KR102629699B1 - 피노스트로빈을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피노스트로빈 및 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 촉진용 조성물을 제공하는 것으로서, 본 발명의 피노스트로빈은 흑색종 세포에 독성 없이, 피노스트로빈은 농도 의존 적으로 멜라닌 합성이 증가 및 티로시나아제 활성을 촉진을 확인하였다. 또한, 멜라닌 생성 관련 단백질 발현 분석 결과 MITF을 중심으로 티로시나아제 및 TRP1 발현을 통하여 멜라닌 생성을 촉진한 것을 확인하였으며, 이와 관련된 유용한 사업 사용될 수 있다.

Description

피노스트로빈을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 촉진용 조성물{Composition for promoting melanin synthesis comprising pinostrobin}

본 발명은 피노스트로빈을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 촉진용 조성물의 관한 것이다.

피부는 1차 방어 조직이자 가장 큰 면역 기관으로서 물리적, 화학적, 생물학적 방법으로 각종 유해환경으로부터 인체를 보호하는 역할을 한다. 특히, 인체 피부의 표피 기저층에 존재하는 색소인 멜라닌은 자외선이나 환경오염, 산화적 스트레스와 같은 외부 자극에 의한 DNA 손상을 제어하는 기능을 한다. 멜라닌은 농도와 분포에 따라 피부, 눈동자, 머리카락의 색을 결정하기 때문에 인체의 외형적 요소를 담당한다.

멜라닌 세포의 기능 이상 및 소실로 인하여 멜라닌 생성이 과도하게 억제되면 피부의 특정 영역이 기준 피부색보다 밝아져 얼룩이 생겨 백반증 (vitiligo), 탈색 모반 (nevus depigmentosus), 부분 백색증 (albinism) 등의 멜라닌 저색소질환이 발생하게 된다. 저색소증 환자는 외관상 모습으로 인하여 심리적 위축될 수 있으며 심각할 경우 대인기피증 등 사회활동에 있어 어려움을 겪는 것으로 보고되. 최근 연구에 따르면 피부암에 대한 노출 가능성이 높은 것으로 알려져 있다.

자외선, 염증, 호르몬 등에 의해서 멜라닌 형성 세포 자극 호르몬(melanocyte stimulating hormone, MSH)이 분비되고, MSH는 수용체와 반응하여 멜라닌 형성 세포 내에 cyclic adenosine monophosphate (cAMP)를 향상시켜 멜라닌을 합성하며, 합성된 멜라닌은 멜라닌 형성 세포의 외부로 분비되어 자외선 등으로부터 피부 또는 모발을 보호하는 역할을 하게 된다. 멜라닌의 합성은 주로 α-MSH에 의해 조절되고, 멜라닌의 합성에 관여하는 단백질로는 microphthalmia-associated transcription factor (MITF), 티로시나아제 (tyrosinase), tyrosinase related protein 1 (TRP1) 및 TRP2 등이 알려져 있다.

멜라닌은 아미노산인 티로신의 산화과정을 통하여 생성되며 티로시나아제, TRP1 및 TRP2가 생합성 과정에 작용하는 핵심 효소이다. 특히, 티로시나아제는 멜라닌 생성의 속도제한효소로 멜라닌 합성에 필수적이며, 저색소증 환자에서 이 유전자의 돌연변이가 많이 발견되었기 때문에, 멜라닌 촉진 생성물 개발 연구의 주요 타겟이 되었다.

MITF는 망막색소상피, 비만세포, 파골세포, 심장 세포 및 멜라닌 세포를 포함한 다양한 세포에서 널리 발현된다. MITF는 아미노산 말단 구조에 따른 조직 특이적 발현을 나타낸다. 멜라닌 세포에서 선택적으로 발현되는 M-isoform MITF는 세포의 발달, 분화 및 생존에 필수적인 역할을 수행하는 마스터레귤레이터이다. 또한, 최근 연구에 따르면 M-isoform MITF는 티로시나아제, TRP1 및 TRP2를 포함한 멜라닌 생성 효소의 전사를 조절하는 주요 인자로 밝혀졌다.

