CN104684882A - 杂色革盖菌提取物、分离生物活性化合物的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了有效且方便的从杂色革盖菌中分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)的方法。另外，本发明提供了杂色革盖菌提取物、从杂色革盖菌中分离的生物活性化学成分以及9-KODE甲酯及相关化合物的治疗用途。在优选的实施方案中，本发明可用于抑制癌细胞的转移扩散。

Description

杂色革盖菌提取物、分离生物活性化合物的方法及其用途
本申请要求于2012年4月11日提交的美国临时申请序列号61/622,846的权利，所述申请以引用的方式全文纳入本文。
背景技术
杂色革盖菌(Coriolus versicolor)，也被称为杂色蘑菇(Agaricusversicolor)、杂色牛肝菌(Boletus versicolor)、变色多孔菌(Polyporusversicolor)、杂色云芝(Polystictus versicolor)、杂色卧孔菌(Poriaversicolor)、杂色栓菌(Trametes versicolor)、云芝(Yun-Zhi，中国)、Kawaratake(日本)和“turkey tail”(北美)，属于担子菌纲(Basidiomycetes class)和多孔菌科(Polyporaceae family)。其广泛分布于世界各地，已经在亚洲、欧洲和北美洲的多树木的温带鉴定出多于120个不同的株系。
杂色革盖菌的药用价值最初在中国明朝期间(公元1368-1644年)由李时珍记录于《本草纲目》(Compendium of Materia Medica，Compendium Medica)。根据《本草纲目》记载，如定期食用杂色革盖菌(云芝)，可使人精力充沛、维持最佳体重、延年益寿并避免不必要的衰老。杂色革盖菌还被认为对肝脏和脾脏功能有保护作用，并已被用于治疗多种与肝功能障碍和呼吸道感染相关的症状。在中国和日本，杂色革盖菌被干燥、研磨并制成茶。目前尚无报道显示杂色革盖菌在长期使用中具有毒性作用。
据报道，杂色革盖菌具有免疫调节、抗肿瘤、抗微生物和抗病毒作用。这些药理学作用大部分由多糖-肽(PSP)例如云芝多糖(PSK)产生。
尽管杂色革盖菌的经验性应用具有很长的历史，但关于其发挥其药理学作用的确切机制仍然所知有限。另外，尚未鉴定出杂色革盖菌的许多生物活性化学成分。因此，需要开发更加有效和方便的提取方法，以用于放大杂色革盖菌提取物的生产，并用于鉴定其用于治疗的生物活性化学成分。
发明内容
本发明提供了有效且便捷的从杂色革盖菌中分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-oxo-10E,12E-octadecadienoic acid methyl ester,9-KODE甲酯)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：
获得杂色革盖菌提取物；及
从所述杂色革盖菌提取物中分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯。
在一个具体实施方案中，所述从杂色革盖菌中分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)的方法包括：
a)提供足够量的杂色革盖菌原材料；及
b)在约15℃至约30℃的温度下用极性溶剂对杂色革盖菌原料进行提取以得到杂色革盖菌提取物及残留物，其中将步骤b)进行一次或多于一次；
c)回收所述杂色革盖菌提取物；
d)从所述杂色革盖菌提取物分离9-KODE甲酯。
在一个实施方案中，以上方法步骤b)中使用的溶剂是极性溶剂。在具体实施方案中，所述溶剂是乙醇-水混合物。在具体实施方案中，通过高效液相色谱法(HPLC)从所述杂色革盖菌提取物中分离9-KODE甲酯。
在另一个实施方案中，本发明提供了式I化合物及其盐的治疗用途：
其中
是双键或单键；
R1是H、OH、直链或支链C1-C4烷基基团(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基基团)，或ORa，其中Ra为直链或支链C1-C4烷基基团；且
R2是H、O或直链或支链C1-C4烷基基团；且
R3是H、OH、O、卤素、直链或支链C1-C4烷基基团(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基基团)，或ORa，其中Ra为直链或支链C1-C4烷基基团。
在一个实施方案中，R2是O，且R1是OH、OCH3或OC2H5。在另一个实施方案中，R3是O或OH。
在某些具体实施方案中，所述式I化合物为9-KODE甲酯或9-KODE。
有利地，所述杂色革盖菌提取物和式I化合物抑制基质金属蛋白酶3(MMP3)的表达并可用于抑制癌细胞或肿瘤细胞的生长、侵袭和/或转移。
本发明还提供了通过本发明的提取方法生产的杂色革盖菌提取物。还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的题述杂色革盖菌提取物、从杂色革盖菌分离的生物活性化学成分和/或式I化合物，及任选的可药用载体。
本发明还提供了预防、治疗或改善疾病或病症的方法，其中对于免疫应答的调节是有益的。在一个实施方案中，所述方法包括，将有效量的组合物给予需要这种治疗的受试者，所述组合物包含治疗有效量的本发明的杂色革盖菌提取物、从杂色革盖菌提取物分离的生物活性化学成分(例如9-KODE甲酯)和/或式I化合物。
在一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或改善癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤包括但不限于脑瘤、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、食道癌、膀胱癌及胃癌(gastric cancer)。在具体实施方案中，本发明的组合物可用于减轻或改善肿瘤细胞或癌细胞的转移或侵袭。
附图说明
图1A-C示出了杂色革盖菌的示例性提取方案。(A)通过在室温下在乙醇(12倍体积)中持续超声将杂色革盖菌提取1小时来获得杂色革盖菌的乙醇提取物。简言之，将杂色革盖菌原材料浸渍于12倍体积乙醇中，同时持续超声1小时。将残留物浸渍于10倍体积的EtOH中，重复所述提取程序两次。将提取物收集、合并并在真空下蒸发至干燥。(B)通过连续提取制备杂色革盖菌提取物，在室温下使用12xEtOH作为第一溶剂、在加热条件下10x 50％EtOH作为第二溶剂、在加热条件下10x 0.04％NaOH溶液作为第三溶剂。将提取物收集、合并、浓缩并冻干。(C)通过连续提取制备杂色革盖菌提取物，使用10x 50％EtOH作为第一溶剂、10x 0.04％NaOH溶液作为第二溶剂。所述提取步骤在加热条件下进行。收集提取物、合并、浓缩并冻干。
图2A-C示出了使用图1A、1B所示的提取方案或通过将杂色革盖菌原材料浸渍于乙醇中18小时而制备的杂色革盖菌乙醇提取物的高效液相色谱(HPLC)色谱图。通过使用Agilent 1200系列HPLC系统和装填有ODS-键合硅胶的柱(Lichrospher 100RP C18,EC 5um)而对所述杂色革盖菌乙醇提取物进行HPLC。流速设定为1.0ml/min，使用水-乙腈混合物作为流动相。在210、254和280nm处检测峰值。(A)在持续超声1小时的情况下用乙醇提取的杂色革盖菌提取物的HPLC色谱图。将所述提取步骤重复两次。(B)通过在乙醇中浸渍18小时提取的杂色革盖菌提取物的HPLC色谱图。(C)使用图1B所示的提取方案提取的杂色革盖菌提取物的HPLC色谱图。简言之，将杂色革盖菌在室温下用乙醇进行提取，然后在加热条件下用50％乙醇提取。
图3A-B示出了使用图1A所示的提取方案制备或通过将杂色革盖菌原材料浸渍在乙醇中18小时而制备的杂色革盖菌乙醇提取物的气相色谱(GC)总离子色谱图。将所述提取物与吡啶和衍生化试剂BSTFA[N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺]在70℃下混合2小时。通过气相色谱-质谱(GC-MS)使用HP-5MS柱(30m x 250um x 0.25um)分析所产生的混合物。初始的柱温箱温度在70℃下维持1分钟，以每分钟10℃的速度增加至180℃，在180℃下维持2分钟，以每分钟10℃的速率增加至280℃，在280℃下维持3分钟。注射器温度设定为275℃。使用流速为1ml/min的氦气作为载气。(A)在连续超声1小时的情况下用乙醇提取的杂色革盖菌提取物的气相色谱(GC)总离子色谱图。将所述提取步骤重复两次。(B)通过在乙醇中浸渍18小时提取的杂色革盖菌提取物的气相色谱(GC)总离子色谱图。
图4示出了使用图1A中示出的提取方案制备的杂色革盖菌乙醇提取物(MPUB-EtOH)的HPLC色谱图。使用反相柱(Lichrospher 100RP C18,EC 5um)将MPUB-EtOH提取物进一步分离为5个级分。流速设定为1.0ml/min，使用水-乙腈混合物作为流动相。在210、254和280nm处检测峰值。
图5A-B示出了在用聚肌苷-聚胞苷酸(poly(I:C))处理的原代人血巨噬细胞中，杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)增加了INFβ的产生(A)并减少了IL10的产生(B)。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为p值<0.05(*)或<0.001(**)是统计学上显著的。
