KR20150034680A - 운지버섯 추출물, 생활성 화합물의 단리 방법 및 이들의 용도 - Google Patents

운지버섯 추출물, 생활성 화합물의 단리 방법 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 운지버섯으로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터 (9-KODE 메틸 에스터)를 단리하는 효율적이고 편리한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 운지버섯 추출물, 운지버섯으로부터 단리된 생활성 화학 성분, 및 9-KODE 메틸 에스터 및 관련 화합물들의 치료적 용도를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 암세포의 전이성 확산을 억제하는데 사용될 수 있다.

Description

운지버섯 추출물, 생활성 화합물의 단리 방법 및 이들의 용도{CORIOLUS VERSICOLOR EXTRACTS, METHODS OF ISOLATING BIOLOGICALLY-ACTIVE COMPOUNDS, AND USES THEREOF}
본 특허출원은 참조에 의해 본원에 전체로서 통합되는, 2012년 4월 11일자로 출원된 미국 가출원 제61/622,846호에 기초한 우선권을 주장한다.
아가리쿠스 베르시콜로르(Agaricus versicolor), 볼레투스 베르시콜로르(Boletus versicolor), 폴리포루스 베르시콜로르(Polyporus versicolor), 폴리스틱투스 베르시콜로르(Polystictus versicolor), 포리아 베르시콜로르(Poria versicolor), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 운지(Yun - Zhi)(중국), 카와라타케(Kawaratake)(일본) 및 "터키 테일(turkey tail)"(북아메리카)로도 알려진, 운지버섯은 담자균류 다공균과에 속한다. 전세계에 걸쳐 널리 분포되어 있으며, 아시아, 유럽 및 북아메리카의 삼림 온대에서 120종 이상의 상이한 종들이 동정되었다.
운지버섯의 의약학적 가치는 중국 명나라 왕조(서기 1368 내지 1644년) 동안, 리 시젠(Li Shi Zhen)에 의한 문헌[Compendium of Materia Medica (Compendium Medica)]에 최초로 기록되었다. 상기 문헌에 의하면, 운지버섯(운지)을 규칙적으로 복용할 경우, 원기를 돋우고, 적정 체중을 유지하며, 장수를 촉진하며, 불필요한 노화를 방지한다. 또한, 운지버섯은 간 및 비장 기능에 대한 보호 효과를 갖는 것으로 생각되고 있으며, 간 기능장애 및 호흡기 감염과 관련된 다양한 증상의 치료에 사용되어 왔다. 중국 및 일본에서는, 운지버섯을 건조시키고, 분쇄하여 차로 만든다. 운지버섯을 장기 복용시 독성 작용을 갖는다는 보고는 없었다.
운지버섯은 면역조절, 항종양, 항미생물 및 항바이러스 효과를 갖는 것으로 보고되어 있다. 이러한 약리학적 효과들은 다당류 크레스틴(polysaccharide Krestin; PSK)과 같은 다당류-펩티드에 의해 주로 나타날 수 있다.
운지버섯은 경험적 사용의 오랜 역사를 갖지만, 운지버섯이 그 약리 작용을 나타내는 정확한 메커니즘에 대한 지식은 여전히 제한되어 있다. 또한, 운지버섯의 많은 생활성 화학성분들이 동정되지 않았다. 운지버섯 추출물의 생산을 대규모화하고, 치료적 사용을 위한 그의 생활성 화학성분들을 동정하기 위한, 보다 효율적이고 편리한 추출 프로토콜을 개발할 필요성이 존재한다.
본 발명은 운지버섯(Coriolus versicolor)으로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터)를 단리하는 효율적이고 편리한 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법은
운지버섯 추출물을 수득하는 단계; 및
상기 운지버섯 추출물로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터를단리하는 단계
를 포함한다.
하나의 특정한 실시양태에서, 운지버섯으로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터)를 단리하는 방법은
(a) 충분한 양의 운지버섯 원료를 제공하는 단계;
(b) 운지버섯 원료를, 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도에서 극성 용매로 추출하여 운지버섯 추출물 및 잔여물을 생성하는 단계(상기 단계 (b)는 1회 이상 수행됨);
(c) 상기 운지버섯 추출물을 회수하는 단계; 및
(d) 상기 운지버섯 추출물로부터 9-KODE 메틸 에스터를 단리하는 단계
를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법에서 단계 (b)에서 사용되는 용매는 극성 용매이다. 특정 실시양태에서, 상기 용매는 에탄올과 물의 혼합물이다. 특정 실시양태에서, 9-KODE 메틸 에스터는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 운지버섯 추출물로부터 단리된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 염의 치료적 용도를 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 식에서,
Figure pct00002
은 이중 결합 또는 단일 결합이고;
R1은 H, OH, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기(예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, s-부틸 또는 t-부틸 기), 또는 ORa이되, Ra는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이고;
R2는 H, O, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이고;
R3은 H, OH, O, 할로, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기(예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, s-부틸 또는 t-부틸 기), 또는 ORa이되, Ra는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이다.
하나의 실시양태에서, R2는 O이고, R1은 OH, OCH3 또는 OC2H5이다. 또다른 실시양태에서, R3은 O 또는 OH이다.
특정한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 9-KODE 메틸 에스터 또는 9-KODE이다.
유리하게는, 운지버섯 추출물 및 화학식 I의 화합물은 매트릭스 메탈로프로테나제 3(MMP3) 발현을 억제하며, 암 또는 종양 세포의 생장, 침윤 및/또는 전이를 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 추출 방법에 의해 생산된 운지버섯 추출물을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 운지버섯 추출물, 운지버섯으로부터 단리된 생활성 화학성분 및/또는 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량, 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 면역 반응의 조절이 유익한 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 운지버섯 추출물, 운지버섯으로부터 단리된 생활성 화학성분(예컨대, 9-KODE 메틸 에스터) 및/또는 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량을 포함하는 조성물의 유효량을, 그러한 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 뇌종양, 비인두암, 유방암, 폐암, 백혈병, 림프종, 대장암, 간암, 위암(stomach cancer), 식도암, 방광암 및 위장암(gastric cancer)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 암 또는 종양의 치료 또는 개선에 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 종양 또는 암 세포의 전이 또는 침윤을 감소시키거나 개선시키는데 사용될 수 있다.
도 1a 내지 1c는 운지버섯의 예시적인 추출 방법을 도시한다. (a) 운지버섯을, 실온에서 1시간 동안 연속적 초음파처리(sonication)로 에탄올(12배 부피) 중에서 추출하여 운지버섯의 에탄올 추출물을 수득하였다. 간단하게는, 운지버섯 원료를, 1시간 동안 연속 초음파처리하여 12배 부피의 에탄올 중에서 침용(macerating)시켰다. 잔여물을 10배 부피의 에탄올 중에 침용시키고, 추출 과정을 2회 반복하였다. 추출물을 수집하고, 합치고, 진공 하에서 건조상태까지 증발시켰다. (b) 실온에서 제1 용매로서 12x 에탄올을, 그리고 가열 조건에서 제2 용매로서 10x 50% 에탄올을, 가열 조건에서 제3 용매로서 10x 0.04% NaOH 용액을 사용하여, 순차적 추출에 의해 운지버섯 추출물을 제조하였다. 추출물을 수집하고, 합치고, 동결건조시켰다. (c) 제1 용매로서 10x 50% 에탄올을, 제2 용매로서 10x 0.04% NaOH 용액을 사용하여, 순차적 추출에 의해 운지버섯 추출물을 제조하였다. 가열 조건에서 추출 과정을 수행하였다. 추출물을 수집하고, 합치고, 농축하고, 동결건조시켰다.
도 2a 내지 2c는 도 1a, 1b에 제시된 추출 방법을 사용하거나, 운지버섯 원료를 에탄올 중에 18시간 동안 침용시켜 제조된 운지버섯 에탄올 추출물의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 크로마토그램을 나타낸다. 운지버섯 에탄올 추출물을 대상으로, ODS-결합 실리카겔(리크로스퍼(Lichrospher) 100 RP C18, EC 5㎛)로 충전된 컬럼을 구비한 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC를 수행하였다. 유속을 1.0 mL/분으로 설정하고, 이동상으로서 물과 아세토니트릴의 혼합물을 사용하였다. 210, 254 및 280 nm에서 피크가 검출되었다. (a) 1시간의 연속 초음파처리 하에서 에탄올로 추출된 운지버섯 추출물의 HPLC 크로마토그램. 추출 과정을 2회 반복하였다. (b) 18시간 동안 에탄올 중에서 침용시켜 추출된 운지버섯 추출물의 HPLC 크로마토그램. (c) 도 1b에 제시된 추출 방법을 사용하여 추출된 운지버섯 추출물의 HPLC 크로마토그램. 간단하게는, 운지버섯을 실온에서 에탄올로 추출한 다음, 가열 조건에서 50% 에탄올로 추출하였다.
도 3a 및 3b는, 도 1a에 제시된 추출 방법을 사용하거나, 에탄올 중 운지버섯 원료를 18시간 동안 침용시켜 제조된, 운지버섯 에탄올 추출물의 기체 크로마토그래피(GC) 총 이온 크로마토그램을 나타낸다. 상기 추출물을 70℃에서 2시간 동안, 피리딘 및 유도체화제 BSTFA[N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드]와 함께 혼합하였다. 얻어진 혼합물을, HP-5MS 컬럼(30m x 250㎛ x 0.25㎛)을 사용하여 기체 크로마토그래피 질량분석법(GC-MS)에 의해 분석하였다. 초기 오븐 온도를 1분 동안 70℃로 유지하고, 10 ℃/분의 속도로 180℃까지 증가시키고, 180℃에서 2분 동안 유지시키고, 10 ℃/분의 속도로 280℃까지 상승시키고, 280℃에서 3분 동안 유지시켰다. 인젝터 온도를 275℃로 설정하였다. 1 mL/분 유속의 헬륨을 캐리어 기체로서 사용하였다. (a) 1시간 동안 연속 초음파처리 하에서 에탄올로 추출된 운지버섯 추출물의 기체 크로마토그래피(GC) 총 이온 크로마토그램. 추출 과정을 2회 반복하였다. (b) 18시간 동안 에탄올 중의 침용에 의해 추출된 운지버섯 추출물의 기체 크로마토그래피(GC) 총 이온 크로마토그램.
도 4는 도 1a에 제시된 바와 같은 추출 방법을 사용하여 제조된, 운지버섯 에탄올 추출물(MPUB-EtOH)의 HPLC 크로마토그램을 보여준다. MPUB-EtOH의 추출물을 역상 컬럼(리크로스퍼 100 RP C18, EC 5㎛)을 사용하여 추가로 5개의 분획으로 분리하였다. 유속을 1.0 mL/분으로 설정하였고, 물과 아세토니트릴의 혼합물을 이동상으로 사용하였다. 210, 254 및 280 nm에서 피크가 검출되었다.
