JP2018123118A

JP2018123118A - 皮膚の老化抑制剤

Info

Publication number: JP2018123118A
Application number: JP2017229233A
Authority: JP
Inventors: 前田　憲寿; Kazuhisa Maeda; 憲寿前田; 陽介本村; Yosuke Motomura; 香枝山▲崎▼; Kae Yamazaki; 裕子庄野; Yuko Shono; 里江子亀岡; Rieko Kameoka
Original assignee: Ueno Fine Chemicals Industry Ltd
Current assignee: Ueno Fine Chemicals Industry Ltd
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2018-08-09

Abstract

【課題】皮膚の老化抑制剤を提供する。【解決手段】式（１）で表されるヒドロキシ安息香酸およびその誘導体：［式中のＲ１は、水素、メチル基またはグルコシル基を示し、式中のＲ２は、水素、炭素数１から８の直鎖または分岐鎖状の炭化水素基、芳香族炭化水素基、グルコースあるいはソルビトールいずれかの糖残基、からなる群より選択される基を示す］並びにその塩から選択される１以上の化合物を有効成分として含有する皮膚の老化抑制剤を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚の老化抑制剤に関する。本発明はまた、皮膚老化の予防および／または改善のための皮膚外用剤に関する。

皮膚は表皮と真皮の二層構造からなり、生命活動の維持に不可欠な存在である。表皮は大部分が角化細胞で構成されており、深部から基底層、有棘層、顆粒層、角層の４層に分類され、内部の蒸発を防ぎ、微生物などの侵入を防ぐバリア機能を維持する役割を持つ。また、真皮はコラーゲン繊維とそれを繋ぎ合わせる弾力性のあるエラスチンが皮膚の弾力性を保ち、隙間に水分を多く含むヒアルロン酸などが存在するため、肌の内側の水分を保持し、うるおいと柔軟性を与えている。若い皮膚はこれら皮膚組織の活動が十分にあるため、水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態を維持している。しかし、紫外線（ＵＶＡ、ＵＶＢ）の照射、空気の乾燥、過度の皮膚洗浄や活性酸素の暴露などの外的因子や、加齢に伴う細胞活動の低下やタンパク質の糖化および脂質酸化などの内的因子の影響により、保湿機能や弾力性の喪失、角質の異常剥離を起こし、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。

セラミドは、角層の角質細胞の間を埋める細胞間脂質の主成分として存在し、ラメラ構造を構築して皮膚の保湿効果を発揮し、皮膚の保護作用や肌荒れ防止の効果を有する事が知られている。セラミドは、角層において皮膚の保湿機能やバリア機能に重要な役割も果たしている。加齢などの影響により、セラミド代謝で重要な役割を担っているセリンパルミトイルトランスフェラーゼの産生量が低下すると、角層中のセラミド量が減少し、皮膚の保湿機能やバリア機能の低下を引き起こしていることが報告されている。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用を有する改善剤としては、例えば特許文献１に記載される、環状ジペプチドまたはその塩を有効成分とするものが知られている。

フィラグリンは、表皮顆粒層の顆粒細胞で産生される塩基性タンパク質の一種である。表皮のターンオーバーに従って、顆粒細胞が角質細胞に移行すると、フィラグリンの前駆体であるリン酸化プロフィラグリンは脱リン酸化および限定加水分解を受け、フィラグリンにまで分解される。フィラグリンは角質細胞が下層から上層へと移行する過程で，さらにプロテアーゼの作用でアミノ酸にまで分解され、生成した角層中の遊離アミノ酸は，天然保湿因子（ＮＭＦ）として機能する。また、フィラグリンの一部は，角質細胞の細胞膜を裏打ちするコーニファイドエンベロープに組み込まれるとの報告や、プロフィラグリンの断片ペプチドが表皮角化細胞のアポトーシスに関与するとの報告もあり、皮膚におけるフィラグリンの機能は多岐にわたる。皮膚ダメージによりフィラグリンの発現が顕著に低下した場合、角層中アミノ酸量は低下し、角層水分量の低下やスケーリングなどの異常を示す。フィラグリン産生促進剤としては、例えば特許文献２に記載される、ワイルドタイム抽出物等を含有するものが知られている。

