KR20080034973A

KR20080034973A - 후코이단 또는 후코이단 가수분해 생성물과 면역 부활소재를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR20080034973A
Application number: KR1020087004829A
Authority: KR
Inventors: 유지 노나카; 다케시 야스모토; 히데오 나오키; 도시히데 구스모토
Original assignee: 산또리 가부시키가이샤; 트로피칼 테크놀로지 센터 리미티드
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-04-22
Also published as: CA2617219A1; EP1920774A4; CN101282732A; JPWO2007013613A1; WO2007013613A1; AU2006273151A1; TW200803872A; EP1920774A1

Abstract

유산균 등의 면역 부활 소재의 활성을 증강시키는 소재를 제공하는 것. 그와 같은 소재를 제공함으로써, 면역 부활 소재의 사용량을 저감시킬 수 있게 된다. 또, 그와 같은 소재를 제공함으로써, 강력한 면역 부활 활성과 바람직한 발효 특성을 갖는 유산균의 선발에 걸리는 시간을 단축시킬 수도 있게 된다. 이들 목적을 위하여, 후코이단을 산 가수분해함으로써 얻어지는 생성물 또는 올리고당을 면역 부활 소재와 조합하여 사용한다. 이와 같은 조합에 의해, 그들의 면역 기능 조절 작용 또는 면역 부활 활성을 상승적으로 증강시킨다.

Description

후코이단 또는 후코이단 가수분해 생성물과 면역 부활 소재를 함유하는 조성물{COMPOSITION CONTAINING FUCOIDAN OR FUCOIDAN HYDROLYSATE AND IMMUNOPOTENTIATING MATERIAL}

본 발명은 후코이단 또는 후코이단 가수분해 생성물과 면역 부활 소재를 함유하고, 면역력의 증강, 면역 기능의 조절 등을 목적으로 한 음식품, 의약품, 건강 식품, 기능성 식품, 화장품 등에 이용 가능한 조성물에 관한 것이다.

면역 부활 소재

최근, 건강 식품 분야에 있어서는, 면역 부활 작용을 갖는 소재가 주목받고 있고, 그들을 함유하는 건강 식품이 많이 개발되고 있다. 이들은, 가령 (加齡) 이나 스트레스, 질환 등에 의해 저하된 면역력 회복 등의 목적에 사용된다. 그와 같은 소재에는, 예를 들어 유산균 (유산구균, 유산간균), 효모, 진균류와 같은 미생물 ; 표고버섯, 잎새버섯, 영지, 아가리쿠스 등의 버섯류 ; 해조류 ; 한방약 등이 포함된다.

유산균

상기 면역 부활 소재 중에서도, 유산균은, 그 면역 부활 작용이 주목받고 있고, 일부의 유산균에 관하여, NK (내추럴 킬러) 활성을 증강시키는 작용이나 Th1/Th2 밸런스를 개선하는 작용 등이 보고되고 있다. 또, 유산균은, 종래부터 음식용에 제공되고 있어, 안전성이 높은 것도 알려져 있다. 따라서, 유산균은, 면역력의 저하를 회복시키는 수단으로서 바람직한 것으로 생각된다.

유산균의 면역 부활 작용의 효과를 높이기 위해서는, 음식품 중의 유산균의 함량을 늘리면 된다. 그러나, 유산균을 다량으로 음료 등에 첨가하면 침전을 발생시킨다는 문제가 있었다. 이와 같은 이유로부터, 지금까지 유산균을 사용한 음식품으로는, 채소 절임과 같은 고체나, 침전이 걱정되지 않는 음식품 (예를 들어 요구르트나 유음료) 이 대부분이었다. 또, 예를 들어 요구르트와 같이, 발효에 의해 유산균을 늘리는 경우에도, 유산균의 수가 일정량에 도달하면 그 이상은 증가하지 않기 때문에, 음식품 중의 유산균 함량을 늘리는 데에는 한계가 있었다. 게다가, 발효 식품을 만드는 이상, 기능뿐만 아니라, 발효의 정도, 발효 후의 향미, 발효 후의 유산균의 수 등도 고려할 필요가 있었다. 따라서, 유산균을 사용하여 기능성 음식품, 특히 면역 기능 조절을 목적으로 한 기능성 발효 음식품을 개발하기 위해서는, 발효 특성이 우수하고, 또한 면역 기능 조절 작용도 우수한 유산균을 사용하는 것이 필수적이다. 그러나, 유산균의 발효 특성과 면역 기능 조절 작용에는 전혀 상관이 없다. 따라서 이와 같은 유산균을 탐색하는 것은 용이한 것은 아니다.

최근에는 유산균 등의 면역 부활 소재의 활성을 높이기 위한 몇 가지 방법이 보고되고 있다. 예를 들어, 3 ∼ 8 종의 유산균이나 효모를 혼합 배양함으로써 면역 부활 작용이 증강된다는 보고나 (특허 문헌 1), 유산균과 버섯을 병용함으로 써 면역 부활 작용을 증강시키는 방법 (특허 문헌 2) 등의 보고가 있다.

후코이단 및 후코이단 가수분해 생성물

후코이단은 해초류에 함유되는 황산화다당으로서, 항혈액 응고 작용, 지혈 청징 작용 (혈액 중의 콜레스테롤이나 과산화지질을 제거하는 작용), 항종양 작용, 암 전이 억제 작용, 항에이즈 바이러스 감염 작용 등의 다양한 활성을 갖는 것이 보고되고 있다. 그 중에서도, 생체의 면역 기능을 정상화하는 작용이 주목받고 있고, 면역 기능 조절 작용을 갖는 의약품이나 건강 식품의 소재로서 유용한 것으로 생각되고 있다. 그러나, 후코이단은 분자량이 매우 큰 황산화다당으로, 그대로 음식품이나 의약품 등으로서 사용할 때에는, 흡수성, 항원성, 균일성, 항응혈 활성 등에 관한 문제가 있다.

이들 문제를 해결하기 위하여, 후코이단으로부터 저분자 화합물을 얻기 위한 시도가 몇 가지 이루어지고 있다. 예를 들어 지금까지, 화학 합성에 의한 푸코오스 함유 올리고당이 보고되고 있으나 (비특허 문헌 1, 2 및 3), 이들은 유기 합성 반응에 의해 조제되고 있기 때문에 식품 등에 사용하는 것은 바람직하지 않았다.

한편, 후코이단을 가수분해하여 후코이단을 저분자화하는 방법도 보고되고 있다. 예를 들어 특허 문헌 3 에는, 후코이단을 산 가수분해하는 방법이 개시되어 있고, 얻어진 저분자 후코이단은, 5 × 10³ 이하의 분자량 분포를 가진 것이 기재되어 있다. 또, 특허 문헌 4 에는, 산을 외부로부터 첨가하지 않고 후코이 단을 가수분해하여 올리고당을 얻는 방법이 기재되어 있다. 또, 특허 문헌 5 와 같이 효소에 의해 후코이단을 가수분해하는 방법도 보고되고 있다.

특허 문헌 1 : 일본 공개특허공보 2005-68092

특허 문헌 2 : 일본 공개특허공보 2004-51504

특허 문헌 3 : 일본 공개특허공보 평7-215990

특허 문헌 4 : 일본 공개특허공보 2002-226496

특허 문헌 5 : 일본 공개특허공보 2000-236889

비특허 문헌 1 : Carbohydrate research 4, 189-195 (1967)

비특허 문헌 2 : Carbohydrate research 37, 75-79 (1974)

비특허 문헌 3 : Carbohydrate research 41, 308-312 (1975)

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

그러나, 특허 문헌 1 및 2 의 방법에서는, 모두 불용성 소재끼리를 조합하는 방법으로서, 침전을 방지하는 것에는 도달하지 못했다. 또, 유산균 이외의 면역 부활 소재의 활성을 효과적으로 높이는 소재에 대해서는, 지금까지 검토가 이루어지지 않았다.

그래서, 면역 부활 소재나 유산균의 활성을 상승적으로 높이는 수용성 소재가 있다면, 보다 강한 효능을 가진 면역 기능 조절제나 음식품을 개발할 수 있을 뿐만 아니라, 활성을 유지한 채로 면역 부활 소재나 유산균의 사용량을 줄일 수도 있기 때문에, 결과적으로 면역 부활 소재나 유산균 함유 식품의 개발 범위를 넓힐 수 있다. 나아가서는 양호한 발효 특성과 면역 기능 조절 작용을 겸비한 유산균을 탐색하는 부담도 경감된다. 또, 식품이나 의약품에 있어서의 용도를 고려하면, 그 물질은 안전성이 높고 또한 간편하게 제조할 수 있는 것인 것이 필요시된다.

따라서 본 발명의 목적은, 면역 부활 소재를 조합함으로써 그들의 면역 기능 조절 작용을 증강시킬 수 있는 물질을 제공하는 것이다.

또한, 여기에서 말하는 면역 기능 조절 작용이란, 예를 들어 자일로올리고당과 같이 장내 세균총을 개선하여 간접적으로 면역 기능을 조절하는 것이 아니라, 몇 가지의 후코이단에서 나타나 있는 바와 같이 직접적으로 면역 담당 세포를 활성화하는 것을 가리킨다.

본 발명의 추가적인 목적은, 효과량을 적확하게 음식품 또는 의약 조성물에 첨가할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자는, 후코이단 또는 후코이단의 산 가수분해 생성물, 바람직하게는 올리고당을 임의의 유산균이나 면역 부활 소재와 조합함으로써 그들의 면역 기능 조절 또는 면역 부활 활성이 상승적으로 증강되는 것을 알아내어, 본 발명의 완성에 이르렀다. 본 발명에 있어서는, 후코이단 유래의 그들 올리고당을 후코이단 올리고당이라고도 칭한다.