MITF 매개 멜라닌 생성경로는 다양한 상위신호전달 기전에 의해 조절된다고 알려져 있다. cAMP/protein kinase A (PKA) 경로는 cAMP에 의해 활성화된 PKA가 핵으로 들어가 cAMP responsive element binding protein (CREB)를 인산화하여 MITF의 발현을 유도한다. 또한, cAMP/PKA는 glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β)의 인산화를 통해 세포질에서 낮은 수준으로 존재하던 beta-catenin (β-catenin) 생성 및 핵 내 이동을 촉진하여 MITF 발현을 증가시킨다.

멜라닌 생성을 증가와 관련된 또 다른 경로는 Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) 매개 경로가 있다. MITF는 extracellularly responsive kinases (ERK1/2) 와 c-jun N-terminal kinases (JNK) 및 p38 MAPKs로 구성되어 있다. p38 MAPK 인산화는 MITF 발현을 촉진하하여 멜라닌 합성을 유도하는 반면, ERK1/2 와 JNK 는 MITF의 분해를 통해 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 보고되고 있다.

피노스트로빈 (5-hydroxy-7-methoxyflavanone)은 핑거루트 (Boesenbergia pandurata), 꿀 및 프로폴리스 등에서 발견되는 주요 플라보노이드의 일종이며, 이는 항산화, 항바이러스, 항백혈병 및 항염증 등 다양한 생물학적 활성이 보고된 바 있다. 본 발명에서는 멜라닌 생성 촉진 효과를 가지는 천연물 유래 물질을 발굴하기 위하여 실시한 스크리닝에서 우수한 효능이 입증된 피노스트로빈을 대상 물질로 선정하였다. 또한, 피노스트로빈의 멜라노마 세포모델에서의 멜라닌 생성 촉진 효과 및 이에 대한 분자생물학적인 기전을 밝히고자 한다. 즉, 멜라닌 합성의 주요 전사인자인 MITF을 중심으로 cAMP/PKA 및 MAPK 신호전달 경로 조절의 관여 여부를 살펴봄으로써 tyrosinase 활성에만 초점을 맞춘 기존의 소재와는 다른 새로운 개념의 멜라닌 생성 촉진 소재 도출하는데 목표를 두고 있다.

멜라닌 저색소증 질환 중 백반증은 전 세계 인구의 1-2%가 나타나는 비교적 흔한 질환으로, 모든 인종, 성별에서 일어나며 특히 10-30세 사이의 사람들에게서 유병율이 높다. 이에 글로벌 저색소 질환 치료제 시장 규모의 경우 2021년에서 2028년까지 연평균 성장률이 5.6%으로 계속 증가할 것으로 예측되고 있다. 하지만 현재까지 개발된 저색소증 관련 치료는 국소 또는 전신 스테로이드 치료, 광선요법, 광화학 요법 및 외과적 시술 등이 있으나 일시적 효능만 있을 뿐, 근본적인 예방 및 개선 또는 치료 방법이 아니기 때문에 보다 근본적인 해결을 위해서는 멜라닌 생성 촉진제에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이에 따라, 본 발명자들은 멜라닌 생성 촉진하는 성분을 연구 하던중, 본 발명의 피노스트로빈이 흑색종 세포에서 세포독성 없이, 멜라닌 생성 하는 것을 확인 하였다. 또한, 멜라닌 생성 관련 단백질을 촉진 및 증가시키는 것을 확인한 바, 본 발명의 피노스트로빈은 멜라닌 세포 촉진 및 멜라닌 관련 질환 예방 또는 개선용 화장료 및 기능성 식품 조성물을 제공할 수 있어, 본 발명을 완성 하였다.