また、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、細胞内の活性を示す生体エネルギーであり、ＡＴＰの産生量を上げることにより、細胞内のエネルギー代謝が促進され、細胞増殖につながり、表皮においてはターンオーバーの促進など角化細胞の活動を活性化させ皮膚の正常化を担う。機能の低下した細胞や老化した細胞では、ＡＴＰ量が減少し、シワ、きめの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を呈することが報告されている。表皮角化細胞内のＡＴＰ産生促進剤としては、例えば特許文献３に記載される、トラネキサム酸またはその誘導体を有効成分とするものが知られている。

セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、表皮角化細胞内ＡＴＰ産生促進作用等の各作用を有する化合物を有効成分とすることにより、皮膚の乾燥、バリア機能の低下、弾力性の低下、くすみシワ等の皮膚の老化症状を、効果的に予防および改善することができると考えられる。

また、従来より皮膚老化の要因として、活性酸素の存在が知られている。活性酸素とは、酸素分子がより反応性の高い化合物に変化したものの総称であり、生体内では日常的に生成されているが、健康なヒトの場合、活性酸素を除去するシステムが働くため酸化障害が顕在化することはない。しかし、紫外線や大気中の有害物質などにより強い酸化ストレスを受けることで、また、老化などにより細胞の活動が低下することで、活性酸素の除去能を上回った活性酸素が生成してしまい、生体内で酸化、特にタンパク質の酸化が進行することが知られている（非特許文献１、２）。生物の構成成分の１つであるタンパク質には、コラーゲン、ケラチンなどの生物の構造に関わる構造タンパク質や、代謝反応を触媒する酵素や生体の活動を調節するホルモンなどの機能タンパク質が存在し、生物にとって特に重要な分子であることから、近年、生体内のタンパク質の酸化についての研究が盛んに行われている。

生体内のタンパク質の酸化は、タンパク質のリジン残基、アルギニン残基、メチオニン残基などが直接酸化される場合と、脂質が酸化して過酸化脂質となり、さらには分解してアクロレイン、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、マロンジアルデヒドなどの反応性が高いアルデヒド化合物となり、これらがタンパク質と結合する場合がある。後者の脂質過酸化反応の終期産物（アルデヒド化合物）がタンパク質と結合する反応は、「カルボニル化反応」とも言われている。

タンパク質のカルボニル化は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体病、トリプレットリピート病、筋委縮性側索硬化症、白内障、動脈硬化、糖尿病性腎症など多くの疾患に関与するだけでなく、肌の透明性や保水性の低下（特許文献４）、皮膚の弾力性の低下（特許文献５）および黄色化（特許文献６）といった皮膚老化にも深く関与することが報告されている。

したがって、生体内のタンパク質のカルボニル化反応を抑制することは、皮膚の老化の予防や改善にも効果があるものと期待されることから、さまざまなカルボニル化抑制剤が検討されている。

例えば、特許文献７には、オリーブ葉エキス、加水分解エンドウタンパク質、レモンエキスから選ばれる１種又は２種以上の有効成分を含んで成る、たんぱく質カルボニル化抑制剤が、特許文献８には、黄杞葉からの抽出物及び／又はハス胚芽からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするタンパク質のカルボニル化抑制剤が提案されている。

特開２０１６−８４３４１号公報特開２００６−１６３３７号公報特開２０１５−３４１５５号公報特開２００５−２４９６７２号公報特開２００６−３４９３７２号公報特開２０１２−２４６２２６号公報特開２０１２−０３１１０６号公報特開２０１２−０４１２７６号公報

Ｌｉｐｉｄｓ，１９９３，ｖｏｌ．２８，ｎｏ．９，ｐｐ７８９−７９３ＷｏｒｌｄＲｅｖｉｅｗｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＤｉｅｔｅｔｉｃｓ, １９８７, ｖｏｌ.５０, ｐｐ１８６−２１４

本発明は、タンパク質のカルボニル化抑制作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、表皮角化細胞内ＡＴＰ産生促進作用等の老化抑制作用を有する化合物を含有する皮膚の老化抑制剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、皮膚老化の予防および／または改善のための皮膚外用剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、老化抑制作用を有し、且つ安全性が高い化合物を探索した。その結果、ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩が、強いカルボニル化抑制作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、表皮角化細胞内ＡＴＰ産生促進作用等の老化抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、式（１）で表されるヒドロキシ安息香酸およびその誘導体：
［式中のＲ１は、水素、メチル基またはグルコシル基を示し、式中のＲ２は、水素、炭素数１から８の直鎖または分岐鎖状の炭化水素基、芳香族炭化水素基、グルコースあるいはソルビトールいずれかの糖残基、からなる群より選択される基を示す］並びにその塩から選択される１以上の化合物を有効成分として含有する皮膚の老化抑制剤（以下、「本発明の老化抑制剤」とも称する）を提供する。