图6A-B示出了杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)减少了LPS诱导的TNFα的产生。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为p值<0.05(*)或<0.001(**)是统计学上显著的。
图7示出了杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)减少LPS诱导的亚硝酸盐(nitrite)的产生。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为p值<0.05(*)是统计学上显著的。
图8A-C示出了杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)的抗病毒作用。(A)示出了由杂色革盖菌提取物导致的单纯疱疹病毒(HSV)病毒滴度的降低。如图4所示，所述杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)被分级分离为级分1-5。级分4-5是细胞毒性的(数据未示出)，因此没有进一步检查其抗病毒作用。(B)示出了由所述杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)的级分1-3导致的HSV病毒滴度的降低。(C)示出了由所述杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)的级分3导致的HSV病毒滴度的降低。认为p值<0.001(*)是统计学上显著的。
图9示出了杂色革盖菌提取物(MPUB-乙醇)减少了MMP-3表达。p值<0.05(*)被认为是统计学上显著的。
图10示出了杂色革盖菌提取物(MPUB-乙醇)降低了小鼠中HSV感染的严重程度。
图11示出了50μg/ml的不同批次杂色革盖菌(R08PUB、R09PUB、R10PUB和R11PUB)的乙醇提取物抑制TNF-α诱导的MMP-3mRNA水平。简言之，将成胶质细胞瘤(glioblastoma)(T98G，脑细胞)细胞用不同批次杂色革盖菌的乙醇提取物预处理18小时，并随后用重组人TNF-α(10ng/ml)处理3小时。用Taqman基因表达测定法分析MMP-3mRNA水平。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为*p<0.05、**p<0.01是统计学上显著的(“R08”、“R09”和“R11”指收获杂色革盖菌的年份分别为2008、2009和2011年)。
图12示出了50μg/ml不同批次杂色革盖菌(R08PUB、R09PUB、R10PUB和R11PUB)的乙醇提取物抑制TNF-α诱导的MMP-3蛋白质表达。简言之，将成胶质细胞瘤(T98G，脑细胞)细胞用不同批次杂色革盖菌的乙醇提取物预处理18小时，并随后用重组人TNF-α(10ng/ml)处理24小时。用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析MMP-3蛋白质表达。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为*p<0.05、**p<0.01是统计学上显著的。
图13示出了从杂色革盖菌分离的化合物(在本文中也被称为Cove-1)的HPLC色谱图和UV吸收度。通过反相HPLC使用从20％至90％乙腈的梯度洗脱以流速1ml/min纯化化合物Cove-1。用光电二极管阵列检测器在280nm下检测到约8.5min处的洗脱的单峰。化合物Cove-1的UV吸收在277nm最大，说明所述化合物Cove-1具有共轭羰基。
图14示出了化合物Cove-1的1H(A)和13C NMR(B)谱图。通过Bruker 500MHz DRX NMR光谱仪，1H在500MHz操作且13CNMR在125.765MHz操作，用甲醇-d作为溶剂，解析化合物Cove-1的结构。化合物Cove-1的1H NMR谱图在0.9、1.3-1.4、1.45、1.58、2.19、2.25、2.58、3.33、6.12、6.26和7.22处具有信号。化合物Cove-1的13C NMR谱图在14.5、23.7、25.7、26.3、29.7、30.3、30.3、30.3、32.7、34.3、35.4、41.1、50.0、128.9、130.4、145.5、147.6、178.2和204.1处具有信号。
图15示出了化合物Cove-1的化学结构。1H NMR(500MHz):δ0.9(3H,H-18),1.3-1.4(10H,H-4,5,6,16,17),1.45(2H,H-15),1.58(4H,H-3,7),2.19(2H,H-14),2.25(2H,H-2),2.58(2H,H-8),3.33(3H,CH3OOC),6.12(1H,H-10),6.26(2H,H-12,13),7.22(1H,H-11)。13CNMR(125MHz):δ14.5(C-18),23.7(C-17),25.7(C-7),26.3(C-3),29.7(C-15),30.3(C-4*),30.3(C-5*),30.3(C-6*),32.7(C-16),34.3(C-14),35.4(C-2),41.1(C-8),50.0(OCH3),128.9(C-10),130.4(C-12),145.5(C-11),147.6(C-13),178.2(C-1)和204.1(C-9)。*可互换。上述结果通过Dept 135,HSQC和1H-1H COSY证实。化合物Cove-1在m/z 55、67、81、95、151、166、276、308表现出离子峰。将光谱数据与文献报道的数据进行比对，将化合物Cove-1鉴定为9-氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)。
图16示出了10、25和50μg/ml的纯化的化合物Cove-1抑制TNF-α诱导的MMP-3mRNA水平。简言之，将成胶质细胞瘤(T98G，脑细胞)细胞用纯化的化合物Cove-1预处理18小时，并随后用重组人TNF-α(10ng/ml)处理3小时。用Taqman基因表达测定法分析MMP-3mRNA水平。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为**p<0.01是统计学上显著的。
图17示出了10、25和50μg/ml的纯化的化合物Cove-1抑制TNF-α诱导的MMP-3蛋白质表达。简言之，将成胶质细胞瘤(T98G，脑细胞)细胞用纯化的化合物Cove-1预处理18小时，并随后用重组人TNF-α(10ng/ml)再处理24小时。用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析MMP-3蛋白质表达。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为*p<0.05、**p<0.01是统计学上显著的。
图18示出了用50μg/ml的不同批次杂色革盖菌(R08PUB、R09PUB、R10PUB和R11PUB)乙醇提取物孵育的T98G细胞的代谢活动没有显著区别。MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二-苯基四氮唑溴盐)测定是在48小时的时间内进行。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。
图19示出了用10、25和50μg/ml纯化的化合物(Cove-1)孵育的T98G细胞的代谢活动没有显著区别。MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二-苯基四氮唑溴盐)测定是在48小时的时间内进行。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。所述数据表明，化合物Cove-1不具有明显的毒性。
图20示出了50μg/ml的杂色革盖菌(R11PUB)的乙醇提取物降低了T98G细胞的侵袭性。用Matrigel Invasion Chamber研究细胞侵袭性。将成胶质细胞瘤(T98G，脑细胞)细胞用R11PUB处理18小时，并允许细胞侵袭穿过基质另外24小时。通过在光学显微镜下计数来确定侵袭细胞的数量。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为**p<0.01是统计学上显著的。
图21示出了25和50μg/ml的杂色革盖菌(R11PUB)的乙醇提取物降低了T98G细胞的侵袭性。用Matrigel Invasion Chamber研究细胞侵袭性。将成胶质细胞瘤(T98G)、肺癌(A549)和乳腺癌(MDA-MB-231)细胞用R11PUB处理18小时，并允许细胞侵袭穿过基质另外24小时。通过在光学显微镜下计数来确定侵袭细胞的数量。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为**p<0.01是统计学上显著的。
图22示出了25μg/ml的9-KODE甲酯(Cove-1)降低了T98G细胞的侵袭性。用Matrigel Invasion Chamber研究细胞侵袭性。将成胶质细胞瘤(T98G，脑细胞)细胞用Cove-1处理18小时，并允许细胞侵袭穿过基质另外24小时。通过在光学显微镜下计数来确定侵袭细胞的数量。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为**p<0.01是统计学上显著的。
具体实施方式
本发明提供了有效且便捷的从杂色革盖菌中分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：
获得杂色革盖菌提取物；及