즉 본 발명은,

(1) 후코이단 또는 후코이단 가수분해 생성물과 면역 부활 소재를 함유하는 조성물 ;

(2) 가수분해 생성물이, 후코이단을 0.1 ∼ 6.0N 의 산으로, 25 ∼ 100℃, 0.25 ∼ 2.5 시간 가수분해하여 얻어지는 것인, (1) 에 기재된 조성물 ;

(3) 가수분해 생성물이, 후코이단을 0.5 ∼ 4.0N 의 산으로, 30 ∼ 90℃, 0.5 ∼ 2.0 시간 가수분해하여 얻어지는 것인, (2) 에 기재된 조성물 ;

(4) 가수분해가 염산 또는 황산으로 실시되는, (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 조성물 ;

(5) 가수분해 생성물이 올리고당인, (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 조성물 ;

(6) 올리고당이, 푸코오스, 황산화푸코오스, 아세틸화푸코오스, 및 글루크론산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 당으로 구성되는 2 당부터 5 당까지의 올리고당인, (5) 에 기재된 조성물 ;

(7) 올리고당으로서, 하기 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X) 및 (XI) 로 나타내는 화합물에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는, (6) 에 기재된 조성물 ;

[화학식 1]

(분자량 340)

[화학식 2]

(분자량 486)

[화학식 3]

(분자량 390)

[화학식 4]

(분자량 420)

[화학식 5]

(분자량 566)

[화학식 6]

(분자량 712)

[화학식 7]

(분자량 754)

[화학식 8]

(분자량 808)

[화학식 9]

(분자량 850)

[화학식 10]

(분자량 858)

[화학식 11]

(분자량 900)

(8) 면역 부활 소재가, 유산균 (유산구균 및 유산간균), 효모, 진균류와 같은 미생물 ; 표고버섯, 잎새버섯, 영지, 아가리쿠스 등의 버섯류 ; CpG 모티프를 함유하는 면역원성 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG-ODN), PolyI : C 와 같은 핵산 유래 물질 ; 리포다당 (LPS), β-글루칸 ; 해조류 ; 한방약 ; MM46 암 항원과 같은 암 백신 ; 콘카나발린 A (ConA) ; 크레스틴 (등록상표), OK-432 (피시바닐, 등록상표), 렌티난 (등록상표) 과 같은 BRM (생물학적 응답 수식제) 에서 선택되는 적어도 1 종인, (1) ∼ (7) 중 어느 하나에 기재된 조성물 ;

(9) 면역 부활 소재가 유산균인, (8) 에 기재된 조성물 ;

(10) (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 함유하는 면역 기능 조절제 ;

(11) (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 첨가한 음식품 ;

(12) (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 함유하고, 면역 기능 조절 작용을 갖는 취지를 표시한 음식품 ;

(13) (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 함유하는 의약 조성물 ; 및

(14) (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 조성물을 함유하는 화장품에 관한 것이다.

발명의 효과

본 발명의 후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 면역 부활 소재의 조합은, 그들을 단독으로 사용한 경우와 비교하여, 상승적으로 증강된 면역 기능 조절 또는 면역 부활 작용을 갖는다. 따라서, 지금까지의 면역 부활 소재를 사용한 음식품이나 의약품보다 효과가 높은 제품을 개발할 수 있게 된다. 또, 그 높은 효과 때문에, 면역 부활 소재의 음식품, 의약품, 화장품에 대한 첨가량을 줄일 수도 있게 된다.

이들의 이점은, 면역 부활 소재로서 유산균을 사용할 때에 특히 중요해진다. 예를 들어, 수용성이 낮은 유산균에 있어서는, 그 첨가량을 삭감할 수 있다면, 그 침전을 방지할 수 있다. 또, 면역 부활 활성과 바람직한 발효 특성을 겸비한 유산균을 선발하는 과정도 생략할 수 있다. 결과적으로, 유산균 함유 제품의 개발을 유리하게 진행할 수 있다.

또, 본 발명의 조성물의 구성 요건인 후코이단 또는 그 가수분해 생성물은, 식품 소재로부터 분리된 것이기 때문에 부드러운 작용을 가져, 매우 안전성이 높다.

따라서, 본 발명 조성물은 매우 유용하고, 그 응용 범위는 음식품뿐만 아니라, 의약품 및 화장품에도 적용할 수 있다.

또, 올리고당으로서, 상기 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X) 및 (XI) 로 나타내는 화합물에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 것을 사용함으로써, 간편하고 또한 정확하게 품질을 관리할 수 있다. 또, 이들 후코이단 유래 올리고당은 저분자로 취급하기 쉽고 또 간편하게 제조할 수 있으며, 안전성도 높기 때문에, 이들 올리고당을 면역 부활 소재와 조합한 조성물은, 음식품이나 의약품 등, 다양한 용도에 사용할 수 있다.

도 1 은 오키나와 큰실말로부터 열수 추출에 의해 얻어지는 후코이단의 당 조성 분석을 나타내는 HPLC 차트이다.

도 2a 는 후코이단을 가수분해할 때에 사용하는 산 농도가 면역 부활 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 2b 는 후코이단을 가수분해할 때에 사용하는 산 농도가 면역 부활 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 3a 는 후코이단을 가수분해할 때에 반응시키는 온도가 면역 부활 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 3b 는 후코이단을 가수분해할 때에 반응시키는 온도가 면역 부활 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 4 는 후코이단을 가수분해할 때에 반응시키는 시간이 면역 부활 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 5 는 식 (I) 로 표시되는 분자량 340 의 후코이단 올리고당의 MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 6 은 식 (II) 로 표시되는 분자량 486 의 후코이단 올리고당의 MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 7 은 식 (I) 로 표시되는 분자량 340 의 후코이단 올리고당의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 8 은 식 (I) 로 표시되는 분자량 340 의 후코이단 올리고당의 ¹³C-NMR 스 펙트럼을 나타낸다.

도 9 는 식 (II) 로 표시되는 분자량 486 의 후코이단 올리고당의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 10 은 식 (II) 로 표시되는 분자량 486 의 후코이단 올리고당의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 11 은 식 (III) 으로 표시되는 분자량 390 의 후코이단 올리고당의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 12 는 식 (III) 으로 표시되는 분자량 390 의 후코이단 올리고당의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 13 은 식 (V) 로 표시되는 분자량 566 의 후코이단 올리고당의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 14 는 식 (V) 로 표시되는 분자량 566 의 후코이단 올리고당의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 15 는 식 (VI) 으로 표시되는 분자량 712 의 후코이단 올리고당의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 16 은 식 (VI) 으로 표시되는 분자량 712 의 후코이단 올리고당의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 17 은 식 (VII) 로 표시되는 분자량 754 의 후코이단 올리고당의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 18 은 식 (VII) 로 표시되는 분자량 754 의 후코이단 올리고당의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 19 는 식 (VIII) 로 표시되는 분자량 808 의 후코이단 올리고당의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 20 은 식 (VIII) 로 표시되는 분자량 808 의 후코이단 올리고당의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 21 은 식 (IX) 로 표시되는 분자량 850 의 후코이단 올리고당의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 22 는 식 (IX) 로 표시되는 분자량 850 의 후코이단 올리고당의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 23 은 식 (VII) 로 표시되는 분자량 754 의 후코이단 올리고당을 재생시킨 후의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 24 는 식 (VII) 로 표시되는 분자량 754 의 후코이단 올리고당을 재생시킨 후의 TOF-MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 25 는 식 (VII) 로 표시되는 분자량 754 의 후코이단 올리고당을 재생시 킨 후의 ESI-MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 26 은 식 (IV) 로 표시되는 분자량 420 의 후코이단 올리고당의 FAB-MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 27 은 식 (IV) 로 표시되는 분자량 420 의 후코이단 올리고당의 MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 28 은 식 (X) 으로 표시되는 분자량 858 및 식 (XI) 로 표시되는 분자량 900 의 후코이단 올리고당의 FAB-MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 29 는 식 (X) 으로 표시되는 분자량 858 의 후코이단 올리고당의 FAB-MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 30 은 식 (XI) 로 표시되는 분자량 900 의 후코이단 올리고당의 FAB-MS/MS 스펙트럼을 나타낸다.

도 31 은 오키나와 큰실말을 가수분해 후, ABEE 로 형광 표지화한 ESI-MS 의 차트를 나타낸다.

도 32a 는 식 (I) 로 표시되는 후코이단 올리고당과 유산균의 병용이 상승적으로 비장 세포의 IFN-γ 유도 효과를 높이는 것을 나타낸다.

도 32b 는 식 (II) 로 표시되는 후코이단 올리고당과 유산균의 병용이 상승적으로 비장 세포의 IFN-γ 유도 효과를 높이는 것을 나타낸다.

도 33 은 후코이단 올리고당 혼합물과 유산균의 병용이 상승적으로 비장 세포의 IFN-γ 유도 효과를 높이는 것을 나타낸다.

도 34 는 후코이단 올리고당과 유산균의 병용이 상승적으로 수상 (樹狀) 세 포의 IL-12 유도 효과를 높이는 것을 나타낸다.

도 35 는 후코이단 올리고당과 유산균의 병용이 상승적으로 수상 세포의 IL-10 유도 효과를 높이는 것을 나타낸다.

도 36 은 후코이단 올리고당과 유산균의 병용이 상승적으로 CTL 활성을 높이는 것을 나타낸다.

도 37 은 활성이 거의 없는 유산균과 후코이단 가수분해 생성물에 의한 IL-12 생산의 상승적 증강을 나타낸다.

