JP5162174B2 - 育毛剤及び抗肥満剤 - Google Patents
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しかし、前記活性酸素の過剰な生成は生体内の膜及び組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。生体内で生産され、他の活性酸素の出発物質ともなっているスーパーオキサイドは、通常、細胞内に含まれているスーパーオキサイドジスムターゼ(SOD)の触媒作用により逐次消去されている。しかし、スーパーオキサイドの産生が過剰な場合、あるいはSODの作用が低下している場合には、スーパーオキサイドの消去が不十分になってスーパーオキサイド濃度が高くなる。このことが、関節リウマチ、ベーチェット病等の組織障害、心筋梗塞、脳卒中、白内障、シミ、ソバカス、しわ、糖尿病、動脈硬化、肩凝り、冷え性、皮膚の老化などを起こす原因の一つであると考えられている。
これらの中でも、皮膚は紫外線等の環境因子の刺激を直接受けるため、スーパーオキサイドが生成し易い器官であるから、スーパーオキサイド濃度の上昇により、例えば、コラーゲン等の生体組織を分解、変性、又は架橋したり、また油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成して、皮膚のしわを形成したり、皮膚の弾力性低下等の老化、炎症、肌の色素沈着を引き起こすという問題がある(非特許文献1参照)。
そこで、活性酸素消去物質、ラジカル消去物質、過酸化水素消去物質等を安全性の点で有利な天然物から得る試みがなされており、アブラナ科ブラシカ属植物の抽出物(特許文献1参照)、ベンケイソウ科リュウキュウベンケイ属植物の抽出物(特許文献2参照)、タマコチョウの抽出物(特許文献3参照)、スイオウの抽出物(特許文献4参照)、などに有効性が確認されている。
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等のある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少すると共に架橋による弾力低下を起こす。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるため、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。
このように皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン等の真皮マトリックス成分の減少乃至変性が関与している。
前記MMPsはその一次構造と基質特異性の違いから、(1)コラゲナーゼ群(MMP−1、MMP−8及びMMP−13)、(2)ゼラチナーゼ群(MMP−2及びMMP−9)、(3)ストロメライシン群(MMP−3及びMMP−10)、(4)膜結合型マトリックスメタロプロテアーゼ群(MMP−14、MMP−15、MMP−16、及びMMP−17)、(5)その他(MMP−7、MMP−11、及びMMP−12)の5つのグループに分類されている(特許文献7参照)。
前記MMPsの中でも、MMP−1(マトリックスメタロプロテアーゼ−1)及びMMP−14(マトリックスメタロプロテアーゼ−14)は、皮膚の真皮マトリックスの主な構成成分であるI型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンを分解する酵素として知られている。また、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線によるコラーゲンの減少乃至変性の一因となり、皮膚のシワ形成等の大きな要因の一つであると考えられている。
したがってコラゲナーゼ活性の阻害、皮膚線維芽細胞の増殖の促進、マトリックスメタロプロテアーゼ−1(MMP−1)活性阻害、マトリックスメタロプロテアーゼ−14(MMP−14)活性阻害、あるいは加齢によるエストロゲン分泌減退を補うことにより、皮膚のしわの形成、弾力性低下等の皮膚の老化を予防乃至治療できると考えられる。
体組織への親和性を保つヒアルロン酸塩は、含水系の中では紫外線、酵素等によって分解され、分子量の低下に伴って保水効果も減少する。また、ヒアルロン酸は細胞間組織として存在し、血管透過性とも関与している。更に、ヒアルロニダーゼは肥満細胞中にあって活性化により、肥満細胞からの脱顆粒に関与していると考えられている。したがってヒアルロン酸の加水分解酵素であるヒアルロニダーゼの活性を阻害することにより、ヒアルロン酸の安定化をはかり、肥満細胞からの種々のケミカルメディエーターの放出を防止し、保湿の強化又は抗炎症が期待できる。
このようなヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有する生薬としては、例えば、オスベッキア属植物の抽出物(特許文献8参照)、藤茶抽出物(特許文献9参照)、ローズマリー、タイム抽出物及びメリッサ抽出物(特許文献10参照)などが報告されている。
したがって炎症性疾患において、一酸化窒素(NO)の過剰な産生を抑制することが重要となる。このような一酸化窒素の産生抑制作用を有する生薬としては、例えば、ローズマリー抽出液、カルノソール、カルノシン酸、コーヒー豆の抽出液、サクラダソウ抽出液、オウレン抽出液、オウバク抽出液、カンゾウ抽出液、イヌノイバラの抽出液、センキュウ抽出液、トウニン抽出液、シャクヤク抽出液、ヨクイニン抽出液、アカブドウ抽出液(特許文献11参照)、唐独活、タラ根皮、和続断、車前子、遠子、茜草根、半枝連、槐花、花椒(非特許文献2参照)、などが報告されている。
このように、毛乳頭細胞は、毛包上皮系細胞の増殖乃至分化及び毛髪の形成において最も重要な役割を果たしており、例えば、毛乳頭細胞に対象物質を接触させて、その細胞の増殖活性の有無、あるいは強弱を特定することで、その対象物質の育毛効果を検定する方法が提案されている(特許文献15参照)。また、毛乳頭細胞増殖促進作用を有する生薬としては、例えばハトムギ抽出物、ワイルドタイム抽出物、スギナ抽出物、ショウブ抽出物、ローズマリー抽出物、ウコン抽出物、シラカバ抽出物、コウチャ抽出物などが提案されている(特許文献16参照)。
そこで、テストステロン−5αリダクターゼ阻害作用を有する生薬の抽出物としては、例えば、ウルシ科Choerospondias属植物の抽出物(特許文献17参照)、マジトの抽出物及びカチュアの抽出物(特許文献18参照)、五斂子の抽出物(特許文献19参照)、紅豆杉、鳥欖、幌傘楓、及び穿心蓮から選択されるいずれかの抽出物(特許文献20参照)、などが提案されている。
そこで、サイクリックAMPホスホジエステラーゼ阻害作用を有する物質を天然物から抽出することが試みられており、例えば、藤茶抽出物(特許文献9参照)、カエデ属植物の抽出物(特許文献21参照)、などが報告されている。
また、本発明は、第2に、エラスターゼ活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−1(MMP−1)活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−14(MMP−14)活性阻害作用、皮膚線維芽細胞増殖促進作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系抗老化剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第3に、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、一酸化窒素(NO)産生抑制作用、TNF−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、及び血小板凝集抑制作用の少なくともいずれかを有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系抗炎症剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第4に、毛乳頭細胞増殖促進作用、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用及びアンドロゲンレセプター拮抗作用の少なくともいずれかを有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系育毛剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第5に、サイクリックAMP−ホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有し、安全性が高く、原料の入手が容易な天然系抗肥満剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第6に、優れた美白作用を有するエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第7に、本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、前記抗炎症剤、前記育毛剤、前記抗肥満剤、及び前記エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤の少なくともいずれかを有効成分として配合した化粧料、及び美容用飲食品を提供することを目的とする。
