TWI748944B - 基質金屬蛋白酶產生抑制劑 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的為提供MMP-1產生之抑制劑。本發明之解決手段為含有選自南非醉茄、西番蓮、及刺槐所組成群組之1或2種以上的植物萃取物作為有效成分之MMP-1產生抑制劑。

Description

基質金屬蛋白酶產生抑制劑
本發明係關於新穎的基質金屬蛋白酶產生抑制劑及包含該抑制劑之皮膚外用劑。
皮膚從外側起係由角質層、表皮、基底膜、及真皮所構成。真皮係由細胞成分、及此等細胞所產生之稱為細胞外基質之巨大分子網目構造所填滿。作為細胞成分，已知纖維母細胞、巨噬細胞、肥胖細胞、血管或神經之構成細胞的存在，作為細胞外基質，已知膠原蛋白或彈力蛋白等纖維性蛋白質、及玻尿酸或蛋白多醣等多醣類等的存在。作為細胞外基質之膠原蛋白纖維據說佔真皮的乾燥重量之約70%，在維持皮膚的緊實或彈力上扮演重要的角色。在膠原蛋白分子中存在20種亞型，而存在於真皮中之膠原蛋白纖維之大部分為I型膠原蛋白。
基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase：以下，記為「MMP」)為涉及細胞外基質的分解代謝之蛋白質分解酵素。MMP從分子構造或基質特異性等之觀點而言，係被分類成數種亞型。舉例而言，MMP-1係分解I型膠原蛋 白的3重螺旋構造，MMP-2或MMP-9係分解構成基底膜之IV型膠原蛋白或明膠。MMP不僅調控真皮細胞外基質的代謝，亦深切涉及細胞的濕潤或細胞激素等生理活性分子的活化，已有報告指出與各種疾患之關連性。尤其是在皮膚中，已明瞭因紫外線暴露或各式各樣的炎症會過量產生MMP，該MMP將膠原蛋白或彈力蛋白進行分解/變性，成為皮膚的皺紋或鬆弛之原因。
在此等背景之下，已從控制MMP之觀點進行各式各樣的檢討，已有許多報告指出阻礙MMP的活性之植物萃取物等(專利文獻1及2)。再者，已有報告指出意圖抑制酵素的產生本身，在根本上抑制MMP的作用之以酵母培養液作為有效成分之MMP-1產生抑制劑(專利文獻3)、以具有巰基之化合物及具有二硫鍵之化合物作為有效成分之MMP-1產生抑制劑(專利文獻4)等。另一方面，近年來，已暗示屬於負責維持脂質或糖代謝之基因群的表現控制之核內受體的過氧化物酶體增殖劑應答性受體(Peroxisome Proliferator-activated receptor，以下，記為「PPAR」)之亞型之1種的PPAR δ之促效劑會在纖維母細胞中抑制UVB暴露所引發之MMP-1的產生(非專利文獻1)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開平7-196526號公報
[專利文獻2]日本專利特開平7-291873號公報
[專利文獻3]日本專利特開2009-24638號公報
[專利文獻4]日本專利特開2002-47178號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1] SA Ham et al: Journal of Investigative Dermatology 133, 2593-2600(2013)
然而，如記載為「由於直至UVB為止的短波長紫外線幾乎不會穿透至真皮，因而對真皮有所影響之紫外線主要為UVA」(今川孝太郎等人，「光給予皮膚之影響」，日本雷射醫學會誌(JJSLSM)第32卷第4號(2012)，第448頁22~24行)般，一般認為在通常的環境下，即便皮膚暴露於紫外線，UVA除外之紫外線幾乎無法到達至真皮。從而，一般認為在通常的環境下之真皮纖維母細胞所引發之MMP-1的產生係由於UVA對真皮纖維母細胞之直接作用、或者透過由暴露於UVB之皮膚細胞所產生之炎症性細胞激素或活性氧種(ROS)之間接作用。非專利文獻1係對源自真皮之纖維母細胞直接照射UVB，皮膚係與暴露於UVB之環境有所不同。即，關於PPAR δ之配體劑抑制在通常的環境下可能發生之MMP-1的產生，實屬未知。本發明之目的為提供MMP-1產生之抑制劑。
