KR101191992B1 - 강활 추출물 또는 비사볼란겔론 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 강활(Angelica koreana Maxim) 추출물 또는 비사볼란겔론(bisabolangelone) 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 용도의 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 강활 추출물 또는 비사볼란겔론 화합물은 멜란닌 합성의 핵심 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 생성을 현저히 억제하는 동시에, 천연물로부터 추출된 것으로써 인체에 부작용이 거의 없으므로, 피부 미백용도의 화장품, 의약 또는 기능성 식품으로 개발될 수 있다.

Description

강활 추출물 또는 비사볼란겔론 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물{Skin Whitening Composition Comprising Angelica koreana Maxim Extract or Bisabolangelone Compound As Active Ingredient}

본 발명은 강활 (Angelica koreana Maxim) 추출물 또는 비사볼란겔론(bisabolangelone) 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 용도의 조성물에 관한 것이다.

멜라닌 색소는 멜라닌형성(melanogenesis)이라고 불리는 과정을 통해 멜라닌세포(melanocyte)의 멜라노좀(melanosome)에서 합성되고 상피의 각질형성세포(keratinocyte)로 분산됨으로써, 피부색을 형성하고 피부를 태양의 자외선광으로부터 보호한다[1]. 멜라닌 생합성에 대한 생화학적 경로는 티로시나아제(tyrosinase)가 촉매하는 2개의 특징적 반응인 L-티로신의 수산화반응과 3,4-디히드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, dopa)의 산화반응을 통해 시작된다[2]. 생성된 도파퀴논(dopaquinone)은 멜라노좀에서 시스테인(cysteine) 또는 글루타티온(glutathione)과 같은 티올 물질과 쉽게 반응하여 황색/적색 피오멜라닌(pheomelanin)을 생성한다[3]. 티올 물질이 고갈되면, 과량의 도파퀴논은 자발적으로 도파크롬(dopachcrome)으로 변환되고 종국적으로 흑색/갈색 유멜라닌(eumelanin)을 형성한다[3]. 피부색이 멜라닌색소의 혼합에 의해 결정이 되지만, 티로시나아제는 피오멜라닌과 유멜라닌 모두의 생합성에 반드시 필요하다.

피부의 각질형성세포와 섬유아세포로부터 분비되는 파라크린 인자(paracrine factor)는 멜라노사이트에서 멜라닌의 생성에 영향을 미칠 수 있다. 이들 인자들중에서 α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone)은 멜라노사이트상의 MC1R (melanocortin type 1 receptor)에 특이적으로 결합하여 아데닐레이트 사이클라아제(adenylate cyclase)를 활성화시킴으로써 cAMP의 세포내 농도를 증가시키고, 이로 인해 곧 티로시나아제(tyrosinase) 발현이 유도된다[4]. 따라서, 파라크린 인자들 간의 균형은 멜라노사이트 활성화의 세밀한 조절을 통해 피부의 색소화를 조정하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 그러나, 멜라닌 색소가 비정상적으로 축적되면, 기미(melasma), 주근깨(freckle), 노인성흑자(senile lentigen)과 같은 색소과다침작 질환이 발생하는데, 이러한 질환은 티로시나아제 활성을 억제하는 아르부틴(arbutin) 또는 히드로퀴논(hydroquinone)의 처리에 의해 개선될 수 있다[5].

본 발명자들은 종래부터 약용식물로부터 색소 침착 억제제를 개발하기 위해 연구하였고, 그 결과, 뽕나무(Morus alba)로부터 옥시레스버라트롤(oxyresveratrol), 필발(Piper longum)로부터 파이퍼롱구미닌(Piperlonguminine) 및 사상자(Torilis japonica)로부터 토릴린(Torilin) 등을 각각 분리하고 이들 물질이 저색소화 활성이 있음을 이미 보고하였다[6, 7]. 한편, 강활(Angelica koreana Maxim)은 미나리과 (Umbelliferae)에 속하는 다년생초본으로 한국의 대체의학에서 전통적으로 두통, 신경통 및 관절통 치료에 사용되어 왔으나, 멜라닌 색소의 형성을 억제하는 저색소화(hypopigmentation) 효능에 대해서는 현재까지 보고된 바 없다.