なお、前記抗酸化剤におけるグルタチオン産生促進作用は、加齢により衰える酸化ストレスの防御を高め、かつ紫外線による酸化ストレスに対する傷害を抑制することにつながり、皮膚の老化の予防、治療、あるいはシミなどの色素沈着に対する改善が期待できるので、抗老化剤及び美白剤としても有用である。
<1> 千里香の抽出物を含有することを特徴とする抗酸化剤である。
<2> スーパーオキサイド消去作用、ラジカル消去作用、及びグルタチオン産生促進作用の少なくともいずれかを有する前記<1>に記載の抗酸化剤である。
<3> 千里香の抽出物を含有することを特徴とする抗老化剤である。
<4> エラスターゼ活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−1(MMP−1)活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−14(MMP−14)活性阻害作用、皮膚線維芽細胞増殖促進作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有する前記<3>に記載の抗老化剤である。
<5> 千里香の抽出物を含有することを特徴とする抗炎症剤である。
<6> ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、一酸化窒素(NO)産生抑制作用、TNF−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、及び血小板凝集抑制作用の少なくともいずれかを有する前記<5>に記載の抗炎症剤である。
<7> 千里香の抽出物を含有することを特徴とする育毛剤である。
<8> 毛乳頭細胞増殖促進作用、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用、及びアンドロゲンレセプター拮抗作用の少なくともいずれかを有する前記<7>に記載の育毛剤である。
<9> 千里香の抽出物を含有することを特徴とする抗肥満剤である。
<10> サイクリックAMP−ホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有する前記<9>に記載の抗肥満剤である。
<11> 千里香の抽出物を含有することを特徴とするエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤である。
<12> 前記<1>から<11>のいずれかに記載の千里香の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする化粧料である。
<13> 前記<1>から<11>のいずれかに記載の千里香の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美容用飲食品である。
本発明の抗老化剤によると、優れたエラスターゼ活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−1(MMP−1)活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−14(MMP−14)活性阻害作用、皮膚線維芽細胞増殖促進作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを通じて、皮膚のシワ及び皮膚の弾力低下の防止乃至改善することができる。
本発明の抗炎症剤によると、優れたヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、一酸化窒素(NO)産生抑制作用、TNF−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、及び血小板凝集抑制作用の少なくともいずれかを通じて、炎症性疾患を防止乃至改善することができる。
本発明の育毛剤は、優れた毛乳頭細胞増殖促進作用、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用及びアンドロゲンレセプター拮抗作用の少なくともいずれかを通じて、男性型脱毛症等の予防乃至治療に極めて有用である。
本発明の抗肥満剤は、優れたサイクリックAMP−ホスホジエステラーゼ活性阻害作用を通じて、肥満を予防乃至防止することができる。
本発明のエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤は、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用を通じて、美白効果を奏することができる。
また、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、抗炎症剤、育毛剤、抗肥満剤、及びエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤は、天然系抽出物であり安全性に優れ、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさないので化粧料に配合したり、美容用飲食品に添加して用いるのに好適なものである。
本発明の抗酸化剤、抗老化剤、抗炎症剤、育毛剤、抗肥満剤、及びエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤は、千里香の抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
前記抗老化剤は、抗老化作用として、エラスターゼ活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−1(MMP−1)活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−14(MMP−14)活性阻害作用、皮膚線維芽細胞増殖促進作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかを有している。
前記抗炎症剤は、抗炎症作用として、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、一酸化窒素(NO)産生抑制作用、TNF−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、及び血小板凝集抑制作用の少なくともいずれかを有している。
前記育毛剤は、育毛作用として、毛乳頭細胞増殖促進作用、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用及びアンドロゲンレセプター拮抗作用の少なくともいずれかを有している。
前記抗肥満剤は、抗肥満作用として、サイクリックAMP−ホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有している。
前記エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤は、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用を有している。
前記千里香の抽出物における抗酸化作用、抗老化作用、抗炎症作用、育毛作用、抗肥満作用、及びエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用の少なくともいずれかを有する物質の詳細については不明であるが、該千里香の抽出物がこれらの優れた作用を有し、抗酸化剤、抗老化剤、抗炎症剤、育毛剤、抗肥満剤、及びエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤として有用であることは現在までのところ全く知られておらず、これらのことは、本発明者らの鋭意研究による新知見である。
