JP2007039341A

JP2007039341A - フコイダン由来オリゴ糖

Info

Publication number: JP2007039341A
Application number: JP2005222197A
Authority: JP
Inventors: Yuji Nonaka; 裕司野中; Takeshi Yasumoto; 健安元; Hideo Naoki; 秀夫直木; Shunei Kusumoto; 俊英楠元
Original assignee: Suntory Ltd; Tropical Technology Center Ltd
Current assignee: Suntory Ltd; Tropical Technology Center Ltd
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2005-07-29
Publication date: 2007-02-15
Also published as: WO2007013609A1; TW200745154A

Abstract

【課題】分子量が極めて大きい硫酸化多糖であるフコイダンを医薬品、健康食品として開発する際に生じる、吸収性、抗原性、均一性、抗凝血活性等に関する問題の少ない、特定された構造と機能を有する低分子フコイダン由来低分子化合物を提供する。
【解決手段】
フコイダンを酸加水分解することにより、明細書に記載した新規のフコイダンオリゴ糖（I）〜（XI）を見出した。これらオリゴ糖にはＩＦＮ−γ誘導能、ＩＬ−１０、１２誘導能、樹状細胞成熟化作用、ＣＴＬ活性誘導作用等のさまざまな免疫機能調節作用があることが見出された。
【選択図】なし

Description

産業上の利用分野

本発明は免疫力の増強、免疫機能の調節などを目的とした飲食品、健康食品、機能性食品、医薬品、化粧品等に利用可能な新規化合物およびそれを含む組成物に関する。

発明の背景

フコイダンは藻類に含まれる硫酸化多糖であり、抗血液凝固作用、脂血清澄作用（血液中のコレステロールや過酸化脂質を除去する作用）、抗腫瘍作用、癌転移抑制作用、抗エイズウイルス感染作用等の様々な活性を有することが報告されている。中でも、生体の免疫機能を正常化する作用が注目されており、免疫機能調節作用を有する飲食品や医薬品の素材として有用であると考えられている。

一方、フコイダンの構造は、由来となる藻類やその生育環境などにより異なることが知られている。その理由の一つは、フコイダンの構成成分であるフコース、ガラクトース、キシロース、グルクロン酸等の組成が、藻類やその生育環境によって変動するためである。また、それら構成糖上のエステル結合およびグルコシド結合の位置が変動し得ることも、フコイダン構造の多様性に寄与している。そのため、未だに多くのフコイダンの構造が特定されていない。

これらの理由により、フコイダンを利用して飲食品や医薬品などを開発する場合には、それらに適切なフコイダンを選定するのに多大な時間を要することが多かった。また、消費者にとっても、どのフコイダンを選べばよいのか明確ではなかった。さらに、フコイダンは分子量が極めて大きい硫酸化多糖であり、このためそのまま飲食品や医薬品として用いる際には、吸収性、抗原性、均一性、抗凝血活性等に関する問題がある。

これらの問題を解決するために、特定された構造と機能を有する低分子のフコイダン由来オリゴ糖が望まれる。
これまでに、化学合成によるフコース含有オリゴ糖が報告されているが（非特許文献１、２および３）、これらは有機合成反応により調製されているため食品などに使用するのは好ましくなかった。

一方、フコイダンを加水分解してフコイダンを低分子化する方法も報告されている。例えば、特許文献１には、フコイダンを酸加水分解する方法が開示されており、得られた低分子フコイダンは、５×１０^３以下の分子量分布を有していたことが記載されている。また、特許文献２には、酸を外部から添加することなくフコイダンを加水分解してオリゴ糖を得る方法が記載されている。また、特許文献３のように酵素によりフコイダンを加水分解する方法も報告されている。