도 5a 및 5b는 폴리이노신-폴리시티딜산(poly(I:C))으로 처리된 1차 인간 혈액 대식세포에서, 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)이 INFβ 생산을 증가시켰고(a), IL10 생산을 감소시켰다(b)는 것을 보여준다. 모든 데이터는 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±표준편차(SD)로서 도시하였다. 0.05 미만(*) 또는 0.001 미만(**)의 p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 6a 및 6b는 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)이, LPS-유도된 TNFα 생산을 감소시켰다는 것을 보여준다. 모든 데이터들은 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. 0.05 미만(*) 또는 0.001 미만(**)의 p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 7은 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)이 LPS-유도된 아질산염 생산을 감소시켰다는 것을 보여준다. 모든 데이터들은 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. 0.05 미만(*)의 p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 8a 내지 8c는 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)의 항바이러스 효과를 보여준다. (a)는 운지버섯 추출물에 의한 단순 헤르페스 바이러스(HSV)의 바이러스 역가 감소를 나타낸다. 도 4에 제시된 바와 같이, 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)을 분획 1 내지 5로 분획화하였다. 분획 4 및 5는 세포독성을 나타내었으므로(데이터가 제시되지 않음), 항바이러스 효과를 추가로 시험하지 않았다. (b)는 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)의 분획 1 내지 3에 의한 HSV 바이러스 역가의 감소를 나타낸다. (c)는 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)의 분획 3에 의한 HSV 바이러스 역가의 감소를 나타낸다. 0.001 미만(**)의 p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 9는 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)이 MMP-3 발현을 감소시켰다는 것을 보여준다. 0.05 미만(*)의 p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 10은 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)이 마우스에서 HSV 감염의 중증도를 감소시켰다는 것을 보여준다.
도 11은 50 ㎍/mL에서, 운지버섯 에탄올 추출물의 상이한 배치들(R08PUB, R09PUB, R10PUB 및 R11PUB)이 TNF-α에 의해 유도된 MMP-3 mRNA 수준을 억제하였다는 것을 보여준다. 간단하게는, 교아종(T98G, 뇌세포) 세포들을, 운지버섯 에탄올 추출물의 상이한 배치들로 18시간 동안 전처리한 다음, 재조합 인간 TNF-α(10ng/mL)로 3시간 동안 처리하였다. 타크만 유전자 발현 분석(TaqMan Gene Expression Assay)에 의해 MMP-3 mRNA 수준을 분석하였다. 모든 데이터는 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. 0.05 미만(*) 또는 0.001 미만(**)의 p 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. ("RE08", "RE09" 및 "RE11"은 운지버섯의 수확연도가 각각 2008년, 2009년 및 2011년이라는 것을 나타낸다.)
도 12는 50 ㎍/mL에서, 상이한 배치의 운지버섯 에탄올 추출물(R08PUB, R09PUB, R10PUB 및 R11PUB)이 TNF-α 유도 MMP-3 단백질 발현을 억제했다는 것을 보여준다. 간단하게는, 교아종(T98G, 뇌세포) 세포들을 상이한 배치의 운지버섯 에탄올 추출물로 18시간 동안 전처리한 다음, 재조합 인간 TNF-α(10ng/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 효소결합 면역흡착법(ELISA)에 의해 MMP-3 단백질 발현을 분석하였다. 모든 데이터는 3개 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. * P<0.05, ** P<0.01인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 13은 운지버섯으로부터 단리된 화합물(본원에서, "코브(Cove)-1"로도 지칭됨)의 HPLC 크로마토그램 및 UV 흡수를 나타낸다. 코브-1 화합물을, 1mL/분의 유속에서, 20%로부터 90%까지의 아세토니트릴 구배 용리를 이용하여 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 280 nm에서 광 다이오드 어레이 검출기를 사용하여, 약 8.5분에 용리된 단일 피크가 검출되었다. 코브-1 화합물의 UV 흡수는 277 nm에서 최대였으며, 이는 상기 화합물이 공액결합된 카보닐 기를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 14는 코브-1 화합물의 1H(A) 및 13C NMR(B) 스펙트럼을 나타낸다. 코브-1 화합물의 구조를, 메탄올-d를 용매로 사용하여, 1H NMR의 경우 500 MHz, 13C NMR의 경우 125.765 MHz에서 작동하는 브루커 500 MHz DRX NMR 분광기에 의해 규명하였다. 코브-1 화합물의 1H NMR 스펙트럼은 0.9, 1.3-1.4, 1.45, 1.58, 2.19, 2.25, 2.58, 3.33, 6.12, 6.26 및 7.22에서 신호를 나타내었다. 코브-1 화합물의 13C NMR 스펙트럼은 14.5, 23.7, 25.7, 26.3, 29.7, 30.3, 30.3, 30.3, 32.7, 34.3, 35.4, 41.1, 50.0, 128.9, 130.4, 145.5, 147.6, 178.2 및 204.1에서 신호를 나타내었다.
도 15는 코브-1 화합물의 화학구조를 나타낸다. 1H NMR (500MHz): δ0.9 (3H, H-18), 1.3-1.4 (10H, H-4, 5, 6, 16, 17), 1.45 (2H, H-15), 1.58 (4H, H-3, 7), 2.19 (2H, H-14), 2.25 (2H, H-2), 2.58 (2H, H-8), 3.33 (3H, CH3OOC), 6.12 (1H, H-10), 6.26 (2H, H-12, 13), 7.22 (1H, H-11). 13C NMR (125MHz): δ14.5 (C-18), 23.7 (C-17), 25.7 (C-7), 26.3 (C-3), 29.7 (C-15), 30.3 (C-4*), 30.3(C-5*), 30.3(C-6*), 32.7 (C-16), 34.3 (C-14), 35.4 (C-2), 41.1 (C-8), 50.0 (OCH3), 128.9 (C-10), 130.4 (C-12), 145.5 (C-11), 147.6 (C-13), 178.2 (C-1) 및 204.1 (C-9) (*상호교환가능함). 상기 결과는 Dept 135, HSQC 및 1H-1H COSY에 의해 확인되었다. 코브-1 화합물은 m/z 55, 67, 81, 95, 151, 166, 276, 308에서 이온 피크를 보였다. 상기 스펙트럼 데이터를 문헌에 보고된 데이터와 비교하여, 코브-1 화합물은 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터)로 확인되었다.
도 16은 10, 25 및 50 ㎍/mL의 정제된 코브-1 화합물이 TNF-α에 의해 유도된 MMP-3 mRNA 수준을 억제했다는 것을 보여준다. 간단하게는, 교아종(T98G, 뇌세포) 세포들을 정제된 코브-1 화합물로 18시간 동안 전처리한 다음, 재조합 인간 TNF-α(10 ng/mL)로 3시간 동안 처리하였다. 타크만 유전자 발현 분석에 의해 MMP-3 mRNA 수준을 분석하였다. 모든 데이터들을 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. ** P<0.01인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 17은 10, 25 및 50 ㎍/mL의 정제된 코브-1 화합물이 TNF-α에 의해 유도된 MMP-3 단백질 발현을 억제했다는 것을 보여준다. 간단하게는, 교아종(T98G, 뇌세포) 세포들을 정제된 코브-1 화합물로 18시간 동안 전처리한 다음, 재조합 인간 TNF-α(10 ng/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 효소결합 면역흡착법(ELISA)에 의해 MMP-3 단백질 발현을 분석하였다. 모든 데이터들을 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. * P<0.05, ** P<0.01인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 18은 T98G 세포에 있어서, 50 ㎍/mL의 운지버섯 에탄올 추출물의 상이한 배치들(R08PUB, R09PUB, R10PUB 및 R11PUB)과 함께 인큐베이션된 세포들의 대사 활동에 유의한 차이가 없었다는 것을 보여준다. 48시간의 시간에 걸쳐 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디-페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석을 수행하였다. 모든 데이터들을 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다.
도 19는 T98G 세포에 있어서, 10, 25 및 50 ㎍/mL의 상기 정제된 화합물(코브-1)과 함께 인큐베이션된 세포의 대사 활동에 유의한 차이가 없었다는 것을 보여준다. 48시간의 시간에 걸쳐 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디-페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석을 수행하였다. 모든 데이터들을 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. 이 결과는 코브-1 화합물이 유의한 독성을 갖지 않는다는 것을 보여준다.
도 20은 운지버섯의 에탄올 추출물(R11PUB)이 50 ㎍/mL에서 T98G 세포 침윤을 감소시켰다는 것을 보여준다. 마트리겔(Matrigel) 침윤 챔버를 사용하여 세포 침윤을 실험하였다. 교아종(T98G, 뇌세포) 세포들을 R11PUB로 18시간 동안 처리하고, 그 후 24시간 동안 세포들이 매트릭스를 통해 침윤하도록 하였다. 침윤 세포수를 광학 현미경 하에서 계수하여 측정하였다. 모든 데이터들을 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. ** P<0.01인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 21은 운지버섯의 에탄올 추출물(R11PUB)이 25 ㎍/mL 및 50 ㎍/mL에서 세포 침윤을 감소시켰다는 것을 보여준다. 마트리겔 침윤 챔버를 사용하여 세포 침윤을 실험하였다. 교아종(T98G), 폐암(A549) 및 유방선암(breast adenocarcinoma)(MDA-MB-231) 세포들을 R11PUB로 18시간 동안 처리한 다음, 24시간 동안 상기 세포들이 매트릭스를 통해 침윤하도록 하였다. 침윤 세포수를 광학 현미경 하에서 계수하여 측정하였다. 모든 데이터들을 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. ** P<0.01인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 22는 9-KODE 메틸 에스터(코브-1)이 25 ㎍/mL에서 T98G 세포 침윤을 감소시켰다는 것을 보여준다. 마트리겔 침윤 챔버를 사용하여 세포 침윤을 실험하였다. 교아종(T98G) 세포들을 코브-1로 18시간 동안 처리한 다음, 24시간 동안 상기 세포들이 매트릭스를 통해 침윤하도록 하였다. 침윤 세포수를 광학 현미경 하에서 계수하여 측정하였다. 모든 데이터들을 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. ** P<0.01인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
본 발명은 운지버섯으로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터)를 단리하는 효율적이고 편리한 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은
운지버섯 추출물을 수득하는 단계; 및
상기 운지버섯 추출물로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터를 단리하는 단계
를 포함한다.
하나의 특정한 실시양태에서, 운지버섯으로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터)를 단리하는 방법은
(a) 충분한 양의 운지버섯 원료를 제공하는 단계;
(b) 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도에서 극성 용매로 운지버섯 원료를 추출하여 운지버섯 추출물 및 잔여물을 수득하는 단계(상기 단계 (b)는 1회 이상 수행됨);
(c) 운지버섯 추출물을 회수하는 단계; 및
(d) 상기 운지버섯 추출물로부터 9-KODE 메틸 에스터를 단리하는 단계
를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법의 단계 (b)에서 사용되는 용매는 극성 용매이다. 특정한 실시양태에서, 상기 용매는 에탄올과 물의 혼합물이다. 특정한 실시양태에서, 9-KODE 메틸 에스터는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 운지버섯 추출물로부터 단리된다.
또한, 본 발명은 운지버섯 추출물을 제조하기 위한 효율적이고 편리한 방법을 제공한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 운지버섯 추출물은 실온에서, 물, 에탄올, 또는 에탄올과 물의 혼합물을 용매로서 사용하여 제조된다. 하나의 실시양태에서, 상기 운지버섯 추출물을 추가적으로 증류시켜 고체 또는 반고체 조성물을 생성할 수 있다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 추출 방법에 의해 생산된 운지버섯 추출물을 제공한다. 또한, 본 발명의 운지버섯 추출물, 운지버섯으로부터 단리된 생활성 화학 성분(예컨대, 9-KODE 메틸 에스터) 및/또는 화학식 I의 화합물의 치료적 유효량, 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료용 또는 약학 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명은 면역 반응의 조절이 유익한 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 개선시키는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 그와 같은 치료를 필요로 하는 대상에, 본 발명의 운지버섯 추출물 및 화합물을 포함하는 조성물의 유효량 및 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 조성물은 IFNβ 생산의 촉진, 및/또는 TNF-α, IL10 및/또는 MMP-3 생산의 감소가 유익한 질환 또는 상태의 치료 또는 개선에 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 다형성 교아종 및/또는 비인두암의 치료에 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 박테리아, 바이러스, 및/또는 미생물 감염의 치료에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 암 또는 면역저하된 환자에서 발견되는 흔한 바이러스 감염인, 바리셀라 조스터(varicella zoster), 사이토메갈로바이러스 및 헤르페스 바이러스 8 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 감염의 치료에 사용될 수 있다.