本発明はまた、上記ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩から選択される１以上の化合物を有効成分として含有する、皮膚老化の予防および／または改善のための皮膚外用剤（以下、「本発明の皮膚老化予防／改善用皮膚外用剤」とも称する）を提供する。

タンパク質のカルボニル化反応は、種々の生活習慣病や皮膚老化との関連が示唆されている反応であり、特に、皮膚の弾力性低下および皮膚の黄色化の発生および／または進行に深く関与する。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、および表皮角化細胞内ＡＴＰ産生促進作用は皮膚の老化抑制に深く関与する。本発明者らによりこれらいずれかの作用を有することが見出されたヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩は、皮膚の老化抑制剤として有用である。また、皮膚老化の予防および/または改善、例えば皮膚の黄色化、乾燥、バリア機能の低下、弾力性の低下、くすみ、シワ等の予防、進行の遅延および／または改善のための皮膚外用剤における有効成分として有用である。ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体について、従来、これらの効果に関しては全く知られておらず、このことは本発明者らによって発見された新たな知見である。

本明細書並びに特許請求の範囲おいて、「式（１）で表されるヒドロキシ安息香酸およびその誘導体」という場合、それぞれ単一の化合物である場合、複数の混合物である場合のいずれも包含する。

本明細書並びに特許請求の範囲において、「皮膚老化抑制」とは、皮膚の弾力性低下、黄色化、乾燥、バリア機能の低下、くすみ、シワといった老化を原因とする皮膚トラブルのいずれか１以上を予防する、進行を遅延させる、または改善することを意味する。

ヒドロキシ安息香酸は、高分子材料の原料として広い用途を持ち、そのアルキルエステル類の多くは、化粧品、医薬品、飲料品等の防腐剤として幅広く用いられている。本発明の老化抑制剤の有効成分であるヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩は、合成品であってもよく、植物から抽出、単離されたものであってもよく、市販されているものであってもよい。合成によって得る場合、その合成方法は特に限定されず、従来知られる方法により合成すればよい。

本発明の老化抑制剤に用いられる、ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体としては、具体的に、サリチル酸（ｏ−ヒドロキシ安息香酸）、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸メチルエステル、サリチル酸エチルエステル、サリチル酸プロピルエステル、サリチル酸イソプロピルエステル、ｍ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｍ−ヒドロキシ安息香酸エチルエステル、ｍ−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル、ｍ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソブチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルヘキシルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ベンジルエステル、サリチル酸グルコシルエステル、サリチル酸ソルビトールエステル、ｍ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステル、ｍ−ヒドロキシ安息香酸ソルビトールエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ソルビトールエステル、ｏ−アニス酸、ｍ−アニス酸、ｐ−アニス酸、サリチル酸グルコシルエーテル、サリチル酸ソルビトールエーテル、ｍ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテル、ｍ−ヒドロキシ安息香酸ソルビトールエーテル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ソルビトールエーテル等が挙げられ、これらの塩としては特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、ストロンチウム塩等のアルカリ土類金属塩、ベリリウム塩、マグネシウム塩等の金属塩などがあげられる。

強いカルボニル化抑制作用を有する点では、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステル、サリチル酸ソルビトールエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステル、ｍ−アニス酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルナトリウムが好適に用いられる。中でも、入手の容易性の点で、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステルを用いるのが好ましい。

セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用に優れる点では、ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステルが特に好適に用いられる。また、フィラグリン産生促進作用または表皮角化細胞内ＡＴＰ産生促進作用に優れる点では、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステルを用いるのが好ましい。

上記より、幅広い老化抑制効果を有する点で、ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステルを用いるのがより好ましい。ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩は、単独で用いてもよく、２つ以上を組み合せてもよい。

