KR101712643B1

KR101712643B1 - 택시폴린 또는 그 유도체를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101712643B1
Application number: KR1020160104399A
Authority: KR
Inventors: 이재덕; 안현진; 이용섭; 이용화; 윤영경
Original assignee: 여명바이오켐 주식회사
Priority date: 2016-08-17
Filing date: 2016-08-17
Publication date: 2017-03-06

Abstract

본 발명은 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 천년초 추출물, 그로부터 유래한 분획물, 그 분획물로부터 분리한 택시폴린(taxifolin) 및 택시폴린의 유도체인 택시폴린 테트라 옥타노에이트 (taxifolin tetra octanoate)는 우수한 피부 미백효과를 발휘한다.

Description

택시폴린 또는 그 유도체를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for skin whitening with taxifolin or its derivative}

본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 택시폴린 또는 그 유도체를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

국내 화장품 개발에 이용되는 화장품 원료는 대부분 수입에 의존하고 있으며, 화장품 산업의 발전에 따라 원료의 수입량은 지속적으로 증가하여 2010년 1.45억 달러에 달하고 있다. 주 수입국은 일본, 미국, 독일, 프랑스 등 화장품 선진국으로 불리는 국가들이며, 이들 국가에 대한 의존도가 상당히 높은 편이다. 전 세계 무한경쟁의 시대를 맞이하여 국내 화장품산업의 국내외 경쟁력 강화 및 수출 상품으로의 육성을 위해서는 국내 자원의 고기능성 개발을 통한 수입 원료의 대체, 국산원료의 수출 상품화 및 나아가 국내 화장품의 고급화가 지속적으로 요구되고 있다.

고령화 사회로의 진입은 국내외 피부노화 관련 연구가 활발하도록 하게 하는 촉매 역할을 하고 있다. 피부 노화는 나이가 들어감에 따라 자연적으로 발생하는 내인성 노화와 자외선, 매연, 흡연 등의 환경 스트레스에 의한 외인성 노화에 기인하며, 노화가 진행됨에 따라 피부 내에서 나타나는 변화로는 기미, 주근깨 등의 과색소 침착, 탄력 저하, 주름 증가 및 각종 피부염 발생을 들 수 있다.

한편, 미백활성을 갖는 소재는 흑화의 원인인 멜라닌의 생성경로에 따라 많은 연구가 이루어 지고 있다. 티로시나제의 활성을 억제하는 알부틴, 감초추출물, 닥나무추출물 등과 티로시나제 발현을 억제하는 Melasolv, 멜라닌 합성을 차단하는 아스코르브산 및 그 유도체, 코엔자임 Q10과 같이 멜라노좀이 각질세포로 이동되는 것을 차단시켜 주는 원료 등이 개발되어 있다.

그런데, 미백제로 사용하던 코직산(kojic acid)의 발암성 문제가 제기되면서, 알부틴이나 아스코르브산 등의 원료로 대체되었다. 멜라노사이트 세포주인 Mel-Ab 세포에 대하여 강력한 멜라닌 생합성 저해활성을 보이는 테레인(Terrein)이 개발되었으며, 이는 코직산보다 10배 이상의 활성을 보이는 것으로 발표된 바 있다.

화장품의 원료로 천연물을 활용한 역사는 오래되었는데, 일본에서는 예부터 미강(米糠)이나 수세미물 등을 이용하여 피부를 가꿔왔고, 중국에서는 ‘외태비요(外台秘要)’‘천금익방(千金翼方)’‘천금미용방(千金美容方)’등에 나타나 있는 바와 같이 이미 약초를 화장품으로 이용하고 있었다. 현재 일본 공정서인 ‘화장품원료기준’‘화장품종별배합성분규격’에는 총 272품목의 식물추출성분 67품목의 식물유가 기재되어 있고, 기타 각 사가 독자적으로 사용실적을 얻고 있는 물질까지 합치면 400품목 이상의 식물성분이 화장품에 이용되고 있다. 우리나라에서도 화장품의 주요 원료를 수입에 의존하던 것에서 탈피하여 우리나라 여성들의 피부에 적합한 한방이나 생약성분의 신소재를 개발하여 제품화하는 움직임이 활발히 일고 있다.