운지버섯 추출물 및 단리된 화학 성분들
본 발명의 하나의 양태는, 운지버섯 추출물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 운지버섯 추출물로부터 생활성 화학성분들을 단리하기 위해서도 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 운지버섯 추출물, 및 운지버섯 추출물로부터 단리된 화합물 및 생활성 화학성분들이 제공된다.
또한, 본 발명은 운지버섯으로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터)를 단리하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은,
운지버섯 추출물을 수득하는 단계; 및
상기 운지버섯 추출물로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터를 단리하는 단계
를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 충분한 양의 운지버섯 원료를 제공하는 단계;
(b) 약 15℃ 내지 약 30℃에서 용매를 사용하여 운지버섯 원료를 추출하여, 운지버섯 추출물 및 잔여물을 수득하는 단계(단계 (b)는 1회 이상 수행됨);
(c) 운지버섯 추출물을 회수하는 단계; 및 선택적으로,
(d) 운지버섯 추출물로부터 생활성 화학 성분을 단리하는 단계
를 포함하거나, 상기 단계들로 필수적으로 이루어지거나, 상기 단계들로 이루어진, 운지버섯 추출물을 제조하고/하거나 운지버섯 추출물로부터 생활성 화학 성분(예컨대, 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터)을 단리하는 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법의 단계 b)에서 사용되는 용매는 극성 용매이다. 유리하게는, 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도에서 극성 용매를 사용함으로써, 항암 및/또는 항바이러스 효과를 갖는 하나 이상의 생활성 소분자 화학성분의 추출을 촉진할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 운지버섯으로부터 단리된 생활성 화학 성분은 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터이다. 하나의 실시양태에서, 운지버섯 추출물은 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터를 포함한다. 바람직하게는, 운지버섯의 원료는 건조되고, 분말 상태로 분쇄된다. 바람직하게는, 운지버섯 추출물은 다당류 크레스틴(PSK)과 같은, 다당류-펩티드(PSP)를 포함하는 생활성 화학성분들을 포함한다. 바람직하게는, 상기 원료는 운지버섯 과실체이다.
특정 실시양태에서, 운지버섯의 제조를 위한 적합한 용매는 알코올(예컨대, C1-C8 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올; C1-C8 알킬 폴리올); C1-C8 케톤(예컨대, 아세톤) 또는 알킬 케톤; 클로로포름; 아세트산; 물; 및 염산과 같은 무기산)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 1:5 내지 1:20, 및 바람직하게는 약 1:10, 1:12 또는 1:15의, 운지버섯 대 용매의 비(부피/부피)를 사용한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 추출 과정은 물, 알코올(예컨대, 에탄올), 또는 알코올과 물의 혼합물(예컨대, 에탄올-물)을 용매로서 사용한다. 알코올과 물(예컨대, 에탄올과 물)의 혼합물은 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 알코올(예컨대, 에탄올)을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 용매는 12배 부피의 95% 에탄올을 포함하는 물과 에탄올의 혼합물이다. 추출 과정의 단계 (b)는 실온에서 수행되는 것이 바람직하다. 또한, 단계 (b)는 실온보다 약간 낮거나 높은 온도에서 수행될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 단계 (b)는 약 15℃ 내지 약 30℃, 약 18℃ 내지 약 28℃, 약 20℃ 내지 약 28℃, 약 22℃ 내지 약 26℃의 온도에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 단계 (b)는 약 25℃에서 수행된다.
하나의 실시양태에서, 운지버섯의 원료는 추출 과정의 단계 (b) 동안, 차가운 용매 중에서, 바람직하게는 실온 또는 실온 미만에서 침용된다. 하나의 실시양태에서, 추출 과정의 단계 (b) 전 및/또는 단계 (b) 동안, 용매나 운지버섯 원료 중 어느 것도 50℃ 초과의 온도 또는 45℃ 초과의 온도까지 끓거나 가열되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 적어도 약 15분 동안 운지버섯 원료를 용매와 혼합하여 생활성 화학성분을 추출한다. 바람직하게는, 추출 시간은 약 20분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 50분 이상, 1시간 이상, 1.5시간 이상, 2시간 이상, 2.5시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상 또는 5시간 이상이다.
바람직하게는, 추출의 단계 (b)는 연속 초음파처리를 사용하여 수행된다. 초음파처리는, 일부 경우에, 건조 약재로부터 화합물을 추출하는 효율을 개선시키고, 추출 시간을 단축시킬 수 있는 방법이다. 이와 같은 향상을 초래하는 메커니즘은, 질량 이동의 강화 및 용매의 약재로의 보다 용이한 접근이다. 따라서, 초음파처리는 통상적인 추출 기술에 대한 신속하고, 저렴하고, 효율적인 대안이며, 일부 경우에는, 심지어 초임계유체 및 마이크로파-보조 추출보다 우수하다.
바람직한 실시양태에서, 단계 (b) 동안, 약 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 4시간 또는 5시간 이상의 시간 동안, 연속 초음파처리를 사용하여 운지버섯 원료와 용매를 혼합한다. 그러나, 본 발명자들은 일부 경우에, 초음파처리가 의약 원료로부터 용매로 용이하게 침출될 수 있는 특정 화학성분들의 추출 수율을 개선시키지 않을 수 있다는 것을 발견하였다. 그와 같은 경우에, 추출 과정은 바람직하게는 초음파처리를 사용하지 않거나, 거의 사용하지 않고 수행된다.
운지버섯 추출물은 예를 들면, 용매 추출물을 함유하는 액체상으로부터의 고체상(예컨대, 잔여물)의 분리를 촉진하는 기술, 예컨대, 원심분리에 의해 회수할 수 있다. 추출물은, 예를 들어, 잔여물을 제거하기 위한 여과에 의해 수집할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 운지버섯 추출물은 추가로 증류되어 고체 또는 반고체 조성물을 생성할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 운지버섯 추출물은 농축 및/또는 정제될 수 있다.
운지버섯 추출물 및/또는 생활성 화학성분들은 단일 추출 또는 순차적 추출을 통해 수득될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 최초 추출물을 회수한 후에, 잔여물을 추가적 추출을 위해 동일한 용매에 재-용해시킬 수 있다. 또다른 실시양태에서, 운지버섯 추출물 및/또는 생활성 화학성분들은 순차적 추출을 통해, 용매-추출물 또는 잔여물을 원하는 생활성 화학성분을 추출하기 위해 매번 상이한 용매로 추출함으로써 수득될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 추출 방법은 추가로 단계 (a) 및 (b) 후에, 운지버섯 잔여물을 가열 조건 하에서(예컨대, 약 60℃ 이상의 온도에서) 용매로 추출하여 제2 운지버섯 추출물 및 제2 잔여물을 수득하는 단계, 및 선택적으로, 상기 운지버섯 추출물로부터 생활성 화학성분을 단리시키는 단계를 포함하거나, 상기 단계들로 필수적으로 이루어지거나, 상기 단계들로 이루어질 수 있다. 하나의 특정한 실시양태에서, 가열 조건 하에 운지버섯 잔여물을 추출하기 위해 극성 용매가 사용된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 추출 방법은 추가로 단계 (a) 및 (b) 후에, 가열 조건 하에서(예컨대, 약 60℃ 이상의 온도에서) 수성 알칼리성 용액(예컨대, NaOH 및 KOH)으로 운지버섯 잔여물을 추출하여, 제2 운지버섯 추출물 및 제2 잔여물을 수득하는 단계, 및 선택적으로, 상기 운지버섯 추출물로부터 생활성 화학성분을 단리하는 단계를 포함하거나, 상기 단계들로 필수적으로 이루어지거나, 상기 단계들로 이루어질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 수성 알칼리성 용액은 0.1N, 또는 0.05N, 0.02N, 0.01N, 또는 0.001N과 같이, 0.1N보다 낮은 임의의 노르말 농도값을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 추출 방법은
(a) 충분한 양의 운지버섯 원료를 제공하는 단계;
(b) 운지버섯 원료를, 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도에서 제1 용매로 추출하여 제1 운지버섯 추출물 및 제1 잔여물을 수득하는 단계;
(c) 제1 잔여물을, 가열 조건 하에서(예컨대, 약 60℃ 이상의 온도에서) 제2 용매로 추출하여, 제2 운지버섯 추출물 및 제2 잔여물을 수득하는 단계; 및
(d) 제2 잔여물을, 가열 조건 하에서(예컨대, 약 60℃ 이상의 온도에서) 알칼리성 용액(예컨대, NaOH 및 KOH)으로 추출하여 제3 운지버섯 추출물 및 제3 잔여물을 수득하는 단계;
(e) 운지버섯 추출물을 회수하는 단계; 및 선택적으로
(f) 운지버섯 추출물로부터 생활성 화학성분을 단리시키는 단계
를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 용매는 극성 용매이다.
또다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 추출 방법은
(a) 충분한 양의 운지버섯 원료를 제공하는 단계;
(b) 운지버섯 원료를, 가열 조건 하에서(예컨대, 약 60℃ 이상의 온도에서) 제1 극성 용매로 추출하여, 제1 운지버섯 추출물 및 제1 잔여물을 수득하는 단계; 및
(c) 제1 잔여물을, 가열 조건 하에서(예컨대, 약 60℃ 이상의 온도에서) 알칼리성 용액(예컨대, NaOH 및 KOH)으로 추출하여 제2 운지버섯 추출물 및 제2 잔여물을 수득하는 단계;
(d) 운지버섯 추출물을 추출하는 단계; 및 선택적으로
(e) 상기 운지버섯 추출물로부터 생활성 화학성분을 단리시키는 단계
를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 추출 방법은
(a) 충분한 양의 운지버섯 원료를 제공하는 단계;
(b) 운지버섯 원료를 극성 용매로 추출하여 운지버섯 추출물 및 잔여물을 수득하고, 상기 운지버섯 추출물을 회수하는 단계(단계 (b)는 1회 이상 수행됨);
(c) 단계 (b)에서 수득된 잔여물을 수성 알칼리성 용액으로 추출하여 수성 추출물을 수득하고, 상기 수성 추출물을 회수하는 단계(단계 (c)는 1회 이상 수행됨);
(d) 상기 단계 (b) 및 (c)로부터 수득된 하나 이상의 추출물을 합쳐서 운지버섯 추출물을 수득하는 단계; 및 선택적으로
(e) 상기 운지버섯 추출물로부터 생활성 화학 성분을 단리시키는 단계
를 포함하거나, 상기 단계들로 필수적으로 이루어지거나, 상기 단계들로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 가열 조건하에 운지버섯을 추출하는데 사용되는 극성 용매는 C1-C8 알코올(예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 가열 조건 하에 운지버섯을 추출하는데 사용되는 극성 용매는 에탄올 또는 에탄올과 물의 혼합물이다. 특정 실시양태에서, 가열 조건 하에 운지버섯을 추출하는데 사용되는 극성 용매는 물이 아니다.
본 발명에 따르면, 가열은 60℃ 초과, 65℃ 초과, 70℃ 초과, 75℃ 초과, 80℃ 초과, 85℃ 초과, 90℃ 초과, 95℃ 초과 또는 100℃ 초과의 온도에서 수행될 수 있다.
도 1a 내지 1c는 본 발명의 추출 방법의 바람직한 실시양태를 도시한다.
