JP6709587B2 - 皮膚化粧料および頭髪化粧料 - Google Patents

Description

本発明は、抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害剤、皮膚化粧料、頭髪化粧料および飲食品に関するものである。

グルタチオンは、グルタミン酸、システインおよびグリシンの３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、細胞内の主要なシステイン残基を有する化合物である。細胞内におけるグルタチオンは、ラジカルの捕捉、酸化還元による細胞機能の調節、異物代謝、各種酵素のＳＨ供与体としての機能を果たすものであり、活性酸素等に対する抗酸化成分としても知られている。その作用発現は、システイン残基に由来すると考えられている。しかしながら、過剰な酸化ストレスや異物の付加、加齢などにより、細胞内のグルタチオン量が欠乏または低下することが報告されており、このことが細胞の酸化ストレスに対する防御能を低下させ、細胞のＤＮＡおよびタンパク質等の構成成分にダメージを与える一因であると考えられている。

このような、細胞内のグルタチオン量の低下または欠乏が病態と関連することが知られている疾患として、酸化ストレスが原因となって誘発される疾患群のほか、肝障害（アルコールの多飲、または重金属や化学物質等の異物の摂取が原因となる）等が知られている。すなわち、グルタチオンの産生を促進することは、細胞の酸化ストレスに対する防御能を高め、細胞内のグルタチオン量が低下または欠乏することに起因する上記の疾患群を予防ないし治療することができると考えられる。グルタチオン産生促進作用を有するものとして、リクイリチゲニン（特許文献１参照）等が知られている。

表皮は、外部刺激を緩和し、水分等の体内成分の逸失を制御する働きをしており、最下層である基底層から始まって、有棘層、顆粒層、角質層へと連なる４層構造から構成されている。各層に存在する大部分の細胞は、基底層から分化した角化細胞である。基底層で分裂、増殖した角化細胞は、有棘層、顆粒層を通過しながら分化し角質細胞となって、強固な架橋結合をもったケラチン蛋白線維で構成された角質層を構成し、最終的には垢として角質層から脱落する。

角質層は皮膚の最外殻に存在しており、外界からの刺激に対する物理的なバリアとしての役割を果たしている。皮膚ではこのバリア機能を持たせるため、角化細胞が基底層で産生されてから垢となって剥がれ落ちるまでのサイクル（角化）を通常４週間の周期で繰り返し、表皮の新陳代謝を行っている。しかしながら、この角質層も加齢によって新陳代謝機能が衰え、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚トラブルを発生することになる。そのため、角化細胞の増殖を促進し、肌の新陳代謝機能を回復させることにより、こじわ、くすみ、色素沈着等の皮膚の老化を改善できるものと考えられる。従来、表皮角化細胞増殖促進作用を有するものとして、土貝母抽出物（特許文献２参照）等が知られている。

近年、皮膚の老化に伴う変化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ；Matrix metalloproteinases）の関与が指摘されている。このＭＭＰｓの中でも、ゼラチナーゼ群に属する酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）は、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンやラミニン５を分解する酵素として知られている。ＭＭＰ−２の発現および活性は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線による基底膜成分の減少、基底膜の構造変化の原因となり、皮膚におけるシワやたるみの形成等の大きな要因となることが明らかとなっている（非特許文献１参照）。ＭＭＰ−２の活性が亢進すると、細胞外マトリックスが破壊される。細胞外マトリックスの破壊は、癌の浸潤・転移、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周病、加齢黄斑変性症等、様々な疾患と関連することが知られている。さらに、ＭＭＰ−２は、血管内皮細胞下に存在する基底膜を構成するＩＶ型コラーゲン等を分解し、分解された血管内皮細胞は間質へ遊走していき、間質中で増殖し、管腔を形成し、新生血管を構築していく。そして、この新生された血管が腫瘍細胞に到達して、栄養源と酸素とを腫瘍細胞に供給し、腫瘍が大きくなっていくことが知られている（非特許文献２参照）。

したがって、ＭＭＰ−２の活性を阻害することにより、基底膜成分の減少、基底膜の構造変化を抑制し、皮膚機能を改善することができるとともに、血管新生を抑制し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができると考えられる。ＭＭＰ−２阻害作用を有するものとしては、例えば、クロバナツルアズキからの抽出物（特許文献３参照）等が知られている。

セラミドは、表皮細胞の角化の過程においてセリンとパルミトイル−ＣｏＡとを基に、セラミド合成の律速酵素として知られるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）をはじめとする酵素の働きにより生成される。セラミドは、皮膚最外層を覆う角質細胞間脂質の主成分として特異的に存在し、皮膚本来が持つ生体と外界とのバリア膜としての機能維持に重要な役割を果たしている。

角質層の構造は、レンガとモルタルとに例えられ、１５層ほどに積み重なった角質細胞を細胞間脂質が繋ぎ止める形で強固なバリア膜を形成している。角質細胞は、アミノ酸を主成分とする天然保湿因子を細胞内に含有することによって水分を保持し、一方、角質細胞間脂質は、約５０％のセラミドを主成分とし、コレステロール、脂肪酸等の両親媒性脂質から構成されており、疎水性部分と親水性部分とが交互に繰り返される層板構造、いわゆるラメラ構造を特徴としている。

様々な内的・外的要因による皮膚のバリア機能の低下は、経表皮水分蒸散量を増加させ、皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等を惹き起こし、いわゆる乾燥肌に陥る。また、皮膚のバリア機能の低下は、皮膚の炎症を増大させ、外界からの様々な刺激に対する防御機能が低下するという悪循環に陥る。最近の研究において、加齢により、またはバリア障害として知られるアトピー性皮膚炎患者において、角質セラミド成分（いわゆる細胞間脂質）の減少や組成変化が報告されており（非特許文献３参照）、皮膚のバリア機能の維持、改善にセラミドが重要であることが広く知られるようになっている。皮膚のバリア機能を改善する方法として、セラミドを外部から補う方法（非特許文献４参照）や皮膚内部においてセラミド産生能を高める方法（非特許文献５参照）等が知られている。

皮膚細胞では、水チャンネルとして知られるアクアポリンが、細胞膜上に発現して、細胞間隙の水をはじめとする低分子物質を細胞内へ取り込む役割を担っていることが知られている。ヒトでは、１３種類のアクアポリン（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１２）の存在が知られている。表皮細胞においては、主としてＡＱＰ３が存在しており、水に加えて、水分保持作用に関与するグリセロールや尿素等の低分子化合物をも取り込む役割を担っていると考えられている。

しかしながら、ＡＱＰ３は加齢とともに減少し、このことが水分保持機能の低下の一因であることが示唆されているため、ＡＱＰ３の発現を促進することにより、加齢による水分保持能やバリア機能等を制御することが可能であると考えられる（非特許文献６参照）。ＡＱＰ３発現促進作用を有するものとして、例えば、スターフルーツの葉部からの抽出物（特許文献４参照）等が知られている。

皮膚においてメラニンは、紫外線から生体を保護する役目も果たしているが、過剰生成や不均一な蓄積は、皮膚の黒化やシミの原因となる。一般にメラニンは、色素細胞の中で生合成される酵素チロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、ついで５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成されるものとされている。したがって、皮膚の色黒（皮膚色素沈着症）、シミ、ソバカス等を予防、治療または改善するためには、メラニンの産生に関与するチロシナーゼの活性を阻害すること、またはメラニンの産生を抑制することが考えられる。

従来、皮膚色素沈着症、シミ、ソバカス等の予防、治療または改善には、ハイドロキノン等の化学合成品を有効成分とする美白剤を外用する処置が行われてきた。しかしながら、ハイドロキノン等の化学合成品は、皮膚刺激、アレルギー等の副作用のおそれがある。そこで、安全性の高い天然原料を有効成分とする美白剤の開発が望まれており、チロシナーゼ活性阻害作用を有するものとしては、例えば、ヤナギタデ抽出物（特許文献５参照）等が知られている。また、メラニン産生抑制作用を有するものとしては、例えば、サウスウレア（Saussurea）属植物からの抽出物（特許文献６参照）等が知られている。

多くのステロイドホルモンは産生臓器から分泌された分子型で受容体と結合してその作用を発現するが、アンドロゲンと総称される男性ホルモンの場合、例えば、テストステロンは標的臓器の細胞内に入ってテストステロン５α−レダクターゼにより５α−ジヒドロテストステロン（５α−ＤＨＴ）に還元されてから受容体と結合し、アンドロゲンとしての作用を発現する。

アンドロゲンは重要なホルモンであるが、それが過度に作用すると、男性型脱毛症、多毛症、脂漏症、座瘡（ニキビなど）、前立腺肥大症、前立腺腫瘍、男児性早熟等、さまざまな好ましくない症状を誘発する。そこで、従来から、これらの各種症状を改善するために過剰のアンドロゲンの作用を抑制する方法、具体的には、テストステロンを活性型５α−ＤＨＴに還元するテストステロン５α−レダクターゼの作用を阻害することにより、活性な５α−ＤＨＴが生じるのを抑制する方法や、テストステロンから生じた５α−ＤＨＴが受容体と結合するのを阻害することによりアンドロゲン活性を発現させない方法などが知られている。これまでに、テストステロン５α−レダクターゼ阻害作用やアンドロゲン受容体結合阻害作用を有するものとして、例えば、東紫蘇からの抽出物（特許文献７参照）等が知られている。

毛髪は、成長期、退行期および休止期からなる周期的なヘアサイクル（毛周期）に従って成長および脱落を繰り返している。このヘアサイクルのうち、休止期から成長期にかけての新たな毛包が形成されるステージが、発毛に最も重要であると考えられており、このステージにおける毛包上皮系細胞の増殖・分化に重要な役割を果たしているのが、毛乳頭細胞であると考えられている。毛乳頭細胞は、毛根近傍にある外毛根鞘細胞とマトリックス細胞とからなる毛包上皮系細胞の内側にあって、基底膜に包まれている毛根の根幹部分に位置する細胞であり、毛包上皮系細胞に働きかけてその増殖を促進する等、毛包上皮系細胞の増殖・分化および毛髪の形成において重要な役割を担っている（非特許文献７参照）。