한편, 천년초는 선인장과(Cactaceae)에 속하는 식물로 선인장의 일종으로 손바닥 선인장으로 불리며 예로부터 식용이나 식품 대용으로 사용되고 있다. 선인장의 줄기와 열매는 동맥경화, 당뇨병, 위장염, 고혈당 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 천년초 선인장은 널리 국내에 분포되어 재배되고 있으며, 기능성 식품소재로도 사용되고 있다. 천년초 선인장의 기능에 관한 연구로는 항산화효과, 항균효과, 위궤양 치유효과, 간기능 보호효과 등이 있다. 그 외에 기관지, 천식, 기침, 폐질환, 위염, 변비, 장염, 신장염, 고혈압, 당뇨, 신경통, 관절염에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 상기와 같은 효과가 알려진 천년초 선인장으로부터, 피부미백용 소재를 발굴하여, 화장품 원료로 개발하여 제공하고자 한다.

대한민국 특허등록번호 제10-1500551호 (등록일자 2015.03.03)로, 하이드록시시트릭산(hydroxycitric acid)을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물이 기재되어 있다.

본 발명에서는 천년초 추출물을 이용한 피부미백용 화장료 조성물을 개발하여 제공하고자 하는데, 더욱 구체적으로는 천년초 추출물로부터 피부의 항산화 및 미백 물질인 택시폴린(taxifolin)을 추출 분리하고, 이것 또는 이것의 유도체를 이용한 피부미백용 화장품을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 천년초(Opuntia humifusa) 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부미백용 화장료 조성물에 있어서, 상기 추출물은 일 예로, 천년초의 잎 또는 열매에 메탄올을 첨가하여 메탄올 추출물을 수득하고 건조시키는 단계 (a); 및 상기 건조된 메탄올 추출물에 물과 n-헥산을 첨가하여 분획하는 단계 (b);를 포함하는 과정으로부터 회수되는 물층 분획 추출물인 것일 수 있다. 이때, 회수된 물층 분획 추출물은 추가적으로 건조시켜 분말형태로 제조한 후 사용될 수도 있다. 또한, 분말로 제조 후, 부틸렌글리콜 등의 별도 용매를 추가하여 2차 추출물을 수득한 후, 사용될 수 있다. 또한, 분말을 부틸렌글리콜에 용해 또는 현탁시켜 액상으로도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부미백용 화장료 조성물에 있어서, 상기 추출물은 일 예로, 천년초의 잎 또는 열매에 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 수득하고 건조시키는 단계 (a); 상기 건조된 에탄올 추출물에 물과 헥산을 첨가하여 분획하는 단계 (b); 상기 단계 (b)로부터 물 층을 분리한 후, 물 층에 클로로포름을 가하여 분획하는 단계 (c); 및 상기 단계 (c)로부터 물 층을 분리한 후, 물 층에 에틸아세테이트를 가하여 분획하는 단계 (d);를 포함하는 과정으로부터 회수되는 에틸아세테이트 분획 추출물인 것일 수 있다. 이때, 회수된 에틸아세테이트 분획 추출물은 추가적으로 건조시켜 분말형태로 제조한 후 사용될 수도 있다. 또한, 분말로 제조 후, 부틸렌글리콜 등의 별도 용매를 추가하여 2차 추출물을 수득한 후, 사용될 수 있다. 또한, 분말을 부틸렌글리콜에 용해 또는 현탁시켜 액상으로도 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 택시폴린(taxifolin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 택시폴린 테트라 옥타노에이트 (taxifolin tetra octanoate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.

[화학식 2]

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 일 예로 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 일 예로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로써, 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일 예로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로써 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

본 발명의 천년초 추출물, 그로부터 유래한 분획물, 그 분획물로부터 분리한 택시폴린(taxifolin) 및 택시폴린의 유도체인 택시폴린 테트라 옥타노에이트 (taxifolin tetra octanoate)는 우수한 피부미백효과를 발휘하는바, 피부미백용 화장료 제조되어 사용될 수 있다.

