KR101724604B1

KR101724604B1 - GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101724604B1
Application number: KR1020150177105A
Authority: KR
Inventors: 장성은; 김영훈
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2015-12-11
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2017-04-07

Abstract

본 발명은 GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 멜라노사이트에서 멜라닌 생성에 중추적 역할을 하는 효소인 타이로시나제의 활성을 억제하고, 유멜라닌 생성경로를 저해하고 페오멜라닌 생성경로로 전환되도록 유도함으로써 우수한 미백효과를 나타내는 GSH-MEE를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 및 피부과색소침착성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물은 세포막 투과성이 높고 독성이 없어 안전하며, 타이로시나제의 효소 활성을 효과적으로 억제하고, 유멜라닌의 생성경로보다 페오멜라닌의 생성경로로의 전환을 유도하는 GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함함으로써, 독성이 없고 안정성이 좋으며 피부미백효과가 뛰어난 피부미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있는 효과가 있다.

Description

GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물 {Whitening cosmetic composition to the skin containing GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)}

본 발명은 GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 멜라노사이트에서 멜라닌 생성에 중추적 역할을 하는 효소인 타이로시나제의 활성을 억제하고, 유멜라닌 생성경로를 저해하고 페오멜라닌 생성경로로 전환되도록 유도함으로써 우수한 미백효과를 나타내는 GSH-MEE를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 및 피부과색소침착성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 피부 내 멜라닌(melanin)의 농도와 분포에 따라 유전적으로 결정되나, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다.

피부의 색을 결정하는 멜라닌 생성에 대한 화학적 작용은 현재까지 여러 논문 등을 통해 많이 보고되고 있는데, 멜라닌 생성세포인 멜라노사이트(melanocyte)가 멜라노좀(melanosome)이라는 세포내 소기관 내에서 자외선으로부터 세포를 보호하는 기능을 가진 멜라닌을 합성한 후, 상기 멜라닌은 멜라노사이트에서 각질형성세포(keratinocyte)로 이동하는 것으로 알려져 있으며, 이렇게 각질형성세포로 이동된 멜라닌이 피부색을 결정하는 것으로 보고되고 있다.

상기 멜라닌 생합성 과정에서 필요한 전구물질은 타이로신(tyrosine)이라는 아미노산으로, 이 타이로신은 디히드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 전환되고, 그 후 도파퀴논(dopaquinone)이라는 물질 등을 거쳐 최종적으로 멜라닌으로 전환된다고 알려져 있다. 이러한 멜라닌 생합성과 관련하여, 타이로신-관련 단백질 1(tyrosine-related protein 1) 또는 도파크롬 타우토메라제(dopachrome tautomerase, TRP-2) 등은 멜라닌 생합성에 영향을 끼친다고 알려져 있으며, 이들을 조절할 수 있는 주요 전사 인자인 MITF 또한 멜라닌 생합성 조절에 역할을 한다고 알려져 있다. 그 중에서도 특히, 멜라닌 생합성에 대하여 중추적인 역할을 하는 효소로 타이로시나제(tyrosinase)가 있는데, 상기 타이로시나제는 타이로신에서 DOPA로, DOPA에서 도파퀴논으로의 산화 반응에 필요하며, 이 효소의 활성이 저해되면 멜라닌 합성이 저해된다고 알려져 있다.

상기 타이로시나제 활성을 저해하는 물질로서, 내인성으로 존재하는 저분자량 물질들 중 활성 설프히드릴기(sulfhydryl group)을 함유하는 물질인 설프히드릴 에이전트(sulfhydryl agent)가 있으며, 그 속에는 시스테인(cysteine) 또는 환원형 글루타치온(reduced glutathione, GSH)이 속해 있다.