유리하게는, 용매로서 알칼리성 용액을 사용함으로써, 다당류 크레스틴(PSK)과 같은, 다당류-펩티드(PSP)를 비롯한 생활성 거대분자 화학성분의 추출을 촉진할 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 운지버섯 조 추출물을 분획화하거나 분리하여, 원하는 생활성 화학성분들을 함유하는 하나 이상의 분획을 수득할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 운지버섯 조 추출물을 대상으로 이동상으로서 물-아세토니트릴을 사용하여 HPLC를 실시한다. 특정 실시양태에서, 물-아세토니트릴은, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 및 95:5의 물:아세토니트릴을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 1:100 내지 100:1의 임의의 물:아세토니트릴 범위로 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 운지버섯 조 추출물에 대해 표 1에 기재된 용리 파라미터를 사용한 HPLC를 수행함으로써, 도 4에 나타난 바와 같은 5개의 분획을 수득한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 방법은, HPLC 및/또는 기체 크로마토그래피-질량 분광분석(GC-MS)의 조합을 사용함으로써, 운지버섯 추출물에 대한 화학적 프로파일을 생성하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은, 추출물에 대해 HPLC를 실시하는 단계, 상기 추출물을 용리시키는 단계 및 HPLC 후에 추출물에 대한 화학적 프로파일을 생성하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 추출물에 대해 기체 크로마토그래피-질량 분광분석을 실시하는 단계, 및 상기 추출물에 대한 크로마토그래피/분광분석 프로파일을 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 추출 방법에 의해 제조된 운지버섯 추출물을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 운지버섯 추출물은 도 2a, 2b, 2c에 나타난 바와 같은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 프로파일, 또는 도 4에 제시된 분획 1 내지 5 중 임의의 것; 및/또는 도 3a 또는 3b에 나타난 바와 같은 기체 크로마토그래피-질량 분광분석(GC/MS) 프로파일을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "필수적으로 이루어진"은, 특정된 단계 및 본 발명, 즉, 운지버섯 추출물을 제조하고/하거나 운지버섯으로부터 생활성 화학 성분들을 단리시키는 방법의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 단계들로 발명의 범위를 제한한다. 예를 들어, "필수적으로 이루어진"이라는 표현을 사용함으로써, 운지버섯 추출물의 제조 방법은, 운지버섯을 추출하거나 이와 접촉시키는 임의의 특정되지 않은 단계들, 예컨대, 특정되지 않는 용매(들)로 운지버섯을 추출 또는 이와 접촉시키거나, 특정된 조건과 상이한 조건(들)(예컨대, 온도) 하에서 운지버섯을 추출하는 추가의 단계(들)를 포함하지 않는다. 또한, 용어 "필수적으로 이루어진"을 사용함으로써, 상기 방법은 운지버섯 추출물을 수집 또는 회수하는 단계; 운지버섯 추출물을 농축하는 단계; 다수의 운지버섯 추출물을 단일 조성물로 합치는 단계; 운지버섯 추출물을 고체 또는 반고체 조성물로 동결건조 또는 건조시키는 단계; 운지버섯 추출물을 약학 조성물, 예컨대, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 과립, 분말, 전제, 팅크제로 제제화하는 단계; 운지버섯 추출물을 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 향미제, 완충제, 및/또는 유화제와 혼합하는 단계; 및 운지버섯 추출물을 포장하는 단계를 포함하는, 운지버섯의 생활성 화학 성분의 추출에 실질적으로 영향을 미치지 않는 단계들을 포함할 수 있다.
화합물
또다른 양태에서, 본 발명은 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터) 및 관련 화합물들에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따라 유용한 화합물은 하기 화학식 I로 표시되는 화학 구조를 갖는다:
화학식 I
Figure pct00003
상기 식에서,
Figure pct00004
은 이중 결합 또는 단일 결합이고;
R1은 H, OH, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기(예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, s-부틸 또는 t-부틸 기) 또는 ORa이되, Ra는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이고;
R2는 H, O, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이고;
R3은 H, OH, O, 할로, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기(예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, s-부틸 또는 t-부틸 기) 또는 ORa이되, Ra는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이다.
하나의 실시양태에서, R2는 O이고, R1은 OH, OCH3 또는 OC2H5이다. 또다른 실시양태에서, R3은 O 또는 OH이다.
하나의 실시양태에서, 화학식 I의 알킬 기는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알킬"은 탄소 및 수소를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 1가 라디칼을 지칭한다. 알킬 기의 대표적인 예로는, 메틸, 에틸, 프로필, 2-프로필, n-부틸, 이소-부틸 및 tert-부틸이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 의미한다.
용어 "하이드록시"는 라디칼 -OH를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치환된"은 화합물의 하나 이상의 수소 원자 또는 화학적 잔기가 제2의 화학적 잔기로 대체되는 것을 지칭한다. 치환기의 비제한적인 예로는, 본 명세서에 개시되어 있는 예시적 화합물 및 실시양태에 존재하는 치환기들; 및 할로겐; 알킬; 알켄일; 알킨일; 하이드록시; 알콕실; 아미노; 할로알킬(예컨대, 트리플루오로메틸); 및 -COOH가 있다. 달리 명시되어 있지 않은 경우, 본 명세서에 개시되어 있는 모든 화학적 기들은 치환될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된, "치환된" 알킬, 알켄일 또는 알킨일 잔기는 하이드로카빌 잔기, 할로, 알콕시 및 -COOH와 같은 제2 화학적 잔기로 치환된 잔기일 수 있다. 치환된 알킬 기는, 할로알킬, 하이드록시알킬, 카복시알킬 및 아미노알킬을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따라 유용한 화학식 I의 화합물은 하기 구조를 갖는, 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터)이다:
Figure pct00005
.
또다른 실시양태에서, 본 발명에 따라 유용한 화학식 I의 화합물은 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산(9-KODE)이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I로 표시되는, 단리된 또는 실질적으로 순수한 화합물에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 순수한"은 99% 초과의 순도를 의미한다.
유리하게는, 화학식 I의 화합물은 TNF-α 유도 매트릭스 메탈로프로테나아제 3(MMP3) 발현을 억제하고, 암 또는 종양 세포의 성장, 침윤 및/또는 전이를 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 식물로부터 단리될 수 있거나, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 문헌[쿠클레브 등(1997)] 및 문헌[안드레오 등(2009)]을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된"은 화합물이 천연에서 존재할 수 있는 임의의 환경으로부터 분리된 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 화합물은 상기 화합물이 단리될 수 있는 식물에 존재하는 상태의 화합물을 지칭하지 않을 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 75% 이상의 순도를 가지며, 바람직하게는 90% 이상의 순도를 갖고, 더욱 바람직하게는 95% 초과의 순도를 가지며, 가장 바람직하게는 99% 초과의 순도(실질적으로 순수함)를 갖는다.
또한, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 입체이성질체를 포함한다. 용어 "입체이성질체"는 본 명세서에 개시된, 광학적으로/입체적으로 순수한 모든 화합물, 및 광학적으로/입체적으로 강화된 모든 화합물을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 거울상 이성질체 형태들을 포함한다. 본 발명의 화합물의 거울상 이성질체 형태는 다른 거울상 이성질체를 실질적으로 포함하지 않는다(즉, 거울상 이성질체 과량 상태). 즉, 상기 화합물의 R형은 상기 화합물의 S형을 실질적으로 포함하지 않고, 따라서, S형의 거울상 이성질체 과량 상태이다. 반대로, 상기 화합물의 S형은 상기 화합물의 R형을 실질적으로 포함하지 않으며, 따라서, R형의 거울상 이성질체 과량 상태이다. 본 발명의 일 실시양태에서, 거울상 이성질체 화합물들은 적어도 약 80%의 거울상 이성질체 과량 상태이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 화합물들은 적어도 약 90%의 거울상 이성질체 과량 상태이다. 보다 바람직한 실시양태에서, 상기 화합물들은 적어도 약 95%의 거울상 이성질체 과량 상태이다. 그보다 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 화합물들은 적어도 약 97.5%의 거울상 이성질체 과량 상태이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 화합물들은 적어도 약 99% 거울상 이성질체 과량 상태이다.
면역 반응의 조절 및 암 치료를 위한 용도
본 발명의 또다른 양태는 운지버섯 추출물, 운지버섯으로부터 단리된 생활성 성분(예를 들면, 9-KODE 메틸 에스터) 및/또는 화학식 I의 화합물 및 그의 염의 치료적 용도, 및 전술된 성분들 중 하나 이상을 포함하는 면역 반응 조절 및 암 치료를 위한 조성물을 제공한다.
유리하게는, 본 발명의 운지버섯 추출물 및 화학식 I의 화합물은 보호 면역 반응을 촉진하며, 질환을 초래할 수 있는 원치않은 면역 반응을 억제한다. 예를 들어, 운지버섯 추출물 및 화학식 I의 화합물은, 예컨대, 항암제 투여에 기인하는, 저하된 면역계 기능을 회복 또는 개선시킬 수 있다.
또다른 실시양태에서, 운지버섯 추출물 및 화학식 I의 화합물은 바이러스, 박테리아 및/또는 미생물 감염에 방어하는 보호 면역 반응을 촉진시킨다.
또한, 본 발명의 운지버섯 추출물 및 화학식 I의 화합물은 원치않은 면역 반응, 예컨대, 전이를 촉진하기 위해 특정 종양 세포에 의해 이용되는, TNF-α의 생성 및 그의 메탈로프로테나제 생성 유도를 억제할 수 있다.
구체적으로, 본 발명자들은 이제, 본 발명의 운지버섯 추출물 및 화학식 I의 화합물들이 병원성 감염 및 종양형성에 대한 급성기(acute-phase) 면역 반응에 중요한 역할을 하는 염증유발 매개자인 TNF-α의 생성을 감소시킨다는 것을 발견하였다. TNF-α는 또한, 세포외 매트릭스 단백질을 분해시키는, 매트릭스 메탈로프로테나제(MMP) 및 MMP 패밀리 구성원의 생성을 유도한다. 그러나, 특정 종양 세포(예컨대, 교아종, 비인두암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 대장암)들은 TNF-α의 세포독성 효과에 대한 저항성을 발달시켰다. 그 결과, 상기 종양 세포들은 TNF-α에 의한 MMP 유도를 이용하여, 인접 조직뿐만 아니라 신체의 원위부에 위치하는 기관에도 침입한다.
유리하게는, 본 발명의 운지버섯 추출물 및 화학식 I의 화합물은 종양 세포에서의 TNF-α 생성을 억제하고, 그에 따라 TNF-α에 대한 저항성을 갖는 악성 종양 세포(예컨대, 교아종, 비인두암, 유방암, 폐암, 전립선암 및 대장암)의 전이성 확산을 예방 또는 감소시키는데 특히 유용하다.