このように、毛乳頭細胞は、毛包上皮系細胞の増殖・分化および毛髪の形成において重要な役割を果たしており、毛乳頭細胞の増殖を促進することで、脱毛症を予防ないし改善することができると考えられる。これまでに、毛乳頭細胞増殖促進作用を有するものとしては、例えば、ワイルドタイム抽出物（特許文献８参照）等が知られている。

炎症性疾患、例えば、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、アトピー性皮膚炎、その他肌荒れを伴う各種皮膚炎症性疾患、関節リウマチ、変形性関節症、喘息等の原因および発症機構は、多種多様である。その原因として、主にマクロファージから産生される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）によるもの、ヒアルロニダーゼの活性の亢進によるもの、ヒスタミンの遊離によるもの、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の活性の亢進によるものなどが知られている。

ＴＮＦ−αは、腫瘍を壊死させる因子として見出されたが、最近では腫瘍に対してだけでなく、正常細胞の機能を調節するメディエーター的な役割を担うサイトカインであると考えられている。ＴＮＦ−αは、炎症の初発から終息までの過程において重要な役割を担っているが、その持続的かつ過剰な産生は、皮膚を含む組織の障害を引き起こし、全身的には発熱やカケクシアの原因となり、炎症の悪化を引き起こす。したがって、病的な炎症においては、ＴＮＦ−αの過剰な産生を抑制することが重要となる。ＴＮＦ−α産生抑制作用を有するものとして、例えば、土貝母からの抽出物（前述した特許文献２参照）等が知られている。

ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の加水分解酵素である。体組織への親和性を保つヒアルロン酸塩は、含水系の中では紫外線、酸素等によって分解され、分子量の低下に伴って保水効果も減少する。また、ヒアルロン酸は、生体内において細胞間組織として存在し、血管透過性にも関与している。さらに、ヒアルロニダーゼは、肥満細胞中に存在するが、その活性化により起こる脱顆粒により遊離され、炎症系ケミカルメディエーターとして作用する。したがって、ヒアルロニダーゼの活性を阻害することで、保湿の強化および炎症の予防または軽減が期待される。ヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有するものとして、例えば、オスベッキア属植物からの抽出物（特許文献９参照）等が知られている。

ヒスタミン遊離は、肥満細胞内のヒスタミンが細胞外に遊離する現象であり、遊離されたヒスタミンが炎症反応を引き起こす。そのため、ヒスタミン遊離を阻害または抑制する物質により、アレルギー性疾患および炎症性疾患を予防または治療する試みがなされている。しかし、ヒスタミンの遊離を直接的に評価することは困難であり、ヒスタミンの遊離と同時に遊離されることが確認されているヘキソサミニダーゼの遊離を指標にヒスタミンの遊離を評価することができる。したがって、ヘキソサミニダーゼの遊離を抑制することにより、同時にヒスタミンの遊離も抑制でき、これにより炎症性疾患等の予防、治療または改善に効果があるものと考えられる。

また、ヒスタミンは局所伝達物質として細胞間の情報伝達を仲介しており、消化器官においては胃酸分泌を亢進し、中枢神経系における神経伝達物質として機能し、覚醒状態の維持に寄与することが知られている。ここで、ヒスタミン遊離が過剰となると、消化器官においては胃酸過多による潰瘍の原因となり、中枢神経系においては睡眠障害の一因となる。前述したように、ヘキソサミニダーゼの遊離を抑制することにより、同時にヒスタミンの遊離も抑制できることから、これにより、胃酸過多を原因とする胃潰瘍、睡眠障害等を予防、治療または改善できると考えられる。ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有するものとして、例えば、藤茶からの抽出物（特許文献１０参照）等が知られている。

炎症は、発赤、浮腫、発熱、痛み、機能障害等の症状を示す複雑な反応である。微視的に見ると、炎症は、血漿漏出を起こす血管反応、白血球の浸潤、炎症性細胞による組織破壊等の共通する反応からなり、発熱反応や痛覚過敏等の中枢神経系も関与する、全身反応も引き起こす場合もある。このような炎症の個々の反応には、プロスタグランジンが重要な役割を果たしており、この炎症時におけるプロスタグランジンの産生には、主として誘導型のシクロオキシゲナーゼであるシクロオキシゲナーゼ−２が関与することが明らかとなっている。このため、炎症反応の防止および予防を図る目的で、アスピリンに代表される多くのシクロオキシゲナーゼ阻害剤が用いられている（非特許文献８参照）。

近年、飽食や運動不足等の生活習慣が原因となって体脂肪が増加し、肥満が増えている。このような肥満の増加は、人間ばかりでなく、ペットや家畜においても見られる。肥満は、高脂血症や動脈硬化等の成人病の原因になるため、美容の面で問題となるばかりでなく、健康の面でも大きな問題となる。

ここで、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は、生体内の脂肪分解に関与することが知られている。ｃＡＭＰは生体内に存在するリパーゼを活性化し、活性化されたリパーゼによって脂肪が脂肪酸とグリセロールとに分解される。しかし、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼが活性化されるとｃＡＭＰの分解が誘発され、リパーゼの活性化が阻害される。そのため、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼの活性を阻害することにより細胞内におけるｃＡＭＰが増量し、脂肪の分解を促進することができるものと考えられる。

また、炎症反応を引き起こす血小板凝集は、血小板中のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の濃度と関係があり、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼによってｃＡＭＰが分解されてｃＡＭＰの濃度が低下すると、血小板は凝集しやすくなることが知られている。従って、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼの作用を抑制してｃＡＭＰ濃度の低下を防止すれば、血小板凝集を防止でき、これによりアレルギー性疾患や炎症性疾患等を予防、治療または改善できると考えられる。ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有するものとして、ツベイモシドＩ（特許文献１１参照）等が知られている。

肝臓は、腸で吸収された様々な栄養素を代謝、貯蔵する他、胆汁の生成や分泌、および解毒や排泄など、生命の維持に必要な多くの働きを行っており、ヒトにとって極めて重要な臓器である。しかし、肝臓は、不規則な生活、ストレス、ウイルス、薬物、アルコール、栄養不良、肝循環系障害などの様々な因子により、急性的または慢性的な障害が生じやすく、急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、黄疸、肝硬変などの疾患（肝機能障害）を起こす場合がある。

ここで、肝臓においてグルタチオンは、多様な酸化ストレスから肝細胞を保護するほか、薬物や反応性化合物等の有害物質と抱合体を形成してそれらが細胞外に排出されるなど、薬物代謝などの肝機能の発現に直接的に寄与している。しかし、グルタチオンの作用が発揮されることは、同時にグルタチオンが消費されることでもあり、実際にラットにおいてガラクトサミン等により肝障害を誘導すると、肝細胞内のグルタチオン量が減少することが知られている。そのため、肝臓において、各種ストレスや薬物等に起因するグルタチオン量の低下を抑制することができれば、肝臓の障害が抑えられ、ひいては肝機能の向上につながると考えられる。

ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（以下、「ＤＰＰＩＶ」ともいう。）は、セリンプロテアーゼの一つであって、Ｎ末端から２番目のプロリンまたはアラニンを認識し、そのＣ末端側を切断する酵素活性を有する。ＤＰＰＩＶは、腎臓、肝臓、腸管、胎盤等の組織の上皮および内皮細胞、ならびにＴ細胞の細胞表面に発現しており、その酵素活性等を介して様々な生理現象に関与すると考えられている。

ＤＰＰＩＶの基質として、インクレチンと呼ばれるホルモンが挙げられる。インクレチンは、栄養素の刺激により腸管から分泌され、血糖依存的に膵β細胞からインスリン分泌を促進するホルモンの総称であり、ＧＬＰ−１やＧＩＰ等が知られている。これらインクレチンは、血糖依存的なインスリン分泌の促進だけでなく、膵α細胞からのグルカゴン分泌の抑制、血圧の低下、胃排出の抑制、さらには視床下部に作用しての摂食抑制等の作用を有している（非特許文献９参照）。しかし、インクレチンはＤＰＰＩＶにより分解されるため、例えばＧＬＰ−１の生体内における半減期は１．５分程度であることが知られている。そのため、ＤＰＰＩＶの酵素活性を阻害することができれば、インクレチンの生体内における半減期を延長することができ、これにより、前述したインクレチンの作用を通じ２型糖尿病、肥満、高血圧症、インスリン抵抗性等の治療に有用であると期待されている。

また、ＤＰＰＩＶはＴ細胞活性化マーカーの一つであるＣＤ２６と同一であり、多くの免疫調節ペプチドを基質とし、その活性を制御することが知られている。そのため、ＤＰＰＩＶの活性を制御することにより、関節リウマチ等の自己免疫疾患や移植による拒絶反応等の免疫反応を制御し得ると考えられる。さらに、ＤＰＰＩＶは、いくつかの神経ペプチドや成長ホルモンの代謝；癌における浸潤、転移、血管新生等；ＨＩＶのリンパ球への感染等への関与が知られている。そのため、ＤＰＰＩＶの活性を阻害することにより、疼痛、神経変性疾患および神経精神疾患等の神経障害（例えば坐骨神経痛、アルツハイマー病、うつ病等）；成長ホルモン欠損症および成長ホルモンが治療に使用される疾患；癌（例えばＴ−細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、甲状腺癌、基底細胞癌、乳癌等）；ＨＩＶ感染症（ＡＩＤＳ）等の疾患を治療することができると考えられる。

なお、４−ビニルグアヤコールについては、フェルラ酸を含有する培地にてある種の乳酸菌を培養すると、４−ビニルグアヤコールが検出されることが知られている（非特許文献１０）。

特開２００９−２６９８８９号公報 特開２００６−０５６８５４号公報 特開２００７−２１７３５２号公報 特開２００９−１９１０３９号公報 特開２００４−０８３４８８号公報 特開２００２−２０１１２２号公報 特開２０１０−１８４９１５号公報 特開２００６−２１９４０７号公報 特開２００３−０５５２４２号公報 特開２００３−０１２５３２号公報 特開２００６−０５６８５５号公報