在以上情事之下，本案之發明者等人係著手於對各式各樣的素材進行探索，並找出抑制MMP-1產生之活性。其結果，判明由特定的植物調製而成之植物萃取物係有效地抑制MMP-1產生。基於該種見解，而完成本發明。
本發明係提供以下各者。
(1)一種MMP-1產生抑制劑，其係含有選自南非醉茄、西番蓮、及刺槐所組成群組之1或2種以上的植物萃取物作為有效成分。
(2)如(1)所記載之MMP-1產生抑制劑，其中，前述植物萃取物為使用溶媒萃取而得之植物萃取物。
(3)如(2)所記載之MMP-1產生抑制劑，其中，前述溶媒為包含醇之溶媒。
(4)如(1)~(3)中任一項所記載之MMP-1產生抑制劑，其係在前述MMP-1的產生開始之前或開始之後進行應用。
(5)如(1)~(4)中任一項所記載之MMP-1產生抑制劑，其中，前述MMP-1係由構成皮膚之細胞所產生。
(6)如(5)所記載之MMP-1產生抑制劑，其中，前述細胞為真皮纖維母細胞。
(7)如(1)~(6)中任一項所記載之MMP-1產生抑制劑，其中，前述MMP-1的產生係起因於對紫外線的暴露或炎症。
(8)如(7)所記載之MMP-1產生抑制劑，其中，前述紫 外線為UVB。
(9)如(1)~(8)中任一項所記載之MMP-1產生抑制劑，其係應用於表皮。
(10)如(1)~(8)中任一項所記載之MMP-1產生抑制劑，其係應用於皮下。
(11)如(1)~(10)中任一項所記載之MMP-1產生抑制劑，其係用於預防或改善皮膚的老化。
(12)如(11)所記載之MMP-1產生抑制劑，其中，前述皮膚的老化為皺紋或鬆弛。
(13)一種皮膚外用劑，其係包含(1)~(9)中任一項所記載之MMP-1產生抑制劑。
(14)一種(1)~(9)中任一項所記載之MMP-1產生抑制劑之用途，其係用在皮膚外用劑的製造中。
(15)一種皮膚之非醫療性處置方法，其係包含應用(1)~(12)中任一項所記載之MMP-1產生抑制劑或(13)所記載之皮膚外用劑而成。
根據本發明，藉由使用由南非醉茄、西番蓮、刺槐之特定的植物所獲得之萃取物，能夠顯著地抑制MMP-1產生。此種抑制效果係由本案之發明者所發現，對於在諸如紫外線暴露或炎症般之通常的環境下之MMP-1產生的誘導亦有效地進行作用。根據本發明，起因於MMP-1產生之真皮之細胞外基質，特定而言，膠原蛋白的分解係受到 抑制，可發揮優異的老化防止效果。即，可提供老化防止效果優異之皮膚外用劑。藉由在其中組合其他藥劑，例如美白劑或抗氧化劑、抗炎症劑、細胞賦活劑、保濕劑、紫外線防止劑等，可期待更高的老化防止效果。如上述般之優異效果係無法由先前技術加以預測。
[圖1]圖1係示出經照射UVB之表皮角化細胞所引發之IL-1 β的產生。對全滿的人類表皮角化細胞照射0~60秒UVB，對24小時後(◆)及72小時後(■)之培養基中之IL-1 β的濃度進行定量。
[圖2]圖2係示出在IL-β的存在下之真皮纖維母細胞所引發之MMP-1的產生。將全滿的人類真皮纖維母細胞以IL-1 β處理24小時，對培養基中之proMMP-1進行定量，並作為MMP-1的產生量。
[圖3]圖3係示出植物萃取物對由過氧化氫所誘導之活性氧種(ROS)的產生抑制之效果。AG：南非醉茄之萃取物、PF：西番蓮之萃取物、NAC：N-乙醯半胱胺酸。**：P<0.01對於對照組、#：P<0.05對於僅添加過氧化氫、# #：P<0.01對於僅添加過氧化氫。
<MMP-1產生抑制劑>
本發明係提供含有植物萃取物作為有效成分之MMP- 1產生抑制劑。