또한, 본 발명자들은 운지버섯이, 염증유발 사이토카인의 발현을 하향조절하는 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생성을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 운지버섯이 병원성 침입에 대한 급성기 면역 반응을 촉진하는 IFNβ의 생성을 증가시킨다는 것을 발견하였다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 면역 반응의 조절이 유익한 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 개선 방법을 제공한다. 상기 방법은 그와 같은 치료를 필요로 하는 대상에, 본 발명의 운지버섯 추출물, 운지버섯으로부터 단리된 생활성 성분(예컨대, 9-KODE 메틸 에스터) 및/또는 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특히, 본 발명의 조성물은 IFNβ의 생성 촉진 및/또는 TNF-α, MMP3 및/또는 IL-10의 생성 또는 그의 수준 감소가 유익한 질환 또는 상태를 치료 또는 개선시킬 목적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상"은, 본 발명의 조성물을 사용한 치료를 제공받을 수 있는 포유류, 예컨대, 영장류를 비롯한 유기체를 지칭한다. 본 명세서에 개시된 치료 방법으로부터 이익을 받을 수 있는 포유류는, 유인원, 침팬지, 오랑우탄, 인간, 원숭이; 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭과 같은 가축; 및 마우스, 랫트, 기니어피그 및 햄스터와 같은 기타 동물들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 실시양태에서, 상기 대상은 본 발명에 따라 치료될 수 있는 상태를 갖는 것으로 진단된다. 특정 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상은, 교아종, 뇌종양, 비인두암, 유방암, 백혈병, 림프종, 대장암, 간암, 위암, 식도암, 방광암, 폐암, 전립선암 및 위장암을 포함하나, 이에 한정되지 않는 암 또는 종양을 갖는 것으로 진단된다. 하나의 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상은 전이성 암을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상은 바이러스, 박테리아 및/또는 미생물 감염을 갖는다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 대상이 본 발명에 따라 치료될 수 있는 상태를 갖는지 여부를 진단하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 양성 및/또는 악성 종양의 치료에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료" 또는 그의 임의의 문법적 변형어(예컨대, "치료하다", "치료하는" 및 "치료" 등)는, 질환 또는 상태의 증상을 개선 또는 완화시키는 것, 상태의 진행, 중증도 및/또는 범위를 감소, 진압, 억제, 경감 또는 이들에 영향을 미치는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방" 또는 그의 임의의 문법적 변형어(예컨대, "예방하다", "예방하는" 및 "예방" 등)는 증상의 개시를 지연시키는 것, 질환의 재발을 방지하는 것, 증상 에피소드간 잠복기를 증가시키는 것 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는, 예방은 증상의 완전한 부재를 요구하는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효량"은 질환 또는 상태를 치료 또는 개선시키거나, 원하는 치료 효과를 나타낼 수 있는 양을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 유효량은 TNF-α, MMP3 및/또는 IL-10의 생성 또는 수준을 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 유효량은 IFNβ의 수준 또는 생성을 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 증가시킬 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은, 교아종, 뇌종양, 비인두암, 유방암, 백혈병, 림프종, 대장암, 간암, 위암, 식도암, 방광암 및 위장암을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 암 또는 종양의 치료 또는 개선에 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 종양 세포, 특히 TNF-α의 세포독성 작용에 저항성을 갖게 된 종양 세포의 전이성 확산을 예방하거나 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 다형성 교아종, 유방암종, 폐암종, 전립선암, 대장암종 및/또는 비인두암종의 치료에 사용될 수 있다. 추가적인 특정 실시양태에서, 본 발명은 다형성 교아종, 유방암종, 폐암종, 전립선암, 대장암종 및/또는 비인두암종의 전이성 확산을 예방 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 면역계의 강화 및/또는 면역계 기능의 회복 또는 개선을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 화학요법 및/또는 방사선 요법의 면역억제 효과를 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 화학요법제의 면역계 억제 효과를 상쇄시키기 위해, 화학요법제의 투여 전, 투여 중 및/또는 투여 후에 투여된다.
또한, 본 발명의 조성물은 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물 및/또는 기타 미생물 또는 병원성 감염의 예방, 치료 또는 개선을 위해 사용될 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 조성물은 병원성 감염에 대한 면역계 기능을 조절 및/또는 강화시킨다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 바리셀라 조스터(대상포진), 헤르페스 바이러스-8, 사이토메갈로바이러스, 인간 T-림프영양성바이러스 타입-1(HTLV-1), 소 백혈병 바이러스(BLV), 엡스타인-바 바이러스 및 코로나 바이러스와 같은, 바이러스 감염의 치료 또는 개선을 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은, 칸디다 및 아스퍼질러스 종에 의한 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 진균 감염; 마이코박테리아(예컨대, M. 튜베르쿨로시스), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 대장균, 리스테리아 모노사이토제네스 및 리스테리아 아마조넨시스에 의한 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 박테리아 감염; 폐포자충(Pneumocystis) 및 톡소플라즈마 종에 의한 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 원생동물 감염의 치료 또는 개선을 위해 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 간 기능장애, 호흡기 감염 및 기관지염의 치료에 사용될 수 있다.
치료용 조성물 및 제제
본 발명은 운지버섯 추출물, 생활성 화학 성분 및/또는 본 발명의 화합물의 치료적 유효량, 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 치료용 또는 약학 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은, 본 발명에 따라 운지버섯으로부터 단리된 생활성 화합물 또는 화학 성분을 포함하는 치료용 또는 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 운지버섯 추출물을 포함하는 식이 보충체 및 건강 식품 또는 음료 제제를 포함한다.
용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 그와 같은 약학적 담체들은 물 및 오일과 같은 멸균액일 수 있고, 미네랄 오일과 같은 석유, 땅콩유, 대두유 및 참기름과 같은 식물유, 동물유 또는 합성기원의 오일을 포함할 수 있다 특히 주사용액을 위한 액상 담체로서 염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액도 사용될 수 있다.
적절한 약학 부형제로는, 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 치료용 조성물은, 원하는 경우, 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이 조성물들은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 캡슐, 과립, 분말, 지연방출형 제제 등의 제형을 취할 수 있다. 상기 조성물은 전형적인 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세라이드와 함께 제제화될 수 있다. 적절한 약학적 담체의 예가, E.W.마틴에 의한 "레밍턴 약제학(Remington's Pharmaceutical Sciences)"에 기술되어 있다. 그와 같은 조성물들은 환자에 대한 적절한 투여를 위한 제형을 제공하기 위해, 치료용 조성물의 치료적 유효량과 적절한 양의 담체를 함께 포함할 수 있다. 상기 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.
본 발명의 치료용 또는 약학 조성물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2철 하이드록사이드 등과 형성된 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 약학 조성물의 1종 이상의 성분, 예컨대, 화합물, 담체로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다.
본 발명의 조성물은 전통적인 중의학 실무에 따라 제제화될 수 있다. 특정 질환, 상태 또는 장애의 치료에 효과적인 제제의 조성 및 투여량은, 표준 임상 기술에 의해 상기 질환, 상태 또는 장애의 성질에 따라 달라질 것이다.
처방량의 전통 중국 의약은 인간 또는 동물에 투여하기에 적합한 임의의 형태의 약물로 용이하게 제조될 수 있다. 적합한 형태로는, 예를 들면, 팅크제, 전제 및 건조 추출물이 포함된다. 이들은 경구로 복용하거나, 정맥 주사 또는 점막을 통해 적용될 수 있다. 또한, 활성 성분을 캡슐, 분말, 펠렛, 당의정(pastille), 좌제, 경구 용액, 멸균된 위장관 현탁액 주사(pasteurized gastroenteric suspension injection), 소량 또는 다량의 주사, 동결 분말 주사, 멸균 분말 주사 등으로 제제화할 수 있다. 전술된 모든 방법들은 당업자에게 알려져 있고, 문헌에 기술되어 있으며, 한의사들에 의해 통상적으로 사용되고 있다.
팅크제는 의약 원료(예컨대, 약초 및 진균)을, 예를 들어 와인 또는 리퀴르과 같은 알코올 용액 중에 현탁시켜 제조된다. 일정 시간의 현탁 후에, 상기 액체(알코올 용액)를 예를 들어, 1일 2회 또는 3회, 매회 1 티스푼씩 투여할 수 있다.
추출물은 의약 원료의 필수 성분들의 농축된 제제이다. 전형적으로, 필수 성분들은 상기 의약 원료를 적절한 용매, 전형적으로는 물, 에탄올/물 혼합물, 메탄올, 부탄올, 이소부탄올, 아세톤, 헥산, 석유 에터 또는 기타 유기 용매 중에 현탁시킴으로써, 의약 원료(예컨대, 약초 및 진균)로부터 추출된다. 추출 공정은 침용(maceration), 침출(percolation), 재침출(repercolation), 역류 추출, 터보-추출의 방법, 또는 이산화탄소 초임계 (온도/압력) 추출에 의해 더욱 촉진될 수 있다. 약초 잔재를 제거하기 위한 여과 후에, 추출 용액을 추가로 증류시킴으로써 농축하여 연질의 추출물(익스트랙텀 스피썸(extractum spissum)) 및/또는 최종적으로는, 분무 건조, 진공 오븐 건조, 유동층 건조 또는 동결 건조에 의해 건조 추출물, 익스트랙텀 시컴(extractum siccum)을 생산할 수 있다. 연질의 추출물 또는 건조 추출물을 추가적으로 원하는 농도까지 적절한 액체에 용해시키거나, 알약, 캡슐, 주사제 등의 제형으로 가공할 수 있다.
투여 경로
본 발명의 화합물 및 조성물은 경구 투여, 흡입 투여, 또는 정맥내, 피하, 국부, 경피, 피내, 경점막, 복강내, 근육내, 피막내(intracapsular), 안와내, 심장내, 경기관지, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사, 주입 및 전기천공법을 비롯한 비경구 투여를 포함하여 표준 경로에 의해, 또한 대상에 (일시적 또는 영구적으로) 삽입되는 임의의 의료 장치 또는 물체의 성분으로서 함께 투여됨으로써 치료 대상에 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 경구 투여에 의해 대상에 투여된다.
특정 질환, 상태 또는 장애의 치료에 효과적인 본 발명의 치료용 또는 약학 조성물의 양은 투여 경로 및 상기 질환, 상태 또는 장애의 중증도에 좌우될 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 일반적으로, 상기 투여량은 약 0.001 mg/kg 내지 약 3 g/kg 범위이다.
예를 들어, 적절한 단위 투여량은 약 0.01 내지 약 500 mg, 약 0.01 내지 약 400 mg, 약 0.01 내지 약 300 mg, 약 0.01 내지 약 200 mg, 약 0.01 내지 약 100 mg, 약 0.01 내지 약 50 mg, 약 0.01 내지 약 30 mg, 약 0.01 내지 약 20 mg, 약 0.01 내지 약 10 mg, 약 0.01 내지 약 5 mg, 약 0.01 내지 약 3 mg, 약 0.01 내지 약 1 mg, 또는 약 0.01 내지 약 0.5 mg일 수 있다. 이와 같은 단위 투여량은 1일 1회 초과, 예를 들면, 1일 2회 또는 3회 투여될 수 있다.
단일 투여 제형을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 상태 및 치료 대상의 종류에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로, 치료용 조성물은 약 5% 내지 약 95%(중량/중량)의 활성 성분을 함유한다. 보다 구체적으로, 치료용 조성물은 약 20% 내지 약 80%(중량/중량), 또는 약 30% 내지 약 70%(중량/중량)의 활성 성분을 함유한다.
환자 상태의 개선이 나타난 후, 필요하다면 유지 용량이 투여된다. 후속적으로, 투여량 또는 투여빈도, 또는 이들 모두가 개선된 상태가 유지되는 수준으로, 증상의 함수로서 감소될 수 있다. 증상들이 원하는 수준까지 완화되었을 때, 치료를 중단해야 한다. 그러나, 환자들은 질환 증상의 재발시 장기간에 걸친 간헐적 치료를 필요로 할 수 있다.