Nature，1996年，Vol.379，No.6563，p.335-339 「血管新生とマトリックスメタロプロテアーゼ」，第120回日本医学会シンポジウム記録集 血管新生の基礎と臨床，2001年12月13日，p.43-49 J. Dermatol.，1993年，Vol.20，No.1，p.1-6 「フレグランスジャーナル」，2004年，Vol.32，No.11，p.23-32 Br. J. Dermatol.，2000年，Vol.143，Issue 3，p.524-531 「フレグランスジャーナル」，2006年，Vol.34，No.10，p.19-23 Trends Genet.，1992年，Vol.8，Issue 2，p.55-61 「薬理学アトラス」，福原武彦監訳，文光堂，1995年，p.184 「日本薬理学雑誌」，2005年，Vol.125，No.6，p.379-384 J. Agric. Food Chem.，2009年，Vol.57，No.2，pp.490-494

本発明は、天然物由来の化合物の中から抗老化作用、美白作用、育毛作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、抗肥満作用、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害作用を有するものを見出し、それを有効成分とする抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害剤、ならびに当該化合物を配合した皮膚化粧料、頭髪化粧料および飲食品を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害剤は、４−ビニルグアヤコールを有効成分として含有することを特徴とする。また、本発明の皮膚化粧料、頭髪化粧料および飲食品は、４−ビニルグアヤコールを配合したことを特徴とする。

本発明によれば、４−ビニルグアヤコールを有効成分として含有させることにより、作用効果に優れた抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害剤を提供することができる。さらに、４−ビニルグアヤコールを配合することにより、上記作用に優れた皮膚化粧料、頭髪化粧料および飲食品を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害剤は、４−ビニルグアヤコールを有効成分として含有するものである。また、本実施形態の皮膚化粧料、頭髪化粧料および飲食品は、４−ビニルグアヤコールが配合されるものである。

４−ビニルグアヤコール（4-vinylguaiacol）は、下記式で表される化学構造を有する化合物である。

４−ビニルグアヤコールは、例えば、フェルラ酸もしくはフェルラ酸エチル等のフェルラ酸誘導体、またはフェルラ酸を含有する組成物（例えば、植物の破砕物または抽出物など）を、フェノール酸脱炭酸酵素を有する微生物により醗酵させ、フェルラ酸を４−ビニルグアヤコールに変換した後、得られた醗酵物を抽出・単離・精製することにより製造することができる。フェルラ酸を含有する組成物としては、例えば、コーヒー、コムギ、トウモロコシ、トマト、マテ、ヨモギ、ゴボウ等の等の植物の破砕物および抽出物などが挙げられる。さらには、フェルラ酸は木本植物におけるリグニンの構成成分であるため、フェルラ酸を含有する組成物として、リグニンまたはこれを含有する組成物を利用してもよい。一方、フェノール酸脱炭酸酵素を有する微生物としては、例えば、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus brevis、Pediococcus pentosaceus等の乳酸菌；Saccharomyces cerevisiae等の酵母；などが挙げられる。

上記植物または醗酵物などから４−ビニルグアヤコールを抽出・単離・精製する方法は特に限定されず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出処理は、抽出原料としての上記植物または醗酵物を乾燥した後、そのまままたは粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供すればよい。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。

抽出溶媒としては、極性溶媒を使用することが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独でまたは２種以上を組み合わせて、室温または溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。

抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。

抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。

２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を抽出溶媒として使用する場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比が９：１〜１：９（容量比）であることが好ましく、７：３〜２：８（容量比）であることがさらに好ましい。また、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水と低級脂肪族ケトンとの混合比が９：１〜２：８（容量比）であることが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水と多価アルコールとの混合比が５：５〜１：９（容量比）であることが好ましい。

抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温または還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。

以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物または当該抽出液の乾燥物から４−ビニルグアヤコールを単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、抽出物を展開溶媒に溶解し、シリカゲルやアルミナ等の多孔質物質、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体やポリメタクリレート等の多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、４−ビニルグアヤコールを含む画分を回収する方法等が挙げられる。この場合、展開溶媒は使用する固定相に応じて適宜選択すればよいが、例えば固定相としてシリカゲルを用いた順相クロマトグラフィーにより抽出物を分離する場合、展開溶媒としてはクロロホルム：メタノール＝９５：５等が挙げられる。さらに、カラムクロマトグラフィーにより得られた４−ビニルグアヤコールを含む画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。

〔抗老化剤，美白剤，育毛剤，抗男性ホルモン剤，抗炎症剤，抗肥満剤，サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤，グルタチオン低下抑制剤，ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性阻害剤〕
以上のようにして得られる４−ビニルグアヤコールは、優れた抗老化作用、美白作用、育毛作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、抗肥満作用、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）ホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）活性阻害作用を有しているため、抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびＤＰＰＩＶ活性阻害剤の有効成分として用いることができる。本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびＤＰＰＩＶ活性阻害剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品等の幅広い用途に使用することができる。

なお、本実施形態に係る抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびＤＰＰＩＶ活性阻害剤の有効成分として、単離した４−ビニルグアヤコールに替えて、４−ビニルグアヤコールを含有する組成物を用いてもよい。ここで、本実施形態における「４−ビニルグアヤコールを含有する組成物」には、４−ビニルグアヤコールを含有する植物を抽出原料として得られる抽出物、４−ビニルグアヤコールを含有する醗酵物、および当該醗酵物を抽出原料として得られる抽出物が含まれる。また、「抽出物」には、抽出処理により得られる抽出液、当該抽出液の希釈液もしくは濃縮液、または当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物が含まれる。

本実施形態に係る抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびＤＰＰＩＶ活性阻害剤の有効成分として、４−ビニルグアヤコールを含有する組成物を用いる場合は、精製して４−ビニルグアヤコールの純度を高めたものを使用することが好ましい。４−ビニルグアヤコールの純度を高めたものを有効成分として使用することによって、より一層作用効果に優れた抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびＤＰＰＩＶ活性阻害剤を得ることができる。

４−ビニルグアヤコールが有する抗老化作用は、例えば、グルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）活性阻害作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）ｍＲＮＡ発現促進作用およびアクアポリン３（ＡＱＰ３）ｍＲＮＡ発現促進作用からなる群より選択される１または２以上の作用に基づいて発揮される。ただし、４−ビニルグアヤコールが有する抗老化作用は、上記作用に基づいて発揮される抗老化作用に限定されるものではない。

また、４−ビニルグアヤコールは、そのグルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用またはＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を利用して、それぞれグルタチオン産生促進剤、表皮角化細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−２活性阻害剤、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤またはＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として使用してもよい。

４−ビニルグアヤコールが有する美白作用は、例えば、チロシナーゼ活性阻害作用および／またはメラニン産生抑制作用に基づいて発揮される。ただし、４−ビニルグアヤコールが有する美白作用は、上記作用に基づいて発揮される美白作用に限定されるものではない。また、４−ビニルグアヤコールは、そのチロシナーゼ活性阻害作用またはメラニン産生抑制作用を利用して、それぞれチロシナーゼ活性阻害剤またはメラニン産生抑制剤の有効成分として使用してもよい。

４−ビニルグアヤコールが有する育毛作用は、例えば、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用および毛乳頭細胞増殖促進作用からなる群より選択される１または２以上の作用に基づいて発揮される。ただし、４−ビニルグアヤコールが有する育毛作用は、上記作用に基づいて発揮される育毛作用に限定されるものではない。また、４−ビニルグアヤコールは、そのテストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用または毛乳頭細胞増殖促進作用を利用して、それぞれテストステロン５α−レダクターゼ活性阻害剤、アンドロゲン受容体結合阻害剤または毛乳頭細胞増殖促進剤の有効成分として使用してもよい。

４−ビニルグアヤコールが有する抗男性ホルモン作用は、例えば、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用および／またはアンドロゲン受容体結合阻害作用に基づいて発揮される。ただし、４−ビニルグアヤコールが有する抗男性ホルモン作用は、上記作用に基づいて発揮される抗男性ホルモン作用に限定されるものではない。

４−ビニルグアヤコールが有する抗炎症作用は、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性阻害作用からなる群より選択される１または２以上の作用に基づいて発揮される。ただし、４−ビニルグアヤコールが有する抗炎症作用は、上記作用に基づいて発揮される抗炎症作用に限定されるものではない。また、４−ビニルグアヤコールは、そのＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用またはＣＯＸ−２活性阻害作用を利用して、それぞれＴＮＦ−α産生抑制剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤またはＣＯＸ−２活性阻害剤の有効成分として使用してもよい。

４−ビニルグアヤコールが有する抗肥満作用は、例えば、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用に基づいて発揮される。ただし、４−ビニルグアヤコールが有する抗肥満作用は、上記作用に基づいて発揮される抗肥満作用に限定されるものではない。

本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤は、４−ビニルグアヤコールまたは４−ビニルグアヤコールを含有する組成物のみからなるものでもよいし、４−ビニルグアヤコールまたは４−ビニルグアヤコールを含有する組成物を製剤化したものでもよい。

本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびＤＰＰＩＶ活性阻害剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびＤＰＰＩＶ活性阻害剤は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料、頭髪化粧料等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。

本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤を製剤化した場合、４−ビニルグアヤコールまたは４−ビニルグアヤコールを含有する組成物の含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。

なお、本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤は、必要に応じて、抗老化作用、美白作用、育毛作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用またはＤＰＰＩＶ活性阻害作用を有する他の天然抽出物等を、４−ビニルグアヤコールまたは４−ビニルグアヤコールを含有する組成物とともに配合して有効成分として用いることができる。

本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤の患者に対する投与方法としては、経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防ないし治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。

本実施形態の抗老化剤は、有効成分である４−ビニルグアヤコールが有するグルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用およびＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用からなる群より選択される１または２以上の作用を通じて、皮膚のシワの形成、弾力性の低下、保湿機能の低下等の皮膚の老化症状を予防、治療または改善することができる。ただし、本実施形態の抗老化剤は、これらの用途以外にもグルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用またはＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