在本發明中，植物萃取物係意味可抑制MMP-1的產生之源自植物之萃取物。作為該植物萃取物的原料之植物可設為藉由以各式各樣的植物為對象之篩選所找出之選自南非醉茄(Withania somnifera)、西番蓮(Passiflora incarnata)、及刺槐(Robinia pseudoacasia)所組成群組之1種或2種以上。以下，針對各植物進行說明。
南非醉茄為茄科植物，其葉或根自古以來在印度傳統醫療阿育吠陀(Ayurveda)中被用作長壽藥薩拉揚(Sarayan)。在本發明中，較佳可使用根。西番蓮為西番蓮科植物，其地上部被稱為受難花(passion flower)，在歐洲係被用於神經不安或失眠症等之藥草。在本發明中，較佳可使用地上部。刺槐為亦被稱為洋槐之豆科植物，在本發明中，較佳係使用花。
用作本發明中所使用之植物萃取物的原料之植物較佳係使用針對各植物上述所說明之部位，但並不限制於此，可使用蕾、花、果實、果皮、種子、葉、枝、幹、樹皮、根、根皮、地上部、全草等所有的部位。此外，除了上述之較佳部位以外，亦可併用選自上述所有的內容之1種或2種以上。
作為原料之植物體可使用生鮮的或經乾燥之物，視需要可進行粉碎、細切、粉末化等加工而使用。此外，亦可使用能夠以生藥之形式取得者。
植物萃取物可藉由使用溶媒直接由作為原料之植物進 行萃取而獲得。作為該萃取溶媒，並無特別限定，可列舉水、醇、液狀多元醇(例如1,3-丁二醇、丙二醇、甘油等)、酮類(例如丙酮、甲基乙基酮)、酯類(例如醋酸乙酯、醋酸丁酯等)等。此處，作為醇，較佳為碳數為1~4的低級醇，可例示甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等。此等萃取溶媒可單獨使用，亦可混合使用2種以上。此外，在本發明中所使用之溶媒中，在不會大幅損及所獲得之植物萃取物的萃取效率或MMP-1產生抑制作用之前提下，亦可包含任意的其他成分。
作為經由溶媒之植物萃取物的調製之一態樣，可列舉藉由將作為原料之植物以包含醇之溶媒進行處理，而獲得植物萃取物。醇的濃度，在所獲得之植物萃取物具有抑制MMP-1產生之效果之前提下，並無特別限制。在萃取溶媒中之醇的濃度為約10~100容量%，較佳為約10~70容量%。作為包含醇之溶媒，可適當地使用醇水溶液。在本發明中，從安全性之觀點而言，較佳係使用乙醇作為醇。
原料植物之萃取方法並無特別限定，可依照公知的手段，視所期望適宜設定。舉例而言，藉由將原料植物浸漬於溶媒中等而使溶媒與原料植物接觸，視需要亦可進行靜置保存、攪拌、或加熱回流。萃取溫度並無特別限制，只要視溶媒的溫度適宜設定即可，從操作上之觀點而言，可設為溶媒的沸點以下。此外，視需要亦可設定加壓或減壓等之條件。
萃取時間只要依所使用之植物原料的種類或萃取溶媒的種類及使用量等適宜設定即可。其使用量通常可設為相對於原料植物1重量份而言為1~1000倍，較佳為1~100倍，更佳為1~10倍，萃取時間通常可設為約10分鐘~1個月左右，較佳為10分鐘~7日左右。此外，在使用熱水作為溶媒之情況，其使用量通常可設為相對於原料1重量份而言為1~1000倍，較佳為1~100倍，更佳為1~10倍，萃取時間通常可設為約10分鐘~7日左右，較佳為10分鐘~1日左右，更佳為10分鐘~1小時左右。
本發明之植物萃取物係在上述萃取操作之後，分離萃取殘渣而製成萃取液之形態。作為此分離手段，可使用公知的方法，例如可使用過濾、離心分離等。在本發明中，亦可依原樣使用上述萃取液。或者，從MMP-1產生抑制作用的調整、輸送的簡便性、或保存的簡便性等各式各樣的觀點而言，亦可視需要獲得前述萃取液之濃縮物或乾燥物(濃縮乾固物)，並使用該等。濃縮可於常壓或減壓下施行，亦可將所獲得之濃縮液的容積調整至濃縮前之萃取液的容積之約10~50容量%，較佳為約10~30容量%。乾固物可藉由使萃取液於減壓下進行乾燥，並去除溶媒而獲得。