도 1은 '추출방법 1'에 따라 추출한 천년초 추출물의 HPLC 분리 결과이다. A: 표준품 택시폴린, B: 천년초 조추출물, C: 택시폴린 표준품과 분획물의 PDA 스펙트럼.
도 2는 천년초 70% 에탄올 추출물의 분획 과정 및 분획 결과를 보여준다.
도 3은 천년초 70% 에탄올 추출물의 분획물에 대한 TLC 이미지이다.
도 4는 택시폴린으로부터 택시폴린 테트라 옥타노에이트의 합성 과정을 보여준다
도 5는 멜라닌 합성의 기전을 보여준다.
도 6은 멜라노마 셀 (melanoma cell)에서 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, MITF 단백질 발현에 대한 택시폴린 테트라 옥타노에이트의 효과를 보여준다.
도 7은 멜라노마 셀 (melanoma cell)에서 ERK 활성화에 대한 택시폴린 테트라 옥타노에이트의 효과를 보여준다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 천년초로부터 택시폴린의 추출]

가. 실험 재료

본 실험에 사용된 천년초(Opuntia humifusa)는 충청남도 아산에서 재배된 것으로 줄기 분말 형태로 구매하여 사용하였다.

나. 천년초 추출 방법

(1) 추출방법 1

천년초는 잎과 열매 형태로 구분되어 있으며, 각각 열매와 잎의 분쇄된 천년초가루 50 g를 메탄올 500 mL를 첨가하여 교반한 후, 상온에서 24시간 동안 추출하였다. 이와 같은 과정을 2회 반복해준 뒤 n-헥산 용매를 이용하여 수층만을 분리하여 실험에 사용하였다.

분리된 수층을 감압농축한 여액으로부터 HPLC를 이용하여 택시폴린(taxifolin)을 분리하였다. 분리 조건은 표 1에 나타내었으며, 분석용 컬럼은 Polaris 5 (250 x 4.6mm, 180Å, C18-A, Varian)를 사용였다. 택시폴린의 분리는 표준품을 미리 분석하고, 동일한 시간대에서 용출되는 분획을 분획 수집기 (fraction collector)를 이용하여 분리하였다. 표준품으로는 시그마 사에서 구입한 택시폴린을 1 mM의 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용하였다.

(2) 추출방법 2

천년초 줄기 분말 100 g에 70% 에탄올 1L를 가하여 80℃에서 3시간 동안 환류냉각 추출하였다. 추출물은 감압여과하고, 여과물에 추출용매를 가하여 같은 조건으로 추출과정을 2회 반복하였다. 이렇게 얻은 여과액을 감압농축하여 추출물을 얻었다.

추출물은 DW에 용해한 후 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸 아세테이트 (ethyl acetate), 부탄올(butanol)을 순차적으로 1시간 동안 교반하여 분획하였다. 각각 용매마다 3회씩 반복하였다. 용매 분획물은 감압농축하여 건조하였다. 택시폴린 함량이 가장 많은 에틸아세테이트 분획을 실리카켈컬럼으로 정제하였다. 정제물은 HPLC로 정량 분석하였다.

다. 천년초 추출 결과

(1) 추출방법 1

① HPLC를 이용한 택시폴린의 분리·정제

천년초에서 추출한 추출물의 택시폴린을 HPLC를 이용하여 순수분리하였다. 분리조건은 표 1에 표시하였다. 택시폴린 표준품과 동일한 시간대에서 천년초 줄기 추출물의 분획을 분리하였고(도 1의 A, B), 표준용액과 천년초 추출물의 동일한 시간대의 PDA 스펙트럼을 측정하였을 때, 거의 동일한 패턴의 스펙트럼 (도 1의 C)을 확인할 수 있었다. 이러한 방법으로 천년초 건조분말 50 g에서 26.17 mg의 택시폴린을 회수하였다.

택시폴린의 분리를 위한 HPLC 조건

Instrument	Condition
Column	250×4.6mm, 180Å, C18-A, Varian
Mobile phase	Time	A	B
	Time	1% acetic acid in H₂O	Acetonitrile
	Initial	99	1
	4:30	97	3
	6:00	96	4
	7:30	93	7
	13:00	86	14
	14:00	85	15
	19:00	76	24
	24:00	60	40
	34:00	60	40
	40:00	99	1
Detector	PDA detector, 280 nm
Flow rate	0.8 mL/min
Injection volume	10 μL

(2) 추출방법 2

① 분획 용매별 추출 수율

70% 에탄올로 추출한 천년초 줄기 추출물과 극성에 따라 순차적으로 용매 분획한 분획물의 수율을 측정한 결과는 표 2 및 도 2와 같았다. 70% 에탄올 추출물의 수율은 26.4%였고, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획한 수율이 각각 13.8%, 0.96%, 2.82%, 15.5%, 60.9%로 나타나, 물 분획에서 가장 높았고, 클로로포름에서 가장 낮았다. 따라서, 천년초 줄기추출물은 극성이 높은 물질이 많이 함유되어 있는 것으로 판단되었다.