또한, 최적 투여량 범위의 확인을 돕기 위해 선택적으로 시험관내 분석이 사용될 수 있다. 제제에 사용될 정확한 용량도 투여경로 및 질환, 상태 또는 장애의 중증도에 좌우될 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험계로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
재료 및 방법
생물학적 분석을 위한 세포 배양
면역계에 대한 운지버섯 추출물의 효과를 시험하기 위한 생물학적 분석에 일차 인간 혈액 대식세포 및 인간 백혈병 단핵구 림프종 세포(U937)를 사용하였다. 피콜-파크(Ficoll-Paque) 원심분리에 의해, 건강한 기증자의 혈액 샘플(홍콩 적십자 수혈 서비스)로부터 혈액 단핵세포들을 단리시키고, 이전에 기술된 부착법에 의해 정제하였다(문헌[Yang 등(2009)]; 및 문헌[Cheng 등(2009)] 참조).
간단하게는, 혈액 샘플들을 15분 동안 3000 rpm으로 원심분리하고, 혈장 및 세포 층으로 분리하였다. 세포층을, 1:1의 비율로 인산 완충 염수(PBS)를 사용하여 희석시켰다. 희석된 세포들을 피콜(GE 헬쓰케어)상에 서서히 도포하고, 적혈구로부터 단핵세포들을 분리하기 위해 2300 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 단핵세포층을 제거하고, 상청액이 맑아질 때까지 RPMI 1640 배지(깁코)로 세정하였다.
세포 펠렛을 5% 자가조직 혈장, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보강된 RPMI 1640(깁코) 중에 재현탁시켰다. 현탁액을 페트리접시 상에 펼치고, 단핵구 부착을 위해 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. RPMI 1640으로 세척하고, 밤새 인큐베이션한 후에, 부착된 단핵구를 5mM EDTA를 함유하는 차가운 RPMI 1640에 의해 탈착하였다.
단핵구를 24-웰 조직 배양 플레이트 상에 0.5 x 106 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 5% 자가조직 혈장, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보강된 RPMI 1640과 함께 인큐베이션하였다. 본 발명자들의 지난 보고서에 기술된 바와 같이, 14일의 시험관내 배양 후에 분화된 대식세포를 수득하였다(문헌[Yang 등(2009)] 및 문헌[Lee 등 (2009)] 참조).
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 얻은, 마우스 대식세포(RAW 264.7) 및 인간 신경아세포(SKNSH)를, 산화질소 분석 및 단순헤르페스 바이러스 감염 분석에 각각 사용하기 위한, 배양액으로 유지하였다.
mRNA 분석을 위한 실시간 역전사 -중합효소 연쇄 반응
제조자의 지시에 따라 트리졸 시약(인비트로젠)을 사용하여 총 RNA 추출을 수행하였다. 총 RNA를 DNase로 처리한 다음, 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 수퍼스크립트 II 역전사효소(인비트로젠)에 의해 역전사시켰다. 본 발명자들의 지난 보고서에서 기술된 바와 같이, 타크만 유전자 발현 분석(어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 사이토카인의 mRNA 수준을 분석하였다(문헌[Yang 등(2009)]; 문헌[Cheng 등(2009)]; 문헌[Law 등(2009)]; 및 문헌[Lee 등(2009)] 참조).
사이토카인 분석을 위한 효소-결합 면역흡착 분석
상업적으로 이용가능한 분석 키트(R&D 시스템)를 사용하여 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 세포 배양 상청액 중의 사이토카인의 단백질 수준을 측정하였다(문헌[Yang 등(2009)]; 문헌[Cheng 등(2009)]; 문헌[Law 등(2009)]; 및 문헌[Lee 등(2009)] 참조). 각각의 샘플들을 2회 반복하여 분석하였다.
운지버섯 에탄올( EtOH ) 추출물의 제조
퓨라팜 인터내셔널(중국, 홍콩)로부터 인증된 약초 운지버섯 샘플을 수득하였다. 4개의 운지버섯 배치(R08PUB, R09PUB, R10PUB 및 R11PUB)를 12배 부피의 95% 에탄올 중에서 각각 침용시킨 다음, 연속 초음파처리로 1시간 동안 추출하거나, 실온에서 24시간 동안 침용시켰다. 추출 과정을 2회 반복하였다. 추출물들을 합치고, 진공 하에서 건조 상태까지 증류시켰다.
R10PUB 로부터 코브 -1 화합물의 단리 및 동정
셉-팍(Sep-Pak) C18 카트리지(아일랜드, 워터스)를 사용하여 R10PUB를 분리하였다. 다음 용매계를 사용하여 컬럼을 용리시켰다: ACN/H2O(5:95), ACN/H2O(10:90), ACN/H2O(15:85), ACN/H2O(30:70), ACN/H2O(50:50) 및 ACN(100%). 생물학적 분석 지침의 분획화 방법을 사용하여, 100% ACN으로 용리된 활성 분획(R10PUB-S6)을 셉-팍 C18 카트리지를 사용하여 추가로 분리하였다. 컬럼을 다음 용매계를 사용하여 용리시켰다: ACN/H2O(50:50), ACN/H2O(60:40), ACN/H2O(70:30), ACN/H2O(80:20), ACN/H2O(90:10) 및 ACN(100%). 그로부터 얻어진 80% ACN(R10PUB-S6-4)으로 용리된 생활성 분획을, 역상 5 ㎛ C18 에클립스 컬럼(4.6 x 250 mm)을 구비한 HPLC를 사용하여 정제하였다. 1.0 mL/분의 유속에서 화합물들을 20% ACN에서 90% ACN으로의 구배 용리를 사용하여 용리시켰으며, 모든 측정은 실온에서 수행하였다. 210, 254 및 280 nm로 설정된 고속 스캐닝 광다이오드 어레이 검출기의 아질런트 1200 시리즈를 사용하여 피크를 검출하였다. HPLC를 사용하여 정제 과정을 반복함으로써, 95% 초과의 순도를 갖는 순수한 화합물(코브-1 화합물)(3.3 mg)을 수득하였다.
분자 구조의 구조 규명
브루커 500 MHz DRX NMR 분광기 상에 1D[1H(500 MHz), 13C(125 MHz) 및 Dept 135°] 및 2D(1H-1H COSY 및 HSQC)를 획득하였다. 화학적 시프트는 메탄올-d 중의 용액에 대한 내부 표준 (CH3)4Si(0 ppm)를 참조하였다. HP-5MS 컬럼(30m x 250㎛ x 25㎛)을 구비한 아질런트 GC-질량 분광분석기(GC: 아질런트, 7890A, MS: 아질런트, 5975C) 상에서 EI-MS를 수행하였다. 1 ㎕의 샘플을 주입하였다. 캐리어 가스로써 헬륨을 1 mL/분의 유속으로 사용하였다. 오븐 온도는 70℃에서 1분으로 시작한 다음, 10℃/분의 속도로 280℃까지 증가시키고, 3분 동안 유지시켰다. 계면 온도는 250℃였으며, 이온원 온도는 230℃였고, 전자 충돌 이온화(EI)는 200 eV였다. 질량 스펙트럼을 25분의 작동 시간 동안 50 내지 350 원자 질량 단위(amu) 범위에서 분석하였다. MS 데이터 분석을 수행하기 위해 G1701EA 켐스테이션(아질런트, 미국, 캘리포니아 산타 클라라)을 사용하였다. .
mRNA 분석을 위한 실시간 역전사 -중합효소 연쇄 반응
교아종(T98G, 뇌세포) 세포들을 상이한 배치의 운지버섯 에탄올 추출물 또는 정제된 화합물로 18시간 동안 전처리한 다음, 재조합 인간 TNF-α(10 ng/mL)로 3시간 더 처리하였다. 제조자의 지시에 따라 트리졸 시약(인비트로젠)에 의해 총 RNA 추출을 수행하였다. 총 RNA를 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 수퍼스크립트 II 역전사효소(인비트로젠)에 의해 역전사시켰다. 타크만 유전자 발현 분석(어플라이드 바이오시스템즈)에 의해 MMP-3 mRNA 수준을 분석하였다. 모든 데이터를 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. * P<0.05 또는 ** P<0.01인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
MMP -3 분석을 위한 효소-결합 면역흡착 분석
T98G 세포를 상이한 배치의 운지버섯 에탄올 추출물로 18시간 동안 전처리한 다음, 재조합 인간 TNF-α(10 ng/mL)로 24시간 동안 더 처리하였다. 상업적으로 이용가능한 분석 키트(R&D 시스템)를 사용하여, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 세포 배양 상청액 중 MMP-3의 단백질 수준을 분석하였다. 모든 데이터를 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. * P<0.05 또는 ** P<0.01인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
MTT 분석
T98G 세포를 상이한 배치의 운지버섯 에탄올 추출물 또는 정제된 화합물과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 처리 후, MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디-페닐테트라졸륨 브로마이드)(시그마)를 1 mg/mL의 최종 농도로 배지에 첨가한 후에, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 생성된 MTT 포르마잔을 200 ㎕의 이소프로판올에 용해시키고, 96-웰 마이크로플레이트 리더를 사용하여, 570 nm에서의 상청액의 흡광도를 측정하였다. 모든 데이터를 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다.
종양 세포 침윤 분석
BD 바이오코트™마트리겔™ 침윤 챔버(BD 바이오사이언스)를 사용하여 세포 침윤을 시험하였다. 1% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% 피루브산 나트륨을 함유하는 MEM 중에 현탁시킨 T98G 세포들을, 각 챔버의 겔 상단에 밤새 시딩하였다. 중탄산염 기반의 배양 배지를 플레이트의 바닥 웰 내에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 세포들을 운지버섯의 에탄올 추출물/코브-1로 18시간 동안 처리하였다. 그 다음, 챔버들을 각각의 웰이 10% FBS로 보강된 MEM을 함유하는, 새로운 플레이트로 옮겼다. 37℃에서 추가의 24시간 동안, 세포들이 매트릭스를 통하여 침윤하도록 두었다. 침윤 분석 후에, 챔버의 하부 표면에 있는 침윤된 세포들을 100% 메탄올로 2분 동안 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 광학 현미경 하에서 계수하여 침윤 세포수를 측정하였다. 모든 데이터를 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. ** P<0.01인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예
다음은 본 발명을 실시하기 위한 실시양태들을 예시한 실시예이다. 하기 실시예들은 한정적인 것으로 해석되어서는 안 된다. 모든 용매 혼합물 비율은, 달리 언급되지 않은 경우 부피 단위이다.
실시예 1 - 운지버섯 추출물의 제조
본 실시예는 운지버섯 추출물을 제조하기 위한 바람직한 추출 방법을 예시한다.
도 1a는 추출 방법의 한 실시양태를 예시한다. 간단하게는, 운지버섯 원료를 12배 부피의 에탄올 중에서 침용시키고, 실온에서 연속 초음파처리로 1시간 동안 추출하고, 원심분리하여 에탄올 추출물 및 잔여물을 생성하였다. 도 1a에 제시된 바와 같이, 잔여물을 10배 부피의 에탄올 중에 침용시켰으며, 추출 과정을 2회 반복하였다. 추출물을 수집하고, 합치고, 진공 하에서 건조 상태까지 증류시켜 운지버섯 에탄올 추출물을 포함하는 과립을 생성하였다.
하나의 실시양태에서, 운지버섯 원료를 에탄올 중에 18시간 동안 침용시키고, 원심분리하여 에탄올 추출물 및 잔여물을 생성하였다.
하나의 실시양태에서, 운지버섯 수 추출물을 제조하기 위한 용매로서 밀리-Q 수를 사용하였다. 간단하게는, 운지버섯 원료를 15배 부피의 밀리-Q 수 중에 침용시키고, 실온에서 연속 초음파처리로 30분 동안 추출하고, 원심분리하여 수 추출물 및 잔여물을 생성하였다. 잔여물을 10배 부피의 물에 재용해시키고, 추출 과정을 2회 반복하였다. 수 추출물을 수집하고, 합치고, 진공 하에서 건조 상태까지 증류시켜 운지버섯 수 추출물을 포함하는 과립을 생성하였다.