サリチル酸の糖エステル誘導体を合成する方法としては、特に限定されず、公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サリチル酸メチルと糖を有機溶媒中、触媒の存在下で、１２５〜１５５ｍｍＨｇに減圧し、反応途中に生成するメタノールを除去しながら、８５〜１１０℃で４〜１６時間反応させる方法が挙げられる。該方法における有機溶媒としては、サリチル酸メチルと糖が溶解し、沸点１００〜２５０℃程度である脱水溶媒を用いるのが好ましく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等を用いることができる。また、該方法における触媒としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属アルコキシド等のアルカリ触媒、塩酸、硫酸、硫酸水素ナトリウム、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸等の酸触媒、ジルコニウム化合物、鉛化合物、鉄化合物、亜鉛化合物、有機スズ化合物、アルミニウム化合物、チタン化合物、バナジウム化合物等を用いることができる。

ヒドロキシ安息香酸の糖エステル誘導体を合成する方法としては、特に限定されず、公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸の水酸基をアセチル化した４−アセトキシ安息香酸とアセチル化グルコースの１位の水酸基をブロモ化した２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミドを有機溶媒中にてエステル化反応させた後、反応濃縮液のろ過残渣を有機溶媒中にて強塩基存在下で脱保護（脱アセチル化）させる方法がある。該方法のエステル化反応における有機溶媒としては、４−アセトキシ安息香酸と２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミドが溶解し、室温で液体であり、沸点が８０℃以下である脱水溶媒を用いるのが好ましく、例えば、メタノール、アセトン、エタノール、ジクロロメタン等を用いることができる。また、該方法の脱保護反応における有機溶媒としては、反応生成物が溶解し、常温で液体かつ構成した結合に影響を及ぼさないものを用いるのが好ましく、例えばテトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、プロパノール等を用いることができる。また、該方法の脱保護反応における強塩基としては、アセチル基のみを除去し、得られたエステル体に影響しないものを用いるのが好ましく、例えば、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、ナトリウムメトキシドなどがある。

ヒドロキシ安息香酸の糖エーテル誘導体を合成する方法としては、特に限定されず、公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルとグルコースの水酸基をアセチル化した１，２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノースを有機溶媒中、触媒の存在下で、１２５〜１５５ｍｍＨｇに減圧し、生成するメタノールを除去しながら８５〜１１０℃で１〜８時間反応させ、反応濃縮液のろ過残渣を有機溶媒中にて塩基条件にて脱保護（脱アセチル化）させる方法がある。該方法のエ−テル化反応における有機溶媒としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルと１，２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノースが溶解し、室温で液体であり、沸点が８０℃以下である脱水溶媒を用いるのが好ましく、例えば、ビス（２−メトキシエチル）エーテル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン等を用いることができる。また、該方法のエーテル化反応における触媒としては、例えば、リンモリブデン酸水和物を用いることができる。また、該方法の脱保護反応における有機溶媒としては、反応生成物であるアセチル化エーテル体が溶解し、常温で液体かつイオン交換樹脂に影響を及ぼさないものを用いるのが好ましく、例えばテトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド、ジメチルアミン、メタノール等と精製水の混合物で、精製水１重量部に対して１〜５重量部のものを用いることができる。

本発明の老化抑制剤は、式（１）で表されるヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩を含むものであればよく、その効果を妨げない限り、化粧品、医薬品、医薬部外品等に一般に用いられる賦型剤等を適宜用いて顆粒状、粉末状とする他、適当な溶剤等を用いて液状、エマルション、クリーム、ペースト等としてもよい。これらの賦型剤の種類や配合量は、当業者に周知のものから適宜選択することができる。

本発明の老化抑制剤は、皮膚外用剤、例えば、乳液、美容液、ローション、パック、クリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、化粧下地、リップクリームおよび口紅等の化粧料に配合することができる。本発明の老化抑制剤の、皮膚外用剤への配合量は使用する系により異なり、所望する効果によって適宜調整すればよいが、皮膚外用剤全量に対するヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩の量が、好ましくは０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．０００２５〜３重量％、さらに好ましくは０．０００７５〜１重量％となるように配合されるのがよい。配合量が０．０００１重量％未満の場合、十分な老化抑制効果が発揮されない傾向があり、配合量が５重量％を超える場合、溶解性が低下し安定性が悪くなる傾向がある。

特に皮膚の黄色化の抑制を目的とする場合、皮膚外用剤全量に対するヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩の量は好ましくは０．０５〜５重量％、より好ましくは０．１〜１重量％とすればよい。

