KR101467605B1 - 신규의 다프난 디테르펜계 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 다프난-타입 디테르펜 에스테르 화합물과 이 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 및 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]

(단, 상기 화학식 1에서 R은 메틸기 또는 페닐기임)
본 발명의 다프난-타입 디테르펜 에스테르 화합물은 α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone)에 의해 활성화된 B16 멜라노마 세포에서 매우 우수한 멜라닌 합성 저해 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 화합물은 피부 미백용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있으며, 멜라닌 색소의 과다 침착으로 인한 질환, 예컨대 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines)의 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있다.

Description

신규의 다프난 디테르펜계 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물{Novel Daphnane Diterpenoid Compound and Composition for Skin Whitening Comprising the Same As Active Ingredient}

본 발명은 신규의 다프난 타입 디테르펜계 화합물 및 이 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물 및 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

원화(Daphne genkwa, Thymelaeaceae)는 한국과 중국에서 복수(ascites), 부종(edema) 및 천식(asthma)의 치료에 이뇨제로 사용되는 전통 민간의약으로 잘 알려져 왔다(1). 원화(Daphne) 속은 항암활성, TRPV1 활성화활성, 불임활성, 살충활성, 신경영양성, 콜레스테롤 저하활성, 항고혈당증, 자극제 및 종양 촉진활성과 같은 다양한 생물학적 활성을 갖는 것으로 증명된 daphnane-타입 디테르펜 오르토에스테르가 풍부한 것으로 알려져 있다(2, 3).

미백활성 실험에서 타겟이 되는 멜라닌(melanine)은 동물, 식물, 미생물에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 물질로 이것의 생성은 기미, 주근깨 검버섯을 형성하며 피부노화도 촉진 시키는 것으로 알려져 있다. 멜라닌은 표피 기저층의 멜라노사이트 세포내 멜라노좀(melanosome)에서 티로시나아제(tyrosinase) 효소의 연속적 산화반응으로 합성된다. 티로시나아제는 구리를 함유한 멜라닌 생합성 과정의 주요 효소이며 멜라닌 합성의 출발 물질은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)이다. 티로신이 티로시나아제에 의해 L-3,4-dihydroxyl-L-phenylalanine(L-DOPA)으로, 이것이 다시 DOPAquinone으로 산화되고 다시 DOPAquinone이 DOPAchrome, 5,6-dihydroxyin-dole, indole 5,6-quinone이 되어 중합에 의해 최종적으로 멜라닌이 합성된다. 이렇게 티로시나아제는 티로신을 산화시켜 DOPA를 만드는 티로신 히드록시아제(tyrosine hydroxyase)로, DOPA를 산화시켜 DOPA quinone을 만드는 DOPA 옥시다아제로 작용하며 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요 효소로 작용한다. 따라서 티로시나아제 활성억제 실험은 멜라닌 생성 억제의 유용한 평가법으로 인정되고 있는데, 이 티로시나아제 활성억제 실험은 티로신 히드록실라아제 억제실험법과 DOPA 옥시다아제 억제실험법, 종합적인 멜라닌 합성 억제 실험법으로 구별되며, 티로신 히드록실라아제 억제실험법과 멜라닌 합성억제 실험법은 방사성 동위원소를 사용하기에 실제로는 DOPA를 기질로 하여 생성되는 도파크롬(DOPAchrome)의 양을 측정하는 DOPA 옥시다아제(oxidase) 억제 실험법이 많이 사용된다. 지금까지 알려진 티로시나아제 억제제로는 히드로퀴논(hydroquinone), 레조르시놀(resorcinol), 4-히드록시아니솔(4-hydroxyanisole), 아스코르브산(ascorbic acid)와 그 유도체, 코직산(kojic acid), 우바우르시 잎(arbutin), 글루코사민(glucosamin), 상백피(oxyreseveratrol), 알파-비니페린(α-viniferin), 페룰린산(ferulic acid) 등이 있으나 피부안전성, 제형안정성 등의 문제로 인해 아부틴(arbutin)과 코직산(kojic acid)가 미백제의 첨가제로 제한된 양만 사용되고 있다. 천연 미백제 개발을 위해 최근까지 다양한 식물들이 연구되어 왔는데 그 중 티로시나아제 저해활성이 있는 것으로 알려진 것으로 상백피, 오배자, 감초, 녹차, 석이, 치자 열매 등이 보고되고 있으며 일부는 제품에 사용되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 멜라닌 생성 억제활성을 가짐으로써 피부 미백용도로 사용될 수 있는 식물 유래의 화합물을 발굴하고자 연구 노력한 결과, 원화(D. genkwa) 꽃눈의 메틸렌클로라이드 가용성 분획으로부터 신규의 다프난 타입의 디테르펜 오르토에스테르 화합물을 분리하여 확인하였고, 이들 화합물들이 α-MSH-활성화 B16 멜라노마 세포에서 멜라닌의 생성을 억제하는 효과가 있다는 것을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규의 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 신규의 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규의 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 다프난 타입의 디테르펜 에스테르 화합물을 제공한다.

