原料的形状可以直接为原形、或者也可以采用切割为适当尺寸或形状的形式、或者破碎、粉碎或摩碎后的形式、或者榨汁的形式。

<用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物>

本发明的一种以上的实施方式涉及一种含有TRPV1激动剂及TRPA1激动剂作为有效成分的用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物。

本发明的另外一种以上的实施方式涉及一种TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的组合，用于增强肾上腺髓质素基因的表达的用途。其中，所述组合优选为包含TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的组合物、或包含彼此不混合的TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的试剂盒。

在非专利文献1中，记载了：6-生姜酚具有促进肾上腺髓质素从肠道上皮细胞中释放的作用，该作用被TRPA1的拮抗剂抑制。但是非专利文献1及其它现有技术中并未指出，TRPV1激动剂和TRPA1激动剂的组合所产生的肾上腺髓质素基因表达增强作用是超过了由TRPV1激动剂及TRPA1激动剂分别单独的作用所预测的作用(相加作用)的增效作用。

本实施方式所涉及的组合物或组合的对象典型为人，但不限定于人，也可以为其它非人动物，例如除人以外的哺乳类。

本实施方式所涉及的组合物或组合的对象优选为需要或期待肾上腺髓质素的基因表达增强的对象。另外，本实施方式所涉及的组合物或组合对于健康对象也有效。

肾上腺髓质素是具有扩张血管、血管新生等生理活性的肽。通过增强肾上腺髓质素的基因表达，能够实现增加血流。另外，通过利用增强肾上腺髓质素的基因表达来增加血流，能够实现抗菌作用、抗肠炎、保护胃粘膜、抑制血栓形成等效果。因此，本实施方式所涉及的组合物或组合可以用于在人、非人哺乳动物等对象中，实现选自增加血流、抗菌作用、抗肠炎、保护胃粘膜、及抑制血栓形成中的一种以上的效果。另外，本实施方式所涉及的组合物或组合可以用于在人、非人哺乳动物等对象中治疗或预防可通过肾上腺髓质素基因表达增强改善的疾病或症状，具体而言，用于治疗或预防选自可通过增加血流改善的疾病或症状、微生物导致的疾病或症状、肠炎、可通过保护胃粘膜改善的疾病或症状、以及可通过抑制血栓形成改善的疾病或症状中的一种以上。

肾上腺髓质素的基因表达增强可以通过从摄取或给药本实施方式所涉及的组合物或组合后的对象中采集的细胞、或者在本实施方式所涉及的组合物或组合的存在下培养的细胞中的mRNA制备cDNA，以该cDNA为模型，使用能够对肾上腺髓质素(具体为肾上腺髓质素前驱体(肾上腺髓质素前体))的cDNA碱基序列(5’非翻译区、编码区和/或3’非翻译区，优选为编码区)的至少一部分特异性扩增的引物组进行核酸扩增反应，并检测该反应所产生的扩增产物量来进行确认。肾上腺髓质素是由前驱体(肾上腺髓质素前体)产生的肽。因此，“肾上腺髓质素的基因表达”也可以称为“肾上腺髓质素前驱体的基因表达”。

另外，肾上腺髓质素的基因表达增强可以通过在从摄取或给药本实施方式所涉及的组合物或组合后的对象中采集的细胞、或者在本实施方式所涉及的组合物或组合的存在下培养的细胞中，检测肾上腺髓质素的肽的量、肾上腺髓质素前驱体的量、或由除肾上腺髓质素前驱体产生的肾上腺髓质素以外的肽的量、优选肾上腺髓质素的肽的量来进行确认。在细胞中肾上腺髓质素的肽的量、肾上腺髓质素前驱体的量、或除由肾上腺髓质素前驱体产生的肾上腺髓质素以外的肽的量增加的情况下，则能够评价为肾上腺髓质素的基因表达增强。

将来自人的肾上腺髓质素的前体(肾上腺髓质素前体)的氨基酸序列示于序列号3，来自人的肾上腺髓质素的前驱体(肾上腺髓质素前体)的cDNA碱基序列示于序列号4。在序列号4中，编码区为第179位～第736位。

本实施方式所涉及的组合物或组合中的TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的含量不受特别限定，例如，相对于组合物或组合的总量，合计能够优选包含0.1～95质量％，更优选包含1～50质量％的TRPV1激动剂及TRPA1激动剂。