분획 용매 별 수율

용매	수율(%)
70% ethanol	26.4

용매	수율(%)
n-Hexane	13.8
Chloroform	0.96
Ethyl acetate	2.82
Buthanol	15.5
Water	60.9

② 실리카겔 컬럼을 이용한 택시폴린의 분리·정제

각 용매 분획과 택시폴린 표준품과의 TLC 분석 비교 결과 (도 3), 택시폴린의 함량이 가장 높은 에틸아세테이트 분획을 실리카켈 컬럼으로 정제하였다. 실리카겔 컬럼을 각각 1회, 2회, 3회 실시한 정제물을 Purification 1, 2, 3이라 명명하고, HPLC로 정량 분석하였다. Purification 1, 2, 3을 메탄올에 용해한 후, 표 3의 조건으로 HPLC 분석하였다. 택시폴린 하이드레이트 (taxifolin hydrate, ≥90%, sigma) 표준 시약으로 검량선 작성 후, 정제물의 택시폴린 함량을 계산하였다 (표 4).

HPLC 분석 조건

항목	작동 조건
Colum	Alltech C18
Detector	UV280nm
Mobile phase	AcCN/H2O(TFA 0.2%)=30/70
Flow rate	1ml/min

HPLC 분석 결과

샘플	택시폴린 함량 (%)
Purification 1	4.8
Purification 2	18.5
Purification 3	53.0

[ 실시예 2: 택시폴린 유도체의 합성]

가. 개요

플라보노이드는 식품에 널리 분포하는 노란색 계통의 색소이다. 플로보노이드의 한 종류인 택시폴린은, 페닐기 2개가 C3 사슬에 매개하여 결합한 C6-C3-C6형 탄소 골격구조로 되어 있다. 이것은 여러 당류와 에테르 결합을 통해 글루코시드의 형태로 존재하는 경우가 많다.

플라보노이드는 항균, 항암, 항바이러스, 항알레르기 및 항염증 활성이 있고, 많은 질병의 원인이 되는 생체 내 산화작용을 억제한다는 것으로 알려지면서 물질의 개발 및 활용에 관한 관심이 커지고 있다. 플라보노이드계 화합물들은 다양한 질병의 예방이나 치료에 중요한 것으로 여겨지고 있으나 열에 대한 불안정성, 산화 조건에 대한 불안정성, 및 물에 대한 불용성 등의 문제점이 있다.

택시폴린으로부터 택시폴린 옥타노에이트 유도체의 합성을 통해 보다 화학적으로 안정한 물질을 개발하며, 미백효과에도 우수한 소재를 개발하려고 한다 (도 4).

나. 택시폴린 - 테트라 옥타노에이트 ( Taxifolin -tetra octanoate ) 합성

무수 다이옥산 (Anhydrous dioxane) 15ml에 택시폴린(0.4g, 1.33mmol)을 상온에서 용해하였다. 옥타노일 클로라이드 (Octanoyl chloride, 1.12ml, 7.34 mmol)를 첨가하고 상온에서 10분간 교반하였다. 무수 피리딘 (Anhydrous pyridine, 0.58ml, 7.34mmol)을 넣은 후 4시간 교반하고, 12시간 방치하였다. 반응물은 여과하여 감압 농축하였다. 농축물을 20배 가량의 에틸 아세테이트 (ethyl acetate)로 용해 후 NaHCO₃ 3% 용액과 증류수로 수세하였다. 수세 후 감압 농축하였다.(0.99g, 79%, 연한노란색 파우더)

¹H-NMR(500MHz,δ,DMSO-d6)11.30(1H,s), 7.36(1H,dd), 7.30(1H,d), 7.26(1H,m), 6.37(1H,d), 6.32(1H,d), 5.76(1H,d), 5.41(1H,d), 2.55(4H,t), 2.35(4H,t), 1.75(2H,m), 1.65(6H,m), 1.31(32H,m), 0.89(12H,m). ¹³C-NMR(125MHz,δ,DMSO-d6) 192.9, 179.9, 172.2, 171.2, 170.9, 170.9, 163.4, 161.6, 159.2, 143.2, 142.4, 133.5, 125.3, 124.0, 123.0, 80.6, 72.5, 34.5, 34.2, 34.2, 34.2, 33.8, 31.8, 31.8, 31.8, 31.7, 29.3, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0, 29.0, 29.0, 25.1, 24.9, 24.9, 24.8, 22.8, 22.7, 14.2.