단, 상기 화학식 1에서 R은 -CH₃ 또는 페닐(phenyl)기이다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 본 발명자에 의해 원화(D. genkwa)의 메탄올 추출물의 메틸렌클로라이드 분획으로부터 분리되어 확인한 신규의 다프난(daphnane) 타입의 디테르펜 오르토 에스테르 화합물이다. 상기 본 발명의 신규 화합물은 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이 α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone)에 의해 활성화된 B16 멜라노마 세포에서 멜라닌 세포의 생성을 억제하는 활성을 갖는다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 유효성분인 상기 화학식 1의 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물은 식물로부터 추출 및 분리될 수 있고, 화학적으로 합성될 수도 있다.

본 발명의 화합물을 식물로부터 추출 및 분리하여 얻는 경우, 화합물의 분리는 식물의 추출물로부터 단일 화합물을 분리 및 정제하는 당업계의 통상적인 방법에 따라 행할 수 있다. 식물 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 식물 추출물은 원화(D. genkwa) 추출물이다.

식물에 대한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하다.

본 발명의 화합물은 상기 식물 추출물로부터 단일화합물을 정제 및 분리하는 통상적인 방법에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 다양한 용출 용매를 사용하는 실리카겔 또는 셀라이트 겔 컬럼을 이용한 여과, 겔 흡착 크로마토그래피, 액체 컬럼 크로마토그래피를 이용한 크기배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 또는 이들 크로마토그래피의 조합을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

식물 추출물로부터 분리된 단일 화합물은 MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectroscopy), EI MS (Electron Ionization Mass Spectroscopy), CI (Chemical Ionization Mass Spectroscopy), FABI (Fast Atom Bombardment Ionization), ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry)와 같은 질량분석법과, 적외선 분광법(IR Sectrum), 핵자기공명법(NMR, Nuclear Magnetic Resonance), CD (Circular Dichroism), 상관분광법(correlation spectroscopy) 등의 방법을 이용하여 동정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 조성물은 피부 미백용 화장품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "멜라닌 색소의 과다침착"은 피부 또는 손발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 현상을 의미한다. 바람직하게는 상기 멜라닌 색소 과다침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 멜라닌 색소 과다 침착 질환을 치료 또는 예방을 위해 적용되는 점을 감안하면, 본 발명 조성물의 투여는 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 파우더, 젤, 연고, 크림, 로션, 액제 또는 에어로졸 제형이다.

본 발명의 이점을 요약하면 다음과 같다.

(ⅰ) 본 발명의 화합물은 원화(D. genkwa)로부터 분리된 신규한 다프난 타입의 디테르펜 에스테르 화합물이다.

(ⅱ) 본 발명의 화합물은 α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone)에 의해 활성화된 B16 멜라노마 세포에서 멜라닌의 합성을 저해하는 활성을 갖는다.

(ⅲ) 본 발명의 화합물은 멜라닌의 합성을 저해함으로써 피부 미백용도로 사용될 수 있으며, 멜라닌 색소의 과다 침착에 의한 질환의 치료용도로도 사용될 수 있다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물과 이 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물, 및 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물은 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)에 의해 활성화된 B16 멜라노마 세포에서 매우 우수한 멜라닌 생성 저해 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 화합물은 피부 미백용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있으며, 멜라닌 색소의 과다 침착으로 인한 질환, 예컨대 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines)의 치료 또는 예방 용도로 사용될 수 있다.