本实施方式所涉及的组合物或组合中的TRPV1激动剂及TRPA1激动剂的配合比例不受特别限定。例如，在本实施方式所涉及的组合物或组合中，相对于TRPV1激动剂1摩尔，TRPA1激动剂优选为0.1～100摩尔，更优选为0.1～50摩尔，更优选为0.1～20摩尔，更优选为0.2～5摩尔，特别优选为0.2～3摩尔。在TRPV1激动剂及TRPA1激动剂包含多种化合物的情况下，将各化合物的摩尔数的合计作为TRPV1激动剂及TRPA1激动剂中的每个的摩尔数。

本实施方式所涉及的组合物或组合优选以在想要增强肾上腺髓质素基因表达的细胞或体内的组织中能够按照1～100μM的浓度输送TRPV1激动剂、1～300μM、更优选为1～100μM的浓度输送TRPA1激动剂的方式含有TRPV1激动剂及TRPA1激动剂。

本实施方式所涉及的组合物或组合可以为药品、饮食品、化妆品等各种形式的组合物。饮食品也包括功能性食品、指定保健用途食品、用于补充营养的补品等形式。

本实施方式所涉及的组合物或组合优选为通过经口或经鼻摄取或给药的组合物或组合，更优选为通过经口摄取或给药的组合物或组合。

本实施方式所涉及的组合物或组合还可以为用于通过与体外的细胞共存而在该细胞中增强肾上腺髓质素的基因表达的组合物或组合。在该情况下，本实施方式所涉及的组合物或组合添加在用于培养细胞的培养基中使用。作为所述细胞，优选上皮细胞，更优选小肠道上皮细胞。

本实施方式所涉及的组合物或组合可以持续摄取、给药或使用，也可以在需要时摄取、给药或使用。

本实施方式所涉及的组合物或组合的形状不受特别限定，例如可以为液体状、流动状、凝胶状、半固形状或固形状等任意形状。

本实施方式所涉及的组合物或组合除TRPV1激动剂和TRPA1激动剂以外，还可以进一步包含至少一种其它成分。作为至少一种其它成分，不受特别限定，优选为药品、饮食品、化妆品等最终形式中可以接受的成分。

作为这样的其它成分，可列举例如：甜味料、酸味料、维生素类、矿物质类、增粘剂、乳化剂、抗氧化剂、水等。另外，还可以根据需要添加色素、香料、保存剂、防腐剂、防霉剂、进一步的生理活性物质等。

作为甜味料，可列举：葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、帕拉金糖、海藻糖、木糖等单糖及二糖、异构糖(葡萄糖果糖液糖、果糖葡萄糖液糖、砂糖混合异构糖等)、糖醇(赤藓糖醇、木糖醇、乳糖醇、益寿糖、山梨糖醇、还原淀粉糖浆等)、蜂蜜、高甜味度甜味料(三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、奇异果甜蛋白、甜叶菊、阿斯巴甜等)等。

作为酸味料，具有柠檬酸、苹果酸、葡萄糖酸、酒石酸、乳酸、磷酸或它们的盐等，能够利用其中的一种或两种以上。

作为维生素类，可列举：维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素E、烟酸、肌醇等。

作为矿物质类，可列举：钙、镁、锌、铁等。

作为增粘剂，可列举：角叉菜胶、胶凝糖胶、黄原胶、阿拉伯树胶、罗望子胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、琼脂、明胶、果胶、大豆多糖、羧甲基纤维素(CMC)等。

作为乳化剂，可列举：甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯、卵磷脂、植物甾醇、皂甙等。

作为抗氧化剂，可列举：维生素C、生育酚(维生素E)、酶处理芦丁等。

所述其它成分分别能够由本领域技术人员按照饮食品、药品等组合物中通常采用的范围内的量适当配合。

本实施方式所涉及的组合物或组合也可以仅包含TRPV1激动剂及TRPA1激动剂作为参与肾上腺髓质素的基因表达的增强的活性成分。在该情况下，本实施方式所涉及的组合物或组合还可以包含不参与肾上腺髓质素的基因表达的增强的诸如上述的其它成分。

本发明的又一实施方式涉及一种用于细胞培养的培养基组合物，包含一种以上的培养基成分、TRPV1激动剂、以及TRPA1激动剂。所述培养基组合物优选用于上皮细胞的培养，更优选用于小肠道上皮细胞的培养。

在所述培养基组合物中，TRPV1激动剂的浓度优选为1～100μM，TRPA1激动剂的浓度优选为1～300μM，更优选为1～100μM。

在所述培养基组合物中，相对于TRPV1激动剂1摩尔，TRPA1激动剂优选为0.1～100摩尔，更优选为0.1～50摩尔，更优选为0.1～20摩尔，更优选为0.2～5摩尔，特别优选为0.2～3摩尔。

作为所述一种以上的培养基成分，可列举：氮源、碳源、无机盐等通常用于培养基的一种以上的成分。

实施例

实验1：TRPV1激动剂和TRPA1激动剂的组合增强来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素基因表达