PSK와 같은 다당류-펩티드(PSP)를 포함한 생활성 고분자 및 기타 생활성 소분자들의 추출을 촉진하기 위해, 운지버섯 원료 또는 운지버섯 잔여물을 알칼리 용액(예컨대, NaOH, KOH)으로 추가로 추출하였다.
도 1b는 추출 방법의 또다른 실시양태를 보여준다. 간단하게는, 운지버섯 원료를 실온에서 1시간의 연속 초음파처리로 12배 부피의 에탄올 중에 침용시켰다. 원심분리 후에, 제1 추출물 및 제1 잔여물을 수득하였다. 이 과정을 2회 반복하였다. 제1 잔여물을 실온에서 2시간 동안, 10배 부피의 50% 에탄올 중에 침용시켰다. 그 다음, 2시간 동안 에탄올-침용 잔여물을 끓였다. 여과에 의해 불용성 물질들을 상청액으로부터 분리하여, 제2 잔여물 및 제2 추출물을 생성하였다. 제2 잔여물을 10배 부피의 0.04% NaOH에 첨가하고, 6시간 동안 끓였다. 여과에 의해 불용성 물질들을 상청액으로부터 분리하여, 제3 잔여물 및 제3 추출물을 생성하였다. 추출물을 수집하고, 합치고, 동결건조시켰다.
도 1c는 추출 방법의 또다른 실시양태를 보여준다. 간단하게는, 운지버섯 원료를 실온에서 2시간 동안, 10배의 50% 에탄올 중에 침용시켰다. 에탄올-침용된 운지버섯 원료를 2시간 동안 끓였다. 여과에 의해 불용성 불질들을 상청액으로부터 분리하여, 제1 잔여물 및 제1 추출물을 생성하였다. 제1 잔여물을 10배의 0.04% NaOH에 첨가하고, 6시간 동안 끓였다. 여과에 의해 상청액으로부터 불용성 물질들을 분리하여, 제2 잔여물 및 제2 추출물을 생성하였다. 추출물을 수집하고, 합치고, 동결건조시켰다.
실시예 2 - 운지버섯 추출물의 고성능 액체 크로마토그래피 분석
본 실시예는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 운지버섯 추출물의 화학적 지문을 분석한다. 운지버섯 추출물을 도 1a, 1b에 예시된 추출 방법을 사용하거나, 운지버섯 원료를 18시간 동안 에탄올 중에 침용시켜 수득하였다.
간단하게는, PDA 검출기(G1315C) 및 오토샘플러(G1367C)를 구비한 아질런트 1200 시리즈 HPLC 시스템(바이너리 펌프 SL, G1312B)을 사용하여, 100 ㎍/㎕의 에탄올 추출물을 대상으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 수행하였다. 크로마토그래피 컬럼(4.6 x 250 mm)을 ODS-결합 실리카겔(리크로스퍼 100 RP C18 EC 5 ㎛)로 충전시키고, 분리 동안 컬럼 온도를 실온으로 유지하였다.
운지버섯 추출물 5 ㎕를 HPLC 시스템에 투입하였다. 물과 아세토니트릴의 혼합물을 이동상으로 사용하여, 1.0 mL/분의 유속으로 HPLC를 수행하였다. 표 1에 설명되어 있는 구배 용리법을 사용하였다. 210, 254 및 280 nm로 설정되어 있는, 아질런트 1200 시리즈의 고속 스캐닝 광다이오드 어레이 검출기를 사용하여 피크를 검출하였다. 도 2a 내지 2c는 HPLC 후 운지버섯 에탄올 추출물의 화학적 프로파일을 보여준다.
Figure pct00006
실시예 3 - 운지버섯 추출물의 기체 크로마토그래피-질량 분광분석
본 실시예는 기체 크로마토그래피-질량 분광분석(GC-MS)에 의해, 운지버섯 추출물의 화학적 지문을 추가로 분석한다. 도 1a에 예시되어 있는 추출 방법을 사용하거나, 운지버섯 원료를 에탄올 중에 18시간 동안 침용시킴으로써 운지버섯 추출물을 수득하였다.
GC-MS에 의한 분석 전에, 운지버섯 추출물에 대한 실릴화 반응을 수행하였다. 간단하게는, 아세토니트릴 중 상기 추출물(30 ㎍/㎕) 100 ㎕를 1 mL 반응 바이얼(올테크)로 옮긴 후, 피리딘 50 ㎕, 및 넓은 범위의 극성 화합물들과 반응하여 상기 극성 화합물의 불안정한 수소 원자를 -Si(CH3)3　기로 대체시키는 유도체화 시약 BSTFA[N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드] 50 ㎕를 첨가하였다. 70℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, GC-MS 분석을 위한 혼합물이 준비되었다.
(GC: 아질런트, 7890A; MS: 아질런트, 5975C) 및 HP-5MS 컬럼(30m x 250㎛ x 0.25㎛)을 사용하여 혼합물을 GC-MS에 의해 분석하였다. 운반 기체로서 헬륨을 1:50의 분할 비율로 사용하였으며, 1 ㎕ 헬륨을 1 mL/분의 유속으로 컬럼 내로 주입하였다. 초기 오븐 온도는 70℃였으며, 이를 1분 동안 유지시키고, 10 ℃/분의 속도로 180℃까지 증가시키고, 180℃에서 2분 동안 유지시켰으며, 10 ℃/분의 속도로 280℃까지 증가시키고, 280℃에서 3분 동안 유지시켰다. 투입기 온도는 275℃였고; 계면 온도는 250℃였으며, 이온원 온도는 230℃였고, 200 eV에서 전자 충돌 이온화(EI)를 실시하였다. 22분의 작동 시간 동안, 50 내지 700 원자 질량 단위(amu) 범위에서 질량 스펙트럼을 분석하였고, 데이터를 아질런트 G1701EA 켐스테이션을 사용하여 처리하였다. 도 3은 GC-MS 분석에 따른, 운지버섯 에탄올 추출물의 크로마토그래피 프로파일을 보여준다.
실시예 4 - 운지버섯 추출물의 분획화
도 1a에 예시된 추출 방법을 사용하여 수득된 운지버섯 에탄올 추출물(MPUB-EtOH)을, 1525 이중 HPLC 펌프, 2998 광다이오드 어레이 검출기 및 워터스 분획 수집기 III을 구비한 워터스 제조용 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 5개의 분획으로 추가 분리하였다(도 4). 역상 컬럼(리크로스퍼 100 RP C18, EC 5 ㎛)을 사용하여 분획화를 수행하였고, 검출 파장을 210, 254 및 280 nm로 설정하였다. 구배 프로그램은 다음과 같이, 1 mL/분의 유속의 2개의 용매, (A) 물 및 (B) 아세토니트릴로 이루어졌다: 0 내지 16분, 10 내지 90% B; 16 내지 18분, 90% B 및 18~22분, 10% B.
실시예 5 - 사이토카인 생성에 대한 운지버섯 추출물의 효과
IFNβ 및 IL-10 생성에 대한 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)의 효과를 시험하기 위해, 일차 인간 혈액 대식세포를 500 ㎍/mL의 MPUB-EtOH로 18시간 동안 전처리하였다. 그 다음, 세포들을 폴리이노신-폴리사이티딜산(폴리I:C)(50 ㎍/mL)으로 3시간 동안 처리하였다. 타크만 유전자 발현 분석에 의해, IFNβ mRNA 및 IL-10 mRNA 수준을 분석하였다. 도 5a 및 5b에 제시된 바와 같이, 운지버섯 추출물은 IFNβ 생성을 증가시켰으며, IL-10 생성을 억제하였다.
LPS에 의해 유도된 TNF-α 생성에 대한 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)의 효과를 시험하기 위해, 일차 인간 혈액 대식세포를 다양한 농도(1, 10 및 50 ㎍/mL)의 MPUB-EtOH로 18시간 동안 전처리하였다. 그 다음, 세포들을 리포폴리사카라이드(LPS)(1 ng/mL)로 3시간 및 24시간 동안 처리하였다. 각각 타크만 유전자 발현 분석 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 TNF-α mRNA 수준 및 단백질 수준을 분석하였다. 도 6a 및 6b에 나타난 바와 같이, 운지버섯 추출물은 용량 의존적으로 TNF-α의 생성을 감소시켰다.
LPS에 의해 유도된 아질산염 생성에 대한 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)의 효과를 시험하기 위해, 마우스 대식세포(RAW 264.7)에 MPUB-EtOH를 다양한 농도(20, 50 및 100 ㎍/mL)로 24시간 동안 전처리하였다. 그 다음, 세포들을 LPS(100 ng/mL)로 18시간 동안 처리하고, 그리스(Griess) 시약에 의해 아질산염 농도(μM)를 측정하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, 운지버섯 추출물은 용량 의존적으로 아질산염 생성을 억제하였다.
실시예 6 - 운지버섯 추출물의 항바이러스 효과 측정
운지버섯 추출물의 항바이러스 효과를 시험하기 위해, 인간 신경 세포(SKNSH)를 10 ㎍/mL의 MPUB-EtOH로 18시간 동안 전처리하였다. 세포 상청액을 후속 인큐베이션을 위해 보관해두었다. 그 다음, 세포들을, 1시간 동안 0.01 m.o.i.(감염다중도)로 단순헤르페스 바이러스(HSV)로 감염시켰다. 바이러스 감염 후, 세포들을 PBS로 2회 세척하고, 보관해둔 배양 상청액과 함께 18시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 바이러스 역가를 측정하기 위해 배양 상청액을 수집하였으며, T98G(인간 교아종) 세포의 감염 동안 조직 배양 세포 반수 감염 용량(TCID50)의 적정에 의해 바이러스 역가를 측정하였다.
실시예 4에 기술된 바와 같이 MPUB-EtOH를 5개의 분획으로 추가로 분획화하였다. SKNSH 세포들을 MPUB-EtOH-1, MPUB-EtOH-2 및 MPUB-EtOH-3으로 전처리하고, 전술된 바와 같이 HSV 바이러스로 감염시켰다. 배양 상청액의 바이러스 역가(TCID50)를 측정하였다. MPUB-EtOH-4 및 MPUB-EtOH-5는 세포독성을 나타내었으며(데이터가 제시되지 않음), 따라서 항바이러스 효과에 대한 시험을 추가로 진행하지 않았다. 도 8a 및 8c에 제시된 모든 데이터들은 3회 이상의 독립적 실험들의 평균값 ±SD로서 도시하였다. P<0.001(**)인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 운지버섯 추출물은 배양 상청액 중의 바이러스 역가를 현저하게 감소시켰으며, 분획 3이 가장 강력한 항바이러스 효과를 나타내었다(도 8b 및 8c 참조).
실시예 7 - MMP -3 발현에 대한 운지버섯 추출물의 효과
본 실시예는 운지버섯 추출물이 MMP-3 발현을 감소시켰다는 것을 보여준다(도 9). 간단하게는, 교아종(T98G, 뇌세포) 세포들을 상이한 농도(1, 10 및 50 ㎍/mL) 의 MPUB-EtOH로 18시간 동안 전처리한 다음, 재조합 인간 TNF-α(10 ng/mL)로 3시간 동안 처리하였다. 타크만 유전자 발현 분석에 의해 MMP-3 mRNA 수준을 분석하였다. 모든 데이터들을 3회 이상의 독립적 실험의 평균값±SD로서 도시하였다. P<0.05(*)인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 8 - 운지버섯 추출물의 생체내 항바이러스 효과의 측정
생체 내에서의 운지버섯 추출물의 항바이러스 효과를 시험하기 위해, 3주령의 수컷 BALB/c 마우스(군 당 15마리의 마우스)에, 7일 동안 24시간 간격으로 1일 1회씩 디메틸 설폭사이드(DMSO)(MPUB-EtOH의 용매) 또는 MPUB-EtOH(250 mg/kg)를 복강내(ip) 투여하였다.