본 발명자들은 약용 식물로부터 멜라닌 색소 침착 억제제를 개발하기 위해 연구한 결과, 대체의학에서 전통적으로 두통, 신경통, 관절통 등의 치료에 사용되어 왔던 강활(Angelica koreana Maxim)의 추출물이 B16 멜라노마 세포 또는 멜란-a 세포에서 α-MSH에 의해 유도되는 멜라닌의 생성을 억제한다는 것을 밝히고, 이 추출물에서 저색소화 작용의 활성성분이 일종의 세스키테르펜(sesquiterpene) 유도체 화합물인 비사볼란겔론(bisabolangelone)이라는 것을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 강활(Angelica koreana Maxim)의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 비사볼란겔론(bisabolangelone) 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 강활(Angelica koreana Maxim) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1으로 표시되는 비사볼란겔론을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 강활 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 클로로포름, 헥산(Hexane) 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 강활 추출물은 0.2 - 2 중량％의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 비사볼란겔론은 0.05-1 중량％의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 비사볼란겔론은 강활(Angelica koreana Maxim)의 디클로로메탄(CH₂Cl₂) 분획 추출물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 조성물은 화장품학적 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 조성물은 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 조성물은 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 멜라닌색소 과다침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines)인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 강활 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 존건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명에서 강활 추출물은 강활 식물의 모든 부분으로부터 얻은 추출물을 포함하며, 바람직하게는 잎, 줄기 또는 뿌리의 추출물이며, 가장 바람직하게는 강활 뿌리의 추출물이다.

본 발명의 강활 추출물을 추출하기 위한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 둘 이상의 서로 다른 용매를 순차적으로 사용하여 추출할 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 추출용매는 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올), 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 클로로포름, 헥산(Hexane) 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는, 메탄올, n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 또는 물이며, 가장 바람직하게는 메탄올 또는 디클로로메탄이다.

본 발명의 강활 추출물은 상기 용매에 의한 추출한 추출물을 추가적으로 더욱 정제하여 분리한 분획물도 포함하는 의미이다. 상기 추가적 분리는 바람직하게는 컬럼 크로마토그래피를 행하여 수행하며, 보다 바람직하게는 액체 컬럼 크로마토그래피를 이용한 크기배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 이온교환(ion-exchange) 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화(affinity) 크로마토그래피 또는 이들 크로마토그래피의 조합을 이용하여 분리 정제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 본 발명의 강활 추출물은 메탄올 추출물, 또는 디클로로메탄 추출물 또는 메탄올 추출물에 대해 추가적으로 디클로로메탄을 용매로 사용하여 얻은 추출물이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 강활 추출물은 메탄올 추출물에 대해 추가적으로 디클로로메탄을 용매로 사용하여 얻은 추출물을 겔 여과(gel filtration) 크로마토그래피 또는 겔 흡착(gel adsorption) 크로마토그래피를 행하여 분획물로 얻은 분획 추출물이다.

본 발명의 피부 미백용 조성물의 다른 유효성분은 화학식 1로 표시되는 비사볼란겔론(bisabolangelone) 화합물이다. 상기 비사볼란겔론 화합물은 세스키테르펜(sesquiterpene) 구조를 갖는 화합물이다.

본 발명에서 화학식 1로 표시되는 비사볼란겔론 화합물은 강활 추출물로부터 분리된 것 뿐만 아니라 다른 분리원으로부터 분리된 것 및 화학적으로 합성된 화합물도 동등한 피부 미백 활성을 갖는다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서 강활 추출물로부터 화학식 1의 비사볼란겔론 단일 화합물은 추출물로부터 화합물을 분리 및 정제하는 통상적인 방법에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 실리카겔 또는 셀라이트(celite)겔 컬럼을 이용한 여과(filtration), 액체 컬럼 크로마토그래피를 이용한 크기배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 이온교환(ion-exchange) 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화(affinity) 크로마토그래피 또는 이들 크로마토그래피의 조합을 이용하여 분리 정제할 수 있다.