<测试化合物>

作为TRPV1激动剂，使用30μM辣椒素(Product#034-11351，和光纯药)、5μM6-生姜酚(Product#192-16161，和光纯药)、30μM6-姜辣素(Product#076-05901，和光纯药)或30μM胡椒碱(Product#162-1724，FUJIFILM和光纯药)。

作为TRPA1激动剂，使用30μM或60μM异硫氰酸烯丙酯(AITC)(Product#016-01463，和光纯药)、30μM或60μM肉桂醛(Product#031-03453，和光纯药)、30μM或60μM二烯丙基二硫醚(Product#320-25071，和光纯药)或10μM或20μM ASP7663(Product#SML1467-5MG，Sigma-Aldrich)。

<肾上腺髓质素基因表达增强>

将来自大鼠的小肠道上皮细胞株(IEC-6)按照达到1×10⁵细胞/mL的方式悬浮在DMEM(5％FBS，4μg/mL胰岛素)培养基中，将制成的细胞悬浮液分别按照1mL/孔(1×10⁵细胞/孔)接种于24孔板，在37℃、5％CO₂的条件下培养24小时。

培养开始经过24小时之后，将各孔中的培养基更换为含有规定浓度的测试化合物的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂的条件下继续培养6小时。

作为对照，使用不含有测试化合物的DMEM培养基，除此以外，按照相同的方法培养小肠道上皮细胞株。

将培养后的细胞用磷酸缓冲液盐水(PBS)清洗，使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)配备的Buffer RLT回收细胞溶解物。

通过RNeasy Mini Kit(QIAGEN)由所述细胞溶解物制备total RNA。

使用total RNA，通过实时PCR测定肾上腺髓质素及内标β肌动蛋白的mRNA表达量。实时PCR使用One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II(Takara Bio公司)，按照配备的流程来进行。引物序列如下表所示。

[表1]

将肾上腺髓质素的mRNA表达量作为针对β肌动蛋白的mRNA表达量的相对值而算得。并且，将各条件下算得的肾上腺髓质素的mRNA表达量表示为相对于在对照条件下算得的肾上腺髓质素的mRNA表达量的相对值。

针对各条件，按照n＝3进行测定，求得平均值及标准偏差。另外，通过one-wayANOVA进行多重比较，及通过Tukey的HSD测试进行事后检验。

将结果示于图1～16。将确认p<0.05的显著差的条件用不同文字表示，将未确认显著差的条件用相同文字表示。

图1示出单独经过30μM辣椒素、单独经过30μM或60μM AITC、以及经过30μM辣椒素和30μM或60μM AITC的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM辣椒素和30μM或60μM AITC的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图2示出单独经过30μM辣椒素、单独经过30μM或60μM肉桂醛、以及经过30μM辣椒素和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM辣椒素和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图3示出单独经过30μM辣椒素、单独经过30μM或60μM二烯丙基二硫醚、以及经过30μM辣椒素和30μM或60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM辣椒素和30μM或60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图4示出单独经过30μM辣椒素、单独经过10μM或20μM ASP7663、以及经过30μM辣椒素和10μM或20μM ASP7663的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM辣椒素和10μM或20μM ASP7663的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图5示出单独经过5μM 6-生姜酚、单独经过30μM或60μM AITC、以及经过5μM 6-生姜酚和30μM或60μM AITC的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过5μM 6-生姜酚和30μM或60μM AITC的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图6示出单独经过5μM 6-生姜酚、单独经过30μM或60μM肉桂醛、以及经过5μM 6-生姜酚和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过5μM 6-生姜酚和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图7示出单独经过5μM 6-生姜酚、单独经过30μM或60μM二烯丙基二硫醚、以及经过5μM 6-生姜酚和30μM或60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过5μM 6-生姜酚和30μM或60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图8示出单独经过5μM 6-生姜酚、单独经过10μM或20μM ASP7663、以及经过5μM 6-生姜酚和10μM或20μM ASP7663的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过5μM 6-生姜酚和10μM或20μM ASP7663的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图9示出单独经过30μM 6-姜辣素、单独经过30μM或60μM AITC、以及经过30μM 6-姜辣素和30μM或60μM AITC的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM 6-姜辣素和30μM或60μM AITC的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图10示出单独经过30μM 6-姜辣素、单独经过30μM或60μM肉桂醛、以及经过30μM6-姜辣素和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM 6-姜辣素和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图11示出单独经过30μM 6-姜辣素、单独经过60μM二烯丙基二硫醚、以及经过30μM6-姜辣素和60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM 6-姜辣素和60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图12示出单独经过30μM 6-姜辣素、单独经过10μM或20μMASP7663、以及经过30μM6-姜辣素和10μM或20μM ASP7663的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM 6-姜辣素和10μM或20μM ASP7663的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图13示出单独经过30μM胡椒碱、单独经过30μM或60μM AITC、以及经过30μM胡椒碱和30μM或60μM AITC的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM胡椒碱和30μM或60μM AITC的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图14示出单独经过30μM胡椒碱、单独经过30μM或60μM肉桂醛、以及经过30μM胡椒碱和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM胡椒碱和30μM或60μM肉桂醛的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图15示出单独经过30μM胡椒碱、单独经过30μM或60μM二烯丙基二硫醚、以及经过30μM胡椒碱和30μM或60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM胡椒碱和30μM或60μM二烯丙基二硫醚的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