간단하게는, 0일차에, 1 x 105 TCID50/mL의 HSV 접종(ip)으로 마우스를 감염시켰다. DMSO, MPUB-EtOH 또는 아시클로버(10mg/kg)를, 감염 1시간 후부터 시작하여 5일 동안 24시간 간격으로 1일 1회 복강내 투여하였다. 마우스를 매일 관찰하였고, 다음의 스코어링 시스템에 기초하여, 뒷다리 마비 시험에 의해 질병 중증도를 측정하였다: 0, 마비가 없음; 1, 뒷다리의 움직임에 명백한 어려움이 있음; 2, 한쪽 뒷다리에 불완전한 마비가 있음; 3, 한쪽 뒷다리에 완전한 마비가 있음; 4, 양 뒷다리에 불완전한 마비가 있음; 5, 양 뒷다리에 완전한 마비가 있음. 도 10에 제시된 바와 같이, 운지버섯 추출물(MPUB-EtOH)은 마우스에서 DMSO-처리된 대조군에 비해 HSV 감염의 중증도를 현저하게 감소시켰다. 운지버섯 추출물의 항바이러스 효과는 아시클로버의 효과와 대등하였다.
실시예 9 - MMP -3 발현에 대한 운지버섯 추출물 및 9- KODE 메틸 에스터의 효과
본 실시예는 운지버섯의 에탄올 추출물 및 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터)가 TNF-α에 의해 유도된 매트릭스 메탈로프로테나제 3(MMP3) 발현을 억제하며, 종양 전이를 억제 또는 감소시키는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
도 11 및 12에 나타난 바와 같이, 운지버섯(PUB) 추출물은 TNF-α에 의해 유도된 MMP3 발현 및 인간 신경교종 T98G 세포의 이동을 조절한다. 운지버섯 에탄올 추출물의 상이한 배치들(R08PUB, R09PUB, R10PUB 및 R11PUB)은 50 ㎍/mL에서 TNF-α에 의해 유도된 MMP3 mRNA 및 단백질 발현 모두를 억제하였다(도 11 및 12). 특히, R11PUB 에탄올 추출물은 50 ㎍/mL에서 T98G 세포 침윤을 감소시켰다(도 20).
9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터; 본원 명세서에서 "코브-1"로도 지칭됨)는 운지버섯으로부터 단리된다(도 13 내지 15). 도 16 및 17에 제시된 바와 같이, 9-KODE 메틸 에스터는 TNF-α에 의해 유도된 매트릭스 메탈로프로테나제 3 발현 및 인간 신경교종 T98G 세포의 이동을 조절한다. 특히, 9-KODE 메틸 에스터는 10, 25 및 50 ㎍/mL에서 TNF-α에 의해 유도된 MMP3 mRNA 및 단백질 발현 모두를 억제하였다(도 16 및 17).
또한, 시험 결과는 운지버섯 에탄올 추출물의 상이한 배치들 또는 9-KODE 메틸 에스터가 세포독성 효과를 거의 갖지 않는다는 것을 보여준다(도 18 및 19).
실시예 10 - 암세포 침윤 감소에 대한 운지버섯 추출물 및 9- KODE 메틸 에스터의 효과
본 실시예는 운지버섯의 에탄올 추출물(R11PUB)이 T98G 세포, A549 세포 및 MDA-MB-231 세포를 포함한 암세포들의 침윤을 용량 의존적으로 감소시켰다는 것을 보여준다(도 21).
구체적으로, 마트리겔 침윤 챔버를 사용하여 암세포 침윤에 대한 운지버섯의 효과를 시험하였다. 교아종(T98G), 폐암종(A549), 및 유방선암종(MDA-MB-231) 세포들을 운지버섯 에탄올 추출물의 한 배치(R11PUB)로 18시간 동안 처리한 다음, 24시간 동안 세포들이 매트릭스를 통해 침윤하도록 하였다. 광학 현미경 하에서 계수하여 침윤 세포의 수를 측정하였다. 모든 데이터들은 3회 이상의 독립적 실험들의 평균값±SD로서 도시하였다. P<0.01(**)인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 도 21에 제시된 바와 같이, 운지버섯 에탄올 추출물(R11PUB)은 25 및 50 ㎍/mL에서 세포 침윤을 감소시켰다.
또한, 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터; 본 명세서에서 "코브-1"로도 지칭됨)(25 ㎍/mL)는 T98G 세포의 침윤을 현저하게 감소시켰다(도 22).
구체적으로, 마트리겔 침윤 챔버를 사용하여 세포 침윤에 대한 9-KODE 메틸 에스터의 효과를 시험하였다. 교아종(T98G) 세포들을 9-KODE 메틸 에스터로 18시간 동안 처리한 다음, 24시간 동안 세포들이 매트릭스를 통하여 침윤하도록 두었다. 광학 현미경 하에서 계수하여 침윤 세포수를 측정하였다. 모든 데이터들은 3회 이상의 독립적 실험들의 평균값±SD로서 도시하였다. P<0.01(**)인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 도 22에 나타난 바와 같이, 9-KODE 메틸 에스터는 25 ㎍/mL에서 세포 침윤을 감소시켰다.
본 명세서에서 인용된, 간행물, 특허 출원 및 특허를 비롯한 모든 문헌들은 상기 각각의 문헌들이 개별적으로 및 구체적으로 참조에 의해 통합된다고 표시되고, 전체로서 본 명세서에 제시된 것과 마찬가지의 범위로 본 명세서에 통합된다.
본 발명을 설명함에 있어서 사용된 관사 및 유사한 표현들은, 달리 명시되거나 문맥상 명백히 모순되는 경우가 아니면 단수형 및 복수형 모두를 포함하는 것으로 해석된다.
본 명세서에서 수치의 범위에 대한 언급은, 달리 언급되지 않은 경우, 해당 범위 내에 속하는 각각의 개별 수치를 개별적으로 언급하기 위한 간단한 방법으로서 사용되었으며, 각각의 개별 수치는 이들이 본 명세서에 개별적으로 기재되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 달리 명시되지 않은 경우, 본 명세서에 제공된 모든 정확한 수치들은 대응하는 근사치들의 대표값이다(예컨대, 특정 요소 또는 측정치와 관련하여 제시된 모든 정확한 예시 수치들은, 적절한 경우, "약"에 의해 수식되는 대응하는 근사 측정치를 또한 제시한 것으로 간주된다).
본 명세서에 제시된 임의의 그리고 모든 예, 또는 예시적 문구(예컨대, "~와 같은")는 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것일 뿐, 달리 언급되지 않은 한 본 발명의 범위에 제한을 두는 것이 아니다. 명시적으로 언급되지 않은 경우, 본 명세서의 어떠한 문구도, 임의의 구성요소가 본 발명의 실시에 필수적임을 의미하는 것으로 이해되어서는 안된다.
특정 구성요소 또는 구성요소들에 관하여 "포함하는", "갖는", "비롯한" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 사용한 본 발명의 임의의 양태 또는 실시양태의 설명은, 달리 명시되거나 문맥상 명백히 모순되는 경우가 아니라면, 상기 특정 구성요소 또는 구성요소들로 "이루어진", "필수적으로 이루어진", "실질적으로 이루어진" 유사한 양태 또는 실시양태에 대한 뒷받침을 제공하는 것으로 의도된다(예컨대, 본 명세서에서 특정 구성요소를 포함하는 것으로 기술된 조성물은, 달리 명시되거나 문맥상 명백히 모순되는 경우가 아니면, 상기 구성요소로 이루어진 조성물도 기술한 것으로 이해되어야 한다).
본 명세서에 설명된 실시예 및 실시양태들은 단지 예시 목적일 뿐이고, 당업자들에게는 그에 비추어 다양한 변형 및 변화들이 제안될 것이며, 이러한 변형 및 변화들도 본 출원의 개념 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
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Claims (19)

  1. (a) 충분한 양의 운지버섯(Coriolus versicolor) 원료를 제공하는 단계;
    (b) 운지버섯 원료를, 약 15℃ 내지 약 30℃의 온도에서 알코올 또는 알코올과 물의 혼합물인 극성 용매로 추출하여, 운지버섯 알코올 추출물 및 잔여물을 생성하고, 상기 운지버섯 알코올 추출물을 회수하는 단계; 및
    (c) 상기 운지버섯 알코올 추출물로부터 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터를 단리하는 단계
    를 포함하되, 상기 단계 (b)가 1회 이상 수행되는,
    단리된 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터(9-KODE 메틸 에스터)의 수득 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    극성 용매가 에탄올, 또는 물과 에탄올의 혼합물인, 수득 방법.
  3. 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염:
    화학식 I
    Figure pct00007

    상기 식에서,
    Figure pct00008
    은 이중 결합 또는 단일 결합이고;
    R1은 H, OH, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기, 또는 ORa이되, Ra는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이고;
    R2는 H, O, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이고;
    R3은 H, OH, O, 할로, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기, 또는 ORa이되, Ra는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이다.
  4. 제3항에 있어서,
    R1이 OH, OCH3 또는 OC2H5인, 화합물.
  5. 제3항에 있어서,
    R2가 O인, 화합물.
  6. 제3항에 있어서,
    R3이 O 또는 OH인, 화합물.
  7. 제3항에 있어서,
    9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터인, 화합물.
  8. 제3항에 따른 화합물을 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    치료적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터를 포함하는, 조성물.
  11. 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양의 치료 방법:
    화학식 I
    Figure pct00009

    상기 식에서,
    Figure pct00010
    은 이중 결합 또는 단일 결합이고;
    R1은 H, OH, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기, 또는 ORa이되, Ra는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이고;
    R2는 H, O, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이고;
    R3은 H, OH, O, 할로, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기, 또는 ORa이되, Ra는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬기이다.
  12. 제11항에 있어서,
    화합물이 9-옥소-10E,12E-옥타데카디엔산 메틸 에스터인, 치료 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    대상이 인간인, 치료 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    대상이 전이성 암을 가지고, 조성물의 투여가 암 전이를 감소시키는데 사용되는, 치료 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    암 또는 종양이 뇌암 또는 뇌종양, 비인두암종, 유방암 또는 유방종양, 폐암 또는 폐종양, 백혈병, 림프종, 대장암 또는 대장종양, 간암 또는 간종양, 위암(stomach cancer) 또는 위종양(stomach tumor), 식도암 또는 식도종양, 방광암 또는 방광종양, 및 위장암(gastric cancer) 또는 위장종양(gastric tumor)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료 방법.
  16. 제11항에 있어서,
    대상이 뇌암 또는 뇌종양을 가지고, 조성물의 투여가 뇌암 또는 뇌종양의 치료에 사용되는, 치료 방법.
  17. 제11항에 있어서,
    대상이 유방암 또는 유방종양을 가지고, 조성물의 투여가 유방암 또는 유방종양의 치료에 사용되는, 치료 방법.
  18. 제11항에 있어서,
    대상이 폐암 또는 폐종양을 가지고, 조성물의 투여가 폐암 또는 폐종양의 치료에 사용되는, 치료 방법.
  19. 제11항에 있어서,
    MMP3의 발현을 억제하는데 사용되는, 치료 방법.
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