천연물 추출물로부터 분리된 단일 화합물은 MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectroscopy), EI MS (Electron Ionization Mass Spectroscopy), CI (Chemical Ionization Mass Spectroscopy), FABI (Fast Atom Bombardment Ionization), ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry)와 같은 질량분석법과, 적외선 분광법(IR Sectrum), 핵자기공명법(NMR, Nuclear Magnetic Resonance), CD (Circular Dichroism) 등의 방법을 이용하여 동정할 수 있다.

본 발명 조성물의 유효성분인 강활 추출물 또는 화학식 1의 비사볼란겔론 화합물은 세포내에서 멜라닌 색소 합성에 핵심 효소인 티로시나아제 단백질의 수준을 크게 억제하지만, 이 효소의 활성에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명의 강활 추출물 및 비사볼란겔론은 천연물 원천이므로 부작용 없이 멜라닌의 생성을 저해하는 피부 미백용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 화장품학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 로션, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림, 로션, 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 피부 피백용 조성물은 기능성 식품 조성물의 형태로 이용될 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 멜라닌 색소 과다침착 질환의 치료 또는 예방 용도의 약제학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “멜라닌 색소의 과다침착(hyperpigmentation)”은 피부 또는 손 발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미한다. 바람직하게는 상기 멜라닌 색소 과다침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 멜라닌 색소 과다 침착 질환을 치료 또는 예방을 위해 적용되는 점을 감안하면, 본 발명 조성물의 투여는 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형이다.

본 발명은 강활 추출물 또는 비사볼란겔론 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 용도의 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 강활 추출물 또는 비사볼란겔론 화합물은 멜란닌 합성의 핵심 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 생성을 현저히 억제하는 동시에, 천연물로부터 추출된 것으로써 인체에 부작용이 거의 없으므로, 피부 미백용도의 화장품, 의약 또는 기능성 식품으로 개발될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 용매 또는 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 강활 추출물을 분획하는 과정을 보여주는 도면이다.
도 2는 비사볼란겔론(bisabolangelone)의 IR 스펙트럼 결과를 보여준다.
도 3은 비사볼란겔론의 ESI-MS 스펙트럼 결과를 보여준다.
도 4는 비사볼란겔론의 ¹H-NMR 스펙트럼 결과를 보여준다.
도 5는 비사볼란겔론의 ¹³C-NMR 스펙트럼 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 비사볼란겔론 화합물의 화학 구조를 보여준다.
도 7a 내지 도 7d는 비사볼란겔론의 멜라닌 생성에 대한 영향을 보여준다. B16 세포들을 비사볼란겔론 또는 아르부틴(arbutin)의 존재하에 72시간 동안 α-MSH로 자극하였다. 세포내의 멜라닌 색소의 양을 합성 멜라닌을 표준으로 하여 측정하였고(도 7a), 비사볼란겔론(-●-) 또는 아르부틴(-○-)의 영향을 저해％로서 표시하였다(도 7b). 멜란-a 세포는 비사볼란겔론의 존재하에 α-MSH으로 96 시간 동안 자극하고, 세포내에서 멜라닌 색소를 정량하였다(도 7c). B16 세포를 α-MSH의 존재 하에서 다양한 농도의 비사볼란겔론과 함께 72 시간 동안 배양하였다. 생존 세포를 MTT 방법에 의해 측정하였다(도 7d). 데이터는 3-5회의 독립적 실험에 대해 평균±SD 값으로 표현하였다. ^#P < 0.05 vs. 배지 단독 처리 그룹. ^*P < 0.05 vs. α-MSH 단독 자극 그룹.
도 8a 및 도 8b는 티로시나아제 단백질 발현 및 활성에 대한 본 발명의 비사볼란겔론 화합물의 영향을 측정한 결과이다. B16 세포는 비사볼란겔론의 존재하에서 α-MSH로 48 시간 자극하였다. 세포 추출물을 항-티로시나아제 또는 항-GAPDH 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 행하였다(도 8a). 무세포(cell free) 티로시나아제는 B16 세포로부터 준비하였고(빗금 막대), 머쉬룸(mushroom) 기원의 티로시나아제는 상업적으로 구입가능한 타입을 구입하여 준비하였다(흑색 막대). 효소액을 비사볼란겔론 또는 아르부틴으로 처리하고, 이어서, 티로시나아제의 촉매 활성으로써 L-티로신의 산화 속도를 분광학적 방법으로 측정하였다(도 8b). 티로시나아제 1 유닛(unit) 활성은 1 분당 1nmole의 L-티로신이 도파크롬(dopachrome)으로 변환되는 것으로 정의하였다. 데이터는 5회 독립의 실험으로부터 평균±SD의 값으로 표현하였다. ^*P < 0.05 vs. 티로시나아제 단독-함유 그룹.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