また、特に皮膚の乾燥、バリア機能の低下、弾力性の低下、くすみ、シワなどの抑制を目的とする場合、皮膚外用剤全量に対するヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩の量は例えば０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．０００２５〜０．０３重量％、さらに好ましくは０．０００７５〜０．００３重量％とすればよい。

本発明の実施形態に係る化粧料には、必要に応じて通常化粧料や医薬部外品に添加される他の成分、例えば油分、界面活性剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、水溶性高分子、無機顔料、有機顔料、美白剤、抗炎症剤、動植物エキス、香料、ｐＨ調節剤、金属封鎖剤、防腐剤等の化粧料に一般的に配合される添加剤を含有していてもよい。

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下のヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩の、タンパク質のカルボニル化抑制作用と、糖化ダメージを与えたときの、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進効果、フィラグリン産生促進効果および表皮角化細胞内ＡＴＰ産生促進効果を評価し、老化抑制作用を確認した。

＜使用したヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩＞
・ｐ−ヒドロキシ安息香酸（上野製薬株式会社）
・ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（上野製薬株式会社）
・ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルエステル（上野製薬株式会社）
・ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステル（上野製薬株式会社）
・サリチル酸（和光純薬工業株式会社）
・ｍ−アニス酸（東京化成工業株式会社）
・サリチル酸ソルビトールエステル（合成品）
・ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステル（合成品）
・ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテル（合成品）
・ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルナトリウム（合成品）

サリチル酸ソルビトールエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテルおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルナトリウムは下記に示す方法で合成した。

（１）サリチル酸ソルビトールエステルの合成
ＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＮａｔｕｒａｌＣｏｍｐｏｕｎｄｓ，３３（５），５７１−５７３，１９９７に記載の方法に基づいてサリチル酸ソルビトールエステルを合成した。具体的には加熱乾燥した２００ｍｌ容量の４つ口フラスコにソルビトール２７．３ｇを入れ窒素置換し、脱水ジメチルホルムアミド１００ｍｌを加え９０℃に昇温した。この溶液に、サリチル酸メチル６．７ｇ、炭酸カリウム（減圧中ヒートガンであぶって乾燥させたもの）０．７ｇを加えて９０〜９６℃で減圧下で（１４６〜１５２ｍｍＨｇ）、１２時間反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、残渣にメタノール１００ｍｌを加えて１．５時間還流させた。室温まで冷却した後、ろ過で析出物を取り除き、減圧濃縮することで薄茶色の粘稠なオイルを３０．４ｇ得た。得られたオイルをクロマト分取装置（装置：Ｋｐｒｅｐ（株式会社ワイエムシィ）、展開溶媒：メタノール／超純水＝５０／５０、流速：１０ｍｌ/ｍｉｎ）を用いて単離し、薄黄色固体を７．３ｇ得た。この単離物をさらにメタノールで再結晶し、綿状白色固体を１．３ｇ得た。

得られた綿状白色固体の^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ_６）分析により、３．３９−３．６３（ｍ，４Ｈ），３．７８−３．８１（ｍ，１Ｈ），３．９６（ｓ，１Ｈ），４．３０−４．５５（ｍ，６Ｈ），５．１３（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），１０．５７（ｓ，１Ｈ）のシグナルを確認し、以下の式のサリチル酸ソルビトールエステルであることを確認した。

（２）ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステルの合成
Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（８），１７０２−１７０６，２０００に記載の方法に基づいてｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステルを合成した。
（第一工程）
２００ｍＬ容量の４つ口フラスコに４-アセトキシ安息香酸２２．１ｇと８０％アセトン１１１ｍｌを加え、３Ｎの水酸化カリウム水溶液にて中和した。反応液に、３０ｍｌのアセトンに溶解させた２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルブロミド２４．７ｇを滴下し窒素置換条件で室温にて５時間撹拌した。その後、−２０℃にて一晩静置し、約３００ｍＬのアセトンにて洗浄した後減圧濃縮し、淡黄色の固体４１．７ｇを得た。
（第二工程）
１００ｍｌナスフラスコに得られた淡黄色固体を３．０ｇとり、メタノール６０ｍｌを加えて０℃で撹拌しながら、４ｍｏｌ／ｌのナトリウムメトキシド・メタノール溶液を５．２ｍｌ滴下した。反応液を室温にて３時間撹拌した後、強酸性陽イオン交換樹脂にて中和し、精製水と酢酸エチルを加えた。不溶物を濾過にて回収し、真空乾燥した。
上記第二工程を繰り返し、６．３ｇの白〜茶色固体を得た。得られた固体をメタノール／精製水＝３／１の液で再結晶し、最終的に４．０ｇの白色固体を得た。

