JP5448384B2

JP5448384B2 - 新規抗酸化性化合物、それを有効成分とする抗酸化剤、及びその製造方法

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Publication number: JP5448384B2
Application number: JP2008191743A
Authority: JP
Inventors: 三雄宮澤; 康隆村椿; 博之中田; 俊樹森
Original assignee: DKS CO. LTD.; Kinki University
Current assignee: DKS CO. LTD.; Kinki University
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2028-07-25
Also published as: JP2010030907A

Description

本発明は、新規な抗酸化性化合物、それを有効成分とする抗酸化剤、及びその製造方法に関する。

活性酸素種は、反応性が高いものが多く、体内に侵入する微生物等に対して殺菌作用を示し、生体への感染を防いでいる。活性酸素種としては、還元分子種であるスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ_２ ⁻）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）および励起分子種である一重項酸素（^１Ｏ_２）などが知られている。

しかしながら、加齢・ストレスに伴う細胞機能の低下等により活性酸素種が過剰に蓄積される結果、活性酸素種が細胞構成成分を攻撃し、様々な疾病の原因となる。例えばこれらの活性酸素種が引き起こす疾病としては、動脈硬化性疾患、癌・腫瘍性疾患、皮膚の老化・色素沈着、しわ、白内障・網膜疾患、消化器等が知られている。

以上のことから、活性酸素種の消去能を有する食品や化粧品、医薬品の開発が望まれている。

天然由来のトコフェロールやアスコルビン酸等は、安全性は高いが、活性酸素消去機能は小さい上、安定性に欠ける等の問題点がある。

そのため、安全で且つ活性酸素種の消去効果が高い抗酸化剤の開発が望まれている。

特許文献１では、アブラナ科ブラシカの花部、種子、葉部、茎部、又はこれらを含む地上部の抽出物が、スーパーオキサイド消去作用、過酸化水素消去作用及びラジカル消去作用を兼ね備えていることが開示されているが、これらの作用を有する化合物を特定していない。
特開２００３−８１８４８号公報

本発明は、新規な抗酸化性物質、それを有効成分とする抗酸化剤及びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、上記目的を達成するため、一般式［１］：

（式中、Ｒ¹はアシル化されていてもよいヒドロキシメチル基、アルデヒド基、カルボキシル基、又はエステル基を表し、R²〜R⁴は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、又はメトキシ基を表す）で示される化合物、それを有効成分とする抗酸化剤、及びそれを含有する食品組成物又は化粧料を提供する。

更に、化合物［１］の製造方法であって、
一般式［a］：

（式中、R⁵〜R⁷は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、又はメトキシ基を表す）で示される化合物と、
一般式［b］：

（式中、Ｒ⁸はアシル化されていてもよいヒドロキシメチル基、アルデヒド基、カルボキシル基、又はエステル基を表す）で示される化合物と反応させることを特徴とする製造方法を提供する。

また、ブロッコリーからの抽出物を精製することを特徴とする化合物［１］の単離方法を提供する。

新規化合物［１］は、高い抗酸化活性を有しており、抗酸化剤として用いることができることが見出された。

また、新規化合物［１］を含有する食品組成物は、活性酸素等が一因となって引き起こされる疾患又は症状を改善及び／又は予防できるという効果を有し、新規化合物［１］を含有する化粧料は、活性酸素種が原因となる皮膚の老化・色素沈着を予防し、皮膚の老化予防又は美白効果を奏する。

更に、本発明の製造方法により、新規化合物［１］を化学合成することもできる。

以下、本発明を詳細に説明する。
抗酸化性化合物
本発明の抗酸化性化合物は、下記一般式［１］で示される化合物である。

式中、Ｒ¹はヒドロキシメチル基、アルデヒド基、カルボキシル基、又はエステル基を表し、当該ヒドロキシメチル基はアシル化されていてもよい。式中のR²〜R⁴は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、又はメトキシ基を表す。
アシルとは、アルカノイル及びアルコキシカルボニルを意味し、好ましくは、C_1-6アルカノイル及びC_1-6アルコキシカルボニルである。C_1-6アルカノイルの具体例としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル等である。C_1-6アルコキシカルボニルの具体例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル等である。