前記千里香は、中国の雲南省に分布しており、この地域から容易に入手可能である。
前記千里香には、例えば消炎、清熱等の効能があり、咽喉炎、鼻炎、眼疾患の治療に用いられている。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。なお、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水10質量部に対して1質量部〜90質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水10質量部に対して1質量部〜40質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水10質量部に対して1質量部〜90質量部添加することが好ましい。
本発明の抗老化剤における抗老化作用は、エラスターゼ活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−1(MMP−1)活性阻害作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−14(MMP−14)活性阻害作用、皮膚線維芽細胞増殖促進作用、及びエストロゲン様作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の抗炎症剤における抗炎症作用は、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、一酸化窒素(NO)産生抑制作用、TNF−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、及び血小板凝集抑制作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の育毛剤における育毛作用は、毛乳頭細胞増殖促進作用、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用及びアンドロゲンレセプター拮抗作用の少なくともいずれかに基づいて発揮される。
本発明の抗肥満剤における抗肥満作用は、サイクリックAMP−ホスホジエステラーゼ活性阻害作用に基づいて発揮される。
本発明のエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤は、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用に基づいて発揮される。
本発明の千里香の抽出物は、優れた抗酸化作用、抗老化作用、抗炎症作用、育毛作用、抗肥満作用、及びエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用の少なくともいずれかを有すると共に、皮膚及び頭皮に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、特に、以下に説明する本発明の化粧料に配合するのに好適である。
また、本発明の千里香の抽出物は、優れた抗酸化作用、抗老化作用、抗炎症作用、育毛作用、抗肥満作用、及びエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用の少なくともいずれかを有すると共に、消化管で消化されるようなものではないことが確認されているので、特に、以下に説明する本発明の美容用飲食品に配合するのに好適である。
本発明の化粧料は、本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、前記抗炎症剤、前記育毛剤、前記抗肥満剤、及び前記エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤の少なくともいずれかを有効成分として含有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。
前記その他の成分としては、本発明の抗酸化作用、抗老化作用、抗炎症作用、育毛作用、抗肥満作用、及びエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用の少なくともいずれかの妨げにならない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択した成分が挙げられ、例えば、収斂剤、殺菌剤、抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、などが挙げられる。これらの成分は、前記千里香の抽出物と共に併用した場合、相乗的に作用して、通常期待される以上の優れた作用効果をもたらすことがある。
本発明の美容用飲食品は、本発明の前記抗酸化剤、前記抗老化剤、前記抗炎症剤、前記育毛剤、前記抗肥満剤、及び前記エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤の少なくともいずれかを有効成分として含有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。
ここで、前記美容用飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口又は消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品、などの区分に制限されるものではなく、例えば、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものを意味する。
前記原料又は添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、L−アスコルビン酸、dl−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンB類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤、などが挙げられる。
−千里香の水抽出物の製造−
抽出原料として千里香の花部の粉砕物100gを、水1000mLに投入し、穏やかに攪拌しながら2時間、80℃に保った後、ろ過した。得られたろ液を40℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物(粉末状)を得た。得られた抽出物の収率を表1に示す。
−千里香の50質量%エタノール抽出物の製造−
抽出原料として千里香の花部の粉砕物100gを、50質量%エタノール(水とエタノールとの質量比1:1)1000mLに投入し、穏やかに攪拌しながら2時間、80℃に保った後、ろ過した。得られたろ液を40℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物(粉末状)を得た。得られた抽出物の収率を表1に示す。
−千里香のエタノール抽出物の製造−
抽出原料として千里香の花部の粉砕物100gを、エタノール1000mLに投入し、穏やかに攪拌しながら2時間、80℃に保った後、ろ過した。得られたろ液を40℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物(粉末状)を得た。得られた抽出物の収率を表1に示す。
−スーパーオキサイド消去試験(NBT法)−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりスーパーオキサイド消去作用を試験した。
3mmol/Lのキサンチン、3mmol/LのEDTA、1.5mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)溶液、0.75mmol/Lのニトロブルーテトラゾリウム(NBT)各0.1mLと、0.05mol/LのNa2CO3緩衝液(pH10.2)2.4mLを試験管にとり、これに各試料溶液0.1mLを添加し、25℃で10分間放置した。次いで、キサンチンオキシダーゼ溶液を加えて素早く攪拌し、25℃で20分間静置した。その後、6mmol/Lの塩化銅0.1mLを加えて反応を停止させ、波長560nmにおける吸光度を測定した。このとき測定した吸光度を「試料溶液添加、酵素溶液添加時の吸光度」という。
また、同様の操作と吸光度の測定を、酵素溶液を添加せずに行った。このとき測定した吸光度を「試料溶液添加、酵素溶液無添加時の吸光度」という。
また、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。このとき測定した吸光度を「試料溶液無添加、酵素溶液添加時の吸光度」という。