得られた白色固体の^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ‐ｄ_６）分析により、３．１３−３．６９（ｍ，６Ｈ），４．５８−４．６１（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ,１Ｈ），５．０４（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，1Ｈ），５．３６（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），５．５３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，1Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ）のシグナルを確認し、以下の式のｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステルであることを確認した。

（３）ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテルの合成
特開２００６−２５７０１２号公報に記載の方法を参照してｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテルを合成した。
（第一工程）
２００ｍｌ容量の４つ口フラスコにビス（２−メトキシエチル）エーテル８０ｍｌ、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル１６．７ｇ、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノース１９．５ｇ、ミクロスパチュラ１杯のリンモリブデン・ｎ水和物を入れ、撹拌しながら１０５℃に昇温し、１５０ｍｍＨｇで減圧しながら８時間反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、残渣に精製水２００ｍｌを加えた。この溶液を酢酸エチル２００ｍｌで３回抽出した。抽出層を１０％の水酸化ナトリウム水溶液にて洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝６／１）にて単離し、黄色の粘稠なオイルを１３．８ｇ得た。
（第二工程）
１００ｍｌナスフラスコに得られたオイルを３．０ｇとり、メタノール２０ｍｌと精製水１０ｍｌを加えて０℃に冷却し、１．３ｇ水酸化ナトリウムを精製水１０ｍｌに溶解した水溶液を滴下した。室温にて４時間撹拌した後、強酸性陽イオン交換樹脂にて中和した。精製水を加えて酢酸エチル５０ｍｌで７回抽出し、減圧濃縮した。
上記第二工程を繰り返し、１９ｇの茶色の粘稠なオイルを得た。得られたオイルをクロマト分取装置（装置：Ｋｐｒｅｐ（株式会社ワイエムシィ）、展開溶媒：メタノール／超純水＝０／１００、流速：１０ｍｌ/ｍｉｎ）を用いて単離し、最終的に１．９ｇの白色固体を得た。

得られた白色固体の^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）分析により、３．３８−３．８７（ｍ，６Ｈ），５．０８または５．６１（ｄ，Ｊ＝７．０または３．６Ｈｚ,１Ｈ），７．０３または７．０７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）のシグナルを確認し、以下の式のｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテルであることを確認した。

（４）ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルナトリウムの合成
エタノール１５０．１ｇに、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル５０．０ｇを加え、室温にて撹拌し、溶解させた。溶解液を５℃に冷却し、４８％水酸化ナトリウム水溶液２７．１ｇを５０分間かけて滴下し、冷却した状態で１時間撹拌させた。撹拌終了後、液中の析出物をろ過し、乾燥させ、白色固体のｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルナトリウム３２．４ｇを得た。

実施例１
ｉｎｖｉｔｒｏカルボニル化抑制試験
特開２０１２−２４６２２６号公報に記載の方法を参照し、ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩のアクロレインにより誘導されるコラーゲンのカルボニル化に対する抑制効果を確認した。
使用試薬
基質：９６ウェルコラーゲンプレート(コーニング株式会社）のコラーゲン
カルボニル化誘導試薬：アクロレイン(東京化成工業株式会社）
カルボニル基検出試薬：ビオチンヒドラジド(株式会社同仁化学研究所）