此外，植物萃取物亦可藉由上述之使用溶媒之方法以外之方法予以調製。舉例而言，在施行水蒸氣蒸餾、或使用超臨界萃取技術之二氧化碳萃取，再者壓榨處理後所獲得之壓榨液(榨汁)及/或殘渣中加入溶媒並進行萃取所獲得 之物、前述壓榨液本身亦包含在本發明之植物萃取物之定義中。此外，本發明之植物萃取物亦可視需要以管柱層析等劃分精製其活性成分。
本發明之MMP-1產生抑制劑可應用於產生MMP-1之所有對象，藉此抑制MMP-1的產生。此處，MMP-1產生抑制並不限定於完全抑制MMP-1的產生，而是設為抑制MMP-1的過量產生等MMP-1產生的部分抑制便足夠。在本說明書中，「對象」係意味哺乳動物，較佳為人類。
產生MMP-1之組織並無限定，可例示皮膚。因此，本發明之MMP-1產生抑制劑可應用於抑制在皮膚中之MMP-1的產生。又，皮膚係由角質層、表皮、基底膜、及真皮所構成，而MMP-1係主要在真皮中產生。因此，本發明之MMP-1產生抑制劑可應用於抑制在真皮中之MMP-1的產生。再者，在真皮中之MMP-1的產生係由存在於真皮中之細胞所執行。因此，本發明之MMP-1產生抑制劑可應用於抑制存在於真皮中之細胞所引發之MMP-1的產生。此外，在真皮中產生MMP-1之細胞主要為纖維母細胞。因此，本發明之MMP-1產生抑制劑可應用於抑制存在於真皮中之纖維母細胞所引發之MMP-1的產生。
在皮膚中，MMP-1係恆常地產生，並涉及真皮的代謝控制。另一方面，亦已知MMP-1會因刺激而過量地產生，並涉及各式各樣的疾患。此處，所謂的刺激，假若與皮膚相關地進行例示，可列舉紫外線及炎症等。因此，本 發明之MMP-1產生抑制劑可應用於抑制由皮膚之紫外線暴露或皮膚之炎症所誘導之在真皮中之MMP-1產生。此處，作為紫外線，已知波長不同的UVA及UVB的存在。一般認為UVA係通過表皮而到達至真皮，並作用於真皮之纖維母細胞而誘導MMP-1的產生。另一方面，一般認為由於UVB幾乎不會到達至真皮，因而無法直接作用於真皮之纖維母細胞而誘導MMP-1產生。即，暗示假若藉由使皮膚暴露於UVB而誘導在真皮之MMP-1的產生，則涉及另外別的因子。本發明之MMP-1產生抑制劑可較佳地應用於抑制由皮膚對UVB之暴露所誘導之在真皮中之MMP-1產生。
對於UVB暴露所引發之MMP-1產生之影響，在非專利文獻1中已有報告。在該報告中，已進行將UVB直接照射至真皮之纖維母細胞之檢討。但是，如上述所說明般，即便對皮膚照射UVB，由於UVB幾乎不會到達至真皮，因而非專利文獻1之報告亦稱不上反映出在通常的環境下使皮膚暴露於UVB之條件。另一方面，本案之發明者發現藉由UVB暴露，皮膚之表皮細胞(例如表皮角化細胞)會產生IL-1 β及ROS。再者，亦發現外因性的IL-1 β會刺激真皮之纖維母細胞所引發之MMP-1產生。此外，已知若在皮膚中產生ROS，則誘導MMP-1的產生之訊號級聯(MAPK)會被活化(Hyeon Ho Kim et al,Journal of Lipid Research 46,1712-1720(2005))。由此等事項，暗示在使皮膚暴露於UVB之情況，會由表皮細胞產生IL-1 β 及/或ROS，該IL-1 β及/或ROS係誘導真皮之纖維母細胞所引發之MMP-1的產生。因此，本案之MMP-1產生抑制劑可應用於抑制由皮膚之UVB暴露所產生之IL-1 β及/或ROS所媒介之在真皮之MMP-1產生。又，該IL-1 β及/或ROS係由表皮細胞所產生，作為該表皮細胞，可例示表皮角化細胞。