도 38 은 유산균 이외의 면역 부활제와 후코이단 가수분해 생성물에 의한, IFN-γ 생산의 상승적 증강을 나타낸다.

도 39 는 유산균과 후코이단 가수분해 생성물이 상승적으로 NK 활성을 증강시키는 것을 in vivo 로 증명한다.

도 40 은 후코이단과 유산균의 병용이 상승적으로 비장 세포의 IFN-γ 유도 효과를 높이는 것을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

면역 부활 소재

면역 부활 소재란, 동물의 면역 응답력을 증강시키는 작용을 갖는 소재를 말한다. 면역 강화 소재라고도 불린다. 본 발명에서 사용하는 면역 부활 소재는, 특별히 한정되지 않지만, 유산균 (유산구균, 유산간균), 효모, 진균류와 같은 미생물 ; 표고버섯, 잎새버섯, 영지, 아가리쿠스 등의 버섯류 ; CpG 모티프를 함유하는 면역원성 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG-ODN), PolyI : C 와 같은 핵산 유래 물질 ; 리포다당 (LPS) ; 해조류 ; 한방약 ; 암 백신 (예를 들어 MM46 암 항원) ; 콘카나발린 A (ConA) ; 크레스틴 (등록상표), OK-432 (피시바닐, 등록상표), 렌티난 (등록상표) 과 같은 BRM (생물학적 응답 수식제) 등의 공지된 면역 부활제가 포함된다.

CpG-ODN 이란, 비메틸화 시토신-구아닌디뉴클레오티드 (CpG) 를 함유하는 (짧은) 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 이고, 그와 같은 CpG 모티프를 함유하는 CpG-ODN 은, 항원 제시 세포를 직접 활성화할 수 있다. 그 결과, CpG-ODN 에 의한 NK 세포 등의 활성화는, Th1 형 응답의 유발 및 세포 장해성 T 세포의 발생을 촉진시킨다 (일본 공표특허공보 2004-519453).

PolyI : C 란, 이노신산과 시티딜산으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드코폴리머를 말하며, 폴리이노신폴리시티딘산이라고도 불린다. 영장류에 있어서는, 인터페론의 체액 중 농도를 높이는 작용을 갖는 것이 일반적으로 알려져 있다.

리포다당은, 자연 면역계를 유도하는 발단이 되는 물질로서 알려져 있다.

MM46 이란, 유방암 또는 종양의 일종이다. MM46 암에 대한 항원 등의 암 백신은, 암 세포를 공격하는 면역 기능을 부활화하기 때문에, 암의 예방이나 치료에 사용된다.

ConA 란, 작두콩 (Jack bean) 종자 유래의 렉틴이다. 다양한 면역 부활 작용을 갖는 것이 알려져 있다.

BRM 이란, 암 치료에 있어서 숙주의 면역 기능 등을 증강, 조절함으로써 종양과 숙주의 상호 관계를 수식하여, 치료 효과를 도출하는 약제나 치료법을 말한 다. 그와 같은 약제에는, OK-432 나 크레스틴 (등록상표), 렌티난 (등록상표) 등이 포함된다. OK-432 란, 주성분으로서 스트렙토코커스·피오게네스 (A 군 3 형) Su 주 페니실린 처리 동결 건조 분말, 건조균체를 함유하는, 항악성 종양제·림프관종 치료제이다. 크레스틴이란, 주성분으로서 구름버섯의 균사체로부터 얻어진, 단백질과 결합한 다당류를 함유하는, 암의 치료에 사용되는 약제이다. 렌티난이란, 표고버섯으로부터 얻어진 β-1,3-글루칸이다.

유산균

본 발명에서 사용하는 유산균은 특정한 주에 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 락토바실러스 (Lactobacillus) 속이고, 그 중에서도 식물 소재를 발효시킬 수 있는 식물성 유산균이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 또는 락토바실러스 펜토수스 (Lactobacillus pentosus) 이다. 본 발명에 있어서 후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 조합하여 사용하는 경우에는, 유산균은 살아 있어도 되고, 죽어 있어도 된다.

후코이단

본 발명의 조성물을 위한 원료로서 사용되는 후코이단은, 어떠한 구조이어도 되고, 또 어느 해초류로부터 취득해도 된다. 해초류의 예에는, 갯쇠털목 (Sphacelariales), 민가지말목 (Chordariales), 고리매목 (Scytosiphonales), 바위수염목 (Dictyosiphonales), 채찍말목 (Cutleriales), 털비말목 (Sporochnales), 그물바탕말목 (Dictyotales), 다시마목 (Laminariales), 뜸부기목 (Fucales) 을 포함하는 갈조강 Phaeophyceae 의 해조가 포함된다. 바람직하게는 큰실말, 보다 바람직하게는 오키나와 큰실말 유래의 후코이단을 사용한다.

후코이단 추출 방법

후코이단을 해초류로부터 추출하는 방법은 다양하게 검토되고 있고, 널리 알려져 있다 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평10-245334 에 기재되어 있는 바와 같은 물을 사용하는 방법, 일본 공개특허공보 평10-195106 에 기재되어 있는 바와 같은 산을 사용하는 방법, 일본 공개특허공보 2002-262788 에 기재되어 있는 바와 같은 알칼리 수성 용매를 사용하는 방법 등이다). 본 발명에 있어서 원료로서 사용하는 후코이단은 이들 공지된 방법에 의해 취득할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들어 이하의 방법에 의해 취득한 것을 사용한다.

즉, 해초류 (예를 들어 오키나와 큰실말) 에 증류수 5 ∼ 10 배량을 첨가하고, 50 ∼ 100℃ 에서 수 분 ∼ 5 시간, 바람직하게는 60 ∼ 90℃ 에서 0.5 ∼ 2.0 시간, 더욱 바람직하게는 80 ∼ 90℃ 에서 약 1 시간 추출한다. 이와 같이 하여 얻어진 해초류 추출물을 냉각, 흡인 여과, 탈염 및 건조시킴으로써, 용이하게 물에 용해되는 후코이단 획분을 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 후코이단 획분은, 추가로 정제하지 않고 다음 공정에 사용해도 되고, 추가로 정제하고 나서 사용해도 된다.

후코이단은, 바람직하게는 상기와 같이 해초류로부터 추출한 것을 사용하는데, 해초류에 함유된 상태에서 사용해도 된다. 후코이단 또는 그것을 함유하는 해초류를 다음의 가수분해 공정에 제공함으로써 후코이단 가수분해 생성물이 얻어진다.

후코이단 가수분해 생성물

후코이단 가수분해 생성물이란, 황산화다당인 후코이단을 가수분해함으로써 얻어질 수 있는 단당 및 다당류를 포함하는 당 유도체, 그리고 그들의 혼합물을 말한다. 후코이단 가수분해 생성물은, 바람직하게는 다당류이고, 보다 바람직하게는 2 ∼ 10 개의 단당으로 이루어지는 올리고당, 보다 더 바람직하게는 2 ∼ 5 개의 단당으로 이루어지는 올리고당이다. 본 발명에 있어서는, 후코이단을 가수분해하여 얻어지는 상기와 같은 올리고당을 후코이단 올리고당이라고도 칭한다. 올리고당을 구성하는 단당은, 바람직하게는 푸코오스, 황산화푸코오스, 아세틸화푸코오스, 및/또는 글루크론산이다. 특히 바람직한 올리고당은, 상기 식 (I) ∼ (XI) 의 화합물이다.

후코이단 가수분해 생성물은 이하와 같이 하여 제조된다.

후코이단 가수분해 생성물의 제조

(1) 후코이단의 가수분해

본 발명의 구성 요건인 후코이단 가수분해 생성물은, 특허 문헌 3 ∼ 5 에 기재되어 있는 바와 같이, 후코이단을 산이나 효소를 사용하는 방법에 의해 가수분해함으로써 얻어진다. 산 가수분해를 실시하는 경우에는, 염산, 황산, 인산, 질산 등의 무기산을 사용해도 되고, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 숙신산, 포름산, 프로피온산 등의 유기산을 사용해도 된다. 바람직한 산은, 염산 및 황산이다. 바람직하게는, 이하와 같은 산 가수분해 조건을 사용한다.

즉, 상기와 같이 하여 해초류로부터 얻어진 후코이단을 함유하는 획분 또는 후코이단을, 산, 바람직하게는 염산을 사용하여, 0.1 ∼ 6.0N, 바람직하게는 0.5 ∼ 4.0N, 더욱 바람직하게는 0.5 ∼ 2.0N 의 HCl 을 함유하는, 25 ∼ 100℃, 바람직하게는 30 ∼ 90℃, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 80℃ 의 수성 용매 중에서, 0.1 ∼ 3 시간, 바람직하게는 0.25 ∼ 2.5 시간, 더욱 바람직하게는 0.5 ∼ 2.0 시간 가수분해를 실시한다. 얻어진 반응물을 염기, 예를 들어 약 1N 의 NaOH 로 중화한 후, 전기 투석 혹은 겔 여과 등의 적절한 수단으로 탈염하고, 건조 (예를 들어 동결 건조) 시킴으로써, 후코이단 올리고당 혼합물을 함유하는 가수분해 생성물을 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 가수분해 생성물은, 이대로 후코이단 가수분해 생성물로서 사용해도 되지만, 추가로 정제하여 그 활성을 높일 수 있다.

(2) 가수분해 생성물의 정제 및 올리고당의 단리

후코이단 가수분해 생성물의 정제는, 크로마토그래피, 재결정, 투석, 알코올 침전 등의 방법을 단독으로, 또는 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어 이하의 조작에 따라 정제를 실시한다.