从所述杂色革盖菌提取物中分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯。
在一个具体实施方案中，所述从杂色革盖菌中分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)的方法包括：
a)提供足够量的杂色革盖菌原料；
b)在约15℃至约30℃的温度下用极性溶剂对杂色革盖菌原材料进行提取以得到杂色革盖菌提取物及残留物，其中将步骤b)进行一次或多于一次；
c)回收所述杂色革盖菌提取物；
d)从所述杂色革盖菌提取物中分离9-KODE甲酯。
在一个实施方案中，以上方法步骤b)中使用的溶剂是极性溶剂。在具体实施方案中，所述溶剂是乙醇-水混合物。在具体实施方案中，使用高效液相色谱法(HPLC)从所述杂色革盖菌提取物中分离9-KODE甲酯。
本发明还提供了有且效便捷的制备杂色革盖菌提取物的方法。在一个优选实施方案中，使用水、乙醇或乙醇-水的混合物作为溶剂在室温下制备所述杂色革盖菌提取物。在一个实施方案中，所述杂色革盖菌提取物可被进一步蒸发以生成固体或半固体组合物。
本发明还提供了用本发明的提取方法生产的杂色革盖菌提取物。还提供了治疗或药物组合物，所述治疗或药物组合物包含治疗有效量的题述杂色革盖菌提取物、从杂色革盖菌中分离的生物活性化学成分(例如9-KODE甲酯)和/或式I化合物，以及任选的可药用载体。本发明还提供了预防、治疗或改善疾病或病症的方法，其中免疫应答的调节是有益的。在一个实施方案中，所述方法包括将有效量的组合物给予需要这种治疗的受试者，所述组合物包含本发明的杂色革盖菌提取物和化合物和组合物。
具体地，本发明的组合物可被用于治疗或改善疾病或病症，其中刺激IFNβ的产生和/或减少TNF-α、IL10和/或MMP-3的产生是有益的。
在优选实施方案中，本发明可用于治疗多形性成胶质细胞瘤和/或鼻咽癌。在另一实施方案中，本发明可用于治疗细菌、病毒和/或微生物感染。在某些实施方案中，本发明可用于治疗感染，所述感染包括但不限于水痘带状疱疹、巨细胞病毒和疱疹病毒-8感染，这些病毒感染是癌症患者或免疫受损患者中常见的病毒感染。
杂色革盖菌提取物及分离的化学成分
本发明的一方面提供了用于制备杂色革盖菌提取物的方法。题述方法还可用于从杂色革盖菌中分离生物活性化学成分。还提供了根据本发明制备的杂色革盖菌提取物和从杂色革盖菌分离的化合物和生物活性化学成分。
另外，本发明提供了从杂色革盖菌中分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：
获得杂色革盖菌提取物；及
从所述杂色革盖菌中分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯。
在一个优选实施方案中，本发明提供了制备杂色革盖菌提取物和/或用于从杂色革盖菌中分离生物活性化学成分(如9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯)的方法，所述方法包括如下步骤或基本上由如下步骤组成或由如下步骤组成：
a)提供足够量的杂色革盖菌原料；
b)在约15℃至约30℃的温度下用溶剂对所述杂色革盖菌原材料进行提取，以得到杂色革盖菌提取物和残留物，其中将步骤b)进行一次或多于一次；
c)回收所述杂色革盖菌提取物；并可选地，
d)从所述杂色革盖菌提取物中分离生物活性化学成分。
在一个实施方案中，上述方法步骤b)中使用的溶剂为极性溶剂。有利地，在约15℃至约30℃的温度下使用极性溶剂可有助于提取一种或多种具有抗癌和/或抗病毒作用的生物活性小分子化学成分。
在一个实施方案中，所述从杂色革盖菌中分离的生物活性化学成分是9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯。在一个实施方案中，所述杂色革盖菌提取物包含9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯。优选地，所述杂色革盖菌原料被干燥并研磨为粉末。优选地，所述杂色革盖菌提取物包含生物活性化学成分，包括多糖-肽(PSP)例如云芝多糖(PSK)。优选地，所述原材料为杂色革盖菌子实体。
在某些实施方案中，适用于杂色革盖菌的制备的溶剂包括但不限于，醇(例如，C1-C8醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；C1-C8烷基多元醇)；C1-C8酮(例如丙酮)或烷基酮；氯仿；乙酸；水；以及无机酸(例如盐酸)。
在一个实施方案中，本发明使用的杂色革盖菌与溶剂的比例(v/v)为1:5至1:20，优选约1:10、1:12或1:15。在优选的实施方案中，题述提取程序使用水、醇(例如乙醇)或醇-水(例如乙醇-水)混合物作为溶剂。所述醇-水(例如乙醇-水)混合物可包含约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的醇(例如乙醇)。
在具体实施方案中，所述溶剂是包含12倍体积的95％乙醇的水-乙醇混合物。优选地，所述提取程序的步骤(b)在室温下进行。步骤(b)也可在稍低于或稍高于室温的温度下进行。在一个实施方案中，步骤(b)在约15℃至约30℃、约18℃至约28℃、约20℃至约28℃或约22℃至约26℃的温度下进行。在具体实施方案中，步骤(b)在约25℃下进行。
在一个实施方案中，在所述提取程序的步骤(b)中，将所述杂色革盖菌原材料浸渍在冷溶剂中，优选在室温下或低于室温下。在一个实施方案中，在所述提取程序的步骤(b)之前和/或之中，所述溶剂以及所述杂色革盖菌原材料都未被煮沸或加热至高于50℃或高于45℃的温度。
在一个实施方案中，将所述杂色革盖菌原材料与溶剂混合至少约15分钟以提取所述生物活性化学成分。优选地，所述提取时间为至少约20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时或5小时。
优选地，使用连续超声进行所述提取步骤(b)。超声是在某些情况中可提高从干燥药材中提取化合物的效率并缩短提取时间的方法。这种增强作用的内在机制是加强质量转移和使所述溶剂更容易进入药材。因此，超声是常规提取技术的迅速、廉价且有效的替代方案，在某些情况中甚至优于超临界流体提取和微波-辅助提取。
在优选实施方案中，在步骤(b)期间，用连续超声将所述杂色革盖菌原材料与所述溶剂混合至少约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时或5小时。但是本发明人已经发现，在某些实例中，超声可能不会提高某些可以容易地从原料药材中浸出(leach out)到溶剂中的化学成分的提取率。在这种情况下，优选地不使用超声或很少使用超声进行所述提取程序。
可通过例如可促进从含有溶剂提取物的液相中分离固相(例如残留物)的技术(例如通过离心)来回收所述杂色革盖菌提取物。可通过例如过滤除去残留物来收集所述提取物。在一个实施方案中，所述杂色革盖菌提取物还可被蒸发以产生固体或半固体组合物。在另一个实施方案中，所述杂色革盖菌提取物可被浓缩和/或纯化。
可通过单次提取或连续提取获得所述杂色革盖菌提取物和/或生物活性化学成分。在一个实施方案中，在回收第一提取物后，可将所得残留物重新溶解在相同溶剂中用于进一步提取。在另一个实施方案中，可通过连续提取获得所述杂色革盖菌提取物和/或所述生物活性化学成分，通过每次用不同溶剂对所述溶剂-提取物或残留物进行提取，以提取所需要的生物活性化学成分。
在一个实施方案中，本发明的提取方法还包括以下步骤或基本上由以下步骤组成或由以下步骤组成：在步骤(a)–(b)后，在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用溶剂对杂色革盖菌残留物进行提取以得到第二杂色革盖菌提取物和第二残留物的步骤，以及可选地，从所述杂色革盖菌提取物中分离生物活性化学成分的步骤。在一个具体实施方案中，将极性溶剂用于在加热条件下萃取杂色革盖菌残留物。
在另一个实施方案中，本发明的提取方法还包括以下步骤或基本上由以下步骤组成或由以下步骤组成，在步骤(a)–(b)后，在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用碱性水溶液(例如NaOH和KOH)对杂色革盖菌残留物进行提取以得到第二杂色革盖菌提取物和第二残留物的步骤，以及可选地，从所述杂色革盖菌提取物中分离生物活性化学成分的步骤。在一个实施方案中，所述碱性水溶液的当量浓度(normality)为0.1N或低于0.1N的任何值，例如0.05N、0.02N、0.01N或0.001N。
在具体实施方案中，本发明的提取方法包括：
a)提供足够量的杂色革盖菌原材料；
b)在约15℃至约30℃的温度下用第一极性溶剂对所述杂色革盖菌原材料进行提取，以得到第一杂色革盖菌提取物和第一残留物；
c)在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用第二极性溶剂对所述第一残留物进行提取，以得到第二杂色革盖菌提取物和第二残留物；和
d)在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用碱性溶液对所述第二残留物进行提取，以得到第三杂色革盖菌提取物和第三残留物；
e)回收所述杂色革盖菌提取物；及可选地
f)从所述杂色革盖菌提取物中分离生物活性化学成分。
在具体实施方案中，所述第一和第二溶剂是极性溶剂。
在另一个具体实施方案中，本发明的提取方法包括：
a)提供足够量的杂色革盖菌原材料；
b)在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用第一极性溶剂对所述杂色革盖菌原材料进行提取，以得到第一杂色革盖菌提取物和第一残留物；和
c)在加热条件下(例如在约60℃或更高的温度下)用碱性溶液(例如NaOH或KOH)对所述第一残留物进行提取，以得到第二杂色革盖菌提取物和第二残留物；