例えば、前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述したグルタチオン産生促進剤は、４−ビニルグアヤコールが有するグルタチオン産生促進作用を通じて、肝障害（アルコールの多飲，または重金属や化学物質等の異物の摂取が原因となる）等の細胞内グルタチオン量の低下または欠乏が病態と関連することが知られている疾患などを予防、治療または改善することができる。

前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述したＭＭＰ−２活性阻害剤は、４−ビニルグアヤコールが有するＭＭＰ−２活性阻害作用を通じて、細胞外マトリックスの破壊が病態と関連していることが知られている疾患等（例えば、癌の浸潤・転移、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周病、加齢黄斑変性症等）の治療・予防の用途に使用することができる。また、本実施形態の抗老化剤またはＭＭＰ−２活性阻害剤は、そのＭＭＰ−２活性阻害作用により、血管新生を抑制し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。

前述した用途の他、本実施形態の抗老化剤または前述したＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤は、４−ビニルグアヤコールが有するＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、皮膚のバリア機能を強化し、肌荒れ、乾燥肌等のほか、乾燥性皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬等）を予防、治療または改善することができる。また、本実施形態の抗老化剤または前述したＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、４−ビニルグアヤコールが有するＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、加齢による水分保持能やバリア機能等を改善することができる。

本実施形態の美白剤は、有効成分である４−ビニルグアヤコールが有するチロシナーゼ活性阻害作用および／またはメラニン産生抑制作用を通じて、皮膚の黒化、シミ、ソバカス等の色素沈着を予防または改善することができる。ただし、本実施形態の美白剤は、これらの用途以外にもチロシナーゼ活性阻害作用またはメラニン産生抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

本実施形態の育毛剤は、有効成分である４−ビニルグアヤコールが有するテストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用および毛乳頭細胞増殖促進作用からなる群より選択される１種または２種以上の作用を通じて、男性型脱毛症、円形脱毛症、トリコチロマニア等の脱毛症等を予防、治療または改善することができ、特に男性型脱毛症の予防、治療または改善に好適である。ただし、本発明の育毛剤は、これらの用途以外にもテストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用または毛乳頭細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

例えば、本実施形態の育毛剤または前述した毛乳頭細胞増殖促進剤は、４−ビニルグアヤコールが有する毛乳頭細胞増殖促進作用を通じて、毛乳頭細胞を活性化し、毛包上皮系細胞の増殖・分化および毛髪の形成を促進することができるとともに、毛周期において成長期から退行期および休止期へと移行するのを防ぎ、成長期を延長させることができる。これにより、脱毛症を予防または改善することができる。また、本実施形態の育毛剤または前述した毛乳頭細胞増殖促進剤は、４−ビニルグアヤコールが有する毛乳頭細胞増殖促進作用を通じて、毛乳頭細胞を用いた毛髪再生等の再生医療分野への応用に使用することもできる。

本実施形態の抗男性ホルモン剤または前述したテストステロン５α−レダクターゼ活性阻害剤もしくはアンドロゲン受容体結合阻害剤は、有効成分である４−ビニルグアヤコールが有するテストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用および／またはアンドロゲン受容体結合阻害作用を通じて、男性ホルモンが関与する疾患、例えば、男性型脱毛症、多毛症、脂漏症、座瘡（ニキビなど）、前立腺肥大症、前立腺腫瘍、男児性早熟等を予防、治療または改善することができる。ただし、本発明の抗男性ホルモン剤は、これらの用途以外にもテストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用またはアンドロゲン受容体結合阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

本実施形態の抗炎症剤は、有効成分である４−ビニルグアヤコールが有するＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用およびＣＯＸ−２活性阻害作用からなる群より選択される１または２以上の作用を通じて、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、アトピー性皮膚炎、その他肌荒れに伴う各種皮膚炎症性疾患を予防、治療または改善することができる。ただし、本実施形態の抗炎症剤は、これらの用途以外にもＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用またはＣＯＸ−２活性阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

例えば、本実施形態の抗炎症剤または前述したＴＮＦ−α産生抑制剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤もしくはＣＯＸ−２活性阻害剤は、４−ビニルグアヤコールが有するＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用またはＣＯＸ−２活性阻害作用を通じて、関節リウマチ、変形性関節症、喘息などを予防、治療または改善することができる。また、本実施形態の抗炎症剤または前述したヘキソサミニダーゼ遊離抑制剤は、４−ビニルグアヤコールが有するヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を通じて、胃酸過多を原因とする胃潰瘍、睡眠障害等を予防、治療または改善することができる。

本実施形態の抗肥満剤は、有効成分である４−ビニルグアヤコールが有するｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を通じて、ｃＡＭＰの産生を促進し、脂肪細胞の分解をすることができ、この結果、肥満症、それに伴う動脈硬化、糖尿病、メタボリック症候群等の様々な疾患を予防または改善することができる。

本実施形態のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、有効成分である４−ビニルグアヤコールが有するｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を通じて、ｃＡＭＰの産生を促進するため、血小板の凝集を抑制することができ、これによりアレルギー疾患や各種炎症性疾患等を予防、治療または改善することができる。また、本実施形態のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、４−ビニルグアヤコールが有するｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を通じて、脂肪細胞の分解を促進することができ、この結果、肥満症、およびこれに伴う動脈硬化、糖尿病、メタボリック症候群等の様々な生活習慣病を予防または改善することができる。ただし、本実施形態のｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、これらの用途以外にもｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

本実施形態のグルタチオン低下抑制剤は、アルコールの多飲、重金属や化学物質等の異物の摂取などに起因する各種ストレスに肝細胞が暴露されたときに、有効成分である４−ビニルグアヤコールが有するグルタチオン低下抑制作用を通じて、有害物質の代謝（例えば、グルタチオンとの抱合体形成による細胞外排出等）を促進し、有害物質による肝障害を予防または低減することができる。これにより、急性肝炎、慢性肝炎、脂肪肝、黄疸、肝硬変などの肝障害に起因する疾患（肝機能障害）を予防、治療または改善することができる。ただし、本実施形態のグルタチオン低下抑制剤は、これらの用途以外にもグルタチオン低下抑制作用を発揮することに意義のある全ての用途に用いることができる。

例えば、本実施形態のグルタチオン低下抑制剤は、４−ビニルグアヤコールが有するグルタチオン低下抑制作用を通じて、二日酔いの予防または改善；有害物質の蓄積に起因する症状（肌荒れ、疲労感等）の予防、治療または改善；などの用途に使用することができる。

本実施形態のＤＰＰＩＶ阻害剤は、４−ビニルグアヤコールが有するＤＰＰＩＶ阻害作用を通じて、２型糖尿病、肥満、高血圧症、インスリン抵抗性等を予防または治療することができるとともに、関節リウマチ等の自己免疫疾患や移植拒絶反応を予防または治療することができる。ただし、本実施形態のＤＰＰＩＶ阻害剤は、これらの用途以外にもＤＰＰＩＶ阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。例えば、本実施形態のＤＰＰＩＶ阻害剤は、４−ビニルグアヤコールが有するＤＰＰＩＶ阻害作用を通じて、疼痛、神経変性疾患、および神経精神疾患等の神経障害（例えば坐骨神経痛、アルツハイマー病、うつ病等）；成長ホルモン欠損症および成長ホルモンが治療に使用される疾患；癌（例えばＴ−細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、甲状腺癌、基底細胞癌、乳癌等）；ＨＩＶ感染症（ＡＩＤＳ）等の疾患を予防または治療することができる。

また、本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤は、優れた抗老化作用、美白作用、育毛作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用またはＤＰＰＩＶ活性阻害作用を有するため、例えば、皮膚外用剤に配合するのに好適である。この場合に、４−ビニルグアヤコールまたは４−ビニルグアヤコールを含有する組成物をそのまま配合してもよいし、４−ビニルグアヤコールまたは４−ビニルグアヤコールを含有する組成物から製剤化した抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤を配合してもよい。

ここで、皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、後述する皮膚化粧料のほか、経皮的に使用される医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。

また、本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤は、優れた抗老化作用、美白作用、育毛作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用またはＤＰＰＩＶ活性阻害作用を有するので、これらの作用機構に関する研究のための試薬としても好適に利用することができる。

〔皮膚化粧料，頭髪化粧料〕
４−ビニルグアヤコールは、優れた抗老化作用、美白作用、育毛作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用およびＤＰＰＩＶ活性阻害作用を有しているため、皮膚化粧料または頭髪化粧料に配合するのに好適である。この場合、４−ビニルグアヤコールまたは４−ビニルグアヤコールを含有する組成物をそのまま配合してもよいし、４−ビニルグアヤコールまたは４−ビニルグアヤコールを含有する組成物から製剤化した抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤を配合してもよい。

４−ビニルグアヤコールまたは上記抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤もしくはＤＰＰＩＶ活性阻害剤を配合することにより、皮膚化粧料または頭髪化粧料に抗老化作用、グルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、美白作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、育毛作用、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用、毛乳頭細胞増殖促進作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＣＯＸ−２活性阻害作用、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用またはＤＰＰＩＶ活性阻害作用を付与することができる。

これらの作用は、いずれも皮膚化粧料または頭髪化粧料に付与されることで好ましい作用を発揮するものであるが、中でも、抗老化作用、グルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、美白作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、抗炎症作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＣＯＸ−２活性阻害作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用または抗男性ホルモン作用が皮膚化粧料に付与されると、それらの作用が発揮されやすいため、特に好適である。

また、前述した作用の中でも、育毛作用、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用、毛乳頭細胞増殖促進作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＣＯＸ−２活性阻害作用またはｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用が頭髪化粧料に付与されると、それらの作用が発揮されやすいため、特に好適である。