도 1은 원화(Daphne genkwa)의 꽃눈으로부터 본 발명의 화합물을 분리하는 과정을 보여주는 도면이다.
도 2는 원화(Daphne genkwa)의 꽃눈으로부터 분리해낸 총 9가지의 단일 화합물의 분자 구조식을 보여주는 도면이다.
도 3a는 본 발명 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 3b는 본 발명 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 3c는 본 발명 화합물 1의 HMQC 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 3d는 본 발명 화합물 1의 HMBC 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 3e는 본 발명 화합물 1의 NOESY 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 3f는 본 발명 화합물 1의 HR-FAB-MS 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 4a는 본 발명 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 4b는 본 발명 화합물 2의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 4c는 본 발명 화합물 2의 HMQC 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 4d는 본 발명 화합물 2의 HMBC 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 4e는 본 발명 화합물 2의 NOESY 스펙트럼을 보여주는 도면이다.
도 4f는 본 발명 화합물 2의 HR-FAB-MS 스펙트럼을 보여주는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 분광학적 분석

UV 스펙트럼은 JASCO UV-550 분광기를 사용하여 얻었다. CD 스펙트럼은 JASCO J-715 분광기상에서 기록하였다. IR 스펙트럼은 Perkin-Elmer model LE599 분광기상에서 기록하였다. ESI-MS 및 HR-FAB-MS는 각각 LCQ Fleet (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA) 및 JMS 700 (JEOL, Tokyo, Japan) 질량 분광기를 사용하여 얻었다. NMR 스펙트럼은 BRUKER AMX-500 MHz NMR 분광기를 사용하여 측정하였다. 오픈 컬럼 크로마토그래피는 실리카 겔 (200 - 400 mesh, Fisher Scientific), RP-18 (particle size 75 μm, YMC), 및 Sephadex LH-20 (25 - 100 μm, Phramacia Fine Chemical Industries Co.)를 사용하여 행하였다. Preparative HPLC는 2개의 Waters 515 pumps, 2996 photodiode array detector, 및 YMC J'sphere ODS H-80 컬럼 (150 X 20 mm, s-4 μm)를 사용하여 행하였다. Pre-coated silica gel 60 F254 plates (0.25 mm, Merck)를 사용하여 TLC를 행하였다.

2. 식물 재료

건조된 원화(D. genkwa)를 대한민국 서울의 경동시장에서 구입하여 이를 세절하여 사용하였다.

3. 추출 및 분리

(1) 원화추출물의 용매 분획

원화의 건조된 분말 3 kg을 상온에서 100％ 메탄올(MeOH) 18L를 사용하여 3회에 걸쳐 추출하였다. 메탄올 추출물을 진공하에서 농축하여 250g의 메탄올 추출물을 얻었고, 이 추출물을 물에 현탁한 후, 메틸렌클로라이드(CH₂Cl_2, MC)(3 X 2 L), 에틸아세테이트(EtOAC)(3 X 2 L), 및 물(H₂O)로 각각 분획하였다.

(2) 미백활성분획

각 용매 추출분획에 대한 미백활성을 조사한 결과, 활성이 메틸렌클로라이드(MC) 분획에서 나타났다. 따라서, 메틸렌클로라이드 분획(80 g)을 실리카겔-컬럼 크로마토그래피(10 X 25 cm)를 행하고, n-헥산 - CH₂Cl₂ - MeOH 그래디언트 (n-hexane-CH₂Cl₂ to CH₂Cl₂-MeOH)으로 용출시켜, DGC-1 부터 DGC-13 까지 총 13개의 분획물을 얻었다.

(3) DGC-11 분획에 대한 컬럼 분획

DGC-11 분획이 미백활성이 우수한 것으로 나타났다. DGC-11(30.6 g) 분획을 n-헥산-EtOAc (15:1 - EtOAc 100％) 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 반복 실시하여 9개의 소분획, DGC-11-1 내지 DGC-11-9의 총 9개의 분획을 얻었다.

(4) DGC-11-7 분획에 대한 컬럼 분획

미백활성이 가장 강한 DGC-11-7 분획(3.7g)을 MeOH - H₂O(6:4 - 9:1) 용매로 ODS 컬럼(RP-18 컬럼) 크로마토그래피(6 X 59cm)을 실시하여 DGC-11-7-1 내지 DGC-11-7-10의 총 10개의 분획을 분리하여 얻었다.

(5) 화합물 1, 4, 5, 8, 9의 분리

미백활성이 가장 우수한 DGC-11-7-7 분획(120 mg)을 MeOH-MeCN-H₂O 용매 그래디언트(4:1:3 - 1:2:1)을 사용하여 ODS 컬럼(RP-18 컬럼) 크로마토그래피(2.5 X 48 cm)을 실시하여 화합물 1, 7 mg을 얻었다. DGC-11-7-8 (650 mg) 분획은 MeOH-MeCN-H₂O 그래디언트(4:1:3 - 1:2:1)을 사용하여 ODS 컬럼(RP-18 컬럼) 크로마토그래피(3 X 30 cm)을 실시하여 화합물 4 (55 mg), 화합물 8 (19 mg) 및 화합물 9 (3 mg)을 얻었다. DGC-11-7-9 (40 mg) 분획을 preparative HPLC (MeCN:H₂O = 88:12, 유속 = 6 mL/min)에 의해 추가 분리하여 화합물 5 (2 mg)을 얻었다.