한편, 상기 세포내에 존재하는 설프히드릴 에이전트는 타이로시나제 활성을 억제할 뿐만 아니라, 타이로시나제에 의해 생성된 도파퀴논이 이후에 대사되는 과정에 대해서도 중요한 영향을 미친다. 멜라닌 생성과정 중간 산물인 도파퀴논은 시스테인 또는 환원형 글루타치온(GSH)과 결합함으로써 시스테이닐도파(cysteinyldopa) 또는 글루타치오닐도파(glutathionyldopa)로 전환될 수 있는데 이들 대사산물은 궁극적으로 페오멜라닌(pheomelanin)으로 전환된다. 페오멜라닌은 일반적인 멜라닌인 유멜라닌(eumelanin)이 검은색 또는 갈색을 띠는 것과 달리, 노란색 또는 빨간색을 띠며 유멜라닌에 비해 상대적으로 페오멜라닌 합성이 많아지게 되면, 전반적으로 색소의 강도는 낮아지면서 노란색이나 빨간색을 띠게 된다. 유멜라닌과 페오멜라닌의 상대적 비율은 인종에 따른 피부색의 차이를 유발하는 중요 인자이다. 또한, 자외선에 의한 색소 침착 과정에서도 자외선에 의해 발생한 활성산소대사산물(reactive oxygen species, ROS)이 세포내 설프히드릴 에이전트를 고갈시키고, 이로 인해 페오멜라닌 생성이 저해되면서 유멜라닌으로의 전환이 촉진되는 것이 주요한 기전으로 작용한다고 알려진 바 있다.

위와 같은 사실들에 착안하여 종래의 피부 미백 성분은 설프히드릴 에이전트를 이용한 피부 미백제를 개발하고자 하는 다양한 시도가 이루어졌으며, 특히, 멜라닌 생합성 과정, 그 중에서도 타이로시나제의 활성을 억제하는 작용을 가진 시스테인 및 GSH 성분을 함유하는 화장료 조성물의 발굴에 초점을 맞춰 개발이 진행되어 왔다.

그러나 상기 설프히드릴 에이전트에 속하는 시스테인의 경우, 상기 물질 자체 또는 그 유도체 중 일부는 세포독성을 나타낸다는 것이 알려져 있어 피부 미백용 화장료 조성물로 사용하기에 적합하지 않다는 문제점이 존재하고 있으며, 실제 화장품에서 많이 사용되고 있는 GSH의 경우 세포독성은 없으나, GSH 자체가 세포 내로 들어가지 못하여(Proc. Natl. Acad. Sci USA Vol. 82, pp. 4732-4735, August 1984) 실제 임상에서는 약이나 화장품으로 사용해도 피부 미백효과를 가질 수 없다는 문제점이 제기되어와, 다른 설프히드릴 에이전트를 이용한 안전하고 효과적인 피부 미백제에 대한 요구는 계속 있어왔다. 설프히드릴 에이전트에 속하는 시스타민의 경우도 유멜라닌 감소는 단지 미미했다.(I Chang et al./British J Dermatol 150 (2004) 39-46)

특히, GSH와 관련하여, 다른 연구 결과에서도 GSH 자체는 세포 내로 투과가 되지 않는다는 유사한 결과를 제시한 바 있으며(G.D. Zeevalk et al./Experimental Neurology 203 (2007) 512-520), 또 다른 연구 결과에서는 특정 멜라노마 세포주에서 GSH가 효과를 나타내는 것은 감마-글루타밀트랜스펩티다아제(gamma-glutamyltranpeptidase)를 경유하는 것임을 확인하였는 바, 이러한 결과는 GSH 자체는 세포 밖에서 분해되어 그 분해산물이 세포 내로 들어가서 효과를 나타낸다는 것을 확인한 것으로, 이러한 내용은 GSH 자체는 실제 임상에서 미백효과를 가질 수 없다는 것을 재확인해 주는 것이다(Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., Vol. 30, No. 2, pp. 373-381, 1994). 실제 연구자의 사전연구나 다른 회사들에서도 GSH의 미백효과를 광고하기 위해서 자체 실험을 하였으나 매우 고농도에서만 미백 효과가 약하게 있을 뿐이어서 발표하지 않았다고 한다. 이렇게 수십년동안 GSH가 타이로시나제(멜라닌을 만드는 가장 중요한 효소)활성을 억제해서 생기는 미백효과에는 의문점이 있었다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들 또한, GSH 자체를 실제 임상환경에서 약이나 화장품으로 사용했을 때 피부 미백효과를 가지지 않는다는 것을 본 발명의 실시예를 통해 다시 한 번 확인하였으며, GSH가 아닌, GSH 분자 내의 글리신의 카복실 그룹(carboxyl group)에 에탄올이 결합하여 에스터의 형태로 전환된 물질인 GSH-MEE 자체가 세포 내로 쉽게 투과되어 타이로시나제의 효소 활성을 억제하고, 유멜라닌 생성경로는 저해하고 페오멜라닌 생성경로로의 전환은 유도하여, GSH보다 현저하고 우수한 피부 미백효과를 가진다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는 피부과색소침착성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서, 상기 GSH-MEE를 포함하는 화장료 조성물은 멜라닌 생성세포 내에서 타이로시나제의 활성을 억제할 수 있다.