먼저, 올리고당 혼합물을 함유하는 후코이단 가수분해 생성물을 음이온 교환 수지를 사용한 크로마토그래피에 제공하여, 흡착되지 않고 통과하는, 황산기를 함유하지 않는 올리고당을 함유하는 획분 (중성·산성 당 획분) 과, 산성 용출액에 의해 용출되는, 황산기를 많이 함유하는 올리고당을 함유하는 획분 (황산화당 획분) 을 분리한다.

본 발명에 있어서는, 이와 같이 하여 얻어진 각 획분을 후코이단 가수분해 생성물로서 사용하는 것이 바람직한데, 이하와 같이 하여, 추가로 정제하고 올리고당을 단리하여 사용해도 된다.

중성·산성 당 획분을 추가로 겔 여과에 제공함으로써, 식 (I) 로 표시되는 2 당과 식 (II) 로 표시되는 3 당을 얻을 수 있다.

한편, 황산화당 획분을 크로마토그래피에 제공함으로써, 황산화올리고당 (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X) 또는 (XI) 각 성분을 단리할 수 있다.

각 올리고당은, 정제, 구조 해석을 보다 용이하게 하기 위하여 적절히 표지화 또는 유도체화해도 된다. 예를 들어, 올리고당은, 4-아미노벤조산에틸 (ABEE) 과 같은 시약으로 형광 표지화할 수 있고, 이로써 올리고당의 검출이 용이해진다. 표지화된 각 올리고당을 분리한 후에 그 표지화 부분을 제거함으로써, 순수한 올리고당을 취득할 수 있다.

후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 면역 부활 소재의 조합

본 발명은, 상기와 같이 하여 얻어지는 후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 면역 부활 소재의 조합을 함유하는 조성물이다. 이와 같은 조합에 의해, 후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 면역 부활 소재의 면역 기능 조절 작용 및/또는 면역 부활 작용이 상승적으로 증강된다.

당해 조성물에 있어서는, 후코이단 가수분해 생성물로서 단일의 후코이단 올리고당을 면역 부활 소재 (예를 들어 유산균) 와 조합하여 사용해도 된다. 또, 후코이단 올리고당을 복수, 예를 들어 3 종류 또는 그 이상 사용하여, 면역 부활 소재와 조합해도 된다.

유산균을 본 발명의 조합에 있어서 사용하는 경우에는, 그것은 살아 있어도 되고, 죽어 있어도 된다. 이에 대하여, 자일로올리고당과 같은 프리바이오틱스로서 알려져 있는 올리고당은, 주로 유산균의 증식을 촉진시킴으로써 면역 기능 조절 작용을 증강시키는 것이다. 본 발명의 가수분해 생성물은, 사균에 의한 면역 기능 조절 작용도 증강시킬 수 있는 점에서, 종래의 프리바이오틱스로서 사용되고 있는 올리고당보다 우수하다.

사용되는 후코이단 또는 그 가수분해 생성물의 면역 부활 소재에 대한 바람직한 비율은, 중량으로 1 : 1 ∼ 10000 : 1, 보다 바람직하게는 250 : 1 ∼ 1000 : 1 이다.

또, 본 발명에는, 후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 면역 부활 소재를 조합하여 사용함으로써 그들의 면역 기능 조절 및/또는 면역 부활 작용을 상승적으로 증강시키는 방법도 포함된다.

본 발명의 조합을, 예를 들어 음식품, 의약품 및 화장품 등에 사용하여, 이들에 면역 기능 조절 작용을 부여할 수 있다.

면역 기능 조절제

본 명세서에 있어서의 면역 기능 조절 작용이란, 생체에 있어서 저하되어 있는 면역 반응을 높이는, 및/또는 항진되어 있는 면역 반응을 억제하는 작용을 말한다. 따라서, 그 작용에는, 면역 부활 작용 및 면역 억제 작용이 포함된다.

본 명세서에 있어서의 면역 기능 조절 작용은, 당해 기술 분야에서 알려져 있는 방법으로 측정할 수 있다. 그것은, 예를 들어 면역 기능 조절 작용을 갖는 사이토카인을 유도하는 작용을 지표로 하여 측정할 수 있다. 이 목적에 사용되는 사이토카인에는, 인터페론-γ, 인터류킨-10, 12 등이 포함된다. 또, 면역 기능 조절 작용은, 면역 응답에 관여하는 수상 세포의 성숙화나, 세포 장해성 T 세포 (CTL) 의 활성을 지표로 하여 측정할 수도 있다.

본 발명의 면역 기능 조절제는 건강 증진을 위하여 사용할 수 있으나, 종양, 암의 전이, 바이러스성 질환 (예를 들어 감기, 에이즈, 바이러스성 간염), 알레르기성 질환 (예를 들어 화분증, 알레르기성 비염, 아토피, 천식), 자기 면역 질환 (예를 들어, 류머티즘성 관절염), 염증성 질환, 당뇨병과 같은 질환 또는 상태에 유효하다.

후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 면역 부활 소재를 함유하는 식품 첨가물 및 음식품

본 발명의 후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 면역 부활 소재의 조합을 음식품에 사용하는 경우에는, 그것을 포함하여 면역 기능 조절 작용을 갖는 식품 첨가물 및 음식품으로서, 그리고 그것을 첨가한 면역 기능 조절 작용을 갖는 건강 식품으로서 실시하는 것이 바람직하다. 이들은, 공지된 감미료, 산미료, 비타민 등의 각종 성분과 혼합하여 사용자의 기호에 맞는 제품으로 할 수 있다. 음식품은, 예를 들어 정제, 캡슐제, 청량 음료, 차 음료, 드링크제, 요구르트나 유산균 음료 등의 유제품, 조미료, 가공 식품, 디저트류, 과자 (예를 들어 껌, 캔디, 젤리) 등의 형태로 제공할 수 있다. 본 발명의 음식품에는, 면역 기능 조절 작용 을 갖는 취지를 용기나 설명서에 표시한 기능성 식품 (특정 보건용 식품이나 조건부 특정 보건용 식품이 포함된다) 도 포함된다. 표시 장소는 용기 또는 그것에 첨부한 지시서 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 용기에는, 병, 캔, 페트병, 플라스틱 보틀, 종이 팩 등이 포함되는데, 그들에 한정되지 않는다. 또, 표시 방법에는, 인쇄, 각인, 시일 등이 포함되는데, 그들에 한정되지 않는다. 또, 음식품은 펫의 먹이로서 가공한 펫 푸드나 동물 사료 등이어도 된다.

후코이단 또는 그 가수분해 성성물과 면역 부활 소재의 조합을 함유하는 의약 조성물

본 발명의 조성물을 의약품으로서 사용하는 경우에는, 예를 들어 면역 기능 조절제, 면역 부활제, 항알레르기제 및 면역 억제제로서 사용할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에 있어서, 본 발명은 후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 면역 부활 소재를 함유하는, 면역 기능 조절 작용, 면역 부활 작용, 항알레르기 작용 및/또는 면역 억제 작용을 갖는 의약 조성물이다.

의약 조성물은, 주약에 희석제, 담체, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 교미 교취제, 용해 보조제, 현탁제, 코팅제 등의 의약의 제제 기술 분야에 있어서 통상 사용하는 공지된 보조제를 사용하여 제제화할 수 있다. 제형으로는, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 액제, 시럽제, 좌제, 크림제, 연고제, 에멀션, 퍼프제, 주사제 등을 들 수 있고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 의약품의 투여 경로로는, 예를 들어 경구 투여, 직장 투여, 경장 투여 등을 들 수 있는데, 특별히 한정되는 것은 아니다.

후코이단 또는 그 가수분해 성성물과 면역 부활 소재의 조합을 함유하는 화장품

본 발명의 조합을 사용함으로써, 면역 기능 조절 작용을 갖는 화장품을 제조할 수 있다.

본 발명의 조합을 함유하는 화장품은, 예를 들어 얼굴용, 피부용, 두발용의 크림, 로션, 겔, 무스, 샴푸, 린스 등이다.

기타 성분과의 병용

본 발명의 조합을 함유하는 조성물은, 음식품, 의약 조성물 및 화장품에 있어서, 그 자체 단독으로 사용해도 되지만, 기타 면역 기능 조절 작용 또는 면역 부활 작용을 갖는 식품 소재 또는 물질과 병용하는 것도 바람직하다. 그와 같은 식품 소재 또는 물질로는, 유산균, 버섯류, 후코이단 등을 들 수 있다.

본 발명의 음식품 또는 조성물에는, 이들 활성 성분 이외에, 구체적인 양태에 따라, 일반적인 성분, 예를 들어 담체, 희석제, 부형제 또는 첨가제 등의 성분을 배합할 수 있다. 여기에서 희석제, 담체, 부형제로는, 후코이단 또는 그 가수분해물 및 면역 부활 소재의 생리 활성을 방해하지 않는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 수크로오스, 글루코오스, 과당, 말토오스, 트레할로스, 유당, 전분, 물엿, 이성화(異性化) 액당 등의 당류, 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 알코올류, 소르비톨, 만니톨, 에리트리톨, 락티톨, 자일리톨, 말티톨, 환원 팔라티노스, 환원 전분 분해물 등의 당 알코올류, 트리아세틴 등의 용제, 아라비아검, 카라기난, 잔탄검, 구아검, 젤란검, 펙틴 등의 다당류, 또는 물을 들 수 있다. 또 첨가제로는, 킬레이트제 등의 보조제, 향료, 향신료 추출물, 방부제 등을 들 수 있다. 희석제, 담체, 첨가제 등을 본 발명의 효과를 해치지 않는 한 배합할 수 있다.