(6) DGC-11-6 분획에 대한 컬럼 분획

DGC-11-6 (2.9 g) 분획은 MeOH-H₂O (5:5 - 9:1) 용매를 사용하여 RP-18 (6 X 59 cm)상에서 ODS 컬럼 크로마토그래피를 행하여, DGC-11-6-1 내지 DGC-11-6-9의 총 9개의 분획을 얻었다.

(7) 화합물 2, 3, 6, 및 7의 분리

DGC-11-6-6 분획(400 mg)을 Sephadex LH-20 컬럼(2 X 40 cm, MeOH-H₂O, 4:6 내지 5:5)을 사용하여 분리하였고, 이어서 preparative HPLC (MeCN:H₂O = 60:40, 유속 6 mL/min)을 행하여 화합물 2(2 mg)를 얻었다. 분획 DGC 11-6-7 (200 mg)은 40％ MeOH 용매를 사용하여 Sephadex LH-20 상에서 추가 크로마토그래피를 행하여 화합물 6(1 mg)을 얻었다. DGC 11-6-8 분획(200 mg)은 MeOH-MeCN-H₂O 용매 그래디언트(4:1:3 - 1:3:1)을 사용하여 RP-18상에서 추가 분리하여 화합물 3 및 7을 얻었다.

4. 멜라닌 생성에 대한 생분석 방법

B16 멜라노마 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, USA)으로부터 구입하였다. 세포들을 96 웰 배양 플레이트에 웰당 2.5 X 10³ 세포의 농도로 접종하고, 37℃, 5％ CO₂ 분위기하에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포들을 측정 시료의 존재하에서 α-MSH (10 nM)으로 72 시간 동안 자극하였다. 세포들을 회수하고, 1 N NaOH-10％ 디메틸설폭사이드내에서 80℃으로 가열하여 세포들을 파쇄하였다. 멜라닌의 함량은 합성 멜라닌을 표준물질로 하여 405 nm의 파장에서 흡광도 값에 의해 측정하였다.

실험결과

1. 화합물 1의 화학구조 규명

화합물 1은 무색 오일의 형태로 분리되었다. 이의 분자구조는 HR-FAB-MS (m/z 469.1842 [M + Na]⁺, calcd. 469.1838)에 의해 C₂₄H₃₀O₈ 으로 결정하였고, 10의 불포화도가 존재하는 것으로 나타났다. IR 스펙트럼에 의해 히드록실(3316 cm^-1) 및 에스테르카르보닐(1707 cm^-1)의 존재를 확인하였다. 화합물 1의 ¹H 스펙트럼은 δ_H 1.799 (3H, s, CH₃-17), 1.801 (3H, s, CH₃-19), 및 1.62 (3H, s, CH₃-2') 위치에서 3개의 3차 메틸기의 존재, δ_H 1.26 (3H, d, J = 7.5 Hz, CH₃-18)위치에서 2차 메틸기의 존재, δ_H 1.94 (3H, s, CH₃-2")위치에서 아세틸기의 존재, δ_H 4.98 (1H, s, H-16) 및 4.92 (1H, s, H-16)위치에서 엑소메틸렌기의 존재, δ_H 7.47 (1H, m, H-1) 및 5.92 (1H, br s, H-7)위치에서 2개의 올레핀 프로톤의 존재, δ_H 4.10 (2H, br s, CH₂-20)위치에서 산소화된(oxygenated) 메틸렌기의 존재, δ_H 2.25 및 2.58 (각 1H, d, J = 19.0 Hz, H-5)위치에서 메틸렌기의 존재, 및 δ_H 4.91 (1H, s, H-12) 및 4.62 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-14) 위치에서 2개의 산소화된 메틴 프로톤의 존재를 보여주었다. 화합물 1의 ¹³C NMR 스펙트럼은 5개의 메틸탄소, 3개의 메틸렌, 7개의 메틴(methine)과 9개의 4차 탄소를 보여주었다. 화합물 1의 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 C-1′위치에서 지방족 모이어티 대신에 메틸기[δ_H 1.62 및 δ_C 21.5 (C-2')]인 것을 제외하고는 yuanhuadine의 것과 유사하였다(6). 추가적 차이점은 화합물 1에서는 C-6 및 C-7으로 지정된 하나의 올레핀 탄소 시그날이 나타났다는 것과, C-5가 산화되지 않았다는 것이다. 화합물 1의 ¹³C NMR 데이터에서, δ_C 125.1 (C-7) 및 δ_C 138.9 (C-6)에서의 탄소 시그널이 다운필드로 이동되어, 6, 7-이중결합이 존재하는 것을 나타내었다 (7). δ 118.3 (C-1') 위치에서의 4차 탄소 시그널은 다프난-타입 디테르펜 에스테르에서의 오르토에스테르기의 가장 구분 가능한 특징이었다.