실시예 1. 화합물, 항체 및 기기

FBS(Fetal bovine serum) 및 배양에 사용한 물질들은 Invitrogen으로부터 구입하였다. 아르부틴(Arbutin) (>98% 순도), 합성 멜라닌 및 α-MSH는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 티로시나아제(tyrosinase)에 대한 항체 및 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 항체는 Santa Cruz Biotech으로부터 구입하였다. UV 및 IR 스펙트럼 분석 결과는 각각 JASCO UV-550 및 Perkin-Elmer model LE599 spectrometer로부터 얻었다. NMR 스펙트럼 결과는 Bruker AMX 500MHz NMR spectrometer를 사용하여 얻었다. ESI-MS 스펙트럼은 LCQ Fleet LC/MS (Thermo Scientific Co.)를 사용하여 측정하였다.

실시예 2. 식물 재료

강활(Angelica koreana Maxim., Umbelliferae)의 건조 뿌리는 청주 소재의 전통 한약재 시장으로부터 구입하여 식물학적 확인 절차를 거친 후 사용하였다. 일부는 증거 샘플(CBNU46)로서 충북대학교에 기탁하였다.

실시예 3. 생분석 -유도( bioassay - guided ) 식물유래 화합물의 분리

강활의 건조한 뿌리를 상온에서 100％ 메탄올로 추출하고, 용매는 감압하에서 증발시켰다. 메탄올 추출물(640 g)은 H₂O에 재현탁시키고, n-헥산(hexane), CH₂Cl₂ 및 에틸아세테이트(ethylacetate)을 사용하여 순차적으로 분획하였다. 본 발명의 생분석-유도(bioassay-guided) 식물 화합물의 분리 방법을 도시하는 도 1을 참조하면, CH₂Cl₂ 분획(41 g)을 추가로 실리카 겔 컬럼(7 X 25 cm, 200-400 mesh)상에 로딩한 후에, n-헥산/아세톤 농도구배 용출액(95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 50:50, 0:100)을 각각 2.5 L씩을 사용하여 용출시켰다. 용출물들은 TLC 패턴을 기초로 하여 합쳐서 9개의 분획(Fr-1 내지 Fr-9)으로 분리하였다. 이러한 분획들중에서 분획 Fr-3는 B16 세포내에서 α-MSH 유도된 멜라닌 생성에 대해 3.2μg/㎖의 IC₅₀ 값을 나타내어 가장 강력한 억제 효과를 보였다. 분획 Fr-3(14 g)으로부터 100％ 메탄올내에서 재결정화를 통해 활성성분(370 mg)을 분리한 후 이를 스펙트럼 데이터 분석하여 이 물질이 비사볼란겔론 (bisabolangelone, 순도 : >97%)임을 최종 확인하였다.