具体的には、１００μＭアクロレインとヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩を溶解して試料溶液を調製した。ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩の濃度は、０．２〜２．０重量％に設定した。ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩を含まない試料溶液には、１００μＭアクロレインおよびサンプルと同量の溶媒を溶解させた（ポジティブコントロール）。これらの試料溶液を、コラーゲンプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注して３７℃で５日間反応させた。なお、アクロレインを含まず、ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩と同量の溶媒を含む溶液についても、同様に試験を行った（ネガティブコントロール）。
５日間反応させたプレートは、界面活性剤（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて洗浄した。その後１．０％ＥＣＬＰｒｉｍｅＢｌｏｃｋｉｎｇＡｇｅｎｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含むＰＢＳ−Ｔ緩衝液を加えて室温で１時間ブロッキングした。再び界面活性剤（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて洗浄した後、１００ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）緩衝液で調製した０．１μＭビオチン−ヒドラジド溶液を各ウェルに１００μＬずつ分注して室温で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液を用いて洗浄した。その後０．１μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識アビジン（ベクター）を各ウェルに１００μＬずつ分注して３７℃で１時間反応させた。さらにＰＢＳ−Ｔ緩衝液を用いて洗浄した後、ＨＲＰの基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン二塩酸塩（ＴＭＢ）を含有する基質溶液（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ）で発色させた。発色反応を止めるため、１Ｎ硫酸溶液を１００μＬずつ加えた。各ウェルについて波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、下記計算式により抑制率を算出した。各濃度についてＮ＝３で抑制率を求め、その平均値によりカルボニル化抑制効果を評価した。
カルボニル化抑制率（％）＝（各試料の吸光度−ネガティブコントロールの吸光度）／（ポジティブコントロールの吸光度−ネガティブコントロールの吸光度）×１００

ヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩を添加した試験区では、コラーゲンのカルボニル化が抑制されていた。結果を表１に示す。

実施例２
ｍＲＮＡ発現量測定試験
以下の方法により、ヒドロキシ安息香酸誘導体のセリンパルミトイルトランスフェラーゼおよびフィラグリンの産生促進効果を評価した。
使用試薬
糖化基質：コラーゲン（ＬＡＣ−３０Ｎａｔｉｖｅｃｏｌｌａｇｅｎ）（株式会社高研）上で培養したヒト不死化表皮角化細胞
糖化誘導試薬：グリセルアルデヒド（和光純薬工業株式会社）

具体的には、直径３５ｍｍｄｉｓｈにコラーゲン酸性溶液（ＬＡＣ−３０Ｎａｔｉｖｅｃｏｌｌａｇｅｎ）０．５ｍＬを加え、１時間静置した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後に５０ｍＭグリセルアルデヒド溶液を加え、湿潤状態下の３７℃のインキュベーターで３日間静置した。非糖化試験区には、グリセルアルデヒドを含まないＰＢＳを添加した。ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＭＥＭ培地を１ｍＬ加え、さらに１日インキュベーションした。ＤＭＥＭ培地を吸い取り、３００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬヒト不死化表皮角化細胞を含む２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を５００μＬずつ加え、１日静置した。上澄み液を取り除き、ＰＢＳを用いて洗浄した。２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（コントロール）または被検物質が０．００１５重量％となるように溶解した２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地５００μＬずつ加え、２日静置した。２日間培養後にＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉｋｉｔ）を用いてＲＮＡを抽出した。ＯｎｅＳｔｅｐＳＹＢＲＲＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ−ＰＣＲＫｉｔＩＩを用いて、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴＬＣ）およびフィラグリンのｍＲＮＡ発現、およびハウスキーピングジーンとしてG３ＰＤＨのｍＲＮＡ発現をｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ（ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ）で測定した。プライマーは、ＲＴ^２ｑＰＣＲＰｒｉｍｅｒＡｓｓａｙｆｏｒＨｕｍａｎＦＬＧ（Ｑｕｉａｇｅｎ）およびＲＴ^２ｑＰＣＲＰｒｉｍｅｒＡｓｓａｙｆｏｒＨｕｍａｎＳＰＴＬＣ２（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いた。試験はｎ＝３で実施した。得られた増殖曲線からスレッショルドサイクル（Ｃｔ）を求め、ハウスキーピングジーンと目的遺伝子のＣｔ値の差（ΔＣｔ：［ＴａｒｇｅｔｇｅｎｅＣｔ］−［ＨｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇｇｅｎｅＣｔ］）を求め、非糖化試験区のΔＣｔと各試験区間のΔＣｔの差（ΔΔＣｔ）から遺伝子発現量比（２^{−（ΔΔＣｔ）}）を求めた。

ヒドロキシ安息香酸誘導体を添加した試験区では、セリンパルミトイルトランスフェラーゼおよびフィラグリンにおいて、コントロールよりもｍＲＮＡ発現量の減少が抑制されていた。結果を表２および表３に示す。