d)对所述杂色革盖菌提取物进行提取；及可选地
e)从所述杂色革盖菌提取物中分离生物活性化学成分。
在一个实施方案中，本发明的提取方法包括以下步骤或基本上由以下步骤组成或由以下步骤组成：
a)提供足够量的杂色革盖菌原材料；
b)用极性溶剂对所述杂色革盖菌原材料进行提取，以得到杂色革盖菌提取物和残留物，并且回收所述杂色革盖菌提取物，其中将步骤b)进行一次或多于一次；
c)用碱性水溶液对步骤b)中获得的残留物进行提取，以得到水性提取物，并且回收所述水性提取物，其中将步骤c)进行一次或多于一次；
d)合并从步骤b)和c)获得的一种或多种提取物以得到杂色革盖菌提取物；及可选地
e)从所述杂色革盖菌提取物中分离生物活性化学成分。
在某些实施方案中，所述用于在加热条件下对杂色革盖菌进行提取的极性溶剂包括C1-C8醇(例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)。在具体实施方案中，所述用于在加热条件下对杂色革盖菌进行提取的极性溶剂为乙醇或乙醇-水混合物。在具体实施方案中，用于在加热条件下对杂色革盖菌进行提取的极性溶剂不是水。
根据本发明，可在以下温度下进行加热：高于60℃、高于65℃、高于70℃、高于75℃、高于80℃、高于85℃、高于90℃、高于95℃或高于100℃。
图1A-C示出了本发明的提取方法的优选实施方案。
有利地，使用碱性溶液作为溶剂有助于提取生物活性的大分子化学成分，包括多糖-肽(PSP)例如云芝多糖(PSK)。
在另一个实施方案中，可对所述杂色革盖菌粗提取物进行分级分离或分离以得到一种或多种含有需要的生物活性化学成分的级分。在一个实施方案中，使用水-乙腈作为流动相对所述杂色革盖菌粗提取物进行HPLC。在某些实施方案中，所述水-乙腈在水:乙腈为1:100至100:1的任意范围内存在，包括但不限于，水:乙腈为5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和95:5。在具体实施方案中，使用表1示出的洗脱参数对所述杂色革盖菌粗提取物进行HPLC，从而得到图4中示出的5个级分。
在另一个实施方案中，题述方法包括通过组合使用HPLC和/或气相色谱-质谱(GC-MS)建立所述杂色革盖菌提取物的化学谱图。在一个实施方案中，所述方法包括：对所述提取物进行HPLC；洗脱所述提取物；在HPLC后建立所述提取物的化学谱图。在另一个实施方案中，所述方法包括:对所述提取物进行气相色谱-质谱并建立所述提取物的色谱/光谱谱图。
本发明还提供了通过本发明提取方法产生的杂色革盖菌提取物。在具体实施方案中，所述杂色革盖菌提取物具有如图2A、2B、2C中所示的高效液相色谱(HPLC)谱图，或如图4中示出的级分1-5的任意级分；和/或如图3A或3B中所示的气相色谱-质谱(GC-MS)谱图。
本文使用的术语“基本上由……组成”，将本发明的范围限制为所具体说明的步骤以及不会实质上影响本发明的基本特征和新特性的那些步骤，即，用于制备杂色革盖菌提取物和/或从杂色革盖菌中分离生物活性化学成分的方法。例如，通过使用“基本上由……组成”，所述用于制备杂色革盖菌提取物的方法不含任何未具体说明的提取或接触杂色革盖菌的步骤，例如，用未具体说明的溶剂提取或接触杂色革盖菌的额外步骤，或在不同于所具体说明的条件的条件(例如温度)下提取杂色革盖菌的额外步骤。并且，通过使用术语“基本上由……组成”，所述方法可包括不会实质上影响从杂色革盖菌中提取生物活性化学成分的步骤，所述步骤包括收集或回收所述杂色革盖菌提取物；浓缩所述杂色革盖菌提取物；将多个杂色革盖菌提取物合并为单一组合物；将所述杂色革盖菌提取物冻干或干燥成为固体或半固体组合物；将所述杂色革盖菌提取物配制为药物组合物，例如溶液剂、悬液剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、煎剂和酊剂；将所述杂色革盖菌提取物与可药用的载体、赋形剂、调味剂、缓冲剂和/或乳化剂混合；以及包装所述杂色革盖菌提取物。
化合物
在另一方面，本发明涉及9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)及相关化合物。在一个实施方案中，依据本发明的有用的化合物具有如式I所示的化学结构：
其中
为双键或单键；
R1为H、OH、直链或支链C1-C4烷基基团(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基基团)，或ORa，其中Ra为直链或支链C1-C4烷基基团；且
R2为H、O或直链或支链C1-C4烷基基团；且
R3为H、OH、O、卤素、直链或支链C1-C4烷基基团(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基基团)，或ORa，其中Ra为直链或支链C1-C4烷基基团。
在一个实施方案中，R2是O，且R1是OH、OCH3或OC2H5。在另一实施方案中，R3是O或OH。
在一个实施方案中，式I的烷基基团可以是取代的或未取代的。
本文使用的术语“烷基”，指含有碳和氢的直链或支链的饱和一价基团。烷基基团的代表性实例包括但不限于，甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
术语“卤素”意指氟、氯、溴和碘。
术语“羟基”意指基团-OH。
本文使用的术语“被取代的”，指化合物或化学部分中至少一个氢原子被另一个化学部分代替。取代基的非限制性实例是本文公开的示例化合物和实施方案中的那些取代基，及卤素、烷基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、氨基、卤代烷基(例如三氟甲基)和-COOH。除非另有说明，本文公开的所有化学基团都可被取代。例如，本文描述的“被取代的”烷基、烯基或炔基部分是由另一化学部分如烃基部分、卤素、烷氧基和-COOH取代的部分。取代的烷基基团包括但不限于，卤代烷基、羟基烷基、羧基烷基和氨基烷基。
在一个实施方案中，依据本发明的有用的式I化合物为9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)，其具有以下化学结构：
在另一实施方案中，依据本发明的有用的式I化合物为9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸(9-KODE)。
在某些实施方案中，本发明涉及分离的或基本纯的由式I代表的化合物的用途。本文所用的术语“基本纯的”，指纯度大于99％。
有利地，式I化合物抑制TNF-α诱导的基质金属蛋白酶3(MMP3)的表达，并可用于抑制癌细胞或肿瘤细胞的生长、侵袭和/或转移。
本发明的化合物可从植物中分离或可通过本领域已知的方法合成。参见Kuklev et al.(1997)和Andreou et al.(2009)。
用于本文时，“分离的”指已经从其可天然存在的任何环境中移出的化合物。例如，分离的化合物不是指当存在于植物中时的化合物，其中所述化合物是从中所述植物中分离的。在优选实施方案中，本发明化合物为至少75％纯度，优选至少90％纯度，更优选高于95％纯度，且最优选多于99％纯度(基本纯的)。
本发明还包括式(I)化合物的立体异构体。术语“立体异构体”包括所有对映异构/立体异构纯的和对映异构/立体异构富集的本文公开的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及式I化合物的对映异构形式。本发明化合物的对映异构形式基本上彼此分离(即，对映体过量)。换言之，所述化合物的“R”形式基本不含该化合物的“S”形式并因此为对“S”形式的对映体过量。反过来，所述化合物的“S”形式基本不含该化合物的“R”形式并因此为对“R”形式的对映体过量。在本发明的一个实施方案中，所述对映体化合物是至少80％对映体过量。在优选实施方案中，所述化合物是至少90％对映体过量。在更优选实施方案中，所述化合物是至少95％对映体过量。在更优选实施方案中，所述化合物是至少97.5％对映体过量。在最优选实施方案中，所述化合物是至少约99％对映体过量。
调节免疫应答和治疗癌症的用途
本发明的另一方面提供了所述杂色革盖菌提取物、从杂色革盖菌中分离的生物活性成分(substituent)(例如，9-KODE甲酯)和/或式I化合物及其盐，及包含一种或多种上述成分的治疗组合物用于调节免疫应答和用于治疗癌症的治疗用途。
有利地，本发明的杂色革盖菌提取物和所述式I化合物刺激保护性免疫应答同时抑制不需要的可引起疾病的免疫应答。例如，所述杂色革盖菌提取物和式I化合物可恢复或提高由例如施用抗癌剂引起的降低的免疫系统功能。
在另一个实施方案中，所述杂色革盖菌提取物和式I化合物可刺激抵御病毒、细菌和/或微生物感染的保护性免疫应答。
另外，本发明的杂色革盖菌提取物和式I化合物可抑制不需要的免疫应答，例如TNF-α的产生及其对金属蛋白酶产生的诱导，金属蛋白酶可被某些肿瘤细胞用于促进转移。
具体地，本发明人现发现，本发明的杂色革盖菌提取物和所述式I化合物可减少TNF-α的产生，TNF-α是在针对病原体感染和肿瘤发生的急性期免疫应答中起重要作用的促炎介质。TNF-α还诱导可降解细胞外基质蛋白的基质金属蛋白酶(MMP)和MMP家族成员的产生。然而，某些肿瘤细胞(例如成胶质细胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌)已经对TNF-α的细胞毒性作用形成抗性。因此，这些肿瘤细胞利用TNF-α对MMP的诱导而侵入邻近组织和位于身体远端的器官。
有利地，本发明的杂色革盖菌提取物和式I化合物抑制肿瘤细胞中TNF-α的产生，并因此，对预防或降低对TNF-α有抗性的恶性肿瘤细胞(例如成胶质细胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌细胞和结肠癌)的转移扩散尤其有用。