음식품, 의약 조성물 및 화장품에 있어서의 후코이단 또는 그 가수분해물 및 면역 부활 소재의 배합량은, 선택하는 기타 배합 성분과의 관계 등에 따라 적절히 선택되는 것으로, 특별히 한정되는 것은 아니다. 그러나, 통상, 후코이단 또는 그 가수분해 생성물과 면역 부활 소재의 합계량은, 음료 또는 식품 중, 의약 조성물 중에 첨가하는 경우, 개체의 체중 60㎏ 에 대하여 0.01g ∼ 10g/일, 바람직하게는 0.05g ∼ 1g/일, 특히 바람직하게는 0.05g ∼ 0.5g/일이다. 화장품 중에는, 0.01 ∼ 20 중량％, 바람직하게는 0.05 ∼ 15 중량％ 사용된다.

본 발명의 후코이단 또는 그 가수분해 생성물 및 올리고당은, 추출 정제품이나 합성 제품을 단독으로 음식품, 의약 조성물 또는 화장품에 사용할 수도 있다.

또한 본 발명은 상기 서술한 각 실시형태에 한정되는 것은 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 다양한 변경이 가능하고, 상이한 실시형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻어지는 실시형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 한정되지 않는 것은 말할 필요도 없다.

이하의 실시예에 있어서는, 특별히 명기하지 않는 한, ECA-600 형 핵 자기 공명 장치 (니혼 전자 주식회사) 를 사용하여 NMR 분석을 실시하였다. 측정 용매로서 중수 (D₂O) 를 사용하였다. 구성 당의 결합 양식은, 2D-NMR 을 사용하여 실시하였다.

실시예 1

후코이단 획분의 조제

오키나와 큰실말 해초체 100g 에 증류수를 1000㎖ 첨가하고, 100℃ 에서 1 시간 추출하였다. 얻어진 추출물을 냉각 후, 흡인 여과, 전기 투석 (탈염) 하고 동결 건조시켜, 후코이단 획분을 2g 얻었다. 이 후코이단을 2N H₂SO₄ 를 함유하는 100℃ 의 수용액으로 1 시간 가수분해하고, 얻어진 수용액을 2N NaOH 를 사용하여 중화하고, ABEE 로 형광 표지화함으로써 단당 분석 샘플을 조제하였다. 그 구성 당의 조성은 SFuc (황산화푸코오스) : GlcA (글루크론산) : Fuc (푸코오스) : Xyl (자일로오스) = 49.3 : 4.9 : 12.1 : 1 인 것을 확인하였다 (도 1).

칼럼 : Cosmosil C18 AR-II (4.6㎜φ × 250㎜)

이동상 : 10％ 아세토니트릴 함유 0.2M 붕산칼륨 완충액

유속 : 1.0㎖/분

온도 : 45℃

검출 : 형광 검출기 (주식회사 시마즈 제작소), Ex : 305㎚, Em : 360㎚

실시예 2

후코이단 가수분해 생성물의 제조와 면역 기능 조절 작용의 측정

하기의 각종 조건으로 후코이단 가수분해 생성물을 얻어, 그들과 유산균의 조합을 사용하여 면역 기능 조절 작용을 검토하였다.

가수분해의 산 농도가 면역 기능 조절 활성에 미치는 영향

실시예 1 에서 얻어진 후코이단을 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0N 의 HCl (80℃) 로 1 시간 가수분해하고, 그 후 각각에 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0N 의 NaOH 를 첨가함으로써 중화한 후, 전기 투석에 의한 탈염, 동결 건조를 거쳐, 후코이단 가수분해 생성물을 얻었다. 이것을 100㎍/㎖ 의 농도로 C57BL/6 마우스 (생후 8 주, 수컷, 니혼 찰스리버 주식회사) 로부터 분리한 비장 세포 (5 × 10⁶cells/㎖) 에 첨가하였다. 30 분 후에 0.1㎍/㎖ 의 유산균 (Lactobacillus pentosus ; FERM BP-10028) 을 첨가하고, 24 시간 배양하고, 배양상청을 회수하고, IFN-γ 의 생산량을 ELISA 키트 (OptEIA, BD Pharmingen) 를 사용하여 측정하였다 (도 2a). 또, 후코이단 가수분해 생성물 단독의 효과도 검토하기 위하여, 유산균을 사용하지 않고 상기와 동일한 조작도 실시하였다 (흰 막대 그래프). 비교 대조로서, 아무것도 첨가하지 않은 것 (흰 막대 그래프 중의 "none"), 유산균만을 첨가한 것 (검은 막대 그래프 중의 "none") 을 사용하였다. 그 결과, 가수분해하여 얻은 생성물을 유산균과 병용하면, 그들 단독으로 얻어지는 결과와 비교하여 IFN-γ 생산이 상승적으로 증강되었다. 이 상승적 효과는, 0.5 ∼ 4.0N 의 HCl 로 가수분해하여 얻어진 생성물에 있어서 관찰되었다.

또, 가수분해 전의 후코이단만을 사용하여 상기 실험을 실시하고, 기타 샘플과 효과를 비교하였다 (도 2b). 그 결과, 0.5 ∼ 4.0N 의 HCl 로 가수분해하여 얻은 가수분해 생성물 (도 2b, 흰 막대 그래프) 은 가수분해 전의 후코이단 (도 2b "후코이단") 과 동일 정도의 활성밖에 나타내지 않지만, 유산균을 첨가함으로써 (도 2b, 검은 막대 그래프), 후코이단에서 얻어진 것 이상의 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.

반응 온도가 미치는 영향

후코이단을 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100℃ 의 1N 의 HCl 로 1 시간 가수분해하고, 그 후 1N 의 NaOH 를 첨가함으로써 중화한 후, 전기 투석에 의한 탈염, 동결 건조를 거쳐, 후코이단 가수분해 생성물을 얻었다. 이것을 100㎍/㎖ 의 농도로 C57BL/6 마우스 (생후 8 주, 수컷, 니혼 찰스리버 주식회사) 로부터 분리한 비장 세포 (5 × 10⁶cells/㎖) 에 첨가하였다. 30 분 후 0.1㎍/㎖ 의 유산균 (Lactobacillus pentosus ; FERM BP-10028) 을 첨가하고, 24 시간 배양하고, 배양상청을 회수하고, IFN-γ 의 생산량을 ELISA 키트 (OptEIA, BD Pharmingen) 를 사용하여 측정하였다 (도 3a). 또, 후코이단 가수분해 생성물 단독의 효과도 검토하기 위하여, 유산균을 사용하지 않고 상기와 동일한 조작도 실시하였다 (흰 막대 그래프). 비교 대조로서, 아무것도 첨가하지 않은 것 (흰 막대 그래프의 none), 유산균만을 첨가한 것 (검은 막대 그래프의 none) 을 사용하였다. 그 결과, HCl 로 가수분해하여 얻은 후코이단 가수분해 생성물을 유산균과 병용함으로 써, 그들 단독으로 얻어지는 결과와 비교하여 상승적으로 증강된 IFN-γ 생산이 관찰되었다. 이 상승적 효과는, 25 ∼ 100℃ 에서 가수분해하여 얻어진 모든 생성물에 있어서 관찰되었는데, 특히, 30 ∼ 90℃ (바람직하게는 50 ∼ 80℃) 에서 가수분해한 경우가 우수했다.

또, 가수분해 전의 후코이단만을 사용하여 상기의 실험을 실시하고, 그 효과를 본원 발명과 비교하였다. 그 결과, 50 ∼ 100℃ 의 HCl 로 가수분해하여 얻은 생성물은, 유산균과 조합하여 사용하면, 가수분해 전의 후코이단과 동일 정도 이상의 활성을 나타내는 것이 분명해졌다 (도 3b).

반응 시간이 미치는 영향

후코이단을 1N 의 HCl (80℃) 로 30, 60, 120 분간 가수분해하고, 그 후 1N 의 NaOH 를 첨가함으로써 중화한 후, 전기 투석에 의한 탈염, 동결 건조를 거쳐, 후코이단 가수분해 생성물을 얻었다. 이것을 100㎍/㎖ 의 농도로 C57BL/6 마우스 (생후 8 주, 수컷, 니혼 찰스리버 주식회사) 로부터 분리한 비장 세포 (5 × 10⁶cells/㎖) 에 첨가하였다. 30 분후 0.1㎍/㎖ 의 유산균 (Lactobacillus pentosus ; FERM BP-10028) 을 첨가하고, 24 시간 배양하고, 배양상청을 회수하고, IFN-γ 의 생산량을 ELISA 키트 (OptEIA, BD Pharmingen) 를 사용하여 측정하였다 (도 4). 또, 후코이단 가수분해 생성물 단독의 효과도 검토하기 위하여, 유산균을 사용하지 않고 상기와 동일한 조작도 실시하였다. 또한, 비교 대조로서, 아무것도 첨가하지 않은 것, 유산균만을 첨가한 것을 사용하였다. 그 결과, 30 ∼ 120 분간 가수분해하여 얻어진 모든 생성물은, 유산균과 병용함으로써, 그들 단독으로 얻어지는 결과와 비교하여 IFN-γ 생산이 상승적으로 증강되었다.

따라서, 후코이단 가수분해 생성물은, 유산균과 조합하여 사용함으로써, 상승적으로 증강된 면역 기능 조절 또는 면역 부활 작용을 갖는 것이 분명해졌다.