본 발명에서, 상기 GSH-MEE를 포함하는 화장료 조성물은 유멜라닌의 생합성을 저해하고, 페오멜라닌 형성을 촉진할 수 있다.

본 발명에서, 상기 GSH-MEE의 함량은 전체 화장료 조성물에 대하여 0.0001~10 중량%일 수 있으며, 예를 들어, 0.001~10 중량%일 수 있다.

본 발명에 따른 피부미백용 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 피부미백용 화장료 조성물은 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 킬레이트제, 살균제, 산화방지제, 방부제, 색소 및 향료로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 첨가제를 더 포함할 수 있다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 유효성분인 “GSH-MEE”는 환원형 글루타치온 모노에틸 에스터(Reduced glutathione monoethyl ester)의 약어로서, 구체적으로, GSH 분자 내의 글리신의 카복실 그룹(carboxyl group)에 에탄올이 결합하여 에스터의 형태로 전환된 물질을 의미하며, 하기 화학식 1의 구조를 가진다.

[화학식 1]

본 발명은 모노에틸기가 아닌 다른 치환기 R이 결합한 GSH 유도체를 포함할 수 있으며, 구체적으로 하기 화학식 2의 구조를 가질 수 있다.

[화학식 2]

구체적으로, 상기 치환기 R은 모노메틸기, 디메틸기, 디에틸기, 모노프로필기, 모노부틸기, 부틸에틸기, 펜틸기, 헥실기, 또는 헵틸기일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 GSH-MEE는 각각 시판되는 제품을 구입하여 사용할 수도 있고, 직접 제조하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서는 GSH-MEE 자체는 세포 독성을 가지지 않아 GSH 만큼이나 안전하다. 또한, 본 발명의 GSH-MEE를 포함하는 화장료 조성물은 타이로시나제의 활성을 억제하며, 유멜라닌의 생합성은 저해하고, 페오멜라닌의 생합성은 촉진함으로써, 피부 미백에 대해 효과가 매우 우수함을 확인하였다.

보다 구체적으로, 일 실시예에서 본 발명자들은 배양된 멜라닌세포를 0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA로 떼어내어 24-배양용기(well-plate)에 1× 10⁵ cells/well로 깔은 후, 24시간 동안 배양하고, 이 후 여기에 GSH-MEE를 처리하였을 때, GSH-MEE가 세포생존율을 높이고 독성을 나타내지 않아 매우 안전한 미백제 임을 확인하였다(도 1). 또한, GSH-MEE 또는 GSH-IPE를 처리한 세포에서는 처리하지 않은 대조군에 비해, 멜라닌의 양이 감소하고 대표적으로 미백물질로 사용되는 알부틴(Arbutin)의 효능과 유사하게 멜라닌의 양이 줄어들었으나, 현재 임상에서 사용하고 있는 GSH 자체는 세포 수준에서 멜라닌을 줄이지 못함을 확인하였다(도 2). 특히, 본 발명자들은 상기에서 사용된 세포주와 다른 멜라닌 세포주인 Mel-ab에서도 GSH 및 GSH-MEE의 미백효과를 확인해 보았는데, 그 결과, GSH-MEE 자체는 미백제로 잘 알려진 알부틴이 가지는 미백효과만큼 현저한 미백 효과를 보였으나, GSH 자체는 대조군과 크게 차이가 없는 것을 확인하였으며(도 3), GSH 자체는 melan A 세포에서 전혀 미백 효과가 없음을 확인하였다(도 4).