また、酵素溶液を添加せず、更に試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。このとき測定した吸光度を「試料溶液無添加、酵素溶液無添加時の吸光度」という。
測定した各吸光度より、下記数式1によりスーパーオキサイド消去率を求めた。
<数式1>
スーパーオキサイド消去率(%)={1−(A−B)/(C−D)}×100
ただし、前記数式1中、Aは試料溶液添加、酵素溶液添加時の吸光度、Bは試料溶液添加、酵素溶液無添加時の吸光度、Cは試料溶液無添加、酵素溶液添加時の吸光度、Dは試料溶液無添加、酵素溶液無添加時の吸光度をそれぞれ表す。
−DPPHに対するラジカル消去試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により非常に安定なラジカルである1,1−diphenyl−2−picrylhydrazyl radical(DPPH)を使用してラジカル消去作用を試験した。
150μmol/LのDPPHエタノール溶液3mLに各試料溶液3mLを加え、直ちに容器を密栓して振り混ぜ、30分間静置した後、波長520nmの吸光を測定した。
コントロールとして、試料溶液の代わりに試料溶液を溶解した溶媒を用いて同様に操作し、波長520nmの吸光度を測定した。また、ブランクとして、エタノールに試料溶液3mLを加えたのち直ちに波長520nmの吸光度を測定した。
そして、測定した各吸光度より、下記数式2によりラジカル消去率(%)を算出した。
<数式2>
ラジカル消去率(%)={1−(B−C)/A}×100
ただし、前記数式2中、Aはコントロールの吸光度、Bは試料溶液を添加した場合の吸光度、Cはブランクの吸光度をそれぞれ表す。
−グルタチオン産生促進作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりグルタチオン産生促進作用を試験した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞(NB1RGB)を10%FBS含有α−MEMを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を2.0×105cells/mLの濃度に10%FBS含有α−MEMで希釈した後、48穴プレートに1穴当たり200μLずつ播種し、一晩培養した。培養後、1%FBS含有D−MEMで溶解した試料溶液を各穴に200μL添加し、24時間培養した。培養終了後、各穴から培地を抜き、400μLのPBS(−)にて洗浄後、150μLのM−PER(PIERCE社)を用いて細胞を溶解した。このうちの100μLを用いて総グルタチオンの定量を行った。
具体的には、96穴プレートに溶解した細胞抽出液100μL、0.1mol/Lのリン酸緩衝液50μL、2mmol/LのNADPHを25μL、及びグルタチオンレダクターゼ25μL(終濃度17.5unit/mL)を加え、37℃で10分間加温した後、10mmol/Lの5,5’−dithiobis(2−nitrobenzoic acid) 25μLを加え、5分間後までの波長412nmにおける吸光度を測定しΔOD/minを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線に基づき算出した。得られた値は総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記数式3に従いグルタチオン産生促進率を算出した。試料濃度200μg/mL、50μg/mL、及び12.5μg/mLでのグルタチオン産生促進率を表4に示す。
<数式3>
グルタチオン産生促進率(%)=(B/A)×100
ただし、前記数式3中、Aは試料溶液を添加しない細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量(対照)を表す。Bは試料溶液を添加した細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量を表す。
−一酸化窒素(NO)産生抑制作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験方法により一酸化窒素(NO)産生抑制作用を試験した。
マウスマクロファージ細胞(RAW264.7)を、10%の牛胎児血清(FBS)含有ダルベッコMEMを用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を3.0×106cells/mLの濃度になるように10%のFBS含有フェノールレッド不含ダルベッコMEMで希釈した後、96穴マイクロプレートに1穴当たり100μLずつ播種し、4時間培養した。培養終了後、培地を抜き、終濃度2質量%のDMSOを含む10%FBS含有フェノールレッド不含ダルベッコMEMで溶解した試料溶液を各穴に100μL添加し、終濃度1μg/mLで10%のFBS含有フェノールレッド不含ダルベッコMEMに溶解したリポポリサッカライド(LPS、E.coli 0111;B4、DIFCO社製)を100μL加え、48時間培養した。NO産生量は亜硝酸イオン(NO2 −)量を指標に測定した。培養終了後、各穴の培養液に、同量のグリス試薬(1質量%のスルファニルアミド、0.1質量%のN−1−naphthyl ethylendiamine dihydrochlpride in 5質量%のリン酸溶液)を添加し、10分間室温にて反応した。反応後、波長540nmにおける吸光度を測定した。コントロールの一酸化窒素(NO)産生量を基にして、下記数式4からNO産生抑制率を算出した。
NO産生抑制率(%)={1−(A−B)/(C−D)}×100
ただし、前記数式4中、Aは試料添加、LPS刺激時の波長540nmにおける吸光度、Bは試料添加、LPS無刺激時の波長540nmにおける吸光度、CはコントロールのLPS刺激時の波長540nmにおける吸光度、DはコントロールのLPS無刺激時の波長540nmにおける吸光度、をそれぞれ表す。
−TNF−α産生抑制作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりTNF−α産生抑制作用を試験した。
まず、マウスマクロファージ細胞(RAW264.7細胞、大日本製薬株式会社製)を、10質量%の牛胎児血清(FBS)を添加したダルベッコMEM(日水製薬株式会社製)培地にて前培養後、セルスクレーパーより細胞を集め、1穴当たり1×105/cells/100μLの密度で96穴マイクロプレートに細胞を播種し、37℃、5%CO2条件下で4時間前培養した。
次に、96穴マイクロプレート中の培地を捨て、予め2質量%のDMSOを含む培養液で溶解した各試料溶液を100μL添加した後、リポポリサッカライド(LPS、終濃度1μg/mL、E.coli 0111、B4、DIFCO Laboratories社製)を100μL添加し、細胞を刺激した。その後、37℃、5%CO2の条件下で24時間の培養により産生したTNF−αの産生量を、下記サンドイッチELISA法を用いて測定した。
次に、一次抗体であるラット抗マウスTNF−αモノクローナル抗体(Endogen Inc.製)を50mmol/Lの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)で2.5μg/mLとなるように溶解した。その溶液100μLを96穴マイクロプレートに加え、一夜、4℃でコーティングした。次いで、洗浄液(0.05質量%のTween20を含むリン酸緩衝液)で各穴を洗浄後、1質量%の牛血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝液でブロッキングを行った。
次に、洗浄液によって各穴を洗浄後、試験培地で培養上清を希釈し、その100μLを各穴に加え、37℃で120分間インキュベートした。各穴を洗浄した後、二次抗体として、0.3質量%のBSAを含むリン酸緩衝液に2.5μg/mLの濃度で溶解させたウサギ抗マウスTNF−αポリクローナル抗体(Endogen Inc.製)100μLを加え、37℃で60分間インキュベートしてから洗浄した。
そして、各試料溶液のTNF−α産生抑制率は、以下の数式5に基づいて算出した。
<数式5>
TNF−α産生抑制率(%)={(B−A)/B}×100
ただし、前記数式5中、Aは試料溶液添加時のTNF−α量、Bは試料溶液無添加時のTNF−α量を表す。
−ヒアルロニダーゼ活性阻害試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりヒアルロニダーゼ活性阻害作用について試験した。