H와 C 간의 상관관계를 확인할 수 있는 HMQC 측정결과, 11.3ppm대에서 관찰되는 피크는 상관된 C가 없으므로 자유로운 OH기로 확인하였고, H와 C 간의 긴 범위 상관성 (long-range correlation)을 볼 수 있는 HMBC에서, H와 C 간의 상관성을 관찰하여 5-OH가 자유로운 택시폴린 테트라 옥타노에이트 (Taxifolin tetra octanoate)로 확인하였다 (표 5).

택시폴린 테트라 옥타노에이트 (Taxifolin tetra octanoate)의 ¹H- 및 ¹³C -NMR 데이터 (500 MHz)

No.	Taxifolin tetra octanoate
No.	¹H	¹³C
2	5.76	80.6
3	5.41	72.5
4		192.9
4a		104.3
6	6.38	105.1
8	6.32	102.2
5		159.2
7		161.6
8a		163.4
1'		133.5
2'	7.36	125.3
5'	7.30	124.0
3'		143.2
4'		142.4
6'	7.26	123.0

[ 실험예 1: 택시폴린 및 택시폴린 테트라 옥타노에이트의 유효성( 미백능 ) 평가]

1. 재료 및 방법

가. 재료

분석에 사용한 샘플은 상기에서 수득한 택시폴린 및 택시폴린 테트라 옥타노에이트였고, 대조군으로 사용한 알부틴(Arbutin)은 Sigma (USA) 사의 제품을 사용하였다. MTT assay 에 사용되는 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide는 Sigma(USA) 사의 제품을 사용하였다. 그 외 실험에 사용된 모든 시약은 모두 특급시약을 사용하였다.

나. 샘플 보관 및 희석 조건

샘플은 모두 4℃에서 보관하였으며 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 농도 별로 희석하여 사용하였다.

다. 항산화 활성 평가 방법 ( FRAP assay)

FRAP assay는 Benzie와 Strain의 방법을 변형하여 사용하였다(Iris F. F. Benzie and J. J. Strain., The Ferric Reducing ability of Plasma (FRAP) as a measure of "Antioxidant power" : The FRAP Assay, Analytical Biochemistry 239, 70-76, Article NO. 0292(1996).

FRAP 시약는 25 mL 아세테이트 버퍼(300 mM, pH 3.6)를 37℃에서 가온 후, 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ 5 mL과 20 mM FeSO4 2.5 mL을 가하여 제조하였다. FRAP 시약 0.9 mL에 각 농도의 샘플 0.03 mL와 증류수 0.09 mL를 넣은 다음 37℃에서 10 min 동안 반응시켜 593 nm에서 분광광도계(Benchmark PLUS Bio-Rad)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

라. 세포독성평가

(1) 세포배양

마우스의 악성 흑색종 세포인(B16/F1 Cell, Mouse malignant melanoma cell)는 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였으며, 이 세포를 37℃, 5% CO₂ 의 조건에서 10% fetal bovine serum (FBS. Hyclone, USA), 50 units/mL의 스트렙토마이신, 100 U/mL의 페니실린을 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle 배지 (Hlyclone, USA)에서 배양하였다.

(2) MTT assay

세포 독성 시험을 통해 천년초에서 추출한 정제 분획의 안정성을 평가하였다. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT, Sigma, USA) assay로 측정하였다. 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 1 X 10⁵ cells/well의 농도로 분주한 다음 24시간 동안 배양하고 분획을 1 ug/mL에서 100 μg/mL까지 농도별로 처리하였다. 다시 24시간 동안 배양한 후 PBS로 세척해주고 MTT를 5㎎/mL 농도가 되도록 PBS에 녹여주고, 이것을 새 배양액에 500 ug/mL이 되도록 희석하여 각 웰에 100 μL씩 분주한 후 4시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 DMSO (dimethyl sulfoxide)와 에탄올을 1:1 비율이 되도록 섞어준 용액을 150 μL씩 각 웰에 분주하여 주고 교반 용해시킨 후 550 nm (Benchmark PLUS Bio-Rad)에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 세 번 반복실험 하였다.