상기의 결과를 종합적으로 생각해보면, GSH 자체는 공지된 것과 다르게 미백 효과가 거의 없고 GSH-MEE 자체가 미백 효과를 가진다는 것을 알 수 있으며, 그 미백 효과 또한 GSH보다도 현저하다는 것을 시사하는 것이다.

상기 실험 외에도, 본 발명자들은 일 실시예에서 실제 임상조건과 비슷하게 세포를 a-MSH로 자극한 후 멜라닌 생성 저해를 확인하고, 멜라닌의 정량화를 시행하여, 시료의 농도의존성을 확인한 결과, 미백 고시물질인 알부틴보다 미백효과가 매우 우수함을 확인하였으며(도 7 및 8), 실제 임상조건과 비슷하게 세포를 a-MSH로 자극한 후 세포내 타이로시나제 효소의 활성도를 측정한 결과, 세포내 타이로시나제를 억제하는 효과가 매우 우수함을 확인하였다(도 5, 6, 9 및 10). 아울러, 분광광도계를 사용하여 유멜라닌과 페오멜라닌의 양을 상대적으로 측정한 결과, 유멜라닌보다 페오멜라닌의 양이 상대적으로 증가하여, 유멜라닌의 생합성은 저해하고, 페오멜라닌의 합성을 촉진한다는 것도 확인하였다(도 11).

이러한 결과들을 종합해 보면, 본 발명의 GSH-MEE를 포함하는 조성물은 피부 미백과 관련하여 매우 우수한 효과를 가지는 미백제 임을 시사하는 것이다.

피부 외용 연고나 화장료 제조시에 함유되는 GSH-MEE의 함량은 전체 화장료 조성물에 대하여 0.0001~10 중량%를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 0.001~10 중량%일 수 있다. 그 함량이 0.001 중량% 미만일 경우에는 뚜렷한 미백 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과할 경우에는 조성물의 안전성 및 제형 안정성에 어려움이 있다.

본 발명에서, 상기 피부미백용 화장료 조성물은 피부 외용제로 적용되는 것으로서, 제형으로는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 등을 포함한다.

또한, 본 발명의 피부미백용 화장료 조성물은 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 킬레이트제, 살균제, 산화방지제, 방부제, 색소 및 향료 등의 통상적인 피부 외용제 성분에 포함되는 성분을 추가로 더 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는 피부과색소침착성 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에서 용어, "GSH-MEE"는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "피부과색소침착성 질환"은 피부에 색소가 과다하게 침착되는 증상을 가진 질환을 의미하는 것으로, 구체적으로는 기미, 주근깨, 잡티 또는 흑색종 등을 포함하는 질환을 의미한다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 GSH-MEE를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여 피부과색소침착성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 상기 GSH-MEE를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 피부과색소침착성 질환의 증상 등을 다스리거나 낫게 하는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균, 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정군제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

본 발명에서, 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효가능한 양"은 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명 GSH-MEE를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물은 세포막 투과성이 높고 독성이 없어 안전하며, 타이로시나제의 효소 활성을 효과적으로 억제하고, 유멜라닌의 생성경로보다 페오멜라닌의 생성경로로의 전환을 유도하는 GSH-MEE를 유효성분으로 함유함으로써, 독성이 없고 안정성이 좋으며 피부미백효과가 뛰어난 피부미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 GSH-MEE가 GSH 정도로 세포생존율을 높이고 독성이 없음에 관해 나타낸 것이다.
도 2는 GSH-MEE가 세포 멜라닌 양을 알부틴과 유사한 수준으로 낮춘다는 것에 관해 나타낸 것이다.
도 3은 GSH-MEE는 멜라닌 세포주 Mel-ab에서 세포 멜라닌 양을 알부틴과 유사한 수준으로 낮추지만, GSH 자체는 세포 멜라닌 양에 미치는 영향이 거의 없다는 것을 나타낸 것이다.
도 4는 melan A 세포에서 GSH 자체가 세포 멜라닌 양에 미치는 영향에 관해 나타낸 것이다.
도 5는 GSH-MEE가 알부틴보다 월등히 우수하게 세포 타이로시나제의 활성을 낮춘다는 것에 관해 나타낸 것이다.
도 6은 GSH-MEE가 농도 의존적으로 세포 타이로시나제의 활성을 감소시킨다는 것에 관해 나타낸 것이다.
도 7은 실제 임상조건과 비슷하게 a-MSH를 처리한 후, GSH-MEE가 농도 의존적으로 멜라닌을 감소시킨다는 것에 관해 나타낸 것이다.
도 8은 실제 임상조건과 비슷하게 a-MSH를 처리한 후, GSH-MEE가 타이로시나제의 활성을 알부틴보다 월등하게 낮춘다는 것에 관해 나타낸 것이다.
도 9는 실제 임상조건과 비슷하게 a-MSH를 처리한 후, GSH-MEE가 타이로시나제의 활성을 농도 의존적으로 감소시킨다는 것에 관해 나타낸 것이다.
도 10은 웨스턴블랏을 통하여 GSH-MEE로 인한 타이로시나제 발현량의 감소를 확인한 것이다.
도 11은 GSH-MEE가 페오멜라닌을 함량을 상대적으로 증가킨다는 것에 관해 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포수준에서 GSH - MEE 에 의한 멜라닌의 생합성 억제 효과 확인