另外，本发明人现发现杂色革盖菌减少IL-10的产生，IL-10是下调促炎性细胞因子表达的抗炎性细胞因子。本发明人还发现，杂色革盖菌提高IFN-β的产生，IFN-β刺激针对病原侵袭的急性期免疫应答。
在一个实施方案中，本发明提供预防、治疗或改善疾病或病症的方法，其中调节免疫应答会是有益的。所述方法包括，将有效量的组合物给予需要这类治疗的受试者，所述组合物包含本发明的杂色革盖菌提取物、从杂色革盖菌中分离的生物活性成分(例如9-KODE甲酯)和/或式I化合物。
具体地，本发明的组合物可用于治疗或改善疾病或病症，其中刺激IFN-β产生并且/或者降低TNF-α、MMP3和/或IL-10的产生或水平会是有益的。
本文使用的术语“受试者”，描述被提供使用依据本发明的组合物的治疗的生物体，包括哺乳动物如灵长类。可以从所公开的治疗方法获益的哺乳动物物种包括但不限于，猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；家养动物例如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡；及其他动物例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
在一个实施方案中，所述受试者被诊断为患有可依据本发明治疗的病症。在某些实施方案中，所述需要治疗的受试者被诊断为患有癌症或肿瘤，包括但不限于成胶质细胞瘤、脑瘤、鼻咽癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、食道癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌和胃癌(gastric cancer)。在一个实施方案中，所述需要治疗的受试者患有转移性癌症。在一个实施方案中，所述需要治疗的受试者患有病毒、细菌和/或微生物感染。
在一个实施方案中，本发明包括诊断受试者是否患有可依据本发明治疗的病症的步骤。
在某些实施方案中，本发明的化合物和组合物可被用于治疗良性和/或恶性肿瘤。
本文使用的术语“治疗(treatment)”或其任何语法变化(例如治疗(treat)、治疗(treating)和治疗(treatment)等)，包括但不限于改善或减轻疾病或病症的症状，降低、压制、抑制、减轻或影响病症的进展、严重性和/或范围。
本文使用的术语“预防(prevention)”或其任何语法变化(例如预防(prevent)、预防(preventing)和预防(prevention)等)，包括但不限于延迟症状的发作，防止疾病的复发，延长症状事件之间的潜伏期，或其组合。本文使用的预防不需要症状完全消失。
本文使用的术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或病症的量或者能够产生预期治疗效果的量。在某些实施方案中，所述有效量能够使TNF-α、MMP3和/或IL-10的产生或水平减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些实施方案中，所述有效量能够使IFNβ的水平或产生增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在一个实施方案中，本发明的化合物和组合物可被用于治疗或改善癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤包括但不限于，成胶质细胞瘤、脑瘤、鼻咽癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、食道癌、膀胱癌和胃癌(gastric cancer)。在优选实施方案中，本发明可被用于预防或减少肿瘤细胞(尤其是那些对TNF-α的细胞毒性作用形成抗性的肿瘤细胞)的转移扩散。在具体实施方案中，本发明可用于治疗多形性成胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌和/或鼻咽癌。在另一具体实施方案中，本发明可用于预防或减少多形性成胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌和/或鼻咽癌的转移扩散。
在一个实施方案中，本发明可用于增强免疫系统和/或恢复或改善免疫系统功能。在具体实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或改善化疗和/或放疗的免疫抑制作用。在一个实施方案中，在给予化疗剂之前、期间和/或之后给予本发明的组合物，以抵消所述化疗剂对免疫系统的抑制作用。
另外，本发明的组合物可被用于预防、治疗或改善细菌、病毒、真菌、原生动物和/或其他微生物或病原感染。有利地，本发明的组合物调节和/或增强响应于病原感染的免疫系统功能。
在一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或改善病毒感染，例如，以下病毒的感染：人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹(带状疱疹)、疱疹病毒-8、巨细胞病毒、I型人T淋巴细胞病毒(HTLV-1)、牛白血病病毒(BLV)、艾普斯登－巴尔病毒和冠状病毒。
在某些实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或改善真菌感染，所述真菌感染，包括但不限于，假丝酵母和曲霉种的感染；细菌感染，包括但不限于，以下细菌的感染：分枝杆菌(Mycobacteria)例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、大肠杆菌(Escherichii coli)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)和亚马逊利什曼原虫(L.amazonensis)；和原生动物感染，包括但不限于，肺囊虫属(Pneumocystis)和弓形体属(Toxoplasma)种的感染。
在一个实施方案中，本发明的组合物可被用于治疗肝功能障碍、呼吸道感染和支气管炎。
治疗组合物和制剂
本发明提供了治疗或药物组合物，其包含治疗有效量的本发明杂色革盖菌提取物、生物活性化学成分和/或化合物，及任选的可药用载体。本发明还提供了治疗或药物组合物，其包括依据本发明从杂色革盖菌中分离的生物活性化合物或化学成分。本发明还包括含有本发明杂色革盖菌提取物的膳食补充剂以及保健食物或饮料制剂。
所述术语“载体”是指可用于给予所述化合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶剂(vehicle)。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油(例如矿物油)、植物油(例如花生油、豆油和芝麻油)、动物油或合成来源的油。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可被用作液体载体，尤其用于注射用溶液。
适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述治疗组合物还可含有少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液剂、悬液剂、乳剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、缓释制剂等形式。可用传统的粘合剂和载体(例如甘油三酯)来配制所述组合物。适合的药物载体的实例记载于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceutical Sciences”中。这种组合物含有治疗有效量的所述治疗组合物，还含有适合量的载体以提供用于适合的给予患者的形式。所述制剂应适合于所述给药方式。
本发明的治疗或药物组合物可被配制为中性或盐形式。可药用盐包括但不限于，用盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁等形成的盐。
本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包括一种或多种容器，所述容器填充有一种或多种本发明药物组合物的成分，例如化合物、载体。
本发明的组合物还可以按照中药实践进行配制。可有效治疗具体疾病、病症或障碍的所述制剂的组成和剂量将通过标准临床技术取决于所述疾病、病症或障碍的性质。
可容易地将处方量的中药制成任何适于给予人或动物的药物形式。适合的形式包括例如酊剂、煎剂和干浸膏。这些形式可通过口服摄入、通过静脉注射或粘膜来施用。所述活性成分还可被配制为胶囊剂、粉剂、丸剂(pallet)、锭剂、栓剂、口服溶剂、巴氏消毒的胃肠道悬液型注射剂、小量注射剂或大量注射剂、冻干粉注射剂、巴氏消毒的粉剂型注射剂等。所有上述方法是本领域技术人员已知的，记载在书籍中并且是中医执业医生通常使用的。
酊剂是通过将原料药材(例如草药和真菌)悬浮于醇溶液(例如果酒(wine)或烈性酒(liquor))中而制备的。悬浮一段时间后，可将所述液体(醇溶液)给药，例如一天2次或3次，每次1茶匙。
提取物是药用原料的必需组分的浓缩制剂。所述必需组分一般是通过将原料药材(例如草药和真菌)悬浮在适当的溶剂中而从所述原料药材提取的，所述溶剂一般为水、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其他有机溶剂。可通过浸渍、渗滤、再渗滤、逆流提取、涡流提取的方式或通过二氧化碳超临界(温度/压力)萃取进一步帮助所述提取过程。过滤除去草药残渣后，可将所述提取溶液进一步蒸发并由此浓缩得到软浸膏(extractum spissum)和/或通过喷雾干燥、真空烘箱干燥、流化床干燥或冷冻干燥最终得到干浸膏(extractum siccum)。所述软浸膏或干浸膏可进一步被溶解在合适的液体中至所需给药浓度，或者加工成例如丸剂、胶囊剂、注射剂等形式。