４−ビニルグアヤコール、または上記抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤もしくはＤＰＰＩＶ活性阻害剤を配合し得る皮膚化粧料または頭髪化粧料の種類は特に限定されるものではなく、皮膚化粧料としては、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ファンデーション等が挙げられ、また、頭髪化粧料としては、例えば、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアリキッド、シャンプー、ポマード、リンス等が挙げられる。

４−ビニルグアヤコール、または上記抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤もしくはＤＰＰＩＶ活性阻害剤を皮膚化粧料または頭髪化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料または頭髪化粧料の種類に応じて適宜調整することができるが、好適な配合率は、約０．０００１〜１０質量％であり、特に好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．００１〜１質量％である。

本実施形態の皮膚化粧料または頭髪化粧料は、４−ビニルグアヤコールが有する抗老化作用、グルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、美白作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、育毛作用、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用、毛乳頭細胞増殖促進作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＣＯＸ−２活性阻害作用、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用またはＤＰＰＩＶ活性阻害作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料または頭髪化粧料の製造に用いられる主剤、助剤またはその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することで、より一般性のある製品となり、また、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。

本実施形態の皮膚化粧料は、４−ビニルグアヤコールが有する抗老化作用、グルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、美白作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、抗炎症作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＣＯＸ−２活性阻害作用、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、育毛作用、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用、毛乳頭細胞増殖促進作用、抗男性ホルモン作用、グルタチオン低下抑制作用およびＤＰＰＩＶ活性阻害作用からなる群より選択される１または２以上の作用を通じて、皮膚のシワの形成、弾力性の低下、保湿機能の低下等の皮膚の老化症状の予防、治療または改善；創傷または熱傷の治癒の促進；肌荒れ、乾燥肌等のほか、乾燥性皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬等）の予防、治療または改善；皮膚の黒化、シミ、ソバカス等の色素沈着の予防、治療または改善；接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、その他肌荒れに伴う各種皮膚炎症性疾患の予防、治療または改善；脂漏症、座瘡（ニキビなど）等の予防、治療または改善；肥満症、およびそれに伴う動脈硬化、糖尿病、メタボリック症候群等の生活習慣病の予防、治療または改善；などをすることができる。

また、本実施形態の頭髪化粧料は、４−ビニルグアヤコールが有する育毛作用、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用、毛乳頭細胞増殖促進作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＣＯＸ−２活性阻害作用、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、抗老化作用、グルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、美白作用、チロシナーゼ活性阻害作用、メラニン産生抑制作用、グルタチオン低下抑制作用およびＤＰＰＩＶ活性阻害作用からなる群より選択される１または２以上の作用を通じて、男性型脱毛症、円形脱毛症、トリコチロマニア等の脱毛症の予防、治療または改善；接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、その他肌荒れに伴う各種皮膚炎症性疾患の予防、治療または改善；肌荒れ、乾燥肌等のほか、乾燥性皮膚疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、魚鱗癬等）の治療；などをすることができる。

〔飲食品〕
４−ビニルグアヤコールは、優れた抗老化作用、美白作用、育毛作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用およびＤＰＰＩＶ活性阻害作用を有しているため、飲食品に配合するのに好適である。この場合、４−ビニルグアヤコールをそのまま配合してもよいし、４−ビニルグアヤコールから製剤化した抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤またはＤＰＰＩＶ活性阻害剤を配合してもよい。

ここで、飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口または消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品等の区分に制限されるものではない。したがって、本実施形態における「飲食品」は、経口的に摂取される一般食品、健康食品（機能性飲食品）、保健機能食品（特定保健用食品，栄養機能食品）、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。

４−ビニルグアヤコールまたは上記抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤、ＤＰＰＩＶ活性阻害剤、抗老化剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤もしくは美白剤を飲食品に配合することにより、抗肥満作用、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用、グルタチオン低下抑制作用、ＤＰＰＩＶ活性阻害作用、抗老化作用、グルタチオン産生促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−２活性阻害作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、育毛作用、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用、アンドロゲン受容体結合阻害作用、毛乳頭細胞増殖促進作用、抗男性ホルモン作用、抗炎症作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用、ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用、ＣＯＸ−２活性阻害作用、美白作用、チロシナーゼ活性阻害作用またはメラニン産生抑制作用を飲食品に付与することができる。これらの作用は、飲食品に付与されることで作用効果が発揮されやすいため、好適である。

４−ビニルグアヤコール、または４−ビニルグアヤコールから製剤化した抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤もしくはＤＰＰＩＶ活性阻害剤を飲食品に配合する場合、それらにおける有効成分の配合量は、使用目的、症状、性別等を考慮して適宜変更することができるが、添加対象となる飲食品の一般的な摂取量を考慮して、成人１日あたりの抽出物摂取量が約１〜１０００ｍｇになるようにするのが好ましい。なお、添加対象飲食品が顆粒状、錠剤状またはカプセル状の飲食品の場合、４−ビニルグアヤコール、または４−ビニルグアヤコールから製剤化した抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤もしくはＤＰＰＩＶ活性阻害剤の添加量は、添加対象飲食品に対して通常０．１〜１００質量％であり、好ましくは５〜１００質量％である。

本実施形態の飲食品は、４−ビニルグアヤコールをその活性を妨げないような任意の飲食品に配合したものであってもよいし、４−ビニルグアヤコールを主成分とする栄養補助食品であってもよい。

本実施形態の飲食品を製造する際には、例えば、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類などの任意の助剤を添加して任意の形状の飲食品にすることができる。

４−ビニルグアヤコールを配合し得る飲食品は特に限定されないが、その具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液および調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などが挙げられ、これらの飲食品に４−ビニルグアヤコールを配合するときに、通常用いられる補助的な原料や添加物を併用することができる。

なお、本実施形態の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤、ＤＰＰＩＶ活性阻害剤、皮膚化粧料、頭髪化粧料および飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ，ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。

以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。なお、本試験例においては、被験試料として４−ビニルグアヤコール（和光純薬工業社製，試料１）を使用した。

〔試験例１〕グルタチオン産生促進作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてグルタチオン産生促進作用を試験した。

正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。

培養後、１％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１を参照）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。なお、コントロールとして、被験試料無添加の１％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養終了後、各ウェルから培地を除去し、４００μＬのＰＢＳ（−）緩衝液にて洗浄した後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（PIERCE社製）を使用して細胞を溶解した。

このうちの１００μＬを使用して総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに、溶解した細胞抽出液１００μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液５０μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰＨ２５μＬ、およびグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度17.5 unit/mL）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を使用して作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式によりグルタチオン産生促進率（％）を算出した。

グルタチオン産生促進率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
Ｂ：被験試料添加における総タンパク量当たりのグルタチオン量
結果を表１に示す。

表１に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたグルタチオン産生促進作用を有していると認められた。

〔試験例２〕表皮角化細胞増殖促進作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにして表皮角化細胞増殖促進作用を試験した。

正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理にて細胞を回収した。回収した細胞を３．０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭ培地で希釈した後、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、ＫＧＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表２を参照）を各ウェルに１００μＬ添加し、３日間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＭＧ培地を用いて同様に培養した。

表皮角化細胞増殖促進作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。すなわち、３日間培養後、培地を除去し、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）緩衝液に溶解したＭＴＴを各ウェル１００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。得られた結果から、下記式により表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。

表皮角化細胞増殖促進率（％）＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ｓｔ：被験試料添加でのブルーホルマザン生成量
Ｃｔ：試料無添加でのブルーホルマザン生成量
結果を表２に示す。

表２に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。

〔試験例３〕ＭＭＰ−２活性阻害作用試験
ＭＭＰ−２は、特開２００７−２１７３５２号公報に記載の方法により調製したものを用いた。すなわち、ＭＭＰ−２タンパク質を、Ｃ末端にヒスチジン６残基を持つ組換え体ｐｒｏＭＭＰタンパク質として大腸菌遺伝子発現系を用い大量発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を用いた精製およびリフォールディングを行った後、活性型へ移行させた。これを酵素標品とし、適宜希釈し酵素溶液を調製した。
得られた酵素溶液を用い、４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてＭＭＰ−２活性阻害作用を試験した。

蛍光強度測定用９６ウェルプレートを用い、被験試料（試料１，試料濃度は下記表３を参照）２０μＬ、酵素溶液４０μＬおよび緩衝液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ₂ ，５０μｍｏｌ／Ｌ ＺｎＳＯ₄ ，０．０２％ ＮａＮ₃ ，０．０５％ Ｂｒｉｊ３５（ｐＨ７．５））２０μＬを混合し、３７℃にて１５分静置した。その後、４．１６μｍｏｌ／Ｌに調製した蛍光基質ペプチド（ＭＯＣＡｃ／ＤＮＰ ｐｅｐｔｉｄｅ）１２０μＬを添加し、直ちに励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４２０ｎｍにおける蛍光強度を測定し、これを基質添加直後の蛍光強度とした。測定後直ちに３７℃で１２０分反応させ、この間、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４２０ｎｍにおける蛍光強度を１５分毎に測定し、これらを基質添加後の蛍光強度とした。また同様の方法で空試験を行い補正した。得られた結果から、下記式によりＭＭＰ−２活性阻害率（％）を算出した。

ＭＭＰ−２活性阻害率（％）＝｛１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加・基質添加１２０分後での波長４２０ｎｍにおける蛍光強度
Ｂ：試料無添加・基質添加直後での波長４２０ｎｍにおける蛍光強度
Ｃ：被験試料添加・基質添加１２０分後での波長４２０ｎｍにおける蛍光強度
Ｄ：被験試料添加・基質添加直後での波長４２０ｎｍにおける蛍光強度
結果を表３に示す。

表３に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたＭＭＰ−２活性阻害作用を有することが確認された。

〔試験例４〕セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。

正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、８０ｃｍ² フラスコにて正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＥｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に２ｍＬずつ播種し（４０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／シャーレ）、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。

培養後、培地を除去し、Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表４を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＥｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２培地を用いて同様に培養した。培養後、培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。

この総ＲＮＡを鋳型とし、ＳＰＴおよび内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用い、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＳＰＴの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式によりＳＰＴ ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。