1 단계: 멜라닌 생성세포의 배양

사람의 멜라닌 세포와 쥐의 불멸화된 멜라닌 생성세포인 멜란-에이(Melan-a) 세포를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배지에서, 2일에 한 번씩 배지를 교환하면서 80% 점유율(confluency)을 보일 때까지 10% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2 단계: GSH - MEE 에 의한 멜라닌 생성세포에서 멜라닌 세포 생존 확인

상기 1 단계에서 배양된 멜라닌 세포를 0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA로 떼어낸 후, 24-배양용기(well-plate)에 1× 10⁵ cells/well로 깔은 후에, 24시간 동안 배양하였다. 여기에 화합물인 N-phenyl-N'-(1,3-thiazol-2-yl)thiourea를 4가지 농도로 처리하고, 3일 후에 광학현미경을 통해 세포모양을 관찰하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, GSH-MEE를 처리하지 않은 대조군과 다르게, GSH-MEE 처리한 세포에서는 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가되었는바, GSH-MEE는 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.

반면, GSH-IPE(Reduced glutathione isopropyl ester)는 GSH-MEE와 같이 GSH의 유도체 중 하나에 속하나, GSH-MEE와는 다르게 GSH-IPE를 처리한 세포에서는 세포 생존율이 농도 의존적으로 감소되었는바, 이를 통해 GSH-IPE는 세포독성을 가짐을 확인할 수 있었으며, 이러한 GSH-IPE의 독성은 GSH-IPE에서 유리되는 아이소프로판올(isopropanol)의 독성에 기인하는 것으로 추정되었다. 이러한 결과는 같은 GSH의 유도체라 하더라도, 모든 GSH 유도체가 세포 독성이 없는 것이 아니라는 것을 나타낸다(도 1).

3 단계: GSH - MEE 에 의한 멜라닌 생성 저해의 확인 및 멜라닌의 정량화

멜라닌의 양이 저해됨을 정량적으로 확인하기 위하여, 멜라닌 어세이(melanin assay)를 실시하였다. 상기 단계에서 확인한 세포에 1N NaOH를 30분 동안 55℃에서 처리한 후 획득한 세포 용해물을, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 490nm의 빛을 투과시켜 확인하고, 세포 용해물의 단백질을 정량화하여 비교하였다. 그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, GSH-MEE 또는 GSH-IPE를 처리한 세포에서 처리하지 않은 대조군에 비해, 멜라닌의 양이 감소함을 확인할 수 있었으며, 또한, 상기 농도에서 대표적으로 미백물질로 사용되는 알부틴(Arbutin)의 효능과 유사하게 멜라닌의 양이 줄어들었음을 확인할 수 있었다. 반면, 현재 임상에서 사용하고 있는 GSH 자체는 세포 수준에서 멜라닌을 줄이지 못함을 확인할 수 있었다(도 2).