给药途径
本发明的化合物和组合物可通过标准途径给予正在进行治疗的受试者，所述途径包括口服、吸入或肠胃外给药，所述肠胃外给药包括静脉、皮下、局部、经皮、真皮内、经粘膜、腹膜内、肌内、囊内、眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外和胸骨内注射、输注和电穿孔，以及作为待插入(暂时或永久)到受试者中的任何医学装置或物体的组分共同给药。在优选实施方案中，本发明的化合物和组合物是通过口服给药给予受试者。
可有效治疗具体疾病、病症或障碍的本发明治疗组合物或药物组合物的量，将取决于给药途径以及所述疾病、病症或障碍的严重性，并应根据执业医生的判断和每个患者的情况来决定。通常，所述剂量范围为约0.001mg/kg至约3g/kg。
例如，适合的单位剂量可以是约0.01至约500mg、约0.01至约400mg、约0.01至约300mg、约0.01至约200mg、约0.01至约100mg、约0.01至约50mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01至约3mg、约0.01至约1mg或约0.01至约0.5mg。这样的单位剂量可被给予多于一次/天，例如2次或3次/天。
可与所述载体物质结合产生单一剂型的活性成分的量会有所变化，这取决于所述病症的类型和要治疗的受试者。通常，治疗组合物含有约5％至约95％的活性成分(w/w)。更具体地，治疗组合物含有约20％(w/w)至约80％或约30％至约70％的活性成分(w/w)。
一旦患者的病症出现改善，如果必要，可给予维持剂量。随后，可根据症状，降低给药剂量和/或给药频率至所述改善的状态得以维持的水平。当所述症状已减轻至所需水平时，治疗应停止。但是一旦疾病症状出现任何复发，患者可能需要长期的间歇性治疗。
另外，可任选地使用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。在所述制剂中使用的精确剂量还将取决于给药途径以及所述疾病、病症或障碍的严重性，并应根据执业医生的判断和每个患者的情况来决定。可以从由体外或动物模型试验系统得到的剂量-反应曲线来外推出有效剂量。
材料和方法
用于生物测定的细胞培养物
在检查杂色革盖菌提取物对免疫系统的作用的生物测定法中使用原代人血巨噬细胞和人白血病单核细胞淋巴瘤细胞(U937)。通过Ficoll-Paque离心从健康供体(香港红十字会输血服务中心)的血液样品中分离得到血液单核细胞，并通过以前记载的贴壁方法(Yang et al.(2009)；Cheng et al.(2009))对其进行纯化。
简言之，将血液样品以3000rpm离心15分钟，分离为血浆和细胞层。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以1:1的比例稀释所述细胞层。将稀释的细胞慢慢铺在Ficoll(GE Healthcare)上并以2300rpm离心20分钟将单核细胞与红细胞分离。移出所述单核细胞层并用RPMI 1640培养基(Gibco)洗涤直到上清澄清。
将细胞沉淀重悬于补充了5％自体血浆、1％青霉素和链霉素(Gibco)的RPMI 1640中。将悬液铺到有盖培养皿中并在37℃下孵育1小时以使单核细胞贴壁。然后用RPMI 1640洗涤并孵育过夜，用含有5mM EDTA的冷RPMI 1640分离所述贴壁单核细胞。
将所述单核细胞以0.5×106个细胞/孔的密度接种到24孔组织培养板中并用补充有5％自体血浆、1％青霉素和链霉素的RPMI 1640孵育。如本发明人之前的报告(Yang et al.(2009)；Lee et al.(2009))中所述，体外培养14天后收获分化的巨噬细胞。
将从美国典型培养物保藏中心获得的小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)和人成神经细胞(SKNSH)维持在培养基中，分别用于一氧化氮测定和单纯疱疹病毒感染测定。
用于mRNA分析的实时逆转录-聚合酶链式反应
根据制造商的说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen)进行总RNA提取。用DNA酶处理总RNA，然后用寡聚核苷酸(dT)引物通过Superscript II逆转录酶(Invitrogen)进行逆转录。如本发明人之前的报告(Yang et al.(2009)；Cheng et al.(2009)；Law et al.(2009)；Leeet al.(2009))中所述，使用TaqMan基因表达测定法(AppliedBiosystems)测定细胞因子的mRNA水平。
用于细胞因子分析的酶联免疫吸附测定
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)使用可商购的测定试剂盒(R&DSystems)测量细胞培养上清液中细胞因子的蛋白水平(Yang et al.(2009)；Cheng et al.(2009)；Law et al.(2009)；Lee et al.(2009))。每个样品测定两次。
杂色革盖菌的乙醇(EtOH)提取物的制备
经鉴定的草药杂色革盖菌的样本获自PuraPharm International(香港，中国)。将四批杂色革盖菌(R08PUB、R09PUB、R10PUB和R11PUB)分别浸渍于12-倍体积的95％乙醇中并随后连续超声1小时或在室温下浸渍24小时进行提取。将所述提取过程重复两次。将提取物合并并且在真空下蒸发至干燥。
来自R10PUB的化合物Cove-1的分离和鉴定
利用Sep-Pak C18Cartridge(Waters，Ireland)分离R10PUB。用以下溶剂系统洗脱柱子：ACN/H2O(5:95)、ACN/H2O(10:90)、ACN/H2O(15:85)、ACN/H2O(30:70)、ACN/H2O(50:50)和ACN(100％)。采用生物活性追踪的分级(bioassay-guided fractionation)方案，将用100％ACN洗脱的活性级分(R10PUB-S6)进一步用Sep-PakC18Cartridge分离。用以下溶剂系统洗脱柱子：ACN/H2O(50:50)、ACN/H2O(60:40)、ACN/H2O(70:30)、ACN/H2O(80:20)、ACN/H2O(90:10)和ACN(100％)。将用80％ACN洗脱的所得的生物活性级分(R10PUB-S6-4)用装有反相5μm C18Eclipse(4.6×250mm)柱的HPLC进行纯化。使用从20％ACN至90％ACN的梯度洗脱液以1.0ml/min的流速将化合物洗脱且全部测定在室温下进行。利用设置在210、254和280nm的Agilent 1200系列的快速扫描光电二极管阵列检测器进行峰检测。通过重复使用HPLC的纯化过程，得到纯度高于95％的纯化合物(化合物Cove-1)(3.3mg)。
分子结构的结构解析
1D[1H(500MHz)、13C(125MHz)和Dept 135°]和2D(1H-1HCOSY和HSQC)是在Bruker 500MHz DRX NMR光谱仪上获得。化学位移参照内标物(CH3)4Si(0ppm)的甲醇-d溶液。用装有HP-5MS柱(30m×250μm×0.25μm)的Agilent GC-质谱仪(GC：Agilent，7890A，MS：Agilent，5975C)进行EI-MS。注入1μl样品。使用流速为1ml/min的氦气作为载气。初始的柱温箱温度维持在70℃并持续1分钟，随后以每分钟10℃的速率增加至280℃，并维持3分钟。界面温度为250℃，离子源温度为230℃，以200eV进行电子轰击电离(EI)。质谱在50-350原子量单位(amu)的范围内分析，运行时间25min。使用G1701EA化学工作站(Agilent，Santa Clara，CA)进行MS数据分析。
用于mRNA分析的实时逆转录-聚合酶链式反应
将成胶质细胞瘤(T98G，脑细胞)细胞用不同的批次杂色革盖菌的乙醇提取物或经纯化的化合物预处理18小时，然后用重组人TNF-α(10ng/ml)再处理3小时。根据制造商的说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen)进行总RNA提取。使用寡聚核苷酸(dT)引物通过Superscript II逆转录酶(Invitrogen)对总RNA进行逆转录。使用TaqMan基因表达测定法(Applied Biosystems)分析MMP-3mRNA水平。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为*p<0.05或**p<0.01是统计学上显著的。
用于MMP-3分析的酶联免疫吸附测定
将T98G细胞用不同批次的杂色革盖菌的乙醇提取物预处理18小时，然后用重组人TNF-α(10ng/ml)再处理24小时。使用可商购测定试剂盒(R&D Systems)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析细胞培养物上清液中的MMP-3的蛋白质水平。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为*p<0.05或**p<0.01是统计学上显著的。
MTT测定
将T98G细胞与不同批次的杂色革盖菌的乙醇提取物或经纯化的化合物孵育48小时。处理后，向培养基中加入MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二-苯基溴化四唑鎓)(Sigma)，其终浓度为1mg/ml，然后在37℃下孵育2小时。随后将所形成的MTT甲臜溶于200μl的异丙醇中并使用96-孔酶标仪在570nm处测定上清液的吸光度。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。