ＳＰＴ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表４に示す。

表４に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。

〔試験例５〕アクアポリン３（ＡＱＰ３）ｍＲＮＡ発現促進作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。

正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、８０ｃｍ² フラスコにて正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用い、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭ培地で希釈した後、３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に２ｍＬずつ播種し（４０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／シャーレ）、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下で２４時間培養した。

培養後に培地を除去し、ＫＧＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表５を参照）のＫＧＭ培地を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃・５％ＣＯ₂ −９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＧＭ培地を用いて同様に培養した。培養後、培地を除去し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。

この総ＲＮＡを鋳型とし、ＡＱＰ３および内部標準であるＧＡＰＤＨについて、ｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time）（タカラバイオ社製，code No. RR063A）によるリアルタイム２Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＡＱＰ３ｍＲＮＡの発現量は、「被験試料添加」および「試料無添加」にてそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求めた。得られた値から、下記式によりＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。

ＡＱＰ３ ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加での補正値
Ｂ：試料無添加での補正値
結果を表５に示す。

表５に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。

〔試験例６〕チロシナーゼ活性阻害作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてチロシナーゼ活性阻害作用を試験した。

４８ウェルプレートに、Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ６．８）０．２ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬチロシン溶液０．０６ｍＬ、２５％ＤＭＳＯ溶液に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表６を参照）０．１８ｍＬを加え、３７℃で１０分間静置した。これに、８００ｕｎｉｔｓ／ｍＬチロシナーゼ溶液０．０２ｍＬを加え、引き続き３７℃で１５分間反応させた。反応終了後、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。

また、ブランクとして、酵素溶液を添加しない場合についても同様の操作および吸光度の測定を行った。さらに、コントロールとして、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。得られた測定結果から、下記式によりチロシナーゼ活性阻害率（％）を算出した。

チロシナーゼ活性阻害率（％）＝｛１−（Ｓｔ−Ｓｂ）／（Ｃｔ−Ｃｂ）｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ｓｔ：被験試料添加・酵素添加での波長４７５ｎｍにおける吸光度
Ｓｂ：被験試料添加・酵素無添加での波長４７５ｎｍにおける吸光度
Ｃｔ：試料無添加・酵素添加での波長４７５ｎｍにおける吸光度
Ｃｂ：試料無添加・酵素無添加での波長４７５ｎｍにおける吸光度
結果を表６に示す。

表６に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたチロシナーゼ活性阻害作用を有していると認められた。

〔試験例７〕Ｂ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてＢ１６メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用を試験した。

Ｂ１６メラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２４．０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳおよび１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェルあたり３００μＬずつ播種し、６時間培養した。

培養終了後、１０％ＦＢＳおよび１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表７を参照）を各ウェルに３００μＬ添加し、４日間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加の１０％ＦＢＳおよび１ｍｍｏｌ／Ｌテオフィリン含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養終了後、培地を除去し、２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液２００μＬを添加して超音波破砕機により細胞を破壊し、波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。測定した吸光度の値から、合成メラニン（SIGMA社製）を用いて作成した検量線をもとにメラニン量を算出した。

また、細胞生存率を測定するために、上記と同様にして培養した後、培地を除去し４００μＬのＰＢＳ（−）緩衝液で洗浄して、終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬで１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したニュートラルレッドを各ウェルに２００μＬ添加し、２．５時間培養した。培養後、ニュートラルレッド溶液を除去し、エタノール・酢酸溶液（エタノール：酢酸：水＝５０：１：４９）を各ウェルに２００μＬ添加し、色素を抽出した。抽出後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果から、下記式により細胞生存率により補正したメラニン産生抑制率（％）を算出した。

メラニン産生抑制率（％）＝｛１−（Ｂ／Ｄ）／（Ａ／Ｃ）｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加におけるメラニン量
Ｂ：被験試料添加におけるメラニン量
Ｃ：試料無添加での波長５４０ｎｍにおける吸光度
Ｄ：被験試料添加での波長５４０ｎｍにおける吸光度
結果を表７に示す。

表７に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたメラニン産生抑制作用を有していると認められた。

〔試験例８〕テストステロン５α−レダクターゼ阻害作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてテストステロン５α−レダクターゼ阻害作用を試験した。

蓋付Ｖ底試験管にて、プロピレングリコールで調製した４．２ｍｇ／ｍＬテストステロン（和光純薬工業社製）溶液２０μＬと、１ｍｇ／ｍＬ ＮＡＤＰＨを含有する５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．１３）緩衝液８２５μＬとを混合した。

さらに、５０％エタノールにて調製した被験試料（試料１，試料濃度は下記表８を参照）溶液８０μＬと、Ｓ−９（オリエンタル酵母工業社製，ラット肝臓ホモジネート）７５μＬとを加えて混合し、３７℃にて３０分間インキュベートした。その後、塩化メチレン１ｍＬを加えて反応を停止させた。これを遠心分離し（１６００×ｇ，１０分間）、塩化メチレン層を分取して、分取した塩化メチレン層について、下記の条件にてガスクロマトグラフィー分析に供し、３α−アンドロスタンジオール、５α−ジヒドロテストステロン（５α−ＤＨＴ）およびテストステロンの濃度を定量した。なお、コントロールとして、被験試料溶液の代わりに試料溶媒を同量（８０μＬ）用いて同様に処理し、ガスクロマトグラフィー分析に供した。

＜ガスクロマトグラフィー条件＞
使用装置：Shimadzu ＧＣ−２０１０（島津製作所社製）
カラム：ＤＢ−１７０１（内径：０．５３ｍｍ，長さ：３０ｍ，膜厚：１．０μｍ）（J&W Scientific社製）
カラム温度：２４０℃
注入口温度：３００℃
検出器：ＦＩＤ
試料注入量：１μＬ
スプリット比：１：２
キャリアガス：窒素ガス
キャリアガス流速：３ｍＬ／ｍｉｎ

３α−アンドロスタンジオール、５α−ＤＨＴおよびテストステロンの濃度の定量は、下記の方法により行った。
３α−アンドロスタンジオール、５α−ＤＨＴおよびテストステロンの標準品を塩化メチレンに溶解し、当該溶液をガスクロマトグラフィー分析に供し、これらの化合物の濃度（μｇ／ｍＬ）およびピーク面積から、ピーク面積と化合物の濃度との対応関係を予め求めておいた。そして、テストステロンとＳ−９との反応後の３α−アンドロスタンジオール、５α−ＤＨＴおよびテストステロンのそれぞれのピーク面積あたりの濃度を、予め求めておいた対応関係を利用して、下記式（１）に基づいて求めた。

Ａ＝Ｂ×Ｃ／Ｄ・・・（１）
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：３α−アンドロスタンジオール、５α−ＤＨＴまたはテストステロンの濃度
Ｂ：３α−アンドロスタンジオール、５α−ＤＨＴまたはテストステロンのピーク面積
Ｃ：標準品の濃度
Ｄ：標準品のピーク面積

式（１）に基づいて算出された化合物濃度を用いて、下記式（２）に基づき、変換率（テストステロン５α−レダクターゼによりテストステロンが還元されて生成した３α−アンドロスタンジオールおよび５α−ＤＨＴの濃度と、テストステロンの初期濃度との濃度比）を算出した。

変換率＝（Ｅ＋Ｆ）／（Ｅ＋Ｆ＋Ｇ）・・・（２）
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ｅ：３α−アンドロスタンジオールの濃度（μｇ／ｍＬ）
Ｆ：５α−ＤＨＴの濃度（μｇ／ｍＬ）
Ｇ：テストステロンの濃度（μｇ／ｍＬ）

式（２）に基づいて算出された変換率を用いて、下記式（３）に基づき、テストステロン５α−レダクターゼ阻害率（％）を算出した。
テストステロン５α−レダクターゼ阻害率（％）＝（１−Ｈ／Ｉ）×１００・・・（３）
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ｈ：被検試料添加での変換率
Ｉ：試料無添加での変換率
結果を表８に示す。

表８に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたテストステロン５α−レダクターゼ阻害作用を有することが確認された。

〔試験例９〕アンドロゲン受容体結合阻害作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてアンドロゲン受容体結合阻害作用を試験した。

マウス自然発生乳癌（シオノギ癌；ＳＣ１１５）よりクローニングされたアンドロゲン依存性マウス乳癌細胞（ＳＣ−３細胞）を、２％ＤＣＣ−ＦＢＳを含む１０^-8ｍｏｌ／Ｌテストステロン含有ＭＥＭ培地（ＭＥＭ／２）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／μＬの細胞密度になるようにＭＥＭ／２培地で希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。

その後、培地を除去し、１．０×１０^-9ｍｏｌ／Ｌ ＤＨＴを含む０．５％ＢＳＡ含有ＨａｍＦ１２＋ＭＥＭ培地（ＨＭＢ）に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表９を参照）１００μＬを添加し、さらに４８時間培養した。培養終了後、培地を除去し、２％ＤＣＣ−ＦＢＳ含有ＭＥＭ／２培地で調製した０．４ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ１００μＬを添加し、さらに２時間培養した後、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。この抽出液について、ブルーホルマザンの吸収極大点がある５７０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。

なお、上記と並行して、試料単独でＳＣ−３細胞に及ぼす影響をみるため、ＨＭＢ培地にＤＨＴを添加せず被験試料のみを添加した場合についても、同様の培養および測定を行った。また、コントロールとして、試料およびＤＨＴを添加しないＨＭＢ培地で培養した場合、ならびに試料を添加せずＤＨＴのみを添加したＨＭＢ培地で培養した場合についても、同様の測定を行った。測定結果から、下記式によりアンドロゲン受容体結合阻害率（％）を算出した。

アンドロゲン受容体結合阻害率（％）＝｛１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加・ＤＨＴ添加でのブルーホルマザン生成量
Ｂ：試料無添加・ＤＨＴ無添加でのブルーホルマザン生成量
Ｃ：被験試料添加・ＤＨＴ添加でのブルーホルマザン生成量
Ｄ：被験試料添加・ＤＨＴ無添加でのブルーホルマザン生成量
結果を表９に示す。