실시예 4. 비사볼란겔론(Bisabolangelone) 화합물

비사볼란겔론 화합물은 약한 노란색 바늘 형상의 결정으로 관찰되었다. 본 화합물에 대한 분광학적 데이터는 다음과 같았다: UV (MeOH): λ_max = 247 ; IR (KBr): ν_max = 3342 (-OH), 1640 (C=O) cm^-1 (도 2); ESI-MS : 249 [M+H]⁺ (도 3); ¹H-NMR (500MHz, CDCl₃): δ 6.02 (1H, m, H-5), 6.01 (1H, m, H-11), 5.39 (1H, d, =11.5Hz, H-10), 4.89 (1H, q, J=6.0Hz, H-8), 2.75 (2H, m, H-7), 2.67 (1H, d, J=6.5Hz, H-9), 2.03 (3H, s, 6-CH₃), 1.81 (3H, s, 12-CH₃), 1.74 (3H, s, 12-CH₃), 1.64 (3H, s, 3-CH₃)(도 4); ¹³C-NMR (125MHz, CDCl₃): δ 196.8 (C-4), 160.0 (C-6), 158.1 (C-2), 132.4 (C-12), 127.2 (C-5), 117.7 (C-11), 94.3 (C-10), 78.5 (C-3), 76.1 (C-8), 53.6 (C-9), 34.9 (C-7), 27.4 (C-15), 26.0 (C-13), 24.7 (C-16), 18.0 (C-14) (도 5).

실시예 5. 세포 배양( Cell culture )

B16 멜라노마 세포 및 멜란-a(melan-a) 멜라노사이트는 ATCC (American ype Culture Collection)으로부터 구입하였다. B16 세포는 10％ FBS 및 항생제(100 U/㎖ 페니실린 G 소디엄, 100 μg/㎖ 스트렙토마이신 설페이트)이 첨가된 DMEM 배지(13.4 mg/㎖의 Dulbecco’s modified Eagle’s medium, 10 mM HEPES, 24 mM NaHCO3, pH 7.1)에서 배양하였고, 멜란-a 세포는 10％ FBS, 200 nM PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 항생제를 첨가한 RPMI 배지(10.4 mg/㎖ RPMI 1640, 10 mM HEPES, 24 mM NaHCO3, pH 7.1)에서 배양하였다. 양쪽 세포 모두 37℃에서 5％ CO₂하의 습화된 조건하에서 배양하였다.

실시예 6. 멜라닌 색소의 정량

세포를 샘플 존재하에서 10 nM α-MSH으로 B16 세포의 경우 72 시간, 멜란-a 세포의 경우 96 시간 자극시켰다. 멜라닌의 함량은 이미 공지되어 알려진 방법에 따라 측정하였다[8]. 간략하게 설명하면, 세포를 회수한 후, 이어서 1N NaOH-10％ 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)내에서 80℃로 가열하여 파쇄하였다. 멜라닌 색소의 양은 표준물질로서 합성 멜라닌(>95％ 순도)과 함께 405 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.

실시예 7. 세포 생존능 분석

세포를 10 nM α-MSH의 존재하에 다양한 농도의 비사볼란겔론과 함께 배양하고, MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide] 분석을 수행하였다. 간략하게 설명하면, 세포에 0.5 mg/㎖ MTT를 첨가하고 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포의 생존능은 대사능을 갖는 활성 세포에 의해 MTT가 보라색의 포르마잔(formazan)으로 변환되는 것을 관찰하여 측정하였다. 포르마잔 결정을 100％ 디메틸설폭사이드로 용해시키고 이어서 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 8. 웨스턴 블롯팅 분석

세포를 샘플 존재 하에 10 nM α-MSH와 함께 48 시간 동안 자극시키고, 이어서, 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% NP-10, 1 mM PMSF, 10 mM Na₃VO₄, pH 7.4)내에서 파쇄하였다. 세포 추출물을 SDS-아크릴아마이드젤 상에서 전기영동에 의해 분리하고, PVDF막으로 이동시켰다. PVDF막의 블롯들을 항-티로시나아제(tyrosinase) 항체 또는 항-GAPDH 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 이어서, 적합한 호오스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)-컨쥬게이트된 2차 항체와 함께 2-4 시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 최종적으로 블롯들을 ECL(enhanced chemiluminescence)시약(GE Healthcare)과 함께 반응시킨 후 X-선 필름에 노출시켰다.