图16示出单独经过30μM胡椒碱、单独经过10μM或20μM ASP7663、以及经过30μM胡椒碱和10μM或20μM ASP7663的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过30μM胡椒碱和10μM或20μM ASP7663的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

以上的结果表明，关于TRPV1激动剂和TRPA1激动剂的组合所产生的增加来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量的作用，无论选择的化合物种类如何，该作用均是增效作用，其大于TRPV1激动剂及TRPA1激动剂分别单独所产的肾上腺髓质素mRNA表达量的增加作用的合计作用(相加作用)。

实验2：柠檬草提取物中所含的氧脂素的分析

(1)从柠檬草中提取氧脂素

向装入三角烧瓶中的2L氯仿中加入约100g柠檬草的干燥粉末，一边使用搅拌器搅拌，一边在室温条件下提取12小时以上。通过吸引过滤回收上清，使用旋转蒸发器浓缩干固。

(2)氧脂素的粗精制

使用中压液体色谱法(LC)装置，在以下的条件对得到的浓缩干固物2～5g进行精制，将每15ml溶出液作为一份。

LC装置

硅胶射出柱：W830

中压LC装置：EPCLC-W-Prep 2XY(山善株式会社)

精制柱：Si-40D(硅胶柱)

流动相条件

流动相：己烷/乙酸乙酯

0分(50％/50％)、16分(50％/50％)、32分(10％/90％)、48分(10％/90％)

流速：40ml/min

对于保持时间在28分至40分之间的组分，在以下的条件下进行薄层色谱法(TLC)分析，回收检测到Rf值达到0.5的组分并合并，作为氧脂素粗精制组分。

TLC条件如下所述。

TLC板：硅胶TLC板，产品名：玻璃板硅胶60F₂₅₄，产品编号：105715(MerckMillipore公司)

展开溶剂：氯仿:甲醇＝9:1

显色试剂：磷钼酸显色试剂(包含10％磷钼酸钠n水合物的乙醇溶液)

(3)氧脂素的精制

针对氧脂素粗精制组分，在以下的条件将其进行制备TLC，刮取并回收检测到UV波长254nm的吸收的Rf值为0.5的条带，将其浸渍于体积比5倍以上的提取溶剂(氯仿:甲醇＝8:2)，通过搅拌器搅拌30分以上，提取成分。将提取液用滤纸过滤，通过旋转蒸发器将滤液浓缩干固。将如此得到的浓缩干固物作为精制氧脂素。

制备TLC条件如下所述。

TLC板：制备TLC板，产品名：PLC玻璃板硅胶60F₂₅₄，1mm，型号：113895(MerckMillipore公司)

展开溶剂：氯仿:甲醇＝9:1

(4)各种氧脂素的分离

对精制氧脂素进行下述条件的可回收制备型HPLC，分别制作将分为三份检测的化合物。即将所制得的组分按照保持时间由长到短的顺序命名为R1、R2、R3。

第一次可回收制备型HPLC条件

可回收制备型装置：LC-9110(日本分析工业株式会社)

制备柱：Diol柱，产品名：Inertsil(注册商标)Diol，粒子径5μm，内径14mm，长度250mm，型号：5020-79054(GL Sciences株式会社)

流动相：己烷:乙醇＝9:1

流速：9.999ml/min

检测波长：230nm，

回收次数：8次以上

接着，将R1、R2、R3分别在以下的条件进行可回收制备型HPLC，由所检测到的各组分分别制备1或2的化合物。

第二次可回收制备型HPLC条件

可回收制备型装置：LC-9110(日本分析工业株式会社)