表９に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたアンドロゲン受容体結合阻害作用を有することが確認された。

〔試験例１０〕毛乳頭細胞増殖促進作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにして毛乳頭細胞増殖促進作用を試験した。

正常ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣ，男性頭頂部由来）を、１％ＦＣＳおよび増殖添加剤を含有する毛乳頭細胞用増殖培地（ＰＣＧＭ，東洋紡績社製）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて１．０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように希釈した後、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ播種し、３日間培養した。

その後、培地を除去し、無血清ＤＭＥＭ培地に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１０を参照）２００μＬを各ウェルに添加し、さらに４日間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加の無血清ＤＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養終了後、ＭＴＴアッセイにより毛乳頭細胞増殖促進作用を測定した。すなわち、培地を除去し、無血清ＤＭＥＭ培地で調製した０．４ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ２００μＬを添加し、さらに２時間培養した後、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール１００μＬで抽出した。この抽出液について、ブルーホルマザンの吸収極大点がある５７０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。測定結果から、下記式に基づいて、毛乳頭細胞増殖促進率（％）を算出した。

毛乳頭細胞増殖促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのブルーホルマザン生成量
Ｂ：試料無添加でのブルーホルマザン生成量
結果を表１０に示す。

表１０に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れた毛乳頭細胞増殖促進作用を有していると認められた。

〔試験例１１〕腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）産生抑制作用試験
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように上記培地で希釈した後、９６ウェルマイクロプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、４時間培養した。

培養終了後、培地を除去し、終濃度０．５％ＤＭＳＯを含む１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地で溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１１を参照）を各ウェルに１００μＬ添加し、終濃度１μｇ／ｍＬで１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（DIFCO社製，E.coli 0111;B4）を１００μＬ加え、２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加の終濃度０．５％ＤＭＳＯを含む１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地等を用いて同様の操作を行った。培養終了後、各ウェルの培養上清中のＴＮＦ−α量を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。得られた結果から、下記式によりＴＮＦ−α産生抑制率（％）を算出した。

ＴＮＦ−α産生抑制率（％）＝｛（Ｂ−Ａ）／Ｂ｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加でのＴＮＦ−α量
Ｂ：試料無添加でのＴＮＦ−α量
結果を表１１に示す。

表１１に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたＴＮＦ−α産生抑制作用を有することが確認された。

〔試験例１２〕ヒアルロニダーゼ活性阻害作用試験
０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１２を参照）０．２ｍＬに、ヒアルロニダーゼ溶液（SIGMA社製，Type IV-S，from bovine testes，400 NF units/mL）０．１ｍＬを加え、３７℃で２０分間静置した。さらに、活性化剤として２．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム０．２ｍＬを加え、３７℃で２０分間静置した。これに０．８ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸ナトリウム溶液（from rooster comb）０．５ｍＬを加え、３７℃で４０分間反応した。その後、０．４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム０．２ｍＬを加えて反応を止め冷却した後、各反応溶液にホウ酸溶液０．２ｍＬを加え、３分間煮沸した。氷冷後、ｐ−ＤＡＢＡ試薬６ｍＬを加え、３７℃で２０分間反応した。その後、波長５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。

また、ブランクとして、酵素溶液を添加しない場合についても同様の操作および吸光度の測定を行った。さらに、コントロールとして、試料溶液を添加せずに蒸留水を添加した場合についても同様の測定を行った。得られた結果から、下記式によりヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）を算出した。
ヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）＝｛１−（Ｓｔ−Ｓｂ）／（Ｃｔ−Ｃｂ）｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ｓｔ：被験試料添加・酵素添加での波長５８５ｎｍにおける吸光度
Ｓｂ：被験試料添加・酵素無添加での波長５８５ｎｍにおける吸光度
Ｃｔ：試料無添加・酵素添加での波長５８５ｎｍにおける吸光度
Ｃｂ：試料無添加・酵素無添加での波長５８５ｎｍにおける吸光度
結果を表１２に示す。

表１２に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有することが確認された。また、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用の程度は、４−ビニルグアヤコールの濃度によって調節できることが確認された。

〔試験例１３〕ヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を試験した。

ラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）を、１５％ＦＢＳ含有Ｓ−ＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を４．０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１５％ＦＢＳ含有Ｓ−ＭＥＭ培地で希釈し、終濃度０．５μＬ／ｍＬとなるようにＤＮＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＥを添加した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。

培養後、培地を除去し、シラガニアン緩衝液１００μＬにて洗浄を２回行った。次に、同緩衝液に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１３を参照）１０μＬおよび同緩衝液３０μＬを各ウェルに添加し、３７℃にて１０分間静置した。なお、コントロールとして、試料無添加のシラガニアン緩衝液４０μＬを用いて同様の操作を行った。続いて、１００ｎｇ／ｍＬ ＤＮＰ−ＢＳＡ溶液１０μＬを加え、３７℃にて１５分間静置し、ヘキソサミニダーゼを遊離させた。

その後、９６ウェルプレートを氷上に静置することにより遊離を停止した。各ウェルの細胞上清１０μＬを新たな９６ウェルプレートに採取し、各ウェルに１ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ−ＮＡＧ（ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）溶液１０μＬを添加し、３７℃で１時間反応させた。

反応終了後、各ウェルに０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ₂ＣＯ₃ ／ＮａＨＣＯ₃ ２５０μＬを加え、波長４１５ｎｍおよび６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、４１５ｎｍにおける吸光度から６５０ｎｍにおける吸光度を減じた値を補正値とした。また、ブランクとして、細胞上清１０μＬと、０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ₂ＣＯ₃ ／ＮａＨＣＯ₃ ２５０μＬとの混合液の波長４１５ｎｍおよび６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、補正値を算出した。得られた測定結果から、下記式によりヘキソサミニダーゼ遊離抑制率（％）を算出した。

ヘキソサミニダーゼ遊離抑制率（％）＝｛１−（Ｂ−Ｃ）／Ａ｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加での補正値
Ｂ：被験試料添加での補正値
Ｃ：被験試料添加・ｐ−ＮＡＧ無添加での補正値
結果を表１３に示す。

表１３に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたヘキソサミニダーゼ遊離抑制作用を有することが確認された。

〔試験例１４〕マウスマクロファージにおけるＣＯＸ−２活性阻害作用試験（ＰＧＥ₂ 産生抑制作用試験）
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地で希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、１８時間培養した。

培養終了後、既に存在するＣＯＸ−１および少量発現しているＣＯＸ−２をアセチル化し失活させるため、培地を５００μｍｏｌ／Ｌアスピリン含有培地に交換し４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳ（−）緩衝液で３回洗浄し、終濃度０．５％ＤＭＳＯを含む１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地で溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１４を参照）を各ウェルに１００μＬ添加した後、終濃度１μｇ／ｍＬで１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（DIFCO社製，E.coli 0111;B4）を１００μＬ添加し、１６時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加の終濃度０．５％ＤＭＳＯを含む１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて同様に培養した。培養終了後、各ウェルの培養上清中のプロスタグランジンＥ₂ 量を、PGE₂ EIA Kit（Cayman Chemical社製）を用いて定量した。得られた結果から、下記式によりＣＯＸ−２活性阻害率（％，ＰＧＥ₂ 産生抑制率）を算出した。

マクロファージＣＯＸ−２活性阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加・ＬＰＳ刺激でのプロスタグランジンＥ₂ 量
Ｂ：試料無添加・ＬＰＳ刺激でのプロスタグランジンＥ₂ 量
Ｃ：試料無添加・ＬＰＳ無刺激でのプロスタグランジンＥ₂ 量
結果を表１４に示す。

表１４に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、マクロファージにおいて優れたＣＯＸ−２活性阻害作用を有することが確認された。

〔試験例１５〕ケラチノサイトにおけるＣＯＸ−２活性阻害作用試験（ＰＧＥ₂ 産生抑制作用試験）
正常ヒト新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用増殖培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１２．５×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようＫＧＭ培地で希釈した後、コラーゲンコートした４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し（２．５×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ウェル）、一晩培養した。細胞が定着したことを確認した後、hydrocortisone（ハイドロコルチゾン）を抜いたＫＧＭ培地２００μＬにて、２４時間培養した。

培養終了後、既に存在するＣＯＸ−１および少量発現しているＣＯＸ−２をアセチル化し失活させるため、５００μｍｏｌ／Ｌアスピリン含有ＫＧＭ培地（ハイドロコルチゾン抜き）を２００μＬ加え、４時間培養した。培養後、細胞をＰＢＳ（−）緩衝液で３回洗浄し、１００μＬのＰＢＳ（−）緩衝液を加えＵＶ−Ｂ照射（５０ｍＪ／ｃｍ² ）を行い、その後ＫＧＭ培地（ハイドロコルチゾン抜き）に溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１５を参照）を各ウェルに４００μＬずつ添加し、３７℃・５％ＣＯ₂ 条件下で２４時間培養した。なお、コントロールとして、試料無添加のＫＧＭ培地（ハイドロコルチゾン抜き）を用いて同様に培養した。培養終了後、各ウェルの培養上清中のプロスタグランジンＥ₂ 量を、PGE₂ EIA Kit（Cayman Chemical社製）を用いて定量した。得られた結果から、下記式によりＣＯＸ−２活性阻害率（％，ＰＧＥ₂ 産生抑制率）を算出した。

ケラチノサイトＣＯＸ−２活性阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：被験試料添加・紫外線照射でのプロスタグランジンＥ₂ 量
Ｂ：試料無添加・紫外線照射でのプロスタグランジンＥ₂ 量
Ｃ：試料無添加・紫外線未照射でのプロスタグランジンＥ₂ 量
結果を表１５に示す。

表１５に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、ケラチノサイトにおいて優れたＣＯＸ−２阻害作用を有することが確認された。