실시예 3

정제한 후코이단 가수분해 생성물의 면역 기능 조절 작용

후코이단 1g 에 2N HCl 을 100㎖ 첨가하여 80℃ 에서 1 시간 산 가수분해를 실시하고, 이어서 1N NaOH 로 중화하였다. 얻어진 반응액을 겔 여과 (바이오 겔 P-6 (Bio-Rad)) 에 제공하여 탈염하고, 동결 건조를 실시함으로써 후코이단 올리고당 혼합물을 함유하는 획분을 얻었다 (올리고당 획분). 얻어진 후코이단 올리고당 혼합물은, 포름산으로 활성화한 음이온 교환 수지 (토소 주식회사) 를 사용하는 크로마토그래피에 제공하였다. 그 결과, 올리고당 획분은, 물로 용출함으로써 얻어진 황산기를 함유하지 않는 올리고당을 함유하는 획분 (Fr.B) 과, 2N HCl 로 용출함으로써 얻어진 황산기를 많이 함유하는 올리고당을 함유하는 획분 (황산화당 획분) 으로 분리되었다. 황산화당 획분을 겔 여과 (바이오 겔 P-6) 에 제공하고, 분자량 500 미만의 Fr.A 와 500 이상의 Fr.C 로 나누었다. 이상과 같이 정제를 실시한 후코이단 가수분해 생성물의 각 획분을 각각 100㎍/㎖ 의 농도로, C57BL/6 마우스 (생후 8 주, 수컷, 니혼 찰스리버 주식회사) 로부터 분리한 비장 세포 (5 × 10⁶cells/㎖) 에 첨가하였다. 30 분 후 0.1㎍/㎖ 의 유산균 (Lactobacillus pentosus ; FERM BP-10028) 을 첨가하고, 24 시간 배양하고, 배양상청을 회수하고, IFN-γ 의 생산량을 ELISA 키트 (OptEIA, BD Pharmingen) 를 사용하여 측정하였다 (표 1). 그 결과, 후코이단에 관해서는, 농도가 낮을 때에 활성을 나타냈으나, 그 농도를 높게 하면 활성이 소실되었다. 한편, 가수분해 생성물 (올리고당 각분, Fr.A ∼ C, 황산화당 각분) 전부에 있어서, 농도 의존적으로 면역 부활능이 높아지고, 또한 후코이단의 활성보다 강하였다. 특히, 올리고당을 정제함으로써 활성이 강해지는 것도 알 수 있었다. 비교 대조로서 사용한 단당 (푸코오스, 황산화푸코오스) 이나 프리바이오틱스로서 널리 사용되고 있는 자일로올리고당에도 이와 같은 작용이 없었다.

[표 1]

실시예 4

후코이단 올리고당의 제조

a) 후코이단의 가수분해 및 올리고당 혼합물의 분리

실시예 1 에서 얻어진 후코이단 획분 1g 에 2N HCl 을 100㎖ 첨가하여 50 ∼ 100℃ 에서 1 시간 산 가수분해를 실시하고, 이어서 1N NaOH 로 중화하였다. 얻어진 반응액을 겔 여과 (바이오 겔 P-6 (Bio-Rad)) 에 제공하여 탈염하고, 동결 건조를 실시함으로써 후코이단 올리고당 혼합물을 895㎎ 얻었다. 얻어진 후코이단 올리고당 혼합물은, 포름산으로 활성화한 음이온 교환 수지 (토소 주식회사) 를 사용하는 크로마토그래피에 제공하였다. 결과적으로, 올리고당 혼합물은, 물로 용출함으로써 얻어진 황산기를 함유하지 않는 올리고당을 함유하는 획분 (중성·산성 당 획분) 280㎎ 과, 2N HCl 로 용출함으로써 얻어진 황산기를 많이 함유하는 올리고당을 함유하는 획분 (황산화당 획분) 425㎎ 으로 분리되었다.

b) 화합물 (I) 및 ( II ) 의 단리

a) 에서 얻어진 중성·산성 당 획분 100㎎ 을 겔 여과 (바이오 겔 P-4 (Bio-Rad), 용출 용매 : 0.2M 붕산칼륨 (K₂B₄O₇) 수용액) 에 제공함으로써, 당해 획분으로부터 분자량 340 의 2 당과 분자량 486 의 3 당이 분리되었다 (화합물 I, II : 도 5, 6). 이들 분자량은, FAB-MS 에 의해 구하였다 (화합물 (I) [M-H]^- : 339.2, 화합물 (II) [M-H]^- : 485.0). 이들 화합물 5㎎ 에, 물 1㎖, ABEE (4-아미노벤조산에틸) 1.6g, NaBH₃CN (수소화시아노붕소나트륨) 350㎎, 메탄올 3.5㎖, 아 세트산 410㎕ 를 첨가하고, 65℃, 4 시간 교반하였다. 반응액을 클로로포름과 물로 분배함으로써 형광 표지화된 상기 2 당 및 3 당을 약 7 ∼ 9㎎ 취득하였다. 이들 표지화 올리고당에 대하여 측정한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 의 차트를 도 7 ∼ 10 에 나타내고, 그들을 해석한 결과를 표 2, 3 에 나타냈다. 이들 결과로부터, 얻어진 분자량 340 의 2 당은 식 (I) 로 표시되는 α-D-GlcA-(1→2)-L-Fuc 이고, 분자량 486 의 3 당은 식 (II) 로 표시되는 α-D-GlcA-(1→2)-α-L-Fuc-(1→3)-L-Fuc 인 것을 알 수 있었다.

[표 2]

형광 표지한 화합물 (I) 에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 해석 결과

[표 3]

형광 표지한 화합물 (II) 에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 해석 결과

c) 화합물 ( III ) ∼ ( XI ) 의 제조

다음으로, 황산화당 획분을 겔 여과 (바이오 겔 P-6 (Bio-Rad)) 에 제공함으로써 탈염하였다. 얻어진 황산화당 획분 100㎎ 에, 물 1㎖, ABEE (4-아미노벤조산에틸) 1.6g, NaBH₃CN (수소화시아노붕소나트륨) 350㎎, 메탄올 3.5㎖, 아세트산 410㎕ 를 첨가하고, 65℃, 4 시간 교반하였다. 얻어진 생성물을 진공에서 건조시키고, 물과 클로로포름에 분배하고, 수층을 역상 칼럼으로 (담체 : Lichroprep RP-8 (25-40㎛) (Merck), φ10 × 220㎜ ; 용매 조건 : 5％ CH₃CN/0.1％ TFA (100 ㎖), 8％ CH₃CN/0.1％ TFA (100㎖), 15％ CH₃CN/0.1％ TFA (100㎖), 20％ CH₃CN/0.1％ TFA (100㎖)) 처리함으로써 형광 표지화된 올리고당의 혼합물을 얻었다. 얻어진 형광 표지 화합물을 HPLC (칼럼 : cosmosil 5C18-AR-II, φ10.0 × 250㎜ ; 용매 조건 : 12.5％ CH₃CN/0.1％ TFA (5 분), 12.5-27.5％ CH₃CN/0.1％ TFA (50 분) ; 유속 : 3㎖/분) 로 아세토니트릴 : 0.1％ TFA 수용액을 5 ∼ 30％ 의 농도 구배로 용출하여, 분자량이 539, 715, 861, 903, 957, 999 이고 황산기를 갖는 6 개의 표지화 후코이단 올리고당을 혼합물로부터 분리하였다 (분자량은, ESI-MS 에 의해 결정하였다). 얻어진 표지화 올리고당에 대하여 NMR 스펙트럼을 측정하고, 그 결과를 해석하였다. 표지화 올리고당의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 의 차트를 도 11 ∼ 22 에 나타내고, 그들을 해석한 결과를 표 4 ∼ 7 에 나타낸다. 이들 결과로부터, 분자량 539, 715, 861, 903, 957, 999 의 화합물은, 각각 화합물 (III), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX) 의 표지체인 것이 분명해졌다.

확인을 위하여, 각 올리고당 상에 결합되어 있던 ABEE 를 제거하고, 재생된 올리고당의 순품을 얻었다. 즉, 이들 분리된 각 표지화 올리고당 10㎎ (100㎕) 에, 과산화수소, 아세트산을 각 10㎕ 첨가하여 하룻동안 방치한 후, 건고 (乾固) 시켰다. 이렇게 하여 얻어진 재생 올리고당 중, 분자량 903 의 화합물로부터 얻어진 것을 ¹H-NMR (도 23), TOF-MS (장치 Voyager DE-STR (Applied Biosystems), Ion mode : negative, Mode of operation : reflector, Accelerating voltage : 20kV, Matrix : 2,5-dihydroxybenzoic acid) (도 24), ESI-MS/MS (도 25) 로 해석하였는데, 그 결과는, 확실히 식 (VII) 의 구조를 나타냈다.

또, 상기 방법으로 분리할 수 없었던 분자량 420, 858, 900 의 화합물 (각각 (IV), (X), (XI)) 에 관해서는, 반응 혼합물을 FAB-MS/MS (장치 : HX110A/HX110A (JEOL), Ion mode : MS, MS/MS (negative), Xe atom beam : 5kV, Ion source accelerating potential : 10kV, Collision energy : 2keV, Matrix : Glycerol), 및 ESI-MS-MS 로 분석함으로써 그 존재를 확인하였다. 도 26 에 (IV) 의 FAB-MS 차트를, 도 27 에 MS/MS 차트를 나타냈다. 또 도 28 에 (X) 및 (XI) 의 FAB-MS 차트를, 도 29, 30 에 각각의 MS/MS 차트를 나타냈다.