특히, 도 3 및 4에서도 확인할 수 있는 바와 같이, 상기에서 사용된 세포주와 다른 멜라닌 세포주인 Mel-ab에서도 확인해 본 결과, 같은 농도에서 GSH-MEE 자체는 미백제로 잘 알려진 알부틴이 가지는 미백효과만큼 현저한 미백 효과를 보였으나, GSH 자체는 대조군과 크게 차이가 없는 것을 확인하였으며(도 3), melan A 세포에서도 GSH 자체는 전혀 미백 효과가 없음을 다시 한 번 확인할 수 있었다(도 4).

상기의 결과를 종합적으로 생각해보면, GSH 자체는 공지된 것과 다르게 미백 효과가 거의 없고 GSH-MEE 자체가 미백 효과를 가진다는 것을 알 수 있으며, 그 미백 효과 또한 GSH 보다도 현저하다는 것을 확인할 수 있다.

4 단계: 멜라닌의 생성 저해 확인

실제 임상조건과 비슷하게 세포를 a-MSH로 자극한 후, 멜라닌의 생성 저해 정도를 확인하고 멜라닌의 정량화를 시행한 후, 시료의 농도의존성을 확인하였다. 도 7 및 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대표적인 미백 고시물질인 알부틴과 비교할 때, GSH-MEE가 멜라닌의 생성을 저해하고, 타이로시나제의 활성을 월등히 억제시킴으로써 그의 미백효과가 현저히 우수함을 확인할 수 있었다(도 7 및 8).

실시예 2: 타이로시나제 어세이(Tyrosinase assay)를 통한 GSH - MEE 로 인한 타이로시나제 효소의 활성 감소 확인

1 단계: 세포외 타이로시나제 효소의 활성 측정

배양된 사람의 멜라닌 세포와 멜란-에이(melan-a) 세포를 0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA로 떼어내어, 6-배양용기(well-plate)에서 3.5×10⁵cells/well로 계대 후에, 5일 동안 배양하였다. 배양 후 RIPA 버퍼를 이용하여 세포를 터트린 다음, 세포 추출물에 GSH-MEE를 농도별로 처리한 후, L-dopa(2mg/ml)를 처리하여 10% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 37℃에서 배양시킨 후 490nm로 측정하였다. 시료액 제조 후 0.1M 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼(pH 6.5)와 상기 시료액, 1,5mM 타이로신 용액, 버섯형 타이로시나제(1500U/ml~2000U/ml)을 처리하고, 37℃에서 15분간 기다렸다. 그 후, 분광광도계를 이용하여 490nm의 빛을 투과시켜 확인하였다. 그 결과, GSH-MEE는 세포외에서 직접적인 타이로시나제 저해제는 아님을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 GSH-MEE가 타이로시나제의 직접적인 저해제인 것이 아니라 효소 활성을 조절하는 것임을 나타내는 것임을 시사하는 것이다.

2 단계: 세포내 타이로시나제 효소의 활성 측정

배양된 멜란-에이(melan-a) 세포를 0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA로 떼어내어, 6-배양용기(well-plate)에서 3.5×10⁵ cells/well로 계대 후에, 24시간 동안 배양한 후, GSH-MEE를 농도별로 처리하고 72시간 동안 배양시켰다. 배양 후, RIPA 버퍼를 이용하여 세포를 터뜨린 다음, 세포 추출물에 L-dopa(2mg/ml)를 처리하여, 10% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 37℃에서 배양시킨 후, 490 nm로 측정하였다. 그 결과는 도 5, 6 및 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군과 비교할 때, GSH-MEE를 처리한 시료에서 타이로시나제의 활성이 농도 의존적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다(도 5, 6 및 9).

3 단계: 세포내 타이로시나제 효소의 활성도를 측정

실제 임상조건과 비슷하게 세포를 a-MSH로 자극한 후, 세포내 타이로시나제 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대표적인 미백 고시물질인 알부틴과 비교할 때, GSH-MEE의 세포내 타이로시나제 효소를 억제하는 효과가 현저히 우수함을 확인할 수 있었다(도 9).