エステル基とは、カルボキシル基がエステル化された基である。例えば、カルボキシル基が、炭素数が１〜３の第１級アルコールとエステル化された基が挙げられる。

本発明の化合物［１］の好ましい化合物としては、下記一般式［２］で示される化合物である、５−ホルミル−２−フルフリルシナペート及び５−ヒドロキシメチル−２−フルフリルシナペートが挙げられる。

（式中、Ｒ⁹はアルデヒド基又はヒドロキシメチル基を表す）
化合物［１］の単離
本発明の化合物［１］は、化合物［１］を含む植物、より好ましくはアブラナ科植物、最も好ましくはブロッコリー(Brassica oleracea var. italica)から単離することができる。これらの植物の使用する部位は、花部、葉部、茎部、根部、種子及び果実であり、好ましくは種子である。

化合物［１］の単離方法は、単離が可能であれば制限はされないが、例えば、抽出及び精製の工程を行うことが挙げられる。ここで抽出は、溶媒を加熱還流することや、溶媒に浸漬することにより行うことができる。浸漬する溶媒の温度は室温〜溶媒の沸点であることが好ましい。ここで使用する溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン系溶媒、及び酢酸エチル等のエステル類が挙げられる。精製は、順相分配クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーや蒸留により行うことができる。精製効率を上げる観点から、複数の精製方法を併用しても構わない。抽出や精製に加えて、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、ブタノール等の各種溶媒を用いた転溶を行うことができる。

化合物［１］の製造方法
一般式［a］：

（式中、Ｒ⁸はアシル化されていてもよいヒドロキシメチル基、アルデヒド基、カルボキシル基、又はエステル基を表し、アシルとエステル基の定義は前記の定義と同じである）で示される化合物とを反応させることによって化合物［１］を製造することもできる。

化合物［a］、［b］は共に、自体公知の方法により製造することができるか、或いは市販されているので容易に入手することができる。

化合物［１］は、化合物［a］と［b］とを脱水反応させて化学合成することもできるが、光延反応を用いて化学合成するのがより簡便である。

この光延反応は、公知の反応試薬、例えば、トリフェニルホスフィンとアゾジカルボン酸ジエチル又はアゾジカルボン酸ジイソプロピルを用いて行うことができ、通常、無水条件下で行われる。使用する溶媒は、例えばトルエン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、及びジメチルホルムアミドが挙げられる。これらの溶媒はそれぞれ単独で、或いは２種以上混合して用いられる。

この反応は、化合物［b］に対して、化合物［a］を、通常、１当量使用する。この反応の反応温度は約-78℃から室温であり、反応時間は約30分〜約2時間である。

化合物［a］と［b］を反応させて直接化合物［１］を製造する以外に、Ｒ^１がアルデヒド基である化合物［１］を上記の方法により合成した後、還元反応によりＲ^１がヒドロキシメチル基である化合物［１］を製造することもできる。

この還元には、公知の還元剤を用いることができるが、例えば、水素化ホウ素ナトリウムが挙げられる。還元剤の濃度は、還元剤の種類等により、適宜決定できる。使用する溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、及びジメトキシエタンが挙げられる。

この還元の反応温度及び反応時間は、用いる還元剤の種類等により異なるが、通常、反応温度は約0℃〜室温であり、反応時間は約10分〜約2時間である。

また、Ｒ^１がアルデヒド基である化合物［１］の公知の酸化反応によりＲ^１がカルボキシル基である化合物［１］を製造でき、Ｒ^１がカルボキシル基である化合物［１］の公知のエステル化反応により、Ｒ^１がエステル基である化合物［１］を製造でき、Ｒ^１がヒドロキシメチル基である化合物［１］の公知のアシル化反応により、Ｒ^１がアシル化されたヒドロキシメチル基である化合物［１］を製造できる。

化合物［１］を有効成分とする抗酸化剤
本発明の化合物［１］は、天然抗酸化剤リコペンに比べ、高い抗酸化性を示すことから、化合物［１］は、抗酸化剤として用いることができる。