流动相：氯仿:甲醇＝98:2，99:1或97:3

流速：9.999ml/min

检测波长：230nm

回收次数：8次以上

(5)结构确定

将由R1分离出的两种化合物作为R1-1、R1-2。将由R2分离出的两种化合物作为R2-1、R2-2。将由R3分离出的一种化合物作为R3。其中，对除极微量的R1-1以外的化合物进行结构分析。

分离作为R1-2的化合物使用蒸发器干固后，使用NMR及HPLC-Orbitrap^TMMS系统(Thermo Fisher Scientific公司)进行分析。其结果是，确定R1-2为具有下述式的平面结构的化合物((9Z,11E,15E)-13-羟基-9,11,15-十八碳三烯酸)。

(9Z,11E,15E)-13-羟基-9,11,15-十八碳三烯酸

分离为R1-2的化合物具有以下的理化性状。

(1)外观：淡黄色透明的糖浆状固体

(2)HR MS[M+H]+：m/z 293.2118

(3)分子式C₁₈H₃₀O₃

(4)溶解性：乙醇、甲醇、乙腈、氯仿

(5)紫外吸收光谱：λmax nm 230(80％CH₃CN中)

(6)1H NMR光谱(500MHz，氯仿-D)δ0.96(t,J＝7.7Hz),1.37(q,J＝6.5Hz),1.60-1.66(m),2.04-2.09(m),2.15-2.19(m),2.28-2.38(m),4.23(q,J＝6.3Hz),5.35(q,J＝9.5Hz),5.41-5.46(m),5.54-5.59(m),5.68(dd,J＝15.2,6.6Hz),5.97(t,J＝11.2Hz),6.52(dd,J＝15.8,11.7Hz)

(7)13C NMR光谱(126MHz，氯仿-D)δ14.3,20.8,24.7,27.6,28.9,29.4,33.8,35.3,72.2,123.8,126.0,127.9,133.0,134.9,135.4,178.1。

分离为R2-1的化合物使用蒸发器干固后，使用NMR及HPLC-Orbitrap^TMMS系统(Thermo Fisher Scientific公司)进行分析。其结果是，推测R2-1为由下述式的平面结构表示的(7Z,13E,15Z)-12-羟基-7,13,15-十八碳三烯酸或(9Z,13E,15Z)-12-羟基-9,13,15-十八碳三烯酸的一者或混合物。

(7Z,13E,15Z)-12-羟基-7,13,15-十八碳三烯酸

(9Z,13E,15Z)-12-羟基-9,13,15-十八碳三烯酸

分离为R2-1的化合物具有以下的理化性状。

(1)外观：淡黄色透明的糖浆状固体

(2)HR MS[M+H]+：m/z 293.2116

(3)分子式C₁₈H₃₀O₃

(4)溶解性：乙醇、甲醇、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、DMSO

(5)紫外吸收光谱：λmax nm 230(80％CH₃CN中)

分离为R2-2的化合物使用蒸发器干固后，使用NMR及HPLC-Orbitrap^TMMS系统(Thermo Fisher Scientific公司)进行分析。其结果是，确定R2-2为具有下述式的平面结构的化合物((9Z,12Z,14E)-16-羟基-9,12,14-十八碳三烯酸)。

(9Z,12Z,14E)-16-羟基-9,12,14-十八碳三烯酸

分离为R2-2的化合物具有以下的理化性状。

(1)外观：淡黄色透明的糖浆状固体

(2)HR MS[M+H]+：m/z 293.2116

(3)分子式C₁₈H₃₀O₃

(4)溶解性：乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿

(5)紫外吸收光谱：λmax nm 230(80％CH₃CN中)

(6)1H NMR光谱(500MHz，氯仿-D)δ6.52(dd,J＝14.9,10.9Hz),5.99(t,J＝10.9Hz),5.68(dd,J＝15.2,6.6Hz),5.40(q,J＝8.0Hz),5.39-5.31(m),4.12(q,J＝6.5Hz),2.92(t,J＝7.2Hz),2.34(t,J＝7.4Hz),2.05(q,J＝6.9Hz),1.66-1.59(m),1.60-1.55(m),1.25-1.39(m),0.93(t,J＝7.4Hz,3H)

(7)13C NMR光谱(126MHz，氯仿-D)δ178.4,135.9,130.8,127.9,127.3,125.8,77.4,77.1,76.9,74.3,33.8,30.3,29.5,29.1,29.0,27.2,26.2,24.7,9.8。

分离为R3的化合物使用蒸发器干固后，使用NMR及HPLC-Orbitrap^TMMS系统(ThermoFisher Scientific公司)进行分析。其结果是，确定R3为具有下述式的平面结构的化合物((10E,12Z,15Z)-9-羟基-10,12,15-十八碳三烯酸)。