應用本發明之MMP-1產生抑制劑之時期並無特別限制。舉例而言，只要在MMP-1的產生開始之前應用本發明之MMP-1產生抑制劑，即可預防性地抑制MMP-1的產生。作為另一例，只要在MMP-1的產生開始之後應用本發明之MMP-1產生抑制劑，即可壓抑MMP-1產生的程度。藉由此種MMP-1的產生抑制作用，可防止膠原蛋白，特定而言，I型膠原蛋白的分解。
本發明之MMP-1產生抑制劑之應用只要是可發揮MMP-1的產生抑制效果之態樣，則以任何方法施行皆可。較佳可藉由例如將該抑制劑進行塗佈、貼附、或噴佈等而加以應用。作為另一較佳例，亦可藉由將該抑制劑注入至皮下而加以應用。但是，並不限定於此等例。該抑制劑的應用量只要是有效於抑制MMP-1的產生之量即可。該抑制劑之應用可設為1日1次，亦可分成數次。此外，應用期可設為1日或其以上之日數。熟習該項技術者可考慮應用該抑制劑之對象(例如人類)的狀態(年齡、性別、症狀等)、及其他情事，決定該抑制劑之適切的應用量、應用次數、及應用期。
本發明之MMP-1產生抑制劑，雖然並無限定，但可應用於皮膚的老化之預防或改善。MMP-1係透過皮膚之I型膠原蛋白的分解，而涉及細胞外基質的分解或變性。皮膚之細胞外基質的分解或變性係成為皮膚的皺紋或鬆弛之原因。由於本發明之MMP-1產生抑制劑可抑制MMP-1的產生，因而可應用於例如皮膚的皺紋或鬆弛之預防或改善。
<皮膚外用劑>
根據本發明，可提供含有上述所說明之MMP-1產生抑制劑之皮膚外用劑。該皮膚外用劑，雖然並無限定，但可應用於皮膚的老化之預防或改善、以及皮膚的皺紋或鬆弛之預防或改善。
本發明之皮膚外用劑之應用只要是可發揮MMP-1的產生抑制效果之態樣，則以任何方法施行皆可。較佳可藉由例如將該皮膚外用劑塗佈、貼附、或噴佈於皮膚等而加以應用。作為另一較佳例，亦可藉由將該皮膚外用劑注入至皮下而加以應用。但是，並不限定於此等例。該皮膚外用劑的應用量只要是有效於抑制MMP-1的產生之量即可。該皮膚外用劑之應用可設為1日1次，亦可分成數次。此外，應用期亦可設為1日或其以上之日數。熟習該項技術者可考慮應用該皮膚外用劑之對象(例如人類)的狀態(年齡、性別、症狀等)、及其他情事，決定該皮膚外用劑之適切的應用量、應用次數、及應用期。
本發明之皮膚外用劑亦可進一步包含可容許之基材。此處，作為可容許之基材，可列舉可容許對人類或動物使用之成分作為較佳例。該基材只要是不會明顯損及MMP-1產生抑制作用者即可，可列舉例如維生素E及維生素C等維生素類、水、醇、糖類、賦形劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、乳化劑、張力劑(等張化劑)、緩衝劑、溶解輔助劑、防腐劑、吸收促進劑、安定化劑、抗氧化劑、著色劑、矯味劑、香料、凝固劑、pH調整劑、增黏劑、萃取物粉末、生藥、各種粉黛、螯合劑、無機鹽、油劑、界面活性劑、血液循環促進劑、抗菌/殺菌劑、各種動植物/微生物萃取物等。可自此等基材中選擇對所意圖之使用態樣而言適切者，並加以使用。舉例而言，在將本發明之皮膚外用劑製成化妝料之情況，可自上述基材中選擇能夠在化妝料或醫藥部外品中使用者，並加以摻合。舉例而言，在將本發明之皮膚外用劑製成醫藥品之情況，可自上述基材中選擇能夠在外用醫藥品中使用者，並加以摻合。
本發明之皮膚外用劑可按照所意圖之使用態樣製成適切的形態。舉例而言，在將該皮膚外用劑用作化妝料之情況，可製成乳液、乳霜、化妝水、面膜、薄膜、洗淨料、粉底、軟膏、氣溶膠等之形態。作為另一例，在將本發明之皮膚外用劑用作醫藥品之情況，可製成乳液、乳霜、水溶液、貼附劑、薄膜、洗淨料、軟膏、氣溶膠等之形態。
本發明之皮膚外用劑亦可與具有抑制MMP-1的產生之作用之追加成分組合使用。作為該追加成分，可列舉例 如美白劑、抗氧化劑、抗炎症劑、細胞賦活劑、保濕劑、紫外線防止劑等。此處，組合使用係指不僅包含將該追加成分摻合至本發明之皮膚外用劑中，亦包含將該追加成分製成有別於本發明之皮膚外用劑之構成，並在應用本發明之皮膚外用劑之前、後、或同時應用該追加成分。