실시예 9. 티로시나아제 활성 분석

효소는 상업적으로 판매되는 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase) (Sigma-Aldrich)로서 구입하였고, B16 세포로부터도 분리하여 준비하였다. 세포는 10 nM α-MSH로 48 시간 동안 자극하였고 얼음상에서 초음파 분쇄에 의해 파쇄하였다. 원심분리한 후에, 상등액은 50 mM 소디엄포스페이트 완충액(pH 6.8)에 대해 투석하고, B16 세포 원천의 효소원으로 사용하였다. 티로시나아제 활성은 이미 공지되어 알려진 방법에 따라 L-티로신 산화 속도를 측정하여 평가하였다[6]. 간략하게 설명하면, 활성을 측정하고자 하는 본 발명의 샘플을 B16 세포 또는 머쉬룸(mushroom)으로부터 유래된 효소와 함께 인큐베이션하고, 이어서 5 mM L-티로신을 기질로서 반응시켰다. 도파크롬(dopachrome) 형성 속도는 475 nm 에서의 흡광도값의 증가 속도에 의해 결정하였다. 1 유닛(unit)의 효소 활성은 1 분당 1 nmole의 L-티로신이 도파크롬으로 변환되는 것으로 정의하였다.

실시예 10. 통계 분석

데이터는 평균±SD로 표시하였으며, ANOVA 및 Dunnet's 테스트에 의해 분석하였다. p < 0.05 의 값을 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험결과

실시예 11. 추출물 및 활성성분 분석

본 발명의 실험에서 강활(A. koreana)뿌리의 총 메탄올 추출물은 α-MSH-활성화된 B16 세포내에서 멜라닌의 생성을 억제하였다(표 1 참조).

[표 1] : B16 세포에서 α-MSH 유도된 멜라닌 생성에 대한 용매 추출물 또는 컬럼크로마토그래피 분획 추출물의 억제 활성.

강활 추출물에서 저색소화 활성성분(hypopigmenting principle)을 밝히기 위해, 메탄올 추출물을 추가적으로 n-헥산층, CH₂Cl₂층, 에틸아세테이트(EtOAc)층 및 수성층(aqueous layer)으로 순차 분획하여 활성을 측정한 결과, CH₂Cl₂ 층이 가장 우수한 활성을 보였다(표 1 참조). CH₂Cl₂층을 추가적으로 컬럼 크로마토그래피 기술을 사용하여 생분석-유도(bioassay-guided) 분획을 실시하였다. 상기 추출물로부터 활성성분을 분리하여 보고된 스펙트럼 데이터[9]와 비교함으로써 이 화합물이 세스키테르펜(sesquiterpene) 유도체인 비사볼란겔론(bisabolangelone) 화합물임 을 확인하였다(도 2 - 도 6 참조).

실시예 12. 미백 활성 평가

비사볼란겔론(bisabolangelone)의 존재 또는 부존재하에 B16 세포 또는 멜란-a 세포를 α-MSH로 자극하였다. 자극되지 않은 B16 세포내에서 멜라닌 색소의 함량은 63±28 pg/cell으로 매우 적었으나, α-MSH 단독으로 72 시간 동안 자극한 경우 348±25 pg/cell의 양으로 크게 증가하였다(도 7a 참조).

B16 세포에서 비사볼란겔론을 처리한 경우 α-MSH에 의해 유도되는 멜라닌의 생성이 처리되는 비사볼란겔론에 대해 용량 의존적 방식으로 억제되었다. 즉, IC₅₀ 값이 2 g/mL을 가지면서, 1 g/mL에서 28％ 억제, 3 g/mL에서 90％ 억제, 10 g/mL에서 99％ 억제 효과를 나타내었다(도 7a 및 도 7b 참조). 아르부틴(Arbutin)은 당업계에서 잘 알려진 피부 미백제이다[10]. α-MSH 자극된 B16 세포내에서 아르부틴을 처리한 경우 IC₅₀ 값은 96 μg/mL의 값을 보이면서 멜라닌 생성이 억제되었다(도 7b).