また、フコイダンの加水分解により得られ、構造が決定されたオリゴ糖がいくつか報告されている。例えば、特許文献４においては、モズク等の藻類から得たフコイダンを酸加水分解してオリゴ糖を製造したことが報告されており、数種の低分子フコイダン由来オリゴ糖の構造が特定されている。また、特許文献５および６においては、フコイダンを酵素的に加水分解して得たオリゴ糖の構造が開示されている。
特開平７−２１５９９０特開２００２−２２６４９６特開２０００−２３６８８９特開２０００−３５１７９０特開２００３−１９９５９６特開２００１−２２６４０８ Carbohydrate research 4, 189-195 (1967) Carbohydrate research 37, 75-79 (1974) Carbohydrate research 41, 308-312 (1975)

しかしながら、特許文献１〜３に記載の方法で得られた物質は構造が特定されていない。したがって、これら構造不明のオリゴ糖を食品に使用する際には、品質の管理が容易ではないという問題がある。

また、特許文献４に記載のオリゴ糖は、食品などに利用した場合の機能が明らかにされておらず安全性が高いとは言い難い。さらに、特許文献５に記載のオリゴ糖には分子量が大きいという問題が、特許文献６に記載の製法にはその操作が煩雑であるという問題もある。

そこで、様々な用途に用いることができる素材として、上記のように、特定された構造を有し、簡便かつ正確に品質管理できるフコイダン由来オリゴ糖を開発することが望まれている。また、飲食品や医薬品における用途を考慮すると、低分子で扱いやすくまた簡便に製造できるものであること、さらには安全性が高いものであることが必要とされる。

そこで、本発明の目的は、構造が特定された新規なフコイダン由来オリゴ糖を提供することである。
また、本発明の別の目的は、安全性が高く、生体の免疫機能を正常化するのに寄与するフコイダン由来オリゴ糖を提供することである。なお、ここでいう免疫機能の正常化とは、例えばキシロオリゴ糖のように腸内細菌叢を改善して間接的に免疫機能を整えるものではなく、いくつかのフコイダンで示されているように直接的に免疫担当細胞を活性化するものを指す。

本発明のさらなる目的は、効果量を的確に飲食品、医薬組成物等に添加することができるフコイダン由来オリゴ糖を提供することである。
本発明のさらなる目的は、煩雑な工程を必要とせずに当該オリゴ糖を提供することでもある。

本発明者は、フコイダンから新規オリゴ糖を製造し、それらの免疫賦活活性を確認することにより、本発明の完成に至った。本発明においては、これらオリゴ糖をフコイダンオリゴ糖とも称する。

すなわち本発明は、
（１）下記構造式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）、または（XI）で表されるフコイダンオリゴ糖；

（２）式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含む免疫機能調節剤；
（３）式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を添加した飲食品；
（４）式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含有し、免疫機能調節作用を有する旨の表示を付した飲食品；
（５）式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含む医薬組成物；および
（６）式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含む化粧品
に関する。

発明の実施の形態

フコイダン
フコイダンとは藻類由来の硫酸化多糖の総称であり、主な構成糖であるフコースに加えて、ガラクトース、グルクロン酸、キシロース等を含有する。構成糖の種類や量は、フコイダンの由来となる藻類やその生育環境により異なる。
本発明のフコイダンオリゴ糖のための原料として用いられるフコイダンは、どのような構造のものでもよく、またいずれの藻類から取得してもよい。藻類の例には、クロガシラ目（Sphacelariales）、ナガマツモ目（Chordariales）、カヤモノリ目（Scytosiphonales）、ウイキョウモ目（Dictyosiphonales）、ムチモ目（Cutleriales）、ケヤリモ目（Sporochnales）、アミジグサ目（Dictyotales）、コンブ目（Laminariales）、ヒバマタ目（Fucales）を含む褐藻綱Phaeophyceaeの海藻が含まれる。好ましくはモズク、より好ましくは沖縄モズク由来のフコイダンを用いる。
フコイダンの抽出方法
フコイダンを藻類から抽出する方法は種々検討されており、広く知られている（例えば、特開平１０−２４５３３４に記載されているような水を用いる方法、特開平１０−１９５１０６に記載されているような酸を用いる方法、特開２００２−２６２７８８に記載されているようなアルカリ水性溶媒を用いる方法等である）。本発明オリゴ糖の原料として用いるフコイダンはこれら公知の方法により取得することができる。本発明においては、例えば、以下の方法により取得したものを用いる。