마. 미백 유효성 평가 방법 ( Melanogenesis inhibition assay)

세포 내에서 멜라노제네시스(melanogenesis)에 의해 생성되는 멜라닌 함량을 측정하기 위하여, Hosoi 등(Hosoi J, Abe E, Suda T, Kuroki T.Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by 1α,25D3 and retinoic acid. Cancer Res. 1985;45:1474-8 )의 방법을 변형하여 측정하였다.

100mm 세포 배양 접시에 1×10⁵ cell/mL의 농도로 초기 접종하여 12시간 동안 배양하였다. 미리 배양한 B16/F1 melanoma cell에 MSH(α-melanin stimulating hormone)를 10 nM 이 되도록 처리한 다음 4시간 동안 전배양(pre-incubation) 하였다. 이후 purification 1, 2, 3 샘플을 각각 50, 100 μg/mL가 되도록 처리하고, 24시간 동안 배양하였다.

배양이 끝난 세포를 DPBS로 2회 세척해주고, 셀 스크래퍼 (cell scraper)로 세포를 모은 뒤 라이시스 버퍼(0.1M sodium phosphate buffer pH 6.8, 1%(V/V) triton X-100)를 1ml 첨가하고, 얼음 위에서 30분간 반응시켰다. 반응한 용액을 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 이 상등액을 이용하여 BCA 단백질 정량법을 이용하여 정량해준 뒤, 처리구가 동일한 양이 되도록 희석하였다. 정량이 끝난 침전물은 1N NaOH용액 1mL 첨가한 다음, 90℃에서 1시간 반응한 뒤 단백질 양에 맞춰 희석하였고, 이 반응액을 475 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 알부틴을 동일한 농도로 처리하여 비교하였고, 공시료는 버퍼만을 처리하였다.

바. 미백활성 기전평가 (Western blot analysis)

B16/F10 melanoma cell을 100mm 세포 배양 접시에 1×10 cell/mL의 농도로 24 h 동안 배양한 후 α-MSH을 10 nM 되도록 처리하였고, 4 h 뒤에 샘플을 처리하였다. 배양된 세포를 모두 수거하여 세포침전물을 RIPA 버퍼에 용해시킨 후 15,000 rpm 에서 15 min 간 원심분리 하여 상층액을 취하였다. 단백질은 BCA 단백질 정량법 정량하였고, 50μL 상층액과 ×5 SDS 샘플 버퍼(1 M Tris-HCl(pH 6.8) 0.6 mL, 글리세롤 5 mL, 10% SDS 2 mL, β-mercaptoethanol 0.5 mL, 1% bromophenolblue 1mL, H₂O 0.9 mL)를 10μL 혼합한 후 7.5% SDS 폴리아크릴아미드 젤 (polyacrylamide gel)에서 전기영동 하였다. 그 다음 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membrane)을 사용하여 트랜스퍼를 진행하였다. 5% 스킴 밀크로 1시간 동안 블록킹 시킨 다음 티로시나아제, 액틴(actin)을 1:1000으로 희석하여 각각 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T로 5회 세척한 후 티로시나아제, 액틴을 anti-Rabit IgG로 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 세척한 후 Davinch-Western imaging system를 이용하여 촬영하였다.

2. 결과 및 고찰

가. FRAP 결과

FRAP assay는 환원제에 의해 ferric tripyridyltriazine (Fe³TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine (Fe²TPTZ)으로 환원되는 것을 이용하는 방법으로, 항산화제의 환원력을 이용한 방법이다.

10 mg/mL의 농도 샘플의 환원력을 확인하였을 때, 택시폴린 테트라 옥타노에이트 (Taxifolin tetra octanoate)는 0.83 mM이었다. 50 mg/mL의 농도에서 확인 결과, 택시폴린 테트라 옥타노에이트는 1.94 mM로 측정되었다. FRAP 값은 택시폴린 테트라 옥타노에이트의 농도의존적으로 증가하였다.