肿瘤细胞侵袭测定
使用BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber(BDBiosciences)研究细胞侵袭性。将悬浮于含1％FBS、1％青霉素-链霉素和1％丙酮酸钠的MEM中的T98G细胞过夜接种于每室中凝胶的上表面。将基于碳酸氢盐的培养基加入至所述板的下孔中。孵育后，将所述细胞用杂色革盖菌的乙醇提取物/Cove-1处理18小时。随后将所述室转移至新板中，每孔中含有补充了10％FBS的MEM。在37℃下允许细胞侵袭穿过基质，持续24小时。侵袭测定后，将所述室的下表面上的侵袭细胞用100％甲醇固定2分钟，并用结晶紫染色。通过在光学显微镜下计数来定量侵袭细胞的数量。所有数据绘制成至少3个独立实验的平均值±SD。认为**P<0.01是统计学上显著的。
实施例
以下是阐述用于实施本发明的实施方案的实施例。这些实施例不应被理解为限制性的。除非另有说明，所有溶剂混合物的比例是按体积计算。
实施例1-杂色革盖菌提取物的制备
该实施例举例说明了用于制备杂色革盖菌提取物的优选提取方案。
图1举例说明了所述提取方案的一个实施方案。简言之，将杂色革盖菌的原材料浸渍于12-倍体积的EtOH中，用连续超声在室温下提取1小时，离心以获得乙醇提取物和残留物。将所述残留物浸渍于10-倍体积EtOH中并如图1A所示将该提取程序重复两次。将提取物收集、合并，并在真空下蒸发至干燥，以形成包含杂色革盖菌乙醇提取物的颗粒。
在一个实施方案中，将杂色革盖菌的原材料浸渍于乙醇中18小时，离心以获得所述乙醇提取物和残留物。
在一个实施方案中，使用milli-Q水作为制备杂色革盖菌水提取物的溶剂。简言之，将杂色革盖菌的原材料浸渍于15-倍体积的milli-Q水中，在室温下连续超声提取30分钟，离心以获得水提取物和残留物。将所述残留物重新溶于10-倍体积的水中并将该提取程序重复两次。将所述水提取物收集、合并，并在真空下蒸发至干燥，以形成包含杂色革盖菌乙醇提取物的颗粒。
为了有助于生物活性大分子(包括多糖肽(PSP)如PSK)和其他生物活性小分子的提取，将杂色革盖菌原材料或杂色革盖菌残留物进一步用碱性溶液(例如NaOH、KOH)提取。
图1B示出了所述提取方案的另一个实施方案。简言之，将杂色革盖菌原材料浸渍于12倍体积的乙醇中，在室温下连续超声1小时。离心后，得到第一提取物和第一残留物。将该程序重复两次。在室温下将第一残留物浸渍于10倍体积的50％乙醇中2小时。然后再将乙醇浸渍的残留物煮沸2小时。通过将过滤不溶物质与上清液分离，以得到第二残留物和第二提取物。将第二残留物加入至10×0.04％NaOH中并煮沸6小时。通过过滤将不溶物质与上清液分离，以得到第三残留物和第三提取物。将所述提取物收集、合并并冻干。
图1C示出了所述提取方案的另一个实施方案。简言之，在室温下将杂色革盖菌原材料浸渍于10倍的50％乙醇中2小时。再将乙醇浸渍的残留物煮沸2小时。通过过滤将上清液和不溶物分离，得到第一残留物和第一提取物。将第一残留物加入至10×0.04％NaOH中并煮沸6小时。通过过滤将不溶物质与上清液分离，得到第二残留物和第二提取物。将所述提取物收集、合并并冻干。
实施例2-杂色革盖菌提取物的高效液相色谱法分析
本实施例通过高效液相色谱法(HPLC)分析所述杂色革盖菌提取物的化学指纹。使用图1A、1B示出的提取方案，或通过将杂色革盖菌原材料浸渍于乙醇中18小时以获得所述杂色革盖菌提取物。
简言之，用装有PDA检测器(G1315C)和自动进样器(G1367C)的Agilent 1200系列HPLC系统(二元泵SL，G1312B)对100ug/uL的所述EtOH提取物进行高效液相色谱(HPLC)分析。色谱柱(4.6×250mm)用ODS-键合的硅胶装填(Lichrospher 100RP C18，EC 5um)，并且在分离过程中将柱温保持在室温。
将5微升的所述杂色革盖菌提取物注入到HPLC系统中。使用水和乙腈的混合物作为流动相以1.0ml/min的流速进行HPLC。所用的梯度洗脱方法如表1所示。利用设置在210、254和280nm的Agilent1200系列快速扫描光电二极管阵列检测器完成峰检测。图2A-C示出了HPLC后杂色革盖菌乙醇提取物的化学图谱。
表1：用于对使用图1A和1B的提取方案获得的杂色革盖菌提取物进行指纹分析的HPLC梯度洗脱图谱
实施例3-杂色革盖菌提取物的气相色谱-质谱分析
该实施例通过气相色谱-质谱(GC-MS)进一步分析了所述杂色革盖菌提取物的化学指纹。使用图1A中示出的提取方案或通过将杂色革盖菌原材料浸渍于乙醇中18小时，以获得所述杂色革盖菌提取物。
在进行GC-MS分析之前，对所述杂色革盖菌提取物进行硅烷化。简言之，将100ul的溶于乙腈中的所述提取物(30ug/μL)转移到1ml反应瓶(Alltech)中，然后加入50ul吡啶和50ul衍生化试剂BSTFA[N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺]，所述BSTFA与多种极性化合物反应，从而用-Si(CH3)3基团替换所述极性化合物的活泼(labile)氢原子。在70℃下孵育2小时后，所述混合物准备好进行GC-MS分析。
通过GC-MS使用(GC:Agilent,7890A；MS:Agilent,5975C)和HP-5MS柱(30m x 250um x 0.25um)分析所述混合物。使用分流比为1:50的氦气作为载气，将1ul的氦气以1ml/min的流速注入柱中。初始的柱温箱温度为70℃，该温度维持1分钟，以每分钟10℃的速度增加至180℃，在180℃下维持2分钟，以每分钟10℃的速度增加至280℃，在280℃下维持3分钟。注射器温度为275℃；界面温度为250℃，离子源温度为230℃，以200eV进行电子轰击电离(EI)。在50-700原子质量单位(amu)范围内分析质谱，运行时间为22分钟，使用Agilent G1701EA化学工作站处理数据。图3示出了进行GC-MS分析后所述杂色革盖菌乙醇提取物的色谱谱图。
实施例4-杂色革盖菌提取物的分级分离
使用装有1525二元HPLC泵、2998光电二极管阵列检测器和Waters级分收集器III的Waters制备型液相色谱系统，将使用图1A所示的提取方案获得的杂色革盖菌乙醇提取物(MPUB-EtOH)进一步分离为5个级分(图4)。使用反相柱(Lichrospher 100RP C18,EC5um)进行分级分离，检测波长设定为210、254和280nm。由两种溶剂(A)水和(B)乙腈组成流速为1ml/min的梯度程序如下：0–16分钟，10-90％B；16-18分钟，90％B；18-22分钟，10％B。
实施例5-杂色革盖菌提取物对细胞因子产生的作用
为研究杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)对IFNβ和IL-10产生的作用，用50ug/ml的MPUB-EtOH预处理原代人血巨噬细胞18小时。然后将所述细胞用聚肌苷-聚胞苷酸(poly I:C)(50ug/ml)处理3小时。通过TaqMan基因表达测定法分析IFNβmRNA和IL-10mRNA水平。如图5A-B所示，所述杂色革盖菌提取物增加了IFNβ产生并抑制了IL-10产生。
为研究杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)对LPS诱导的TNFα产生的作用，用不同浓度(1、10和50ug/ml)的MPUB-EtOH预处理原代人血巨噬细胞18小时。然后将所述细胞用脂多糖(LPS)(1ng/ml)处理3和24小时。分别通过TaqMan基因表达测定法和酶联免疫吸附测定(ELISA)分析TNFαmRNA水平和蛋白质水平。如图6A-B所示，杂色革盖菌提取物以剂量依赖的方式减少TNFα产生。
为研究杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)对LPS诱导的亚硝酸盐(nitrite)产生的作用，用不同浓度(20、50和100ug/ml)的MPUB-EtOH预处理小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)24小时。然后将所述细胞用LPS(100ng/ml)处理18小时，通过Griess试剂测量亚硝酸盐浓度(uM)。如图7所示，杂色革盖菌提取物以剂量依赖的方式抑制亚硝酸盐产生。
实施例6-杂色革盖菌提取物的抗病毒作用的测定
为研究杂色革盖菌提取物的抗病毒作用，用10ug/ml的MPUB-EtOH预处理人神经元细胞(human neuronal cell，SKNSH)18小时。保留培养物上清用于连续孵育。然后用单纯疱疹病毒(HSV)以0.01的m.o.i.(感染复数)感染所述细胞1小时。病毒感染后，用PBS洗涤所述细胞两次，并用保留的培养物上清再孵育18小时。收集培养物上清用于测定病毒滴度，所述病毒滴度是通过在T98G(人成胶质细胞瘤细胞系)细胞感染期间半数组织培养物感染量(TCID50)的滴定来测量的。
如实施例4所述，将MPUB-EtOH进一步分级分离为5个级分。如上所述将SKNSH细胞用MPUB-EtOH-1、-2和-3预处理，并用HSV病毒感染。测量培养物上清的病毒滴度(TCID50)。MPUB-EtOH-4和-5对所述细胞具有细胞毒性(数据未示出)，因此未对其做进一步的抗病毒作用的研究。图8A和8C中示出的所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为p值<0.001(**)是统计学上显著的。
如图8中所示，所述杂色革盖菌提取物显著降低培养物上清中的病毒滴度，其中级分3表现出最强抗病毒作用(图8B和8C)。