Hwang YS, Oh SW, Park SH, Lee J, Yoo JA, et al. Melanogenic effects of maclurin are mediated through the activation of cAMP/PKA/CREB and p38 MAPK/CREB signaling pathways. Oxid Med Cell Longev. 2019. 2019:9827519. Liu F, Wen B, Kayser M. Colorful DNA polymorphisms in humans. Semin Cell Dev Biol. 2013. 24(6-7):562-75. Maron C. Albinism: epidemiology, genetics, cutaneous characterization, psychosocial factors. An Bras Dermatol. 2019. 94(5):503-520. Wang Y. Inhibitions of melanogenesis via Phyllanthus emblica fruit extract powder in B16F10 cells. 2019. 28:177-182. Selzer E, Wacheck V, Lucas T, Heere-Ress E, Wu M, et al. The Melanocyte-specific Isoform of the Microphthalmia Transcription Factor Affects the Phenotype of Human Melanoma. Cancer Res. 2002. 62:2098-2103. Hartman ML, Czyz M. MITF in melanoma: mechanisms behind its expression and activity. Cell Mol Life Sci. 2015;72(7):1249-1260. Pang X, Zheng X, Kong X, Chai Y, Wang Y, et al. A homozygous MITF mutation leads to familial Waardenburg syndrome type 4. Am J Med Genet A. 2019. 179(2):243-248. Tsang TF, Chan B, Tai WC, Huang G, Wang J, et al. Gynostemma pentaphyllum saponins induce melanogenesis and activate cAMP/PKA and Wnt/β-catenin signaling pathways. Phytomedicine. 2019. 60:153008. Karunarathne WAHM, Molagoda IMN, Kim MS, Choi YH, Oren M, et al. Flumequine-Mediated Upregulation of p38 MAPK and JNK Results in Melanogenesis in B16F10 Cells and Zebrafish Larvae. Biomolecules. 2019. 9(10):596. Patel NK, Jaiswal G, Bhutani KK. A review on biological sources, chemistry and pharmacological activities of pinostrobin. Nat Prod Res. 2016. 30(18):2017-27. Ezzedine K, Lim HW, Suzuki T, Katayama I, Hamzavi I, et al. Revised classification/nomenclature of vitiligo and related issues: The Vitiligo Global Issues Consensus Conference. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, E1-E13.

본 발명의 목적은 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 촉진용 화장품 조성물을 제공 하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공 하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공 하는 것이다.

본 발명은 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 촉진용 화장품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 피노스트로빈을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 촉진용 조성물로서, 본 발명의 피노스트로빈은 흑색종 세포의 독성 없이, 피노스트로빈은 농도 의존 적으로 멜라닌 합성이 증가 및 티로시나아제 활성을 촉진을 확인하였다. 또한, 멜라닌 생성 관련 단백질 발현 분석 결과 MITF을 중심으로 티로시나아제 및 TRP1 발현을 통하여 멜라닌 생성을 촉진한 것을 확인하였는 바, 이와 관련된 유용한 사업 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 피노스트로빈의 화학구조를 나타낸 도이다.
도 2는 흑색종 세포 피노스트로빈을 농도별로 처리 시, 세포 독성을 나타낸 도이다.
도 3은 흑색종 세포 피노스트로빈을 농도별로 처리 시, 피노스트로빈에 의한 멜라닌 증가 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 흑색종 세포 피노스트로빈을 농도별로 처리 시, 티로시나아제의 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 피노스트로빈울 농도별로 처리 시, 멜라닌 생성 효소 단백질 및 전사인자(TRP1, TRP2, MITF, β-actin)의 발현 조절능을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 피노스트로빈을 농도별로 처리 시, 멜라닌 생성 관련 상위 단백질(p-CREB, p-GSK-3β, GSK-3β, p-β-catenin, p-p38, β-actin)의 발현 조절능을 나타낸 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다, 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 사료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명은 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 촉진용 화장품 조성물을 제공한다.

상기 피노스트로빈은 하기 화학식 1로 표시 되는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

[화학식 1]

상기 염은 화장료 또는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염을 포함할 수 있으며, 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 피노스트로빈은 멜라닌의 합성 및 함량을 증가시키고, 티로시나아제 활성을 촉진시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 피노스트로빈은 멜라닌 생성 관련 단백질 발현을 증가시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 멜라닌 생성 관련 단백질은 전사인자인 MITF 발현인 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 MITF 발현은 티로시나아제 및 TRP1의 촉진을 매개로 하여, 증가되는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 피노스트로빈은 CREB, GSK-3β 및 β-catenin 인산화를 증가시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 피노스트로빈은 MITF의 upstream activator인 p38의 발현을 증가시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증은 백화증, 백반증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증 후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증 및 점상 백피증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 멜라닌 관련 질환의 예방 조성물을 개체에 투여하여 멜라닌 관련 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 조성물은 멜라닌 관련 피부 질환의 예방 또는 개선용 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨, 에센스 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 팩, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 추출물로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