(10E,12Z,15Z)-9-羟基-10,12,15-十八碳三烯酸

分离为R3的化合物具有以下的理化性状。

(1)外观：淡黄色透明的糖浆状固体

(2)HR MS[M+H]+：m/z 293.2117

(3)分子式C₁₈H₃₀O₃

(4)溶解性：乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿

(5)紫外吸收光谱：λmax nm 230(80％CH₃CN中)

(6)1H NMR光谱(500MHz，氯仿M-D)δ6.50(dd,J＝14.9,10.9Hz),5.98(t,J＝10.9Hz),5.68(dd,J＝14.9,6.9Hz),5.46-5.38(m),5.31(q,J＝8.8Hz),4.16(q,J＝6.5Hz),2.92(t,J＝7.4Hz),2.34(t,J＝7.7Hz),2.10-2.04(m),1.64-1.61(m),1.57-1.50(m),0.97(t,J＝7.4Hz)

(7)13C NMR光谱(126MHz，氯仿-D)δ178.7,136.3,132.5,130.9,127.9,126.6,125.6,73.0,37.3,33.9,29.4,29.2,29.0,26.1,25.4,24.7,20.7,14.3。

实验3：TRP通道激动剂活性的测定

(1)测定方法

载体构建

将包含编码人TRPA1(Accession No.NM_007332.3)(以下，也称为hTRPA1)、人TRPV1(Accession No.NM 080704.4)(以下，也称为hTRPV1)、人TRPM8(Accession No.NM_024080.5)(以下，也称为hTRPM8)的氨基酸序列的碱基序列的DNA片段插入pcDNA5/TO载体(Invitrogen公司)，分别构建hTRPA1表达载体、hTRPV1表达载体及hTRPM8表达载体。

获得hTRPA1、hTRPV1、hTRPM8表达细胞

用包含10％胎牛血清(FBS，Cytiva公司)的Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM，Nacalai Tesque公司)培养T-REx^TM-293细胞(Invitrogen公司)，在6孔板中达到60～70％融合。使用Lipofectamine LTX(Invitrogen公司)，按照说明书将hTRPA1表达载体、hTRPV1表达载体或hTRPM8表达载体转染至T-REx TM-293细胞。

稳定表达株的获得

向包含10％胎牛血清(FBS，Cytiva公司)的Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM，Nacalai Tesque公司)中添加潮霉素B 400μ/ml、杀稻瘟菌素S 5μg/ml，制作药剂选择培养基。将转染后经过了24小时的所述细胞的培养基更换为药物选择培养基，之后，每两日更换培养基，同时培养7天。将残余的存活细胞传代，并将其分别作为hTRPAl稳定表达株、hTRPV1稳定表达株、hTRPM8稳定表达株。

细胞内Ca²⁺成像法的准备

测试前一天，通过胰蛋白酶/EDTA溶液剥下所述各表达株的细胞，按照5×10⁴细胞～6×10⁴细胞/孔，接种于96孔黑孔透明底板。此时，按照1μg/ml向培养基中添加四环素，诱导hTRPA1、hTRPV1或hTRPM8的表达。在37℃的培养箱中培养24小时～48小时后，使用PBS清洗细胞。从孔内除去PBS之后，向其中添加按照4μM的浓度溶解在测定缓冲液(向HBSS(-)中分别以最终浓度达到1mM、20mM、0.1％的方式添加CaCl₂二水合物、HEPES、BSA而成的溶液)中而成的钙荧光指示剂Calbryte 520AM(AAT Bioquest公司)50μl，在33℃下孵育45分钟。然后，再次用测定缓冲液清洗之后，在孔中残留100μl，从而制备测定用细胞。

在96孔板的孔内，制备评价TRP通道激动剂活性的待测物质的浓度是测定浓度2倍的溶液，制备后30分钟以内使用。将所述测定用细胞在31℃下孵育，通过Flaxstation3(Molecular Devices公司)将测试物质溶液100μl添加于测定用细胞，每2秒测定荧光强度(激发波长：490nm，荧光波长：525nm)，共测定120秒。测定开始30秒后，以待测物质的最终浓度达到测定浓度的方式，将所述溶液添加于所述测定用细胞。

通过下述式，将待测物质的TRP通道活化能作为以10μM的离子霉素(Ionomycin)对于各TRP通道的活化能为标准的相对值来计算。

活化率(％)＝(待测物质最大荧光强度-基线)/(离子霉素最大荧光强度-基线)×100

待测物质最大荧光强度：待测物质添加后的荧光强度的最大值

基线：测定开始后20秒的荧光强度的平均值

离子霉素最大荧光强度：离子霉素添加后的荧光强度的最大值

TRPAl活化能测定时，为了确认待测物质是否特异性活化TRPAl，除了添加待测物质之外，同时按照1μM的最终浓度添加作为TRPAl特异性拮抗剂的A-967079，并测定活性是否被抑制。