<其他>
本發明係提供植物萃取物之用途，其係用在MMP-1產生抑制劑的製造中。本發明係進一步提供MMP-1產生抑制劑之用途，其係用在皮膚外用劑的製造中。本發明復提供非醫療性的皮膚之處置方法，其係包含對有需要之對象的皮膚應用本發明之MMP-1產生抑制劑而成。此處，針對該MMP-1產生抑制劑、植物萃取物、皮膚外用劑、及對象之態樣，係如上述。又，在本說明書中所謂的「非醫療性」係指並非以疾病或疾患的治療等醫療性處置為目的，而是意圖藉由預防或改善外觀上的老化，例如皺紋或鬆弛等，而使皮膚的外觀變美、或保持美麗等化妝上或美容上之處置。
[實施例]
在本實施例中，列舉具體例進一步說明本發明。本實施例並非意圖限定本發明之範圍。
[試驗例1]經由UVB照射之表皮角化細胞所引發之IL-1 β的產生
使用源自成人之正常人類表皮角化細胞(NHEK-AD，自Kurabo股份有限公司購入)，針對UVB所引發之在表皮角化細胞之IL-1 β的產生進行評估。在35mm的培養皿中接種細胞，於37℃、二氧化碳濃度5vol%中培養至全滿。對細胞照射0~60秒0.130mJ/cm2的UVB。自UVB照射後24小時及72小時之培養基中回收培養上清液，對分泌至培養基中之IL-1 β進行定量。使用IL-1 β定量ELISA Kit(R&D Systems公司製)，依照所添附之說明書，施行IL-1 β的定量(圖1)。
表皮角化細胞所引發之IL-1 β的產生量係顯示出隨著UVB的照射時間變長而增加。特定而言，在UVB的照射時間超過20秒之情況，IL-1 β的產生量增加變得明確。此種傾向在UVB照射後24小時及72小時皆觀察到。此外，在UVB照射後72小時，顯示出蓄積較多的IL-1 β。
[試驗例2]經由IL-β之真皮纖維母細胞所引發之MMP-1的產生
使用源自新生兒之正常人類皮膚纖維母細胞(NHDF-NB，自Kurabo股份有限公司購入)作為真皮纖維母細胞，以MMP-1的產生量為指標進行檢討。在24孔盤中接種真皮纖維母細胞，於37℃、二氧化碳濃度5vol%中培養至全滿。將IL-1 β以最終濃度成為0、30、100、300、1000pg/mL之方式添加至培養基中，培養24小時。培養後， 回收培養上清液，對分泌至培養基中之proMMP-1進行定量。使用定量ELISA Kit(R&D Systems公司製)，依照所添附之說明書，施行proMMP-1的定量(圖2)，並作為MMP-1的產生量。
由此結果，顯示出因IL-1 β的存在，在真皮纖維母細胞中會產生MMP-1。MMP-1的產生量係伴隨著IL-1 β的濃度而增加。若將此結果與試驗例1之結果合併考慮，則暗示若使皮膚暴露於UVB，則會由表皮角化細胞產生IL-1 β，該IL-1 β誘導真皮纖維母細胞所引發之MMP-1的產生，該MMP-1分解膠原蛋白之一連串的過程。
[調製例1]源自植物之萃取物的調製
將藉由以各式各樣的植物為對象之篩選所選擇出之8種植物進行乙醇萃取，獲得萃取物。將南非醉茄、西番蓮、刺槐、長命草、石楠花、茴香、亮葉楊桐、及西洋接骨木之破碎物各自浸在重量10(w/v)倍量的70容量%乙醇中，於室溫下，除了1日1次攪拌操作以外，亦進行萃取7日。然後，藉由過濾去除殘渣，獲得萃取液。將該萃取液濃縮後，藉由進行凍結乾燥而獲得各植物之乙醇萃取物。在本實施例中使用該植物萃取物。
[試驗例3]MMP-1產生抑制效果
針對源自植物之萃取物在MMP-1產生的抑制中之效果進行檢討。將PPAR δ配體劑作為陽性對照組，同樣地 進行檢討。使用源自新生兒之正常人類皮膚纖維母細胞(NHDF-NB，自Kurabo股份有限公司購入)作為真皮纖維母細胞，以MMP-1的產生量為指標進行檢討。