即ち、藻類（例えば沖縄モズク）に蒸留水５〜１０倍量を加え、５０〜１００℃で０〜５時間、好ましくは８０〜１００℃で０．５〜２時間、さらに好ましくは９０〜１００℃で約１時間抽出する。このようにして得られた藻類抽出物を冷却、吸引濾過、脱塩および乾燥することにより、容易に水に溶解するフコイダン画分を得ることができる。このようにして得られたフコイダン画分は、さらに精製することなく次の工程に用いてもよいし、更に精製してから用いてもよい。

フコイダンは、好ましくは上記のように藻類から抽出したものを用いるが、藻類に含まれた状態で用いてもよい。フコイダンまたはそれを含む藻類を次の加水分解工程に付すことによって本発明による化合物が得られる。

フコイダンオリゴ糖混合物の製造方法
本発明のフコイダンオリゴ糖を製造するには、先ず、特許文献１〜３に記載されているように、フコイダンを酸や酵素を用いる方法により加水分解することにより、フコイダンオリゴ糖の混合物を得る。好ましくは、以下の様な酸加水分解条件を用いる。

即ち、上記のようにして藻類から得られたフコイダンを含む画分またはフコイダンを、酸、好ましくは塩酸を用い分解する。より具体的には、０．１〜５．０Ｎ、好ましくは０．５〜４.０Ｎ、さらに好ましくは０.５〜３.０ＮのＨＣｌを含む、２５〜１００℃、好ましくは３０〜９５℃、さらに好ましくは５０〜９０℃の水性溶媒中で、０.１〜３時間、好ましくは０.２５〜２.５時間、さらに好ましくは０.５〜２時間加水分解を行なう。得られた反応物を塩基、例えば約１ＮのＮａＯＨで中和した後、電気透析もしくはゲル濾過糖の適切な手段で脱塩し、乾燥（例えば、凍結乾燥）することにより、フコイダンオリゴ糖混合物を得ることができる。

オリゴ糖の精製
このようにして得られる混合物からフコイダンオリゴ糖をさらに精製するためには、クロマトグラフィー、再結晶、透析、アルコール沈殿等の方法を単独で、または組み合わせて用いることができる。例えば、以下の操作に従ってオリゴ糖を精製する。

先ず、フコイダンの加水分解により得られたオリゴ糖混合物を陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、吸着されずに通過する、硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（中性・酸性糖画分）と、酸性溶出液により溶出する、硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）とを分離する。

中性・酸性糖画分をさらにゲル濾過に付すことにより、式（I）で表される二糖と式（II）で表される三糖を得ることができる。
一方、硫酸化糖画分をクロマトグラフィーに付すことにより、硫酸化オリゴ糖（III）〜（XI）の各成分を単離することができる。

各オリゴ糖は、精製、構造解析をより容易にするために適宜標識化または誘導体化してもよい。例えば、オリゴ糖は、４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）のような試薬で蛍光標識化することができ、これによりオリゴ糖の検出が容易となる。標識化された各オリゴ糖を分離した後にその標識化部分を除去することにより、純粋なオリゴ糖を取得することができる。

こうして得られるフコイダンオリゴ糖は、例えば飲食品、医薬品、化粧品等に用いて、これらに免疫機能調節作用を付与することができる。
免疫機能調節剤
本明細書における免疫機能調節作用とは、生体において低下している免疫反応を高める、および／または亢進している免疫反応を抑制する作用のことをいう。従って、その作用には、免疫賦活作用および免疫抑制作用が含まれる。

本明細書における免疫機能調節作用は、当該技術分野で知られている方法で測定することができる。それは、例えば、免疫機能調節作用を有するサイトカインを誘導する作用を指標として測定することができる。この目的に用いられるサイトカインには、インターフェロン−γ、インターロイキン−１０、１２等が含まれる。また、免疫機能調節作用は、免疫応答に関与する樹状細胞の成熟化や、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性を指標として測定することもできる。