(2)-1：评价1

测定实验2(4)中通过第一次制备HPLC得到的氧脂素的R2组分、10μM的离子霉素(IONO)、30μM的异硫氰酸烯丙酯(AITC)及100μM肉桂醛(CA)的TRPA1活化能、以及添加0.02％作为阴性对照的二甲基亚砜(DMSO)来代替待测物质时的TRPA1活化能，求得以10μM离子霉素为标准的活化率。

关于氧脂素的R2组分，示作分子量294g/mol，测定1μM～1000μM的浓度下的TRPA1活化能。

将结果示于图17。图17的结果表示氧脂素具有TRPA1激动剂活性。

(2)-2：评价2

测定100μM及500μM的实验2(3)中制备的精制氧脂素(示作分子量294g/mol)、以及30μM的异硫氰酸烯丙酯(AITC)在1μM A-967079共存下或不存在下的TRPA1活化能，求得以10μM离子霉素为标准的活化率。在A-967079的不存在条件的试验中，添加二甲基亚砜(DMSO)来代替A-967079。另外，测定添加作为阴性对照的DMSO来代替待测物质时的TRPA1活化能。

将结果示于图18。100μM及500μM的精制氧脂素与作为TRPA1激动剂熟知的30μM的异硫氰酸烯丙酯(AITC)同样，在作为拮抗剂的A-967079共存下，不显示TRPA1活化能，而在A-967079不存在下，则显示TRPA1活化能。

(2)-3：评价3

测定100μM及500μM的实验2(4)中通过第一次制备HPLC得到的氧脂素的R2组分(示作分子量294g/mol)以及1μM辣椒素的TRPV1活化能，求得以10μM离子霉素为标准的活化率。测定添加作为阴性对照的二甲基亚砜(DMSO)来代替待测物质时的TRPV1活化能，求得以10μM离子霉素为标准的活化率。

将结果示于图19。确认氧脂素的R2组分几乎不具有TRPV1激动剂活性。

(2)-4：评价4

测定100μM及500μM的实验2(4)中通过第一次制备HPLC得到的氧脂素的R2组分(示作分子量294g/mol)、以及5μM的依色林的TRPM8活化能，求得以10μM离子霉素为标准的活化率。测定添加作为阴性对照的二甲基亚砜(DMSO)来代替待测物质时的TRPM8活化能，求得以10μM离子霉素为标准的活化率。

将结果示于图20。确认氧脂素的R2组分几乎不具有TRPM8激动剂活性。

(2)-5：评价5

测定200μM及500μM的实验2(4)中通过第二次制备HPLC得到的化合物R1-2、R2-1、R2-2及R3、以及30μM的异硫氰酸烯丙酯(AITC)在1μM A-967079共存下或不存在下的TRPA1活化能，求得以10μM离子霉素为标准的活化率。在A-967079不存在条件的试验中，添加二甲基亚砜(DMSO)来代替A-967079。另外，测定添加作为阴性对照的DMSO来代替待测物质时的TRPA1活化能。

将结果示于图21。氧脂素化合物R1-2、R2-1、R2-2、及R3与作为TRPA1激动剂熟知的30μM的异硫氰酸烯丙酯(AITC)同样，在作为拮抗剂的A-967079的共存下，不显示TRPA1活化能，而在A-967079不存在下，则浓度依存性地显示TRPA1活化能。

实验4：氧脂素和6-生姜酚的组合所产生的增效作用

<测试化合物>

作为TRPV1激动剂，使用5μM6-生姜酚(Product#192-16161，和光纯药)。

作为TRPA1激动剂，使用50μM、83.3μM、250μM的实验2(3)中制备的精制氧脂素(示作分子量294g/mol)、或20μM ASP7663(Product#SML1467-5MG，Sigma-Aldrich)。

按照与实验1相同的流程，将在规定浓度的TRPV1激动剂及规定浓度的TRPA1激动剂中的一者或两者存在下，来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素的mRNA表达量作为针对β肌动蛋白的mRNA表达量的相对值而算得。并且，将每个条件下所算得的肾上腺髓质素的mRNA表达量表示为针对在对照条件下算得的肾上腺髓质素的mRNA表达量的相对值。