在24孔盤中接種真皮纖維母細胞，於37℃、二氧化碳濃度5vol%中培養至全滿。然後，添加以下成分：‧溶解於DMSO中之PPAR δ配體劑GW501516(EnzoLife Science公司製)、‧溶解於DMSO中之由8種植物各自調製而成之植物萃取物(參照調製例1)、或‧無添加(僅DMSO溶液)。所添加之成分在培養液中之濃度，關於GW501516係設為25nM、關於植物萃取物係設為10μg/mL、關於DMSO係設為0.1%。培養24小時後，將IL-1 β以最終濃度100pg/mL添加至培養基中。此處，在僅添加有DMSO溶液之孔之一部分係設成未添加IL-1 β者，並將其作為對照組。培養48小時後，回收培養上清液，對分泌至培養基中之proMMP-1進行定量，並作為MMP-1的產生量。proMMP-1的定量係使用定量ELISA Kit(R&D Systems公司製)，依照所添附之說明書施行。定量結果係以將針對對照組之MMP-1的產生量設為100%之相對值(%)之形式表示(表1)。
Figure 105106740-A0202-12-0019-1
若在真皮纖維母細胞僅添加IL-1 β，則MMP-1的產生量大約成為220%(對照組的2.2倍)。又，在添加IL-1 β之前以GW501516處理細胞之情況，MMP-1的產生量成為165.2±6.8%。由此，可確認IL-1 β所引發之MMP-1的產生受到GW501516所抑制。
另一方面，在供予本試驗之8種源自植物之萃取物之中，在以由長命草、石楠花、茴香、亮葉楊桐、及西洋接骨木調製而成之5種植物萃取物處理細胞之情況，相較於僅添加IL-1 β者而言，係顯示出MMP-1的產生量反而提高。相對於此，在以由南非醉茄、西番蓮、及刺槐調製而成之3種植物萃取物處理細胞之情況，IL-1 β所引發之MMP-1的產生受到強烈抑制。在以此等3種植物萃取物進行處理之情況之MMP-1的產生量係各自為147.1± 1.5%、200.2±1.3%、及205.6±1.8%，相較於僅添加IL-1 β者而言係受到大幅抑制。可確認尤其是由南非醉茄調製而成之植物萃取物所引發之MMP-1產生的抑制效果係高於GW501516所引發之效果。在供予試驗之植物萃取物之中，僅有由南非醉茄、西番蓮、及刺槐調製而成之3種植物萃取物會強烈抑制MMP-1的產生全為預想之外。
[試驗例4]植物萃取物所引發之MMP-1產生抑制效果
針對在試驗例3中，經確認會抑制MMP-1產生之3種植物萃取物，進一步進行檢討。
除了使此等植物萃取物在培養基中之濃度成為2.5μg/mL、5μg/mL、及10μg/mL以外，以與試驗例3同樣的條件進行試驗。MMP-1的產生量係以將針對對照組之MMP-1的產生量設為100%之相對值(%)之形式表示(表2)。
Figure 105106740-A0202-12-0020-2
若在真皮纖維母細胞中僅添加IL-1 β，則MMP-1的產生量成為大約446%(增加至對照組的4.5倍)。又，供予本試驗之3種植物萃取物在所試驗之所有濃度下皆顯著地抑制MMP-1的產生。由此等結果，顯示出由南非醉茄、西番蓮、及刺槐所調製之植物萃取物具有優異的MMP-1產生抑制效果。
由以上判明，在通常的環境下暴露於紫外線之皮膚中，透過由暴露於UVB之皮膚細胞所產生之炎症性細胞激素之真皮纖維母細胞所引發之MMP-1的產生係受到本發明有效地抑制。
[試驗例5]植物萃取物對於由過氧化氫(H2O2)所誘導之活性氧種(ROS)的產生抑制之效果
已知若將人類的皮膚暴露於UVB，則會產生過氧化氫(H2O2)(Hyeon Ho Kim et al,Journal of Lipid Research 46,1712-1720(2005))。在本試驗中，針對過氧化氫的刺激所引發之活性氧種(ROS)的產生、及植物萃取物所引發之ROS的產生抑制進行檢討。