实施例7-杂色革盖菌提取物对MMP-3表达的作用
该实施例表明杂色革盖菌提取物降低MMP-3的表达(图9)。简言之，将成胶质细胞瘤(T98G，脑细胞)细胞用不同浓度(1、10和50ug/ml)的MPUB-EtOH预处理18小时，然后用重组人TNFα(10ng/ml)处理3小时。通过TaqMan基因表达测定法分析MMP-3mRNA水平。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为p值<0.05(*)是统计学上显著的。
实施例8-杂色革盖菌提取物的体内抗病毒作用的测定
为了研究杂色革盖菌提取物的体内抗病毒作用，将二甲基亚砜(DMSO)(MPUB-EtOH的溶剂)或MPUB-EtOH(250mg/kg)以腹膜内注射(ip)方式给予3周龄雄性BALB/c小鼠(每组15只小鼠)，每天一次，间隔24小时，持续7天。
简言之，在第0天，腹膜内接种1x105TCID50/ml的HSV以感染所述小鼠。感染后1小时开始，通过腹膜内给予DMSO、MPUB-EtOH或阿昔洛韦(acyclovir)(10mg/kg)，每天一次，间隔24小时，持续5天。每天检查所述小鼠，通过基于如下评分系统的后肢瘫痪测量疾病严重程度：0，未瘫痪；1，后肢运动明显困难；2，一条后肢不完全瘫痪；3，一条后肢完全瘫痪；4，两条后肢不完全瘫痪；5，两条后肢完全瘫痪。
如图10中所示，与DMSO-处理的对照相比，杂色革盖菌提取物(MPUB-EtOH)显著地降低小鼠中HSV感染的严重程度。杂色革盖菌提取物的抗病毒效应与阿昔洛韦相当。
实施例9-杂色革盖菌提取物和9-KODE甲酯对MMP-3表达的作用
该实施例表明杂色革盖菌的乙醇提取物和9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)抑制TNF-α诱导的基质金属蛋白酶3(MMP3)表达，并可用于抑制或降低肿瘤转移。
如图11和12中所示，杂色革盖菌(PUB)提取物调节TNF-α诱导的MMP3表达及人胶质瘤T98G细胞的迁移。50μg/ml不同批次的杂色革盖菌(R08PUB、R09PUB、R10PUB和R11PUB)乙醇提取物抑制TNF-α诱导的MMP3的mRNA和蛋白质表达(图11和12)。具体地，50μg/ml的R11PUB乙醇提取物降低了T98G细胞的侵袭(图20)。
9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯；本文中也被称为Cove-1)是从杂色革盖菌中分离的(图13-15)。如图16和17中所示，9-KODE甲酯调节TNF-α诱导的基质金属蛋白酶3的表达和人胶质瘤T98G细胞的迁移。具体地，10、25和50μg/ml的9-KODE甲酯抑制TNF-α诱导的MMP-3mRNA和蛋白质表达(图16和17)。
另外，所述结果表明，不同批次的杂色革盖菌乙醇提取物或9-KODE甲酯几乎不具有细胞毒性作用(图18和19)。
实施例10-杂色革盖菌提取物和9-KODE甲酯对降低癌细胞侵袭性的作用
本实施例表明，杂色革盖菌(R11PUB)乙醇提取物以剂量依赖的方式降低癌细胞的侵袭性，所述癌细胞包括T98G细胞、A549细胞和MDA-MB-231细胞(图21)。
具体地，使用Matrigel侵袭室(Matrigel Invasion Chamber)研究杂色革盖菌对癌细胞侵袭性的作用。将成胶质细胞瘤(T98G)、肺癌(A549)和乳腺癌(MDA-MB-231)细胞用一批杂色革盖菌(R11PUB)乙醇提取物处理18小时，随后允许所述细胞侵袭穿过基质，持续24小时。通过在光学显微镜下计数来定量侵袭细胞的数目。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为**P<0.01是统计学上显著的。如图21中所示，25和50μg/ml的杂色革盖菌(R11PUB)乙醇提取物降低了细胞的侵袭性。
另外，9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯；本文中也称为Cove-1)(25μg/ml)显著降低了T98G的侵袭性(图22)。
具体地，使用Matrigel侵袭室研究9-KODE甲酯对细胞侵袭性的作用。将成胶质细胞瘤(T98G)细胞用9-KODE甲酯处理18小时，随后允许细胞侵袭穿过基质，持续24小时。通过在光学显微镜下计数来定量侵袭细胞的数目。所有数据被绘制为至少3次独立实验的平均值±SD。认为**P<0.01是统计学上显著的。如图22所示，25μg/ml的9-KODE甲酯降低了细胞的侵袭性。
本文所列举的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，通过引证的方式纳入本文，就如同每份参考文献分别且具体地被指明是通过引证的方式纳入本文且在本文中以其全文示出。
除非在本文中另外说明或明显与上下文相悖，在描述本发明的上下文中所使用的术语“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”和类似指代物应解释为涵盖单数和复数形式。
除非本文另外说明，本文对数值范围的叙述仅旨在作为分别指代落入该范围内的每个单独数值的速记法，并且每个单独的数值就如同其在本文中被单独记载一样纳入本说明书。除非另外说明，本文所提供的所有准确数值代表相应的近似值(例如，对于具体因素或测量所提供的所有准确的示例性数值，如果合适，可认为也提供了相应的近似测量，由“约”修饰)。
除非另外指明，使用本文所提供的任意和所有实例或示例性语言(如，“例如”)仅旨在更好地阐明本发明而不对本发明范围构成限制。除非作同样的明确说明，本说明书中的语言不应被解释为指明任意要素对本发明的实施是必要的。
除非另外说明或明显与上下文不符，本文中对使用指代一个要素或多个要素的术语如“含有”、“具有”、“包括”或“包含”的本发明任意方面或实施方案的描述旨在支持“由……组成”、“基本上由……组成”或“基本包含”一个或多个该具体要素的本发明的类似方面或实施方案(例如，除非另外说明或与上下文明显相悖，本文所述的含有具体要素的组合物应理解为也描述了由该要素组成的组合物)。
应理解本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，对本领域技术人员暗示了基于它们的多种修改或改变，这些修改或改变包括在本申请的主旨和范围内。
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Claims (19)

1.一种获得9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯(9-KODE甲酯)的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供足够量的杂色革盖菌原材料；和
b)在约15℃至约30℃的温度下用醇或醇-水混合物极性溶剂提取杂色革盖菌原材料以产生杂色革盖菌醇提取物及残留物，并回收所述杂色革盖菌醇提取物；和
c)从所述杂色革盖菌醇提取物分离9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯
其中将步骤b)进行一次或多次。
2.权利要求1的方法，其中所述极性溶剂为乙醇或水-乙醇混合物。
3.一种具有式I所代表的化学结构的化合物，或其盐，
其中
为双键或单键；
R1为H、OH、直链或支链C1-C4烷基基团，或者ORa，其中Ra为直链或支链C1-C4烷基基团；且
R2为H、O或者直链或支链C1-C4烷基基团；且
R3为H、OH、O、卤素、直链或支链C1-C4烷基基团，或者ORa，其中Ra为直链或支链C1-C4烷基基团。
4.权利要求3的化合物，其中R1为OH、OCH3或OC2H5。
5.权利要求3的化合物，其中R2为O。
6.权利要求3的化合物，其中R3为O或OH。
7.权利要求3的化合物，其为9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯。
8.一种组合物，其包含权利要求3的化合物。
9.权利要求8的组合物，其还包含可治疗用载体。
10.权利要求8的组合物，其包含9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯。
11.一种治疗癌症或肿瘤的方法，包括给予需要这类治疗的受试者有效量的组合物，所述组合物包含式I的化合物或其盐，
其中
为双键或单键；
R1是H、OH、直链或支链C1-C4烷基基团，或者ORa，其中Ra是直链或支链C1-C4烷基基团；且
R2是H、O或直链或支链C1-C4烷基基团；且
R3是H、OH、O、卤素、直链或支链C1-C4烷基基团，或者ORa，其中Ra是直链或支链C1-C4烷基基团。
12.权利要求11的方法，其中所述化合物是9-氧代-10E,12E-十八碳二烯酸甲酯。
13.权利要求11的方法，其中所述受试者是人。
14.权利要求11的方法，其中所述受试者患有转移性癌症并且所述组合物的给予是用于减少癌症转移。
15.权利要求11的方法，其中所述癌症或肿瘤选自脑癌或肿瘤、鼻咽癌、乳腺癌或肿瘤、肺癌或肿瘤、白血病、淋巴瘤、结肠癌或肿瘤、肝癌或肿瘤、胃癌或肿瘤、食道癌或肿瘤、膀胱癌或肿瘤，以及胃癌或肿瘤。
16.权利要求11的方法，其中所述受试者患有脑癌或肿瘤，并且其中所述组合物的给予是用于治疗脑癌或肿瘤。
17.权利要求11的方法，其中所述受试者患有乳腺癌或肿瘤，并且其中所述组合物的给予是用于治疗乳腺癌或肿瘤。
18.权利要求11的方法，其中所述受试者患有肺癌或肿瘤，并且其中所述组合物的给予是用于治疗肺癌或肿瘤。
19.权利要求11的方法，用于抑制MMP3的表达。
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