B16 세포에서의 결과와 일관되게, 멜란-a 세포(melan-a cell)내에서도 α-MSH와 함께 96 시간 인큐베이션시킨 경우, 멜라닌의 생성이 기저 수준인 38±3 pg/cell에서 104±8 pg/cell의 수준까지 크게 증가하였고, α-MSH에 의해 자극된 멜란-a 세포에 비사볼란겔론을 처리한 경우 IC₅₀ 값 4μg/mL을 보이면서 멜라닌 생성이 현저하게 억제되었다(도 7c). 한편, 비사볼란겔론은 저색소화 반응(hypopigmenting response)을 보여주는 유효 농도에서 B16 세포의 생존능에 영향을 미치지 않았기 때문에 비특이적 세포독성에 의한 실험결과 가능성은 배제할 수 있었다(도 7d). 상기 실험 결과들은 본 발명의 비사볼란겔론이 세포-타입의 특이성 없이 멜라닌 생성을 감소시킬 수 있다는 것을 보여주었다.

실시예 13. 미백 활성 작용 메카니즘 분석

티로시나아제(Tyrosinase)는 멜라닌 색소의 생합성 경로에서 속도 결정단계인 L-티로신의 수산화 단계 및 도파(dopa) 산화 단계를 촉매하는 효소이며, 이 효소는 α-MSH의 존재하에서 이의 발현이 유도되는 특성을 갖는다[2, 4]. 비사볼란겔론이 멜라닌 생성을 억제하는 메카니즘에 대해 관찰하기 위해, 비사볼란겔론이 세포내에서 티로시나아제의 양에 영향을 미치는지에 대해 추가로 조사하였다. 즉, B16 세포를 비사볼란겔론의 존재 또는 부존재하에 α-MSH로 48 시간 동안 자극한 후에 티로시나아제 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 8a에서 보여지는 바와 같이, 세포를 α-MSH 만에 대해 노출시킨 경우에 티로시나아제 단백질의 수준이 기저수준과 비교하여 크게 증가하였다. 그러나 여기에 비사볼란겔론을 처리한 경우 α-MSH에 의해 유도되는 티로시나아제 수준이 용량 의존적 방식으로 감소하였다. 한편, 항상적으로 발현되는 GAPDH의 발현양은 α-MSH으로 자극한 경우나 또는 비사볼란겔론으로 처리한 경우에 대해 영향을 받지 않았다.

이어서, 본 발명자들은 비사볼란겔론이 티로시나아제의 촉매활성에 직접적으로 영향을 미치는 지에 대해 조사하였다. B16 세포로부터 무세포(cell-free) 상태의 티로시나아제를 준비하고, 또한 머쉬룸(mushroom) 기원의 상업적으로 구입가능한 타입의 티로시나아제도 준비하였다. 상기 준비한 효소의 용액에 비사볼란겔론을 처리하고, 티로시나아제 활성 척도로서 L-티로신(L-tyrosine)의 산화 속도를 측정하였다. 비사볼란겔론으로 처리한 경우 B16 세포 및 머쉬룸으로부터 분리한 티로시나아제 양쪽 모두의 촉매 활성에는 큰 영향을 미치지 못하였으나, 양성 대조군인 아르부틴(arbutin)은 80 μg/mL의 농도에서 59-68％의 티로시나아제 활성 억제를 보여주었다(도 8b).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

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8. Yun CY, Kim D, Lee WH, Park YM, Lee SH, Na M, Jahng Y, Hwang BY, Lee MK, Han SB, Kim Y. Torilin from Torilis japonica inhibits melanin production in α-melanocyte stimulating hormone-activated B16 melanoma cells. Planta Med 2009; 75: 1505-1508

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11. Jung HW, Mahesh R, Park JH, Boo YC, Park KM, Park YK. Bisabolangelone isolated from Ostericum koreanum inhibits the production of inflammatory mediators by down-regulation of NF-κB and ERK MAP kinase activity in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Int Immunopharmacol 2009; Epub ahead of print, PubMed

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Claims (12)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 하기 화학식 1으로 표시되는 비사볼란겔론(bisabolangelone)을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 비사볼란겔론은 0.05 - 1 중량％의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제 7 항에 있어서, 상기 비사볼란겔론은 강활(Angelica koreana Maxim)의 디클로로메탄(CH₂Cl₂) 분획 추출물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 화장품학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines)인 것을 특징으로 하는 조성물.

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