이들의 결과로부터, 분자량 390 의 2 당은 화학식 (III) 으로 표시되는 α-L-Fuc-4-O-SO₃ ^--(1→3)-L-Fuc, 분자량 420 의 2 당은 화학식 (IV) 로 표시되는 α-D-GlcA-(1→2)-L-Fuc, 분자량 566 의 3 당은 화학식 (V) 로 표시되는 α-L-Fuc-4-O-SO₃ ^--(1→3)-[α-D-GlcA-(1→2)]-L-Fuc, 분자량 712 의 4 당은 화학식 (VI) 으로 표시되는 α-L-Fuc-4-O-SO₃ ^--(1→3)-[α-D-GlcA-(1→2)]-α-L-Fuc-(1→3)-L-Fuc, 그리고 분자량 754 의 4 당은 화학식 (VII) 로 표시되는 α-L-Fuc-4-O-SO₃ ^--(1→3)-[α-D-GlcA-(1→2)]-α-L-Fuc-4-O-아세틸-(1→3)-L-Fuc, 분자량 808 의 5 당은 화학식 (VIII) 로 표시되는 [α-D-GlcA-(1→2)-α-L-Fuc-(1→3)]-[α-D-GlcA-(1→ 2)]-α-L-Fuc-(1→3)-L-Fuc, 분자량 850 의 5 당은 화학식 (IX) 로 표시되는 [α-D-GlcA-(1→2)-α-L-Fuc-(1→3)]-[α-D-GlcA-(1→2)]-4-O-아세틸-α-L-Fuc-(1→3)-L-Fuc, 분자량 858 의 5 당은 화학식 (X) 으로 표시되는 α-L-Fuc-4-O-SO₃ ^--(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-[α-D-GlcA-(1→2)]-α-L-Fuc-(1→3)-L-Fuc, 분자량 900 의 5 당은 화학식 (XI) 로 표시되는 α-L-Fuc-4-O-SO₃ ^--(1→3)-α-L-Fuc-(1→3)-[α-D-GlcA-(1→2)]-α-L-Fuc-4-O-아세틸-(1→3)-L-Fuc 인 것을 알 수 있었다.

[표 4]

형광 표지한 화합물 (III) 에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 해석 결과

[표 5]

형광 표지한 화합물 (V) 에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 해석 결과

[표 6]

형광 표지한 화합물 (VI) 에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 해석 결과

[표 7]

형광 표지한 화합물 (VII) 에 대한 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 해석 결과

실시예 5

오키나와 큰실말 해초체 100g 에 2N HCl 1000㎖ 를 넣고, 1 시간, 50 ∼ 100℃ 에서 산 가수분해를 실시하였다. 얻어진 추출물을 냉각 후, 흡인 여과, 전기 투석 (탈염) 을 실시하고 동결 건조시켜 후코이단 획분을 2g 얻었다. 얻어진 후코이단 획분을 ABEE 로 형광 표지화한 것을 ESI-MS (4000Q TRAP LC/MS/MS 시스템 (Applied Biosystems) 분석 조건 Polarity : Negative ion mode ; Declustering Potential : -50v ; Collision energy : -10eV ; Temperature : 550℃) 로 분석한 결과, 도 31 에서 나타내는 차트가 얻어지고, 식 (I) ∼ (XI) 에 나타내는 후코이단 올리고당의 존재를 확인할 수 있었다.

실시예 6

후코이단 올리고당 화합물과 유산균 의 조합에 의한 상승 효과

마우스 비장 세포에 대한 IFN -γ 유도 작용

실시예 3 과 동일하게 조제한 비장 세포 5 × 10⁶cells/㎖ 에 분자량 340 의 후코이단 올리고당 (화합물 (I)) 을 100㎍/㎖ 가 되도록 웰에 첨가하였다. 비교 대조로서 푸코오스와 황산화푸코오스 (각각 MW164, 244), 자일로올리고당 (XOS) 을 등량 사용하였다. 30 분 후에, 유산균 (Lactobacillus pentosus ; FERM BP-10028) (사균) 을 0.1㎍/㎖ 씩 각 웰에 첨가하였다. 24 시간 배양 후, 배양상청을 회수하고 IFN-γ 의 생산량을 ELISA 키트 (OptEIA, BD Pharmingen) 를 사용하여 측정하였다 (도 32a). 또, 당 단독에 의한 효과를 확인하기 위하여, 유산균을 사용하지 않고 상기와 동일한 조작을 실시하였다.

또, 화합물 (II) 에 관해서도, 화합물 (I) 과 동일하게 실험을 실시하였다. 사용된 화합물 (II) 의 양은, 웰 중, 10, 100 및 300㎍/㎖ 이었다 (도 32b).

화합물 (I) 에 관해서는, 그것을 유산균과 병용하면 현저하게 강한 IFN-γ 유도능이 얻어졌다 (도 32a). 이 작용은, 화합물 (I) 과 유산균을 각각 단독으로 사용하여 얻어진 결과 (도 32a 중, 좌측에서 2 번째 및 우측에서 5 번째) 로부 터 예측할 수 없을 정도로 강하여, 양자를 조합하여 사용함으로써 상승적 효과가 발생하는 것을 뒷받침하고 있다. 또, 화합물 (II) 에 관해서도, 동일하게 유산균과의 상승 효과가 관찰되었다 (도 32b). 구성 성분의 푸코오스나 황산화푸코오스에는 이와 같은 활성이 없고, 프리바이오틱스로서 널리 사용되고 있는 자일로올리고당에도 이와 같은 작용이 없었다. 따라서, 본 발명의 후코이단 올리고당은, 유산균과 병용함으로써 상승적으로 비장 세포를 활성화시켜, 생체의 면역 기능의 조절에 있어서 매우 유용한 것이 분명해졌다.

또, 동일하게 조제한 비장 세포에, 화합물 (I) ∼ (VII) 의 화합물을 임의로 3 종류 균등하게 혼합한 것을 50㎍/㎖ 의 농도로 첨가하고, 30 분 후에 유산균 (Lactobacillus pentosus ; FERM BP-10028) (사균) 을 0.1㎍/㎖ 씩 각 웰에 첨가하였다. 24 시간 배양 후, 배양상청을 회수하여 IFN-γ 의 생산량을 측정하였다 (도 33). 도면에 나타내는 바와 같이, (V), (VI) 및 (VII) 의 혼합물, (I), (V) 및 (VI) 의 혼합물, 및 (I), (V) 및 (VII) 의 혼합물을 사용하면, 높은 IFN-γ 생산량이 관측되었다. 따라서, 화합물 (I) ∼ (XI) 이 혼재하고 있는 경우에도 유산균과 병용함으로써 면역 기능 조절 활성이 상승하는 것을 알 수 있었다.

실시예 7

후코이단 올리고당에 의한, 마우스 유래 수상 세포에 대한 IL -10, 12 유도 작용, 및 CTL 활성 증강 작용

BALB/c 마우스 (생후 8 주, 수컷, 니혼 SLC 주식회사) 의 대퇴골로부터 골수 세포를 분리하고, 1 × 10⁶cells/㎖ 가 되도록, 10％ FBS, 20ng/㎖ GM-CSF (Peprotec), 20ng/㎖ IL-3 (Peprotec) 을 함유하는 RPMI1640 배지 중에 현탁시켜, 24웰 플레이트에서 배양하였다. 배양 개시 3, 5 일째에 배지 교환을 실시하여, 부착성의 미성숙 수상 세포를 얻었다. 얻어진 수상 세포에, 화합물 (I), (II), (III), (V), (VI), 및 (VII) 을 각각 50㎍/㎖ 의 농도로 전처리하였다. 전처리 30 분 후에, 유산균 (Lactobacillus pentosus ; FERM BP-10028) (사균) 을 0.1㎍/㎖ 씩 각 웰에 첨가하였다. 2 일간 배양 후, 배양상청과 세포를 회수하였다. 또, 당 화합물 단독에 의한 효과도 확인하기 위하여, 유산균을 첨가하지 않고 상기와 동일한 조작을 실시하였다.

회수한 배양상청은 ELISA 키트를 사용하여 IL-12 와 IL-10 을 측정하였다. 결과를 각각 도 34, 35 에 나타냈다. 화합물 (I) 은, 그것을 유산균과 병용함으로써 상승적으로 IL-12 를 유도하였다 (도 34). 또, 화합물 (II), (III) 및 (V) 는 유산균과 병용함으로써 IL-10 을 유도하는 것도 알 수 있었다 (도 35). 이들에 의해, 본 발명에서 발견된 후코이단 올리고당에는 생체의 면역 기능을 정 (正) 으로도 부 (負) 로도 조절하는 (저하된 면역을 활성화하거나, 또는 과잉 면역 반응을 억제하는) 기능이 있는 것을 알 수 있었다. 자일로올리고당에는, 이와 같은 작용은 관찰되지 않았다.

또한, 회수한 세포를 카운팅하여, 1 × 10⁵cells/㎖ 로 조제 후, 1㎖ 의 세포 현탁액 중에 마이토마이신 C (50㎍/㎖) 를 처리하고, 37℃ 에서 30 분간 반응시 켰다. 반응 종료 후, PBS 의 세정에 의해 마이토마이신 C 를 제거하고, 통상적인 방법에 따라 조제한 C57BL/6 마우스의 비장 세포 (5 × 10⁶cells/㎖) 를 1㎖ 첨가하여, 4 일간 혼합 배양하였다. 배양 후 세포를 회수하고, C57BL/6 마우스의 동종 항원을 가지는 P-815 세포 (5000cells/100㎕) 를 타겟으로 하여, E : T 비 40 : 1 및 80 : 1 의 비율로 4 시간 반응시키고, 살상된 P-815 의 수를 플로우 사이토메트리로 카운팅함으로써 CTL 활성을 구하였다 (도 36). 화합물 (I), (III), (V), (VI), (VII) 은 유산균과 병용함으로써 CTL 활성이 증강되는 것도 알 수 있었다.