피노스트로빈을 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다. 유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산 부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산 에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산 트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산 이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴, 카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜 틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인 산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르 계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산 및 메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산 및 메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜 (중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈 및 에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 및 헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들수 있다. 에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산 콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린 지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POE 및 POP (폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌) 공중합체, POE 및 POP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산업, 알킬아미드 인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산 디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아 미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다. 양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드 술포 베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트 수지,디비닐벤젠 및 스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠 및 스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐,살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모 노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시 계피산 이소프로필, 디이소프로필 및 디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 멜라닌 저하에 의한 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 밀크 로션, 아스트린젠트, 로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 헤어로션, 헤어토닉, 헤어에센스, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화 아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

이하 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

[실시예]

실시예 1. 시약 구입 및 세포 배양 방법

본 발명의 실시예에서 사용된 피노스트로빈 (≥99%), MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide), L-DOPA (L-3, 4-dihydro-xyphenylalanin), 및 다른 시약들은 시그마 알드리치사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 마우스 유래 흑색종 세포주인 B16-F10 세포는 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank)에서 구입하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; GIBCO BRL), 100 units/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; GIBCO BRL, Carlsbad, CA, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂인 배양기에서 배양하였다. 피노스트로빈의 화학구조는 도 1과 같다.

실시예 2. 흑색종 세포에서 피노스트로빈의 독성 확인.

피노스트로빈의 세포 독성을 알아보기 위하여, 흑색종(B16-F10) 세포에서 MTT 비색법을 이용하여 평가하였다. 흑색종(B16-F10) 세포를 96-well plate에 3×10⁴로 접종하여 24시간 배양하였다. 그 후, 피노스트로빈을 0, 25, 50, 100, 및 200 μM 농도별로 희석된 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. MTT 시약 (0.5 mg/ml)을 넣고 3시간 동안 배양 후, 상층액을 제거하여 DMSO (100 μL)를 첨가 하였다. 세포생존율은 마이크로플레이트 리더기 (ELX808, BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 측정하였다.

도 2와 같이, 흑색종(B16-F10) 세포에 25, 50, 100, 및 200 μM의 피노스트로빈을 72시간 처리하여 세포의 생존율을 분석한 결과이다. 본 화합물 피노스트로빈은 전 구간에서 세포 독성을 보이지 않았다. 따라서, 이후 진행된 실시예의 농도는 100 μM 이하로 선정하여 실험을 진행 하였다.

실시예 3. 흑색종 세포에서 피노스트로빈 처리 시, 멜라닌 함량 및 티로시아제 활성 분석.

실시예 3-1. 흑색종 세포에서 피노스트로빈 처리 시, 멜라닌 함량 측정

흑색종(B16-F10) 세포를 6-well plate에 2×10⁵로 접종하여 24시간 배양 후, 피노스트로빈을 (0, 25, 50, 100 μM) 처리하여 3일간 배양하였다. 배지를 제거한 세포를 phosphate-buffered salines (PBS) 용액으로 세척한 다음, 세포를 회수하여 10% DMSO가 함유된 1N 수산화나트륨 용액을 첨가하여 80℃에서 2시간 반응시켰다. 용해된 멜라닌 함량은 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 흑색종(B16-F10) 세포 내 멜라닌 함량을 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 흡광도 분석한 결과, 저농도의 피노스트로빈 (25 μM)에서 대조군에 비해 멜라닌 합성이 유의적으로 증가하였으며, 100 μM에서는 2배 이상의 증가율이 나타남을 확인하였다(도 3).

실시예 3-2. 흑색종 세포에서 피노스트로빈 처리 시, 티로시나아제 활성 분석

상기 실시예 3-1의 멜라닌 함량 측정과 동일하게 처리한 흑색종(B16-F10) 세포에 cell lysis buffer를 처리하여 수확한 다음 얼음에서 1시간 반응시켰다. 원심분리기를 통해 (13,000 rpm, 20분) 상등액만 분리한 후, 단백질 농도를 BCA kit (BioRad, USA)를 이용하여 정량하였다. 96-well plate에 단백질 (1 μg/μL) 50 μL, L-DOPA (10 mM) 10 μL, 및 인산나트륨 완충액 (pH 6.8, 0.5 mM) 140 μL를 각각 넣은 후 37℃에서 2시간 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 흡광도를 측정하였다 (490 nm).