実施例３
ヒト表皮角化細胞内ＡＴＰ量測定試験
以下の方法により、ヒドロキシ安息香酸誘導体のヒト表皮角化細胞内ＡＴＰ産生促進効果を評価した。
使用試薬
糖化基質：コラーゲン（ＬＡＣ−３０Ｎａｔｉｖｅｃｏｌｌａｇｅｎ）（株式会社高研）上で培養したヒト不死化表皮角化細胞
糖化誘導試薬：グリセルアルデヒド（和光純薬工業株式会社）
ＡＴＰ検出試薬：ＡＴＰ測定試薬（東洋インキ製造株式会社）

具体的には、９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅにコラーゲン１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、１時間静置した後、さらにグリセルアルデヒド４５ｍｇ／ｍＬを１６．７μＬ添加し、３日間静置した。非糖化試験区には、グリセルアルデヒドを含まないＰＢＳを添加した。３日間静置後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて洗浄した。１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヒト不死化表皮角化細胞を含む２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を１００μＬ添加し１日静置した。２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（コントロール）または被検物質が０．０００７５〜０．００３重量％となるように溶解した２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地１００μＬ／ｗｅｌｌに交換して４日間培養した。ＡＴＰ検出試薬を加え、３０分後の発光強度を測定し、ＡＴＰ量とした。

ヒドロキシ安息香酸誘導体を添加した試験区では、コントロールよりもＡＴＰ量の減少が抑制されていた。結果を表４に示す。

実施例４
化粧水の製造
表５に示す割合で各成分を配合し、化粧水を製造した。該化粧水は、本発明の皮膚老化予防／改善用皮膚外用剤の一形態である。

実施例５
乳液の製造
表６に示す割合で各成分を配合し、乳液を製造した。該乳液は、本発明の皮膚老化予防／改善用皮膚外用剤の一形態である。

実施例６
乳液の製造
表７に示す割合で各成分を配合し、乳液を製造した。該乳液は、本発明の皮膚老化予防／改善用皮膚外用剤の一形態である。

実施例７
クリームの製造
表８に示す割合で各成分を配合し、クリームを製造した。該クリームは、本発明の皮膚老化予防／改善用皮膚外用剤の一形態である。

実施例８
クリームの製造
表９に示す割合で各成分を配合し、クリームを製造した。該クリームは、本発明の皮膚老化予防／改善用皮膚外用剤の一形態である。

Claims

式（１）で表されるヒドロキシ安息香酸およびその誘導体：
［式中のＲ１は、水素、メチル基またはグルコシル基を示し、式中のＲ２は、水素、炭素数１から８の直鎖または分岐鎖状の炭化水素基、芳香族炭化水素基、グルコースあるいはソルビトールいずれかの糖残基、からなる群より選択される基を示す］
並びにその塩から選択される１以上の化合物を有効成分として含有する皮膚の老化抑制剤。
式（１）で表されるヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩が、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステル、サリチル酸ソルビトールエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステル、ｍ−アニス酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテルおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルナトリウムから選択される１以上である請求項１に記載の皮膚の老化抑制剤。
皮膚の老化抑制が、タンパク質のカルボニル化抑制作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用、フィラグリン産生促進作用、および表皮角化細胞内ＡＴＰ産生促進作用から選択される１以上に起因するものである請求項１または２に記載の皮膚の老化抑制剤。
式（１）で表されるヒドロキシ安息香酸およびその誘導体：
［式中のＲ１は、水素、メチル基またはグルコシル基を示し、式中のＲ２は、水素、炭素数１から８の直鎖または分岐鎖状の炭化水素基、芳香族炭化水素基、グルコースあるいはソルビトールいずれかの糖残基、からなる群より選択される基を示す］
並びにその塩から選択される１以上の化合物を有効成分として含有する、皮膚老化の予防および／または改善のための皮膚外用剤。
式（１）で表されるヒドロキシ安息香酸およびその誘導体並びにその塩が、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸イソプロピルエステル、サリチル酸ソルビトールエステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエステル、ｍ−アニス酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸グルコシルエーテルおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルナトリウムから選択される１以上である請求項４に記載の皮膚外用剤。
化粧料である、請求項４または５に記載の皮膚外用剤。
乳液、美容液、ローション、パック、クリーム、ハンドクリーム、ファンデーション、化粧下地、リップクリームおよび口紅からなる群より選択される形態のものである、請求項６に記載の皮膚外用剤。