本発明の免疫機能調節剤は健康増進のために用いることができるが、腫瘍、癌の転移、ウイルス性疾患（例えば、カゼ、エイズ、ウイルス性肝炎）、アレルギー性疾患（例えば、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー、喘息）、自己免疫疾患（例えば、リウマチ様関節炎）、炎症性疾患、糖尿病のような疾患または状態に有効であることも知られている。

フコイダンオリゴ糖を含む食品添加物および飲食品、並びにそれを添加した飲食品
本発明のフコイダンオリゴ糖を飲食品に用いる場合には、それを含み免疫機能調節作用を有する食品添加物および飲食品として、並びにそれを添加した免疫機能調節作用を有する健康食品として実施することが好適である。それらは、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合してユーザーの嗜好に合う製品とすればよい。飲食品は、例えば、錠剤、カプセル剤、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤、ヨーグルトや乳酸菌飲料等の乳製品、調味料、加工食品、デザート類、菓子（例えば、ガム、キャンディ、ゼリー）等の形態で提供することが可能である。本発明の飲食品には、免疫機能調節作用を有する旨の表示を容器や説明書に付した機能性食品（特定保健用食品や条件付き特定保健用食品が含まれる）も含まれる。表示場所は容器またはそれに添付した指示書などが挙げられるが、これらに限られない。容器には、瓶、缶、ペットボトル、プラスチックボトル、紙パック等が含まれるが、それらに限定されない。また、表示の方法には、印刷、刻印、シール等が含まれるが、それらに限定されない。また、飲食品は、ペットの餌として加工したペットフード等や動物飼料等でもよい。

フコイダンオリゴ糖を含む医薬組成物
本発明のフコイダンオリゴ糖は、例えば、免疫機能調節剤、免疫賦活剤、抗アレルギー剤および免疫抑制剤として用いることができる。したがって、１つの態様において、本発明はフコイダンオリゴ糖を含む、免疫機能調節作用、免疫賦活作用、抗アレルギー作用および／または免疫抑制作用を有する医薬組成物である。

医薬組成物は、主薬に希釈剤、担体、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、座剤、クリーム剤、軟膏剤、エマルション、ハップ剤、注射剤等を挙げることができ、特に限定されるものではない。本医薬品の投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経腸投与等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

フコイダンオリゴ糖を含む化粧品
本発明のフコイダンオリゴ糖を用いることにより、免疫機能調節作用を有する化粧品を製造することができる。

本発明オリゴ糖が添加または配合される化粧品は、例えば、顔用、皮膚用、頭髪用のクリーム、ローション、ゲル、ムース、シャンプー、リンス等である。
他の成分との併用
本発明のフコイダンオリゴ糖は、飲食品、医薬組成物、および化粧品において、それ自体単独で使用してもよいが、他の免疫機能調節作用または免疫賦活作用を有する食品素材または物質と併用することも好適である。そのような食品素材または物質としては、乳酸菌、キノコ類、フコイダン等が挙げられる。

フコイダンオリゴ糖と乳酸菌の組み合わせ
本発明のフコイダンオリゴ糖は、特に、乳酸菌と組み合わせることにより、それらの免疫機能調節作用が相乗的に増強される。したがって、本発明には、フコイダンオリゴ糖を乳酸菌と組み合わせて添加した、またはそれらを含む、飲食品、医薬組成物、および化粧品も含まれる。これら飲食品、医薬組成物、および化粧品は、フコイダンオリゴ糖または乳酸菌を単独で用いた場合と比較して相乗的に増強された免疫機能調節作用を有することを特徴とする。この目的に用いられる乳酸菌には、Lactobacillus属が含まれる。好ましくは、乳酸菌は Lactobacillus plantarumまたはLactobacillus pentosus である。用いられるフコイダンオリゴ糖の乳酸菌に対する好ましい比率は、重量で１：１〜１００００：１、より好ましくは２５０：１〜１０００：１である。また、本発明には、フコイダンオリゴ糖と乳酸菌とを組み合わせて用いることによりそれらの免疫機能調節作用を相乗的に増強する方法も含まれる。