まず、各抽出物を溶解した0.1mol/Lの酢酸緩衝液(pH3.5)0.2mLにヒアルロニダーゼ溶液〔Type IV−S(from bovine testis;SIGMA 400 NF units/mL)〕0.1mLを加え、37℃で20分間反応した。更に、活性化剤として2.5mmol/Lの塩化カルシウム0.2mLを加え、37℃にて20分間反応した。これに0.4mg/mLのヒアルロン酸ナトリウム溶液(from robster comb)0.5mLを加え、37℃にて40分間反応した。その後、0.4mol/Lの水酸化ナトリウム0.2mLを加え、反応を止めて冷却した後、各反応溶液にホウ酸溶液0.2mLを加え、3分間煮沸した。氷冷後、p−DABA試薬6mLを加え、37℃にて20分間反応した。その後、波長585nmにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。
そして、これらの結果から、下記数式6によりヒアルロニダーゼ活性阻害率を算出した。試料濃度400μg/mLでのヒアルロニダーゼ活性阻害率を表7に示す。
<数式6>
ヒアルロニダーゼ活性阻害率(%)=
[1−(St−Sb)/(Ct−Cb)]×100
ただし、前記数式6中、Stは、試料溶液の波長585nmにおける吸光度を表す。Sbは、試料溶液ブランクの波長585nmにおける吸光度を表す。Ctは、コントロール溶液の波長585nmにおける吸光度を表す。Cbは、コントロール溶液ブランクの波長585nmにおける吸光度を表す。
−ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用試験−
製造例1〜3の各抽出物について、下記の試験方法によりヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を試験した。なお、細胞内のヒスタミンが遊離されると同時にヘキソサミニダーゼも遊離されることから、ヘキソサミニダーゼ遊離を指標にヒスタミン遊離抑制作用を評価することができる。
ラット好塩基球白血病細胞(RBL−2H3)を15%FBS添加S−MEMを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を4.0×105cells/mLの濃度に培地で希釈し、DNP−specific IgE(SIGMA社製)が終濃度0.5μg/mLとなるよう添加した後、96穴プレートに1穴当たり100μLずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、Siraganian緩衝液100μLにて洗浄を2回行った。次に、同緩衝液30μL及び同緩衝液にて調製した試料溶液10μLを加え、37℃にて10分静置した。その後、100ng/mLのDNP−BSA(LSL co.,Ltd製)溶液10μLを加え、37℃にて15分静置し、ヘキソサミニダーゼを遊離させた。その後、96穴プレートを氷上に静置することにより遊離を停止した。各穴の細胞上清10μL、及び1mmol/Lのp−NAG(p−nitrophenyl N−acetyl β−D−glucosaminide、SIGMA社製)溶液10μLを、新たな96穴プレートに添加し、37℃、1時間反応させた。反応終了後、各穴に0.1mol/LのNa2CO3/NaHCO3を250μL加え、波長415nmにおける吸光度を測定した。また、空試験として、細胞上清10μL、及び0.1mol/LのNa2CO3/NaHCO3を250μL混合液の波長415nmにおける吸光度を測定し、補正した。そして、下記数式7からヘキソサミニダーゼ遊離抑制率を算出した。試料濃度400μg/mLでのヘキソサミニダーゼ遊離抑制率(%)を表8に示す。
<数式7>
ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率(%)={1−(B−C)/A}×100
ただし、前記数式7中、Aは、試料溶液無添加での波長415nmにおける吸光度を表す。Bは、試料溶液添加での波長415nmにおける吸光度を表す。Cは、試料溶液添加、p−NAG無添加での波長415nmにおける吸光度を表す。
−血小板凝集抑制作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により血小板凝集抑制作用を試験した。
まず、ヘパリンナトリウム注射液(日本薬局方)を1/10量加えて採血したウサギの血液を遠心分離(180×g、10分、室温)して、血小板浮遊液(Platelet Rich Plasma;P.R.P.)を得た。
次に、血小板浮遊液(P.R.P.)223μLに200mmol/Lの塩化カルシウム溶液1μLを加え、37℃で1分間反応した。これに試料溶液1μLを加え、更に2分間反応し、撹拌子を入れて1分間撹拌した後、コラーゲン溶液を25μL添加して、37℃で10分間の血小板凝集率を測定した。別に、コントロールとして試料溶液の代わりに試料溶液の溶媒を添加した以外は、上記と同様に操作して血小板凝集率を測定した。
そして、これらの測定結果から、下記数式8により血小板凝集抑制率(%)を求めた。試料濃度400μg/mLでの血小板凝集抑制率(%)を表9に示す。
<数式8>
血小板凝集抑制率(%)=〔(A−B)/A〕×100
ただし、前記数式8中、Aは、コントロールの血小板凝集率、Bは、試料溶液添加時の血小板凝集率を表す。
−エンドセリン−1(ET−1)mRNA発現上昇抑制作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、以下のようにして、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用を試験した。
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞(normal human epidermis keratinocyte;NHEK)を、80cm2フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地(EpiLife−KG2)において、37℃、5%CO2下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
次に、EpiLife−KG2を用いて35mmシャーレ(FALCON社製)に40×104cells/2mL/シャーレずつ播き、37℃、5%CO2下で一晩培養した。24時間後に培養液を捨て、HEPES緩衝液1mLを加え、UV−B照射(50mJ/cm2)を行い、その後、EpiLife−KG2で必要濃度に溶解した試料溶液を各シャーレに2mLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN(Wako社製;Cat.No.311−02501)にてtotal RNAを抽出し、それぞれのRNA量を分光光度計にて測定し、200ng/μLになるようにtotal RNAを調製した。
このtotal RNAを鋳型とし、エンドセリン−1(ET−1)、及び内部標準であるGAPDHのmRNAの発現量を測定した。検出はリアルタイムPCR装置(Smart Cycler(R)、Cepheid社製)を用いて、Takara SYBR ExScript RT−PCR Kit(Perfect Real Time)によるリアルタイム RT−PCR反応により行った。
ET−1の発現量は、「紫外線未照射、試料溶液無添加」、「紫外線照射、試料溶液無添加」、及び「紫外線照射、試料溶液添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総RNA標品を基にして、GAPDHの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、試料溶液無添加」の補正値を100とした時の「紫外線照射、試料溶液無添加」、及び「紫外線照射、試料溶液添加」の補正値を算出した。
そして、得られた結果から、下記数式9によりET−1mRNA発現上昇抑制率を算出した。試料濃度10μg/mLでのET−1mRNA発現上昇抑制率を表10に示す。
<数式9>
エンドセリン−1(ET−1)mRNA発現上昇抑制率(%)
={(A−B)−(A−C)}/(A−B)×100
ただし、前記数式9中、Aは紫外線未照射、試料溶液無添加時の補正値、Bは紫外線照射、試料溶液無添加時の補正値、Cは紫外線照射、試料溶液添加時の補正値をそれぞれ表す。
−エラスターゼ活性阻害作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりエラスターゼ活性阻害作用を試験した。