실시예 7 의 결과도, 본 발명의 후코이단 가수분해 생성물을 유산균과 조합함으로써, 상승적으로 증강된 면역 기능 조절 또는 면역 부활 작용이 얻어지는 것을 나타내고 있다.

실시예 8

면역 기능 조절 활성을 거의 갖지 않는 유산균 과의 병용에 의한 IL -12 생산의 상승적 증강

BALB/c 마우스 (생후 8 주, 수컷, 니혼 SLC 주식회사) 에 4.05％ 티오글리콜레이트 배지 (Difco) 를 복강 내 투여하고, 4 일 후 10㎖ 의 PBS 를 사용하여 복강 내에 침윤시킨 세포를 회수하였다. 그 후 1 × 10⁶cells/㎖ 로 조제 후, 24 웰 플레이트에서 배양하였다. 배양 개시 3 시간 후, 배지 교환에 의해 부유 세포를 제거하고, 매크로파지를 얻었다. 각 웰에 화합물 (I) 및 실시예 3 에 기 재된 올리고당 획분을 100㎍/㎖ 의 농도로 첨가하고, 30 분 후, 면역 기능 조절 활성이 강한 유산균 (Lactobacillus pentosus DS84C 주 ; 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 2004년 5월 26일자로 수령된 FERM BP-10028), 또는 면역 기능 조절 활성을 거의 갖지 않는 유산균 (시판되고 있는 Lactobacillus pentosus (이하 유산균 A)) (시판되고 있는 Lactobacillus plantarum (이하 유산균 B)) 0.1㎍/㎖ 의 농도로 첨가하여, 24 시간 배양하였다. 그 후 배양상청을 회수하여, IL-12 의 생산량을 측정하였다 (도 37). 비교를 위하여, 이들 3 종류의 주를 각각 단독으로 사용하여 상기와 동일한 조작을 실시하였다. 유산균 A 도 유산균 B 도, 그 자체만으로는 검출할 수 있을 정도의 IL-12 유도 활성을 나타내지 않았으나, 이들 주를 화합물 (I) 이나 올리고당 획분과 병용함으로써 현저하게 증대된 IL-12 유도 활성이 얻어졌다. 따라서 본 발명에서 얻어지는 후코단 가수분해 생성물은, 면역 기능 조절 활성이 없는 유산균과 병용한 경우에도, 상승적으로 강한 면역 기능 조절 작용을 발휘하는 것이 분명해졌다.

실시예 9

유산균 이외의 물질과의 상승 효과

C57BL/6 마우스 (생후 8 주, 수컷, 니혼 찰스리버 주식회사) 로부터 비장 세포를 분리하고, 5 × 10⁶cells/㎖ 가 되도록 조제하여, 24웰 플레이트에서 배양하였다. 실시예 3 의 Fr.C 획분을 각각 30㎍/㎖ 가 되도록 각 웰에 첨가하였다. 30 분 후에, 면역 부활 작용 또는 면역 기능 조절 작용이 있는 물질로서, PolyI : C (SIGMA) 를 5㎍/㎖, LPS (SIGMA) 를 2ng/㎖, CpG-ODN (5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3' : Integrated DNA Technologies, Inc. 로부터 입수) 을 3㎍/㎖, MM46 암 항원 (MM46 유방암 세포를 HANK's 액 (나카라이 테스크) 중에서 호모게나이즈하여, 그곳에서 추출된 단백질 : 테이쿄 대학 의진균 연구 센터에 의해 제공되었다) 을 50ng protein/㎖, ConA (와코 순약) 를 0.25㎍/㎖, 각각 웰에 첨가하였다. 24 시간 배양 후, 배양상청을 회수하고 IFN-γ 의 생산량을 ELISA 키트 (OptEIA, BD Pharmingen) 를 사용하여 측정하였다 (도 38). 비교를 위하여, Fr.C 를 사용하지 않고 상기와 동일한 조작을 실시하였다. 각 면역 기능 조절 물질은 이번 실험에서 사용한 농도에 있어서 거의 IFN-γ 를 유도하지 않았다. 그러나, 그들을 Fr.C, 즉, 후코이단 가수분해 생성물 (올리고당) 과 병용함으로써 강한 IFN-γ 유도능이 얻어졌다. 따라서, 후코이단 가수분해 생성물 및 그로부터 얻어지는 올리고당은, 그것을 유산균과 병용한 경우뿐만 아니라, 기타 면역 부활 소재와 병용한 경우에도 상승적으로 그들의 면역 부활 또는 면역 기능 조절 작용이 높아지는 것이 분명해졌다.

실시예 10

NK 활성 증강 효과 ( In vivo )

C57BL/6 마우스 (생후 8 주, 수컷, 니혼 찰스리버 주식회사) 를 4 군으로 나누고 각각 후코이단 가수분해 생성물 단독 (실시예 3 에 기재된 황산화당 획분 500㎎/㎏, 도 39 의「후코이단 올리고당」), 유산균 단독 (0.2㎎/㎏), 후코이단 가수분해 생성물 + 유산균 (도 39 의「유산균 + 후코이단 올리고당」) 을 각각 음료수 중에 섞어, 자유 섭취시켰다. 컨트롤군에는 수돗물을 섭취시켰다. 섭취 개시 1 주일 후, 마우스로부터 비장 세포를 정법에 따라 분리하고, Yac-1 세포 (5000cells/100㎕) 를 타겟으로 하여 NK 활성을 측정하였다. NK 활성은 E : T 비 20 : 1, 40 : 1 의 비율로 4 시간 반응시키고, 살상된 Yac-1 의 수를 플로우 사이토메트리로 카운팅함으로써 산출하였다 (도 39). 후코이단으로부터 얻어진 후코이단 올리고당을 섭취함으로써 NK 활성이 증강되었다. 또한 후코이단 올리고당과 유산균을 병용함으로써 보다 NK 활성이 높아졌다. 따라서, 후코이단 가수분해 생성물과 유산균의 조합을 섭취함으로써 면역 기능이 활성화되는 것을 in vivo 에서도 확인할 수 있었다.

실시예 11

후코이단과 유산균 의 조합에 의한 상승 효과

마우스 비장 세포에 대한 IFN -γ 유도 작용

실시예 3 과 동일하게 조제한 비장 세포 5 × 10⁶cells/㎖ 에 후코이단 A (주식회사 사우스 프로덕트), 후코이단 B (주식회사 오키나와 발효 화학), 후코이단 C (실시예 1 에서 조제한 것) 각각을, 1, 10, 100㎍/㎖ 가 되도록 웰에 첨가하였다. 후코이단 첨가 30 분 후에 유산균 (Lactobacillus pentosus ; FERM BP-10028) (사균) 을 0.1㎍/㎖ 씩 각 웰에 첨가하였다. 24 시간 배양 후, 배양상청을 회수하고, IFN-γ 의 생산량을 ELISA 키트 (OptEIA, BD Pharmingen) 를 사용하여 측정하였다 (도 40). 또, 후코이단 단독에 의한 효과를 확인하기 위하여, 유산균을 사용하지 않고 상기와 동일한 조작을 실시하였다.

3 종의 후코이단 각각을 단독으로 사용한 경우에는, IFN-γ 유도능이 관찰되었다. 또한, 그 활성은, 그들을 유산균과 병용함으로써 예상 이상으로 강해졌다. 따라서, 후코이단은, 유산균과 병용함으로써 상승적으로 비장 세포를 활성화시켜, 생체의 면역 기능의 조절에 있어서 매우 유용한 것이 분명해졌다.

<110> Suntory limited, Tropical Technology Center limited <120> Compositions comprising fucoidan or a fucoidan hydrolysate and an immuno-stimulating material <130> YCT-1176 <150> JP 2005-222254 <151> 2005-07-29 <160> 1 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG-ODN <400> 1 tccatgacgt tcctgatgct 20

Claims

후코이단 또는 후코이단 가수분해 생성물과 면역 부활 소재를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 가수분해 생성물이, 후코이단을 0.1 ∼ 6.0N 의 산으로, 25 ∼ 100℃, 0.25 ∼ 2.5 시간 가수분해하여 얻어지는 것인 조성물.
제 2 항에 있어서,

상기 가수분해 생성물이, 후코이단을 0.5 ∼ 4.0N 의 산으로, 30 ∼ 90℃, 0.5 ∼ 2.0 시간 가수분해하여 얻어지는 것인 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 가수분해가 염산 또는 황산으로 실시되는 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 가수분해 생성물이 올리고당인 조성물.
제 5 항에 있어서,

상기 올리고당이, 푸코오스, 황산화푸코오스, 아세틸화푸코오스, 및 글루크론산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 당으로 구성되는 2 당부터 5 당까지의 올리고당인 조성물.
제 6 항에 있어서,

상기 올리고당으로서, 하기 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X) 및 (XI) 로 나타내는 화합물에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 조성물.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 면역 부활 소재가, 유산균, 효모, 진균류와 같은 미생물 ; 표고버섯, 잎새버섯, 영지, 아가리쿠스 등의 버섯류 ; CpG 모티프를 함유하는 면역원성 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG-ODN), PolyI : C 와 같은 핵산 유래 물질 ; 리포다당 (LPS), β-글루칸 ; 해조류 ; 한방약 ; MM46 암 항원과 같은 암 백신 ; 콘카나발린 A (ConA) ; BRM (생물학적 응답 수식제) 에서 선택되는 적어도 1 종인 조성물.
제 8 항에 있어서,

상기 면역 부활 소재가 유산균인 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 함유하는 면역 기능 조절제.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 첨가한 음식품.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 함유하는 의약 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 함유하는 화장품.