本発明の飲食品、組成物には、これら活性成分以外に、具体的な態様に応じて、一般的な成分、例えば、担体、希釈剤、賦形剤または添加剤等の成分を配合することができる。ここで担体、希釈剤または賦形剤としては、フコイダンオリゴ糖の生理活性を妨げないものであれば特に制限されず、例えばシュクロース、グルコース、果糖、マルトース、トレハロース、乳糖、澱粉、水飴、異性化液糖などの糖類、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール類、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、ラクチトール、キシリトール、マルチトール、還元パラチノース、還元澱粉分解物等の糖アルコール類、トリアセチン等の溶剤、アラビアガム、カラギナン、キサンタンガム、グァーガム、ジェランガム、ペクチン等の多糖類、または水を挙げることができる。また添加剤としては、キレート剤等の助剤、香料、香辛料抽出物、防腐剤などを挙げることができる。担体、添加剤等を本発明の効果を損なわない限り配合することができる。

飲食品、医薬組成物および化粧品におけるオリゴ糖の配合量は、選択する他の配合成分との関係等により適宜選択されるものであり、特に限定されるものではない。しかしながら、通常、フコイダンオリゴ糖は、飲料または食品中、医薬組成物中に添加する場合、個体の体重６０ｋｇに対して０．０１ｇ〜１０ｇ／日、好ましくは０．０５ｇ〜１ｇ／日、特に好ましくは０．０５ｇ〜０.５ｇ／日である。化粧品中には、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５から１５重量％用いられる。

本発明のオリゴ糖は、抽出精製品や合成製品を単独で飲食品、医薬組成物、および化粧品に用いることもできるが、本発明オリゴ糖の１つ以上を含む混合物の形態で飲食品等に添加することもできる。

なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
［発明の効果］
本発明の新規フコイダンオリゴ糖は、免疫機能調節作用を有する。また、本発明のフコイダンオリゴ糖は、食品素材から分離されたものであるため穏やかな作用を有し、極めて安全性が高い。従って、本発明のオリゴ糖は非常に有用であり、その応用範囲は健康食品のみならず、医薬品および化粧品にも適用可能である。

即ち、本発明のオリゴ糖を添加することにより、生体の免疫機能を正常化するのに寄与する飲食品、医薬組成物、または化粧品を提供することができる。
また、本発明により、煩雑でない方法で本発明のフコイダンオリゴ糖を提供することができる。
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。

以下の実施例においては、特に明記しない限り、ＥＣＡ−６００型核磁気共鳴装置（日本電子株式会社）を用いてＮＭＲ分析を行なった。測定溶媒として重水（Ｄ_２Ｏ）を用いた。構成糖の結合様式は、２Ｄ-ＮＭＲを用いて行なった。

ａ）フコイダン画分の調製
沖縄モズク藻体１００ｇに蒸留水を１０００ｍｌ加え、１００℃で１時間抽出した。得られた抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析（脱塩）をして凍結乾燥し、フコイダン画分を２ｇ得た。このフコイダンを２ＮＨ₂ＳＯ₄を含む１００℃の水溶液で１時間加水分解し、得られた水溶液を２ＮＮａＯＨを用いて中和し、ＡＢＥＥで蛍光標識化することで単糖分析サンプルを調製した。その構成糖の組成はＳＦｕｃ（硫酸化フコース）：ＧｌｃＡ：Ｆｕｃ：Ｘｙｌ＝４９．３：４．９：１２．１：１であることを確認した（図１）。
カラム：ＣｏｓｍｏｓｉｌＣ１８ＡＲ−II（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ）
移動相：１０％アセトニトリル含有０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液
流速：１．０ｍｌ／分
温度：４５℃
検出：蛍光検出器（株式会社島津製作所）、Ｅｘ：３０５ｎｍ、Ｅｍ：３６０ｎｍ
ｂ）フコイダンの加水分解およびオリゴ糖の分離
得られたフコイダン画分１ｇに２ＮＨＣｌを１００ｍｌ加えて５０〜１００℃