실시예 3: 웨스턴블랏을 통한 GSH - MEE 로 인한 타이로시나제 발현량 감소 확인

멜란-에이(melan-a)세포에 GSH-MEE 처리 후, 용혈 완충액(lysis buffer)(RIPA 완충액, 프로테아제 인히비터 칵테일(Protease inhibitor cocktail, 1mM PMSF)에 넣은 후 분쇄하였다. 13,000rpm으로 원심분리하여 상층액을 취한 다음, NuPage^® 10% Bis-Tris 겔을 이용하여 전기영동하고 PVDF 막으로 18시간 동안 전사하였다. PVDF 막을 블록킹 용액(skim milk)에 넣어 1시간 동안 반응시키고, 타이로시나제(aPEP7, 이하 National Institute of Health, Bethesda, USA, 1:5000), TRP-1 (aPEP1, 1:5000), TRP-2 (aPEP8, 1:5000), MITF (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA, 1:1000), β-actin (Sigma, St. Louis, MO, USA, 1:10000)에 특이적인 1차 항체를 넣어준 후 밤새 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.1% 트윈 20이 들어 있는 1X TBS-T 용액으로 3회 세척하고, horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit(Bethyl, Montgomery, USA, 1:5000), 또는 anti-mouse(Bio-Rad, Hercules, CA, USA, 1:10000)와 같은 2차 항체를 이용하여 1시간 동안 반응 후 동일한 방법으로 세척하였다. WEST-ZOL^® Plus Western Blot Detection System (INtRON Biotechnology, Sungnam, Korea)을 이용하여 단백질의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 타이로시나제, TRP1, TRP2, 및 MITF의 단백질 발현량은 시료를 처리해도 줄어들지 않음을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 본 발명의 GSH-MEE 시료는 멜라닌 형성에 관계하는 단백질의 양을 변화시키지 않는다는 것을 확인할 수 있었다(도 10). 결국, 본 발명의 조성물은 세포내 타이로시나제 활성도만을 낮추는 것으로, 미백물질로 사용 시 가역적이면서 미백효과는 현저히 우수하며, 안전성도 확보할 수 있는 것임을 다시 한 번 확인할 수 있었다(도 1, 6 및 7).

실시예 4: GSH - MEE 로 인한 Tyrosinase 효소 활성의 감소와 연관된 페오멜라 닌의 양 측정

총멜라닌과 별도로 유멜라닌과 페오멜라닌의 양을 각각 측정하여 두 종류의 멜라닌에 대해 GSH-MEE가 미치는 영향을 비교 평가하였다. 각각의 멜라닌을 녹일 수 있는 버퍼 중 가장 효율이 좋은 다음 아래의 버퍼를 선택하여 실험하였다. 그 후 350nm에서 유멜라닌을 측정하고, 400nm에서 페오멜라닌을 측정하였다. 또한 500nm에서 측정되는 총 멜라닌과의 상대적인 비율을 계산하였다. 유멜라닌을 측정하기 위하여 세포시료에 hydriodic acid와 과산화수소를 가하고 130℃에서 20시간 반응시킴으로써 페오멜라닌을 제거한 후 NaOH 용액에 용해시켜 350nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편 페오멜라닌을 측정하기 위한 방법으로는 세포시료를 pH 10.5의 phosphate buffer로 추출함으로써 선택적으로 페오멜라닌을 용해시킨 후 400nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, GSH-MEE가 페오멜라닌을 함량을 상대적으로 증가킨다는 것을 확인할 수 있었다(도 11).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 GSH-MEE(Reduced glutathione monoethyl ester)를 포함하는, 유멜라닌의 생성을 저해하며 페오멜라닌의 생성을 유도하는, 피부 멜라닌 색소 조절용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 멜라닌 색소의 강도를 낮추며, 상기 색소가 노란색 또는 빨간색을 띠도록 조절하는 것인, 피부 멜라닌 색소 조절용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 GSH-MEE가 전체 화장료 조성물 중 0.0001 내지 10 중량%인 것인, 피부 멜라닌 색소 조절용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물의 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이인 것인, 피부 멜라닌 색소 조절용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 킬레이트제, 살균제, 산화방지제, 방부제, 색소 및 향료로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 첨가제를 더 포함하는 것인, 피부 멜라닌 색소 조절용 화장료 조성물.
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