〔試験例１６〕サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を試験した。

５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）０．２ｍＬに、２．５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン溶液０．１ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ溶液０．１ｍＬ、および被験試料溶液（試料１，試料濃度は下記表１６を参照）０．０５ｍＬを加え、３７℃にて５分間静置した。その後、０．５ｍｇ／ｍＬサイクリックＡＭＰ溶液０．０５ｍＬを加え、３７℃で６０分間反応させた。反応終了後、３分間沸騰水浴上で煮沸することにより反応を停止させ、これを遠心（２２６０×ｇ，１０分間，４℃）し、上清中の反応基質であるサイクリックＡＭＰを、下記の高速液体クロマトグラフィー条件にて分析した。また、コントロールとして、試料無添加の溶媒のみを加えて同様の操作を行った。

＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：Ｃｈｒｏｍａｔｏｃｏｒｄｅｒ １２（SYSTEM INSTRUMENTS社製）
固定相：Ｗａｋｏｓｉｌ Ｃ₁₈−ＯＤＳ ５μｍ（和光純薬工業社製）
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：１ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＢＡＰ ｉｎ ２５ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄：ＣＨ₃ＣＮ＝９０：１０
移動相流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２６０ｎｍ

次に、サイクリックＡＭＰ標準品のピーク面積（Ａ）、試料無添加時におけるサイクリックＡＭＰ標準品とサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼとの反応溶液の上清のピーク面積（Ｂ１）および被験試料添加時におけるサイクリックＡＭＰ標準品とサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼとの反応溶液の上清のピーク面積（Ｂ２）を求めた。得られた結果から、下記式により試料無添加時のサイクリックＡＭＰ標準品の分解率（Ｃ）および被験試料添加時のサイクリックＡＭＰ標準品の分解率（Ｄ）を算出した。

試料無添加での標準品分解率（Ｃ，％）＝（１−Ｂ１／Ａ）×１００
被験試料添加での標準品の分解率（Ｄ，％）＝（１−Ｂ２／Ａ）×１００

その後、上記式により算出した各分解率（Ｃ，Ｄ）に基づいて、下記式によりサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率（％）を算出した。
ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率（％）＝（１−Ｄ／Ｃ）×１００
結果を表１６に示す。

表１６に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有することが確認された。

〔試験例１７〕ヒト正常肝細胞を用いたグルタチオン低下抑制作用試験
正常ヒト肝細胞を、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるよう１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ培地で希釈した後、４８ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。

培養終了後、１％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被験試料（試料１，試料濃度は下記表１７を参照）２００μＬと、終濃度５ｍＭのガラクトサミン塩酸塩２００μＬとを各ウェルに添加し、さらに２４時間培養した。また、同様に細胞播種した後、ガラクトサミン塩酸塩を処理しない細胞および細胞播種後ガラクトサミン塩酸塩を処理し被験試料を添加しない細胞についても同様に測定し、それぞれ非処理群と処理群とした。培養終了後、各ウェルから培地を除去し、４００μＬのＰＢＳ（−）緩衝液にて洗浄後、１５０μＬのＭ−ＰＥＲ（PIERCE社製）を用いて細胞を溶解した。

このうちの５０μＬを用いて総グルタチオンの定量を行った。すなわち、９６ウェルプレートに、溶解した細胞抽出液５０μＬ、０．１Ｍリン酸緩衝液１００μＬ、２ｍＭ ＮＡＤＰＨ２５μＬ、およびグルタチオンレダクターゼ２５μＬ（終濃度17.5 unit/mL）を加え、３７℃で１０分間加温した後、１０ｍＭ 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)２５μＬを加え、５分後までの波長４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。総グルタチオン濃度は、酸化型グルタチオン（和光純薬社製）を用いて作成した検量線をもとに算出した。得られた値を総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記式に従いグルタチオン低下抑制率を算出した。

グルタチオン低下抑制率（％）＝｛（Ｎｔ−Ｃ）−（Ｎｔ−Ｓａ）｝／（Ｎｔ−Ｃ）×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ｎｔ：ガラクトサミン塩酸塩非処理（非処理群）のにおける総タンパク量当たりのグルタチオン量
Ｃ ：試料無添加・ガラクトサミン塩酸塩処理（処理群）における総タンパク量当たりのグルタチオン量
Ｓａ：被験試料添加・ガラクトサミン塩酸塩処理における総タンパク量当たりのグルタチオン量
結果を表１７に示す。

表１７に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は、優れたグルタチオン低下抑制作用を有することが確認された。

〔試験例１８〕ＤＰＰＩＶ活性阻害作用試験
４−ビニルグアヤコール（試料１）について、以下のようにしてジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）阻害作用を試験した。

９６ウェルプレートにて、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にて調製した被験試料（試料１，終濃度は下記表１８を参照）２５μＬと、上記緩衝液にて調製した０．４μｇ／ｍＬ ＤＰＰＩＶ（Ｒ＆Ｄシステム社製，ｒｈＣＤ２６）溶液２５μＬとを混合し、３７℃にて５分間プレインキュベーションした。その後、上記緩衝液にて調製した０．５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ＮＡ・Ｔｏｓ（ペプチド研究所社製）５０μＬを添加し、３７℃にて９０分間反応させた。反応終了後、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果から、下記式によりＤＰＰＩＶ阻害率（％）を算出した。

ＤＰＰＩＶ阻害率（％）＝｛１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）｝×１００
式中の各項はそれぞれ以下を表す。
Ａ：試料無添加・酵素添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：試料無添加・酵素無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｃ：被験試料添加・酵素添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｄ：被験試料添加・酵素無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
結果を表１８に示す。

表１８に示すように、４−ビニルグアヤコール（試料１）は優れたＤＰＰＩＶ阻害作用を示した。

〔配合例１〕
下記組成の乳液を常法により製造した。
４−ビニルグアヤコール ０．０１ｇ
ホホバオイル ４．００ｇ
１，３−ブチレングリコール ３．００ｇ
アルブチン ３．００ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.O.） ２．５０ｇ
オリーブオイル ２．００ｇ
スクワラン ２．００ｇ
セタノール ２．００ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．００ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.） ２．００ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５ｇ
グリチルリチン酸ステアリル ０．１０ｇ
黄杞エキス ０．１０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１０ｇ
イチョウ葉エキス ０．１０ｇ
コンキオリン ０．１０ｇ
オウバクエキス ０．１０ｇ
カミツレエキス ０．１０ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例２〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
４−ビニルグアヤコール ０．０５ｇ
クジンエキス ０．１ｇ
オウゴンエキス ０．１ｇ
流動パラフィン ５．０ｇ
サラシミツロウ ４．０ｇ
スクワラン １０．０ｇ
セタノール ３．０ｇ
ラノリン ２．０ｇ
ステアリン酸 １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３．０ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例３〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
４−ビニルグアヤコール ０．０１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
ニンジンエキス ０．１ｇ
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ４．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例４〕
下記組成のヘアトニックを常法により製造した。
４−ビニルグアヤコール ０．４ｇ
酢酸トコフェロール 適量
セファラチン ０．００２ｇ
イソプロピルメチルフェノール ０．１ｇ
ヒアルロン酸ナトリウム ０．１５ｇ
グリセリン １５．０ｇ
エタノール １５．０ｇ
香料 適量
キレート剤（エデト酸ナトリウム） 適量
防腐剤（ヒノキチオール） 適量
可溶化剤（ポリオキシエチレンセチルエーテル） 適量
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例５〕
下記組成のシャンプーを常法により製造した。
４−ビニルグアヤコール ０．５ｇ
マジョラム抽出物 １．０ｇ
ウメ果実部抽出物 ０．２ｇ
ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム １０．０ｇ
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １０．０ｇ
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム ２０．０ｇ
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ４．０ｇ
プロピレングリコール ２．０ｇ
香料 適量
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例６〕
常法により、以下の組成を有する錠剤を製造した。
４−ビニルグアヤコール ５．０ｍｇ
ドロマイト（カルシウム20％、マグネシウム10％含有） ８３．４ｍｇ
カゼインホスホペプチド １６．７ｍｇ
ビタミンＣ ３３．４ｍｇ
マルチトール １３６．８ｍｇ
コラーゲン １２．７ｍｇ
ショ糖脂肪酸エステル １２．０ｍｇ

〔配合例７〕
常法により、以下の組成を有する経口液状製剤を製造した。
＜１アンプル（１本１００ｍＬ）中の組成＞
４−ビニルグアヤコール ０．３質量％
ソルビット １２．０質量％
安息香酸ナトリウム ０．１質量％
香料 １．０質量％
硫酸カルシウム ０．５質量％
精製水 残部（１００質量％）

本発明の抗老化剤、美白剤、育毛剤、抗男性ホルモン剤、抗炎症剤、抗肥満剤、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤、グルタチオン低下抑制剤およびＤＰＰＩＶ活性阻害剤は、皮膚の老化症状の予防、治療または改善；創傷または熱傷の治癒の促進；乾燥性皮膚疾患の予防、治療または改善；皮膚の黒化、シミ、ソバカス等の色素沈着の予防または改善；脱毛症、特に男性型脱毛症の脱毛症の予防、治療または改善；各種皮膚炎症性疾患の予防または改善；肥満の予防、治療または改善；肝機能の向上または改善；２型糖尿病、肥満、高血圧症、インスリン抵抗性等の予防、治療または改善；などに大きく貢献できる。

Claims (3)

1. ４−ビニルグアヤコールを有効成分とし、
   表皮角化細胞増殖促進用途、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進用途およびアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進用途からなる群より選択される１種または２種以上の用途に用いられる
   ことを特徴とする抗皮膚老化剤。
2. ４−ビニルグアヤコールを配合した皮膚化粧料であって、
   表皮角化細胞増殖促進用途、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進用途およびアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進用途からなる群より選択される１種または２種以上の抗皮膚老化用途に用いられる皮膚化粧料。
3. ４−ビニルグアヤコールを配合した頭髪化粧料であって、
   表皮角化細胞増殖促進用途、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進用途およびアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進用途からなる群より選択される１種または２種以上の頭部の皮膚の抗老化用途に用いられる頭髪化粧料。