그 결과, 흑색종(B16-F10) 세포 내 티로시나아제 활성을 마이크로플레이트 리더기의 흡광도로 분석 결과, 피노스트로빈 50 및 100 μM 처리 시, 아무 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 1.3배 및 1.5배 이상의 티로시나아제 활성 촉진이 나타남을 확인 하였다 (도 4).

실시예 4. 흑색종 세포에서 피노스트로빈 처리 시, 멜라닌 생성 관련 단백질 발현 분석

흑색종(B16-F10) 세포에서 피노스트로빈 처리 시, 멜라닌 생성 관련 단백질 발현을 웨스턴 블롯을 통해 분석 하였다.

흑색종(B16-F10) 세포를 96-well plate (2×10⁶)에 24시간 동안 배양한 후, 시험물질을 배양액에 첨가하여 24 시간 동안 반응시켰다. 그 후 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 단백질을 분해한 다음 13000 rpm에서 원심 분리하여 단백질 상등액을 분리한 뒤, BCA kit (BioRad, USA)를 이용하여 정량하였다. 동일한 양의 단백질을 12%의 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamaide gel)에 전기영동하고 Poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA)에 200 mA, 2시간 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유에 넣고 상온에서 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 β-actin (1:1000), MITF (1:800), tyrosinase (1:500), TRP1 (1:1000), TRP2 (1:800), p-CREB (1:1000), p-ERK (1:1000), ERK (1:1000), p-JNK (1:1000), JNK (1:1000), p-p38 (1:1000), p38 (1:1000)를 이용하여 4℃에서 24시간 반응시킨 후 TBST로 세척한 다음 2차 항체 anti-rabbit IgG-HRP 또는 anti-mouse IgG-HRP을 1시간 반응시켰다. 그 후, 단백질은 ECL detection (Advansta Inc, Menlo Park, CA, USA) 용액에 반응시켜 Atto EZ-capture (Tokyo, Japan) 이미지 장비를 이용하여 단백질의 발현양을 확인하였다.

그 결과 도 5와 같이, 피노스트로빈은 티로시나아제와 TRP1의 발현을 유의적으로 증가시킨 반면 TRP 2 발현에는 영향을 미치지 않았다. 본 화합물 피노스트로빈은 멜라닌 생성 주요 전사인자인 MITF 발현 촉진에 뛰어난 효능을 나타낸 것을 확인 하였다. 즉, 피노스트로빈의 멜라닌 생성 효과가 MITF 매개 티로시나아제 및 TRP1 발현 촉진에 의해 증가됨을 확인하였다.

또한, MITF 조절 상위 신호 전달 경로 관련 단백질 발현을 분석한 결과, 도 6과 같이, 피노스트로빈은 50 및 100 μM 농도에서 대조군에 비해 CREB의 인산화를 2배 이상 증가시켰으며, GSK-3β 인산화는 저농도의 피노스트로빈 처리 시에도 유의적으로 증가됨을 확인 하였다.

베타-카테인(β-catenin) 인산화 수준 또한 GSK-3β의 결과와 유사하게, 피노스트로빈 전체 농도구간에서 유의적으로 증가했다. 또한 피노스트로빈은 MITF의 upstream activator인 p38의 발현 역시 농도 의존적으로 증가시켰으며, 100 μM 대조군에 비해 약 3배 이상 활성화를 확인 하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

1. 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 생성 촉진용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 피노스트로빈은 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 조성물.
   [화학식 1]
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 피노스트로빈은 멜라닌의 합성 및 함량을 증가시키고, 티로시나아제 활성을 촉진시키는 것인, 조성물.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 피노스트로빈은 멜라닌 생성 관련 단백질 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 멜라닌 생성 관련 단백질은 전사인자인 MITF 발현인 것인, 조성물.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 MITF 발현은 티로시나아제 및 TRP1의 촉진을 매개로 하여, 증가되는 것인, 조성물.
7. 제 1항에 있어서,
   상기 피노스트로빈은 CREB, GSK-3β 및 β-catenin 인산화를 증가시키는 것인, 조성물.
8. 제 1항에 있어서,
   상기 피노스트로빈은 MITF의 upstream activator인 p38의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
9. 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증은 백화증, 백반증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증 및 점상 백피증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.
11. 피노스트로빈 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
12. 제 11항에 있어서,
    상기 멜라닌 저하에 의한 피부 저색소증은 백화증, 백반증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증 및 점상 백피증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.