¹H NMR, ¹³C NMR, HMQC, 및 HMBC 스펙트럼 분석을 통해 양성자를 이들이 결합하고 있는 탄소에 할당할 수 있었고, 화합물 1이 5-디옥시-6,7-이중 결합다프네톡신 유도체(daphnetoxin derivative)라는 것을 추가적으로 입증하였다.

화합물 1의 HMBC 스펙트럼에서, δH 1.62 위치에서의 CH3-2'과 δC 118.3에서의 C-1' 사이의 상관성은 메틸기가 C-1'에서의 탄소에 연결되어 있음을 시사하였다. δH 1.94 에서의 CH3-2"와 δH 4.91에서의 H-12의 δC 169.9에서의 C-1"과의 추가적 HMBC 상관성에 의해 아세틸기를 C-12에 할당하였다. 화합물 1의 비교 입체화학은 NOESY 실험에 의해 결정하였다. H-14의 H-16, CH₃-17 및 H-8과의 NOESY 상관성은 이들이 β-방향성에 있고, 오르토에스테르 관능기는 α-방향성에 있다는 것을 지시한다. CH₃-18의 H-12와의 추가적 상관성은 C-11 및 C-12에서의 관능기간의 트랜스구조를 암시한다(8-10). 화합물 1의 절대 구조는 α,β-불포화시클로케톤의 공리(axiom)에 대응하는 228 nm에서의 포지티브 코통효과(Cotton effect)를 보여주는 화합물 1의 CD 스펙트럼으로 규명하였다. 결론적으로, 화합물 1은 신규의 다프난-타입 디테르페노이드, 12β-아세톡시-9,13,14-오르토-메타노에이트인 것으로 규명하였고, 다프네르에시니페린 A (daphneresiniferin A)으로 명명하였다.

화합물 1 : 다프네르에시니페린 A (Daphneresiniferin A) 무색 오일; UV (MeOH) λmax nm (log ε): 228 (3.99); CD (MeOH) λmax nm (Δε) 228 (+10.2); IR λmax (film) cm^-1: 3316, 1708; ESI-MS m/z: 469 [M + Na]⁺; HR-FAB-MS m/z: 469.1842 [M + Na]⁺ (calcd. 469.1838); ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) 및 ¹³C NMR (125, MHz, CDCl₃). 표 1 참조.

화합물 1의 분자 구조식

2. 화합물 2의 화학구조 규명

화합물 2는 무색의 오일 형태로 수득하였으며, m/z 531.1992 [M + Na]⁺ (calcd. 531.1995)에서 HR-FAB-MS 이온에 의해 결정된 바와 같이 분자식은 C₂₉H₃₂O₈이었고, 14의 불포화도를 가졌다. 화합물 2의 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 C-12 위치에서의 아세틸기 대신에 벤조일기[δ_H 7.60 (1H, m, H-5"), δ_H 7.46 (2H, m, H-4", 6"), 및 δ_H 7.92 (2H, m, H-3", 7") 및 δ_C 128.2 (C-4", 6"), 129.1 (C-3", 7"), 및 132.9 (C-5")]의 존재를 제외하고는 화합물 1의 것과 유사하였다. 벤조일기의 위치는 δ_H 7.92 (2H, m)에서의 H-3" 및 H-7"과 δ_H 5.18에서의 H-12와, δ_C 165.6에서의 C-1"와의 HMBC 상관성에 의해 C-12으로 지정하였다. 화합물 2의 비교 입체화학은 NOESY 실험에 의해 확립하였다. 화합물 2의 NEOSY 스펙트럼은 화합물 1의 것과 가장 동일한 상관성을 보여주었으며, 이는 동일한 비교 입체화학을 지시하는 것이다. 화합물 2의 CD 스펙트럼도 α,β-불포화 시클로케톤의 공리(axiom)에 대응하는 230nm 에서의 포지티브 코통효과(Cotton effect)를 보여주었고, 화합물 1의 것과 동일하였다(11). 따라서, 화합물 2는 신규 다프난-타입 디테르페노이드, 12β-벤조일옥시-9,13,14-오르토-메타노에이트으로 규명하였고, 다프네르에시니페린 B (daphneresiniferin B)으로 명명하였다.