まず、96穴マイクロプレートにて、0.2mol/LのTris−HCL緩衝液(pH8.0)で調製した各試料溶液50μL、及び20μg/mLのエラスターゼ・タイプIII溶液50μLを混合した。その後、上記緩衝液にて調製した0.4514mg/mLのN−SUCCINYL−ALA−ALA−ALA−p−NITROANILIDEを100μL添加して、25℃にて15分間反応させた。反応終了後、波長415nmにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。
そして、これらの結果から、下記数式10によりエラスターゼ活性阻害率を算出した。試料濃度400μg/mLでのエラスターゼ活性阻害率を表11に示す。
エラスターゼ活性阻害率(%)=[1−(C−D)/(A−B)]×100
ただし、前記数式10中、Aは、試料溶液無添加、酵素添加での波長415nmにおける吸光度を表す。Bは、試料溶液無添加、酵素無添加での波長415nmにおける吸光度を表す。Cは、試料溶液添加、酵素添加での波長415nmにおける吸光度を表す。Dは、試料溶液添加、酵素無添加での波長415nmにおける吸光度を表す。
−マトリックスメタロプロテアーゼ−1(MMP−1)活性阻害作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、以下のようにして、マトリックスメタロプロテアーゼ−1(MMP−1)活性阻害作用を試験した。この試験方法は、Wunsch and Heidrich法を一部改変したものである。
蓋付試験管にて、20mmol/mLの塩化カルシウム含有0.1mol/LのTris−HCl緩衝液(pH7.1)に溶解した各試料溶液50μL、MMP−1溶液50μL、及びPz−peptide溶液400μLを混合し、37℃にて30分間反応させた後、25mmol/Lのクエン酸溶液1mLを加え反応を停止した。その後、酢酸エチル5mLを加え、激しく振とうした。これを遠心分離(1600×g、10分)し、酢酸エチル層の波長320nmにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。
なお、MMP−1としては、COLLAGENASE Type IV from Clostridium histolyticum(シグマ社製)を使用した。
Pz−peptideとしては、Pz−Pro−Leu−Gly−Pro−D−Arg−OH(BACHEM Fenichemikalien AG社製)を使用した。
そして、得られた結果から、下記数式11によりMMP−1活性阻害率を算出した。試料濃度400μg/mLでのMMP−1活性阻害率を表12に示す。
<数式11>
MMP−1活性阻害率(%)={1−(C−D)/(A−B)}×100
ただし、前記数式11中、Aは試料溶液無添加、酵素添加での波長320nmにおける吸光度、Bは試料溶液無添加、酵素無添加での波長320nmにおける吸光度、Cは試料溶液添加、酵素添加での波長320nmにおける吸光度、Dは試料溶液添加、酵素無添加での波長320nmにおける吸光度を表す。
−マトリックスメタロプロテアーゼ−14(MMP−14)活性阻害作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、以下のようにして、マトリックスメタロプロテアーゼ−14(MMP−14)活性阻害作用を試験した。
96穴マイクロプレートにて、50mmol/LのHEPES、10mmol/LのCaCl2、0.05質量%のBrij−35、1mmol/LのDTNB〔5,5’−dithiobis(2−nitoro−benzoic acid〕緩衝液(pH7.5)で調製したMMP−14溶液20μL、及び50mmol/LのHEPES、10mmol/LのCaCl2、0.05質量%のBrij−35、1mmol/LのDTNB〔5,5’−dithiobis(2−nitoro−benzoic acid〕緩衝液で調製した各試料溶液20μLを混合した。37℃にて45分間反応させた後、10μLの基質溶液を添加し、反応を開始した。基質分解産物のメルカプト基と緩衝液中のDTNBとの反応生成物である2−nitoro−5−thiobenzoic acidの量を波長412nmで30分間の吸光度を測定し、1分間当たりの生成量に基づいて30分間の傾斜度の値を求めた。同様の方法で空試験を行い補正した。
MMP−14としては、Enzyme(Human,Recombinant) From:E.coli recombinant human MMP−14 catalytic domain(Biomol社製)を用いた。
基質としては、thiopeptide(Ac−PLG−[2−mercapto−4−methyl−pentanoyl]−LG−OC2H5)(Biomol社製)を用いた。
そして、得られた結果から、下記数式12により、MMP−14活性阻害率を算出した。試料濃度400μg/mLでのMMP−14活性阻害率を表13に示す。
<数式12>
MMP−14活性阻害率(%)=(A−B)/A×100
ただし、前記数式12中、Aは試料溶液無添加時の30分間における傾斜度の値、Bは試料溶液添加時の30分間における傾斜度の値を表す。
−エストロゲン様作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりエストロゲン様作用を試験した。
ヒト乳癌由来細胞(MCF−7)を10%の牛胎児血清(FBS)、1質量%のNEAA及び1mmol/Lのピルビン酸ナトリウムを含有するMEMを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を活性炭処理した10%のFBS、1質量%のNEAA、及び1mmol/Lのピルビン酸ナトリウムを含有するフェノールレッド不含MEM(T−MEM)を用いて3.0×104cells/mLの濃度に希釈した後、48穴マイクロプレートに1穴あたり450μLずつ播種し、細胞を定着させるため培養した。6時間後(0日目)にT−MEMで終濃度の10倍に調製した各試料溶液を各穴に50μLずつ添加し、培養を続けた。3日目に培地を抜き、T−MEMで終濃度に調製した試料溶液を各穴に500μL添加し、更に培養を続けた。
エストロゲン様作用は、MTTアッセイを用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、1質量%のNEAA、1mmol/Lのピルビン酸ナトリウムを含有するMEMに終濃度0.4mg/mLで溶解したMTT〔3−(4,5−Dimethyl−2−thiazolyl)−2,5−diphenyl−2H−tetrazolium Bromide〕を各穴に200μLずつ添加した。2時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを2−プロパノール200μLで抽出した。抽出後、波長570nmにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長650nmにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。ポジティブコントロールとして、10−9mol/Lのエストラジオールを使用した。
そして、得られた測定結果から、エストロゲン様作用(エストロゲン依存性増殖作用)率を下記数式13から算出した。試料濃度50μg/mLでのエストロゲン様作用率(%)を表14に示す。
エストロゲン様作用率(%)=(A/B)×100
ただし、前記数式13において、Aは、試料溶液添加の場合の吸光度を表す。Bは、試料溶液無添加の場合の吸光度を表す。
−皮膚線維芽細胞増殖促進作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により皮膚線維芽細胞増殖促進作用を試験した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞(NB1RGB)を10%の牛胎児血清(FBS)含有α−MEMを用いて培養後、トリプシン処理により回収した。回収した細胞を5%のFBS含有α−MEMで7.0×104cells/mLの濃度に希釈後、96穴マイクロプレートに1穴当たり100μL播種し、一晩培養した。
培養終了後、5%のFBS含有α−MEMに溶解した試料溶液(濃度:400μg/mL)を各穴に100μL添加し、3日間培養した。
次いで、皮膚線維芽細胞増殖促進作用は、MTTアッセイ法を用いて測定した。具体的には、各穴から100μLずつ培地を抜き、終濃度5mg/mLでPBS(−)に溶解したMTT〔3−(4,5−Dimethyl−2−thiazolyl)−2,5−diphenyl−2H−tetrazolium Bromide〕を各穴に20μLずつ添加した。4.5時間培養後に、10質量%のSDSを溶解した0.01mol/L塩酸溶液を各穴に100μL添加し、一晩培養後、波長570nmにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長650nmにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様の方法で空試験を行い補正した。