택시폴린 테트라 옥타노에이트의 FRAP 값 (Ferric-reducing antioxidant potential value)

Layer	FRAP value(Mm)
Taxifolin tetra octanoate 10 mg/ml	0.83
Taxifolin tetra octanoate 25 mg/ml	1.63
Taxifolin tetra octanoate 50 mg/ml	1.94

나. 세포독성 결과

세포에 아무것도 처리 안 한 곳의 생존율을 100%로 하였다. 그리고 각 샘플과 샘플을 녹인 용매 DMSO를 대조군으로 삼고 처리하였다. 실험 결과, DMSO 처리한 곳은 79.30 ±4.01%의 생존율을 보였으며, 각각의 값은 표 7에 나타내었다.

택시폴린 테트라 옥타노에이트의 B16/F10 melanoma cell에 대한 세포독성

샘플	생존률(%)
DMSO	79.30 ±4.01
Taxifolin tetra octanoate 1 μg/ml	91.18 ±3.55
Taxifolin tetra octanoate 10 μg/ml	94.6 4 ±3.57

다. 멜라닌 함량 측정

murine melanoma 세포를 이용하여 멜라닌 합성 억제 효과를 측정하였다. 세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌의 발현을 유도하였고, 그 후 샘플을 농도별로 처리하고 생합성 된 멜라닌의 양을 측정하였다. α-MSH를 단독으로 처리한 세포에서 멜라닌 발생량은 139.69%로 비처리구에 비해 양이 증가하였고, 대조군으로 알부틴 1 mM 처리한 군은 111.42%까지 감소하였다. 택시폴린 테트라 옥타노에이트 10 μg/ml 처리군은 103.53%로 나타나 대조군보다 더 높은 효과를 보였다.

B16/F10 murine melanoma cell의 멜라닌 생성에 대한 택시폴린 테트라 옥타노에이트의 영향

샘플	멜라닌 함량 (%)
Blank	100
α-MSH	139.67
Arbutin	111.42
Taxifolin tetra octanoate 1 μg/ml	114.70
Taxifolin tetra octanoate 10 μg/ml	103.53

라. 미백 활성 기전 평가

멜라닌 합성 신호전달 체계에는 매우 다양한 신호전달물질이 관여하고 있다 (도 5). 멜라닌은 몇 가지 세포 내 신호전달 기전을 통하여 합성되는데, 그 중 cAMP /PKA 경로가 멜라닌 합성의 주요 경로로서, UV에 피부가 노출되었을 때 멜라닌 세포의 cAMP가 증가되고, 하류 신호전달 물질인 PKA를 활성화 시키며, CREB을 거쳐 MITF의 발현을 증가시킨다. MITF는 멜라닌 합성 과정에서 중요한 전사 조절 인자로 티로시나아제, TRP-1, TRP-2의 전사를 촉진한다.

실험 결과, '① Tyrosinase : Arbutin(8%), Taxifolin(52%), taxifolin tetra octanoate (69%) 발현저해', '② TRP-1 : Arbutin(21%), Taxifolin tetra octanoate (29%) 발현저해', '③ TRP-2 : Arbutin(15%), Taxifolin(19%) 발현저해', '④ MITF : Arbutin(48%), Taxifolin(40%), Taxifolin tetra octanoate (43%) 발현저해'로 나타났다.

또한, 웨스턴 블롯 (western blot)을 이용하여 단백질 발현을 조사한 결과, 택시폴린 테트라 옥타노에이트는 티로시나아제와 TRP-1의 발현을 억제하는 것으로 보였고, 전사인자인 MITF의 발현도 억제하는 것으로 확인되었다 (도 6).

따라서, 택시폴린 유도체인 택시폴린 테트라 옥타노에이트는, MITF 발현 억제를 통하여, 티로시나아제, TRP-1의 단백질 발현을 감소시키고, 이로 인해 멜라닌 생성 억제로 이어지는 것으로 사료되었다.

한편, 주로 세포의 증식, 분화에 관여하는 것으로 알려진 MAPK 경로에 속하는 ERK 신호는 MITF의 인산화를 유도하여 MITF의 유비퀴티네이션(ubiquitination)이 이루어져 프로테오소말 데그라데이션 (proteosomal degradation)을 일으키게 됨으로써 멜라닌 합성을 감소시키는 것으로 알려져 있다.

웨스턴 블롯을 이용하여 측정한 결과, 택시폴린 테트라 옥타노에이트 처리에 의해 p-ERK 발현량이 증가됨으로써 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 예상되었다 (도 7).

Claims

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하기 화학식 2로 표시되는 택시폴린 테트라 옥타노에이트 (taxifolin tetra octanoate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
[화학식 2]