具体的には、化粧料、食品組成物等の含有成分として本発明の化合物［１］を用いることができる。

食品組成物としては、例えば、粉末、錠剤、顆粒、タブレット、チュアブルタブレット、カプセル、ソフトカプセル、飲料等の食品組成物が例示される。この場合、食品組成物における化合物［１］の含量は、例えば、0.001〜10重量％、好ましくは0.01〜1.0重量％である。

本発明の食品組成物は、化合物［１］の抗酸化作用により、活性酸素等が一因となって引き起こされる疾患又は症状を改善及び／又は予防し得る機能性食品組成物である。

化粧料としては、皮膚、顔皮、口唇等に適用されるあらゆる化粧料が含まれ、本発明の化粧料の用途は、例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック、ファンデーション、口紅、アイシャドー、ボディーローション、ボディークリーム、クレンジングフォーム、洗顔料、ハンドソープ、ボディーソープ等に用いることができる。

本発明の化粧料における化合物［１］の含量は、特に限定されないが、例えば、0.0001〜10重量％、好ましくは0.01〜1.0重量％である。

本発明の化粧料は、化合物［１］の抗酸化作用により、活性酸素種が原因となる皮膚の老化・色素沈着を予防し、皮膚の老化予防又は美白効果を奏し得る。

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。

1. ブロッコリー種子の抽出および転溶
1.2kgの粉砕したブロッコリー種子をソックスレー抽出器を用いてMeOHで6時間加熱還流を行って抽出した。得られたMeOH抽出物（105g）をヘキサン、CH₂Cl₂、EtOAc、BuOHの各種溶媒を用いて順次転溶を行い、DPPH法を指標としてTLC上で抗酸化活性物質を追跡しながら、活性物質の単離を試みた。CH₂Cl₂ext.からは、Rf値0.6 (化合物1)および0.5 (化合物2)に強い活性が検出され、これら2種の化合物を単離することに成功した。

また、EtOAc ext.からは、Rf値0.4に活性を示さない少量成分(化合物3)を単離し、さらにRf値0.35 にDPPH抗酸化能の活性が検出された化合物(化合物4)の単離にも成功した。図１に化合物1〜4の抽出、転溶の行程を示す。

2. 化合物1および2の単離
CH₂Cl₂ext.からSiO₂カラムクロマトグラフィーを用いてCH₂Cl₂:EtOAc系、及びヘキサン:EtOAc系で順次分画を行い、抗酸化活性の強い化合物1を単離した。その化学構造は各種スペクトルからtrans-シナピン酸メチルであると決定した。

さらに今回、fr. 3-4からSiO₂カラムクロマトグラフィーを用いて抗酸化活性を有する新規化合物2を単離した。図２にCH₂Cl₂ ext.の分画を示す。

3. 化合物１および2の構造決定
化合物１の化学構造は各種スペクトルデータから既知化合物であるtrans-シナピン酸メチルであると決定した。

化合物2の化学構造については各種スペクトルデータを解析することにより、新規化合物である５−ホルミル−２−フルフリルシナペートであると決定した。

m.p. 105-106.5℃
HR-EIMS:m/z 332.0902[M]⁺(calcd. for C₁₇H₁₆O₇ 332.0884)
EI-MS m/z(relative intensity, %)
332[M]⁺(100), 223(34), 207(75), 180(30), 124(18), 109(60), 44(48), 40(44),
IR(KBr, v_max, cm^-1): 3404, 2943,2843, 1707, 1676
4. 化合物3および4の単離
EtOAc ext. からは、SiO₂カラムクロマトグラフィーを用いてCH₂Cl₂: アセトン系、CH₂Cl₂: MeOH系で順次分画を行い、fr. 2から化合物3を単離した。またfr. 4より強い抗酸化能を示す化合物4を単離した。図3にEtOAc ext.の分画を示す。

5. 化合物３および４の構造決定
化合物3の化学構造は各種スペクトルデータから既知化合物である５−ヒドロキシメチル−２−フルアルデヒドであると決定した。

化合物4の化学構造は各種スペクトル解析より新規物質５−ヒドロキシメチル−２−フルフリルシナペートであると決定した。

m.p. 156-157℃
HR-EIMS:m/z 334.1042 [M]⁺(calcd. for C₁₇H₁₈O₇ 334.1053)
EI-MS m/z(relative intensity, %)
334[M]⁺(8), 316(310), 290(7), 224(100), 207(23), 180(13), 111(36), 94(35),
IR(KBr, v_max, cm^-1): 3404, 2943,2843, 1707, 1676
6. 化合物2および4の化学合成
下記合成に用いた試薬は、いずれも和光純薬工業製である。