针对每个条件，按照n＝3进行测定，求得平均值及标准偏差。另外，通过one-wayANOVA进行多重比较，以及通过Tukey的HSD测试进行事后检验。

将结果示于图22。将确认p<0.05的显著差的条件用不同文字表示，将未确认显著差的条件用相同文字表示。

图22示出单独经过5μM 6-生姜酚、单独经过20μM ASP7663、单独经过50μM、83.3μM、250μM精制氧脂素、以及经过5μM 6-生姜酚和50μM、83.3μM、250μM精制氧脂素的组合处理的来自大鼠的小肠道上皮细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量。经过5μM 6-生姜酚和50μM、83.3μM、250μM精制氧脂素的组合处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度大于经过各测试化合物单独处理的所述细胞株中的肾上腺髓质素mRNA表达量相对于对照条件的增加幅度的合计。

本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请均直接通过引用并入本说明书。

序列表

<110> 日本好侍健康食品公司

<120> 用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物

<130> PH-9176-PCT

<150> JP 2020-189986

<151> 2020-11-16

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 引物

<400> 1

ggcagaacaa ctccagcctt tac 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 引物

<400> 2

atcagggcga tggaaaccag 20

<210> 3

<211> 185

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe

1 5 10 15

Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys

20 25 30

Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met

35 40 45

Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala

50 55 60

Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg

85 90 95

Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe

100 105 110

Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr

115 120 125

Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln

130 135 140

Gly Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly

145 150 155 160

Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro

165 170 175

Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu

180 185

<210> 4

<211> 1492

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

actcagtggt ttcttggtga cactggatag aacagctcaa gccttgccac ttcgggcttc 60

tcactgcagc tgggcttgga cttcggagtt ttgccattgc cagtgggacg tctgagactt 120

tctccttcaa gtacttggca gatcactctc ttagcagggt ctgcgcttcg cagccgggat 180

gaagctggtt tccgtcgccc tgatgtacct gggttcgctc gccttcctag gcgctgacac 240

cgctcggttg gatgtcgcgt cggagtttcg aaagaagtgg aataagtggg ctctgagtcg 300

tgggaagagg gaactgcgga tgtccagcag ctaccccacc gggctcgctg acgtgaaggc 360

cgggcctgcc cagaccctta ttcggcccca ggacatgaag ggtgcctctc gaagccccga 420

agacagcagt ccggatgccg cccgcatccg agtcaagcgc taccgccaga gcatgaacaa 480

cttccagggc ctccggagct ttggctgccg cttcgggacg tgcacggtgc agaagctggc 540

acaccagatc taccagttca cagataagga caaggacaac gtcgccccca ggagcaagat 600

cagcccccag ggctacggcc gccggcgccg gcgctccctg cccgaggccg gcccgggtcg 660

gactctggtg tcttctaagc cacaagcaca cggggctcca gcccccccga gtggaagtgc 720

tccccacttt ctttaggatt taggcgccca tggtacaagg aatagtcgcg caagcatccc 780

gctggtgcct cccgggacga aggacttccc gagcggtgtg gggaccgggc tctgacagcc 840

ctgcggagac cctgagtccg ggaggcaccg tccggcggcg agctctggct ttgcaagggc 900

ccctccttct gggggcttcg cttccttagc cttgctcagg tgcaagtgcc ccagggggcg 960

gggtgcagaa gaatccgagt gtttgccagg cttaaggaga ggagaaactg agaaatgaat 1020

gctgagaccc ccggagcagg ggtctgagcc acagccgtgc tcgcccacaa actgatttct 1080

cacggcgtgt caccccacca gggcgcaagc ctcactatta cttgaacttt ccaaaaccta 1140

aagaggaaaa gtgcaatgcg tgttgtacat acagaggtaa ctatcaatat ttaagtttgt 1200

tgctgtcaag attttttttg taacttcaaa tatagagata tttttgtacg ttatatattg 1260

tattaagggc attttaaaag caattatatt gtcctcccct attttaagac gtgaatgtct 1320

cagcgaggtg taaagttgtt cgccgcgtgg aatgtgagtg tgtttgtgtg catgaaagag 1380

aaagactgat tacctcctgt gtggaagaag gaaacaccga gtctctgtat aatctattta 1440

cataaaatgg gtgatatgcg aacagcaaac caataaactg tctcaatgct ga 1492

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 引物

<400> 5

ggagattact gccctggctc cta 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 引物

<400> 6

gactcatcgt actcctgctt gctg 24

Claims

1.一种用于增强肾上腺髓质素基因表达的组合物，含有TRPV1激动剂及TRPA1激动剂作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，

TRPV1激动剂为选自辣椒素、6-生姜酚、6-姜辣素及胡椒碱中的一种以上。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，

TRPA1激动剂为选自异硫氰酸烯丙酯、肉桂醛、二烯丙基二硫醚、ASP7663及氧脂素中的一种以上。