そして、得られた測定結果から、下記数式14により試料濃度200μg/mLの皮膚線維芽細胞増殖促進率を算出した。結果を表15に示す。
<数式14>
皮膚線維芽細胞増殖促進率(%)=(St−Sb)/(Ct−Cb)×100
ただし、前記数式14中、Stは試料溶液を添加した細胞での吸光度、Sbは試料溶液を添加した空試験の吸光度、Ctは試料溶液を添加しない細胞での吸光度、Cbは試料溶液を添加しない空試験の吸光度、をそれぞれ表す。
−毛乳頭細胞増殖促進作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法により毛乳頭細胞増殖促進作用を試験した。
正常ヒト頭髪毛乳頭細胞(TOYOBO社製、CA60205)を、毛乳頭細胞増殖培地(TOYOBO社製、TPGM−250)を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞は10%FBS(Fetal Bovine Serum)含有DMEM(Dulbecco’s modified minimal essential medium)を用いて1.0×104cells/mLの濃度に希釈した後、コラーゲンコートした96穴プレートに1穴当り200μL播種し、3日間培養した。培養後、培地を抜き、無血清DMEMに溶解した試料溶液を各穴に200μL添加し、更に4日間培養した。
毛乳頭細胞増殖作用はMTTアッセイを用いて測定した。具体的には、培養終了後、培地を抜き、終濃度0.4mg/mLで無血清のDMEMに溶解したMTT((3−(4,5−Dimethyl−2−thiazolyl)−2,5−diphenyltetrazolium Bromide、同仁化学研究所製)を各穴に100μL添加した。2時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを2−プロパノール100μLで抽出した。抽出後、波長570nmにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長650nmにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。そして、下記数式15に従い毛乳頭細胞増殖促進率を算出した。試料濃度25μg/mL、6.25μg/mL、及び1.56μg/mLでの毛乳頭細胞増殖促進率を表16に示す。
<数式15>
毛乳頭細胞増殖促進率(%)=(A/B)×100
ただし、前記数式15中、Aは試料溶液を添加した時の吸光度を表す。Bは試料溶液を添加しない時の吸光度を表す。
−テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、以下のようにして、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用を試験した。
まず、秤量蓋付V底試験管にて、プロピレングリコールで調製した4.2mg/mLのテストステロン20μL、及び1mg/mLのNADPH含有5mmol/mLのTris−HCl緩衝液(pH7.13)825μLを混合した。これに、各試料溶液80μL、及びラット肝ホモジネート(S−9)75μLを加え、再び混合し、37℃にて30分間反応させた後、塩化メチレン1mLを加えて反応を停止した。これを遠心分離(1600×g、10分間)し、塩化メチレン層を下記の条件でガスクロマトグラフィー分析した。また、同様の方法で空試験を行った。
予め、3α−アンドロスタンジオール、ジヒドロテストステロン(DHT)、及びテストステロンの標準品の塩化メチレン溶液を同様にガスクロマトグラフィー分析し、これら3つの化合物の精秤量とピーク面積よりピーク面積あたりの化合物量を算出しておき、ラット肝ホモジネート(S−9)による反応後の3α−アンドロスタンジオール、ジヒドロテストステロン(DHT)、及びテストステロンのピーク面積あたりの濃度をそれぞれ求めた(下記数式16参照)。その後、下記数式17に従って、各試料溶液の変換率を求めた。得られた変換率に基づいて、下記数式18からテストステロン5α−リダクターゼ活性阻害率を求めた。試料濃度3000μg/mLの時の結果を表17に示す。
濃度(%)=(試料溶液のピーク面積×標準品濃度)/標準品のピーク面積
変換率(%)=(A+B)/(A+B+C)
ただし、前記数式17中、Aは、3α−アンドロスタンジオールの濃度を表す。Bは、ジヒドロテストステロン(DHT)の濃度を表す。Cは、テストステロンの濃度を表す。
テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害率(%)=(1−E/D)×100
ただし、前記数式18中、Dは、空試験での変換率を表す。Eは、試料溶液添加での変換率を表す。
・使用機器:Shimadzu GC−7A(株式会社島津製作所製)
・カラム:DB−1701(直径0.53mm×30m、膜厚:1.0μm)
・カラム温度/注入温度:240℃/300℃
・検出器:FID
・キャリアガス:窒素ガス
−アンドロゲンレセプター拮抗作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、下記の試験法によりアンドロゲンレセプター拮抗作用を試験した。
まず、マウス自然発生乳がん(シオノギ癌、SC115)よりクローニングされたSC−3細胞を2%の活性炭処理牛胎児血清(FBS)、及び10−8mol/Lのテストステロン含有MEM(MEM/2)を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を1.0×105cells/mLの濃度に活性炭処理FBS含有MEM(MEM/2)で希釈し、96穴マイクロプレートに1穴当たり100μLずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、10−9mol/Lのジヒドロテストステロン(DHT)を含む0.5質量%のBSA含有Ham F12+MEM(HMB)に溶解した試料溶液を100μL添加し、48時間培養した。その後、終濃度0.4g/mLで活性炭処理FBS含有MEM/2に溶解したMTTを各穴に100μL添加した。2時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを2−プロパノール200μLで抽出した。抽出後、波長570nmにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長650nmにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。空試験として、HMBのみで培養した細胞を、陽性対照として10−9mol/LのDHTのみを含有したHMBで培養した細胞を用い、同様の方法で試験を行って補正した。
そして、これらの結果から、下記数式19により、アンドロゲンレセプター拮抗率を算出した。試料濃度50μg/mLでのアンドロゲンレセプター拮抗率(%)を表18に示す。
<数式19>
アンドロゲンレセプター拮抗率(%)=[1−(C−D)/(A−B)]×100
ただし、前記数式19中、Aは、DHT添加、試料溶液無添加での570nm〜650nmにおける吸光度を表す。Bは、DHT無添加、試料溶液無添加での570nm〜650nmにおける吸光度を表す。Cは、DHT添加、試料溶液添加での570nm〜650nmにおける吸光度を表す。Dは、DHT無添加、試料溶液添加での570nm〜650nmにおける吸光度を表す。
−サイクリックAMPホスホジエステラーゼ活性阻害作用試験−
製造例1〜3の各抽出物を試料として用い、以下のようにして、サイクリックAMPホスホジエステラーゼ活性阻害作用を試験した。
まず、5mmol/Lの塩化マグネシウム含有50mmol/LのTris−HCl緩衝液(pH7.5)0.2mLに、2.5mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)溶液0.1mL、及び0.1mg/mLのホスホジエステラーゼ溶液0.1mL、各試料溶液0.05mLを加え、37℃で5分間予備反応した。これに0.5mg/mLのcAMP溶液0.05mLを加え、37℃で60分間反応した。3分間沸騰水浴上で煮沸することにより反応を停止した。これを遠心分離(2260×g、10分間、4℃)し、上清を試料反応液として、下記の条件でHPLC分析した。また同様の方法で空試験を行い補正した。