在24孔盤中接種真皮纖維母細胞，於37℃、二氧化碳濃度5vol%中培養至全滿。
然後，添加以下成分：‧溶解於DMSO中之抗氧化劑N-乙醯半胱胺酸(Nacalai Tesque公司製)、‧溶解於DMSO中之PPAR δ配體劑GW501516(EnzoLife Science公司製)、‧溶解於DMSO中之植物萃取物(參照調製例1)、或‧無添加(僅DMSO溶液)。所添加之成分在培養液中之濃度，關於N-乙醯半胱胺酸係設為30μM及300μM、關於GW501516係設為25nM、關於植物萃取物係設為10μg/mL及20μg/mL、關於DMSO係設為0.1%。培養24小時後，更換成新的培養基，將過氧化氫以最終濃度10μM添加至培養基中，對10分鐘後之細胞內之活性氧種水平進行定量，並作為ROS產生量。ROS的定量係藉由使用DCFDA分析套組(Abcam公司製)依照所添附之說明書施行。在僅添加有DMSO溶液之孔之一部分係設成未添加H2O2者，並將其作為對照組。定量結果係以將針對對照組之ROS產生量設為100%之相對值(%)之形式表示(圖3)。
由未添加成分而添加過氧化氫之細胞及對照組之結果，可確認藉由以過氧化氫刺激細胞，會誘導ROS的產生。又，藉由與針對未添加成分而添加過氧化氫之細胞之結果進行比較，顯示出下列事項：‧藉由南非醉茄之萃取物及西番蓮之萃取物，ROS的產生係受到抑制。所有萃取物皆藉由20μg/ml的添加，而顯著地抑制ROS的產生；‧藉由已知作為抗氧化劑之N-乙醯半胱胺酸，ROS的產生亦受到抑制。在300μM的添加量中，係顯著地抑制ROS的產生。另外，GW501516並未顯示出ROS的產生 抑制效果。
由以上可明瞭，南非醉茄之萃取物及西番蓮之萃取物係抑制由過氧化氫的刺激所誘導之ROS的產生。其效果係與已知作為抗氧化劑之N-乙醯半胱胺酸之效果匹敵或為其以上。
在Hyeon Ho Kim等人(Journal of Lipid Research 46,1712-1720(2005))中，係暗示若使人類的皮膚暴露於紫外線，則過氧化氫會迅速且顯著地產生，而且上升之ROS涉及訊號級聯(MAPK)的活化，結果誘導MMP-1的產生。此處亦進一步教示N-乙醯半胱胺酸等抗氧化劑係藉由捕捉ROS，干涉該級聯的活化，而抑制MMP-1的產生之可能性。若將此等事項與上述結果合併考慮，則暗示南非醉茄及西番蓮亦藉由抑制由過氧化氫所誘導之ROS的產生，而抑制MMP-1的產生。

Claims (10)

  1. 一種使用西番蓮(Passiflora incarnata；受難花(passion flower))萃取物於製造抑制MMP-1產生的組成物之用途，其中該MMP-1的產生係起因於藉由表皮的UVB暴露使皮膚的表皮細胞產生IL-1β及ROS，進一步起因於表皮對紫外線的暴露或表皮的發炎。
  2. 如請求項1之用途，其中前述萃取物為溶媒萃取物。
  3. 如請求項2之用途，其中前述溶媒為含有醇的溶媒。
  4. 如請求項1至3中任一項之用途，其係在前述MMP-1的產生開始之前或開始之後進行應用。
  5. 如請求項1或2之用途，其中，前述MMP-1係由構成皮膚之細胞所產生。
  6. 如請求項5之用途，其中，前述細胞為真皮纖維母細胞。
  7. 如請求項1或2之用途，其中，前述組成物中進一步含有作為有效成分的南非醉茄之根的萃取物。
  8. 如請求項1或2之用途，其中前述組成物適用於經紫外線照射的表皮或發炎狀態的表皮，使用於預防或改善皮膚的老化。
  9. 如請求項8之用途，其中，前述皮膚的老化為皺紋或鬆弛。
  10. 如請求項9之用途，其中前述組成物為皮膚外用 劑。
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