新規化合物２の合成
５−ヒドロキシメチル−２−フルアルデヒド500 mg(3.97 mmol), トリフェニルホスフィン1.04 g(3.97 mmol), シナピン酸890 mg(3.97 mmol) を無水テトラヒドロフラン20 mlに溶解し、氷冷撹拌下にアゾジカルボン酸ジイソプロピル780 μl(3.97 mmol) を3分間にて滴下する。同温度にて30分撹拌後、室温にて2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、残渣を中圧カラムクロマトグラフィー(Hex:EtOAc=1:2) にて精製し、化合物2を1.14 g (収率87%) 得た。アセトン-Hex から結晶化し淡黄色の無定形晶 m.p. 105〜106.5℃を得た。

新規化合物４の合成
化合物2 100 mg (0.3 mmol) をEtOH 2 ml とテトラヒドロフラン 1 mlの混合液に溶解し、氷冷撹拌下、水素化ホウ素ナトリウム 11 mg (0.3 mmol) を加え、室温にて20分間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液 2 ml を加え、EtOAcとテトラヒドロフラン(2:1)の混合液にて抽出し、飽和食塩水にて洗浄した。乾燥後、溶媒を留去し結晶性残渣を得た。EtOAc から結晶化し無色の無定形晶90 mg (収率90%)を得た。m.p. 156〜157℃

合成品2および4は天然物の各種スペクトルと完全に一致した事から、それぞれの化学構造は５−ホルミル−２−フルフリルシナペート(2)、５−ヒドロキシメチル−２−フルフリルシナペート(4)であると確証された。

7. ブロッコリー種子抽出物の評価結果
ブロッコリー種子より得られた抗酸化成分（化合物２、化合物４）のＤＰＰＨラジカル消去能を評価した。天然抗酸化剤リコペンに比べ、いずれも高い抗酸化性を示した（図４）。

実験方法
400μMのDPPH溶液0.9mL、エタノール0.9mL、0.2M MES（2-モルホリンエタンスルホン酸）バッファー（pH6.0） 0.9mLに、試料溶液ａmLと5%エタノール（0.9-ａ）mLを加え、室温で20分反応させた後に520nmの吸光度を測定した（Abs（S））。ａ＝０の吸光度を測定し（Abs（C））、式１によりラジカル消去率を求めた。
（式１）ラジカル消去率＝[Abs（C）−Abs（S）]／Abs（C）×100

ブロッコリー種子の転溶行程を示す図である。 CH₂Cl₂ ext.の分画を示す図である。 EtOAc ext.の分画を示す図である。ブロッコリー種子由来成分の抗酸化能を示すグラフである。

Claims

一般式［１ａ］：

（式中、Ｒ¹はアシル化されていてもよいヒドロキシメチル基、又はエステル化されていてもよいカルボキシル基を表し、R²〜R⁴は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、又はメトキシ基を表す）で示される化合物。
一般式［１］：

（式中、Ｒ¹ はヒドロキシメチル基、又はアルデヒド基を表し、R²〜R⁴は、同一又は異なって、ヒドロキシ基、又はメトキシ基を表す）で示される化合物を有効成分とする抗酸化剤。
請求項１に記載の一般式［１ａ］で示される化合物の製造方法であって、
一般式［a］：

（式中、R⁵〜R⁷は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、又はメトキシ基を表す）で示される化合物と、
一般式［b］：

（式中、Ｒ⁸はアシル化されていてもよいヒドロキシメチル基、又はエステル化されていてもよいカルボキシル基を表す）で示される化合物と反応させることを特徴とする製造方法。
５−ホルミル−２−フルフリルシナペート又は５−ヒドロキシメチル−２−フルフリルシナペートの単離方法であって、ブロッコリーからの抽出物を精製することを特徴とする単離方法。