〔HPLC条件〕
・カラム:Wakosil C18−ODS 5μm
・移動相:1mmol/LのTBAP in 25mmol/LのKH2PO4:CH3CN=90:10
・流速:1.0mL/min
・検出:UV、260nm
<数式20>
分解率(%)=(A−B)/A×100
ただし、前記数式20中のBは、B1又はB2のいずれかを表す。
<数式21>
ホスホジエステラーゼ活性阻害率(%)=(C−D)/C×100
−乳液−
下記組成から乳液を常法により製造した。
・製造例1の千里香の水抽出物・・・0.10g
・ホホバオイル・・・4.00g
・1,3−ブチレングリコール・・・3.00g
・ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E.O.)・・・2.50g
・オリーブオイル・・・2.00g
・スクワラン・・・2.00g
・セタノール・・・2.00g
・モノステアリン酸グリセリル・・・2.00g
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20E.O.)・・・2.00g
・パラオキシ安息香酸メチル・・・0.15g
・黄杞エキス・・・0.10g
・グリチルリチン酸ジカリウム・・・0.10g
・イチョウ葉エキス・・・0.10g
・コンキオリン・・・0.10g
・オウバクエキス・・・0.10g
・カツミレエキス・・・0.10g
・香料・・・0.05g
・精製水・・・残部(合計100.00g)
−化粧水−
下記組成から化粧水を常法により製造した。
・製造例2の千里香の50質量%エタノール抽出物・・・0.10g
・グリセリン・・・3.00g
・1,3−ブチレングリコール・・・3.00g
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20E.O.)・・・2.00g
・パラオキシ安息香酸メチル・・・0.15g
・クエン酸・・・0.10g
・クエン酸ソーダ・・・0.10g
・油溶性甘草エキス・・・0.10g
・海藻エキス・・・0.10g
・クジンエキス・・・0.10g
・キシロビオースミクスチャー・・・0.05g
・香料・・・0.05g
・精製水・・・残部(合計:100.00g)
−クリーム−
下記組成からクリームを常法により製造した。
・製造例3の千里香のエタノール抽出物・・・0.10g
・スクワラン・・・10.00g
・1,3−ブチレングリコール・・・6.00g
・流動パラフィン・・・5.00g
・サラシミツロウ・・・4.00g
・セタノール・・・3.00g
・モノステアリン酸グリセリル・・・3.00g
・ラノリン・・・2.00g
・オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(20E.O.)・・・1.50g
・パラオキシ安息香酸メチル・・・1.50g
・ステアリン酸・・・1.00g
・酵母抽出液・・・0.10g
・シソ抽出液・・・0.10g
・シナノキ抽出液・・・0.10g
・ジユ抽出液・・・0.10g
・香料・・・0.10g
・精製水・・・残部(合計:100.00g)
−パック−
下記組成からパックを常法により製造した。
・製造例1の千里香の水抽出物・・・0.20g
・ポリビニルアルコール・・・15.00g
・エタノール・・・10.00g
・プロピレングリコール・・・7.00g
・ポリエチレングリコール・・・3.00g
・セージ抽出液・・・0.10g
・トウキ抽出液・・・0.10g
・ニンジン抽出液・・・0.10g
・パラオキシ安息香酸エチル・・・0.05g
・香料・・・0.05g
・精製水・・・残部(合計:100.00g)
−ヘアトニック−
下記組成の育毛作用を有するヘアトニックを、常法により製造した。
・塩酸ピリドキシン・・・0.1g
・レゾルシン・・・0.01g
・D−パントテニルアルコール・・・0.1g
・グリチルリチン酸ジカリウム・・・0.1g
・l−メントール・・・0.05g
・1,3−ブチレングリコール・・・4.0g
・ニンジンエキス・・・0.5g
・エタノール・・・25.0g
・製造例2の千里香の50質量%エタノール抽出物・・・0.2g
・香料・・・適量
・精製水・・・残部(全量を100.0gとする)
−シャンプー−
下記組成の育毛作用を有するシャンプー(クリームシャンプー)を、常法により製造した。
・ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム・・・30.0g
・ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸アンモニウム・・・20.0g
・ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン・・・6.0g
・ヤシ油脂肪酸モジエタノールアミド・・・4.0g
・ジステアリン酸エチレングリコール・・・2.0g
・防腐剤(パラオキシ安息香酸メチル)・・・0.15g
・製造例1の千里香の水抽出物・・・0.2g
・ムクロジエキス・・・0.2g
・黄杞エキス・・・0.5g
・オウバクエキス・・・0.3g
・ローズマリーエキス・・・0.5g
・香料・・・0.01g
・1,3−ブチレングリコール・・・3.0g
・精製水・・・残部(全量を100.0gとする)
−リンス−
下記組成の育毛作用を有するリンスを、常法により製造した。
・塩化ステアリルトリメチルアンモニウム・・・1.5g
・ポリオキシエチレンセチルエーテル・・・1.0g
・セチルアルコール・・・2.0g
・オクチルドデカノール・・・1.0g
・カチオン化セルロース・・・0.5g
・プロピレングリコール・・・5.0g
・製造例1の千里香の水抽出物・・・0.2g
・ムクロジエキス・・・0.2g
・黄杞エキス・・・0.5g
・オウバクエキス・・・0.3g
・ローズマリーエキス・・・0.5g
・香料・・・3.0g
・精製水・・・残部(全量を100.0gとする)
−リンス−
下記組成の育毛作用を有するリンスを、常法により製造した。
・塩化ステアリルトリメチルアンモニウム・・・1.5g
・ポリオキシエチレンセチルエーテル・・・1.0g
・セチルアルコール・・・2.0g
・オクチルドデカノール・・・1.0g
・カチオン化セルロース・・・0.5g
・プロピレングリコール・・・5.0g
・製造例3の千里香のエタノール抽出物・・・0.2g
・ムクロジエキス・・・0.2g
・黄杞エキス・・・0.5g
・オウバクエキス・・・0.3g
・ローズマリーエキス・・・0.5g
・香料・・・3.0g
・精製水・・・残部(全量を100.0gとする)
−錠剤状栄養補助食品−
下記の混合物を打錠して、錠剤状栄養補助食品を製造した。
・製造例1の千里香の水抽出物・・・30g
・粉糖(ショ糖)・・・178g
・ソルビット・・・10g
・グリセリン脂肪酸エステル・・・12g
−顆粒状栄養補助食品−
下記の混合物を顆粒状に形成して、栄養補助食品を製造した。
・製造例2の千里香の50質量%エタノール抽出物・・・20g
・ビートオリゴ糖・・・1000g
・ビタミンC・・・167g
・ステビア抽出物・・・10g
−顆粒状栄養補助食品−
下記の混合物を顆粒状に形成して、栄養補助食品を製造した。
・製造例3の千里香のエタノール抽出物・・・20g
・ビートオリゴ糖・・・1000g
・ビタミンC・・・167g
・ステビア抽出物・・・10g
また、本発明の抗酸化剤、抗老化剤、抗炎症剤、育毛剤、抗肥満剤、及びエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制剤の少なくともいずれかを添加した美容用飲食品は、経口摂取によっても優れた抗酸化作用、抗老化作用、抗炎症作用、育毛作用、抗肥満作用、及びエンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用の少なくともいずれかを有し、安全性にも優れているので、例えば、健康食品、栄養補助食品などに幅広く用いられる。
Claims (4)
- 千里香の抽出物を含有することを特徴とする育毛剤。
- 毛乳頭細胞増殖促進作用、テストステロン5α−リダクターゼ活性阻害作用、及びアンドロゲンレセプター拮抗作用の少なくともいずれかを有する請求項1に記載の育毛剤。
- 千里香の抽出物を含有することを特徴とする抗肥満剤。
- サイクリックAMP−ホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有する請求項3に記載の抗肥満剤。
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