화합물 2 : 다프네르에시니페린 B (Daphneresiniferin B): 무색 오일; UV (MeOH) λmax nm (log ε): 230 (4.28); CD (MeOH) λmax nm (Δε) 230 (+6.8); IR λmax (film) cm^-1: 3375, 1705; ESI-MS m/z: 531 [M + Na]⁺; HR-FAB-MS m/z: 531.1992 [M + Na]⁺ (calcd. 531.1995); ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) 및 ¹³C NMR (125, MHz, CDCl₃). 표 1 참조.

화합물 2의 분자 구조식

3. 공지 화합물

신규 화합물 이외에 7개의 공지의 화합물들이 분리되었다. 이들의 물리화학적 및 분광학적 데이터들을 공개된 값들의 것과 비교하여 각각 yuanhuacine (화합물 3)(6), yuanhuadine (화합물 4)(6), yuanhuahine (화합물 5)(8), genkwadaphnin (화합물 6)(12), genkwanine A (화합물 7)(9), genkwanine F (화합물 8)(9) 및 genkwanine H (화합물 9)(9)으로 확인하였다.

4. 멜라닌 생성 억제 효과

분리한 다프난 타입 디테르페노이드 화합물 모두에 대해서 α-MSH (α-melanocyte stimulating hormone) 활성화된 B16 멜라노마 세포내에서 멜라닌의 생성에 대한 억제활성을 포지티브 대조군으로서 아르부틴(arbutin)을 사용하여 측정하였다. 표 2의 나타난 결과를 참조하면, 분리된 화합물들중 화합물 1과 화합물 2는 멜라닌 생성을 억제하였으며, 이들의 IC₅₀ 값들은 각각 4.9 μM 와 2.3 μM 이었다. 이 값은 포지티브 대조군인 아르부틴(Arbutin)의 IC₅₀값 120 μM과 비교하여 볼때 상당히 우수한 값이었다. 세포생존능에 대한 분석 결과, 화합물 1인 다프네르에시니페린 A는 세포독성이 나타났으나, 화합물 2는 심각한 세포독성 효과는 나타나지 않았다(표 2 참조).

따라서, 본 발명의 화합물 1 또는 2의 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물은 멜라노사이트에서 멜라닌의 생성을 억제하는 활성을 가지므로, 피부 미백 용도 뿐만 아니라, 멜라닌-관련 과다 색소 침착 질환의 치료 또는 예방에 응용될 수 있을 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조문헌

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(4) Yun, C. Y.; Kim, D.; Lee, W. H.; Park, Y. M.; Lee, S. H.; Na, M.; Jahng, Y.; Hwang, B. Y.; Lee, M. K.; Han, S. B.; Kim Y. Planta Med. 2009, 75, 1505-1508.

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(6) Zhang, S.; Li, X.; Zhang, F.; Yang, P.; Gao, X.; Song, Q. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 3888-3895.

(7) Liang, S.; Shen, Y. H.; Feng, Y.; Tian, J. M.; Liu, X. H.; Xiong, Z.; Zhang, W. D. J. Nat. Prod. 2010, 73, 532-535.

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(9) Zhan, Z. J.; Fan, C. Q.; Ding, J.; Yue, J. M. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 645-655.

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(14) Villareal, M. O.; Han, J.; Yamada, P.; Shigemori, H.; Isoda, H. Exp. Dermatol. 2010, 19, 450-457.

Claims (6)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물.
   [화학식 1]
   

   

   
   단, 상기 화학식 1에서 R은 -CH₃ 또는 페닐(phenyl)기이다.
   
2. 하기 화학식 1로 표시되는 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장품 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   단, 상기 화학식 1에서 R은 -CH₃ 또는 페닐(phenyl)기이다.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 피부 미백용 조성물은 피부 미백용 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 하기 화학식 1로 표시되는 다프난 타입 디테르펜 에스테르 화합물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   단, 상기 화학식 1에서 R은 -CH₃ 또는 페닐기이다.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광흑색증(solar lentigines)인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 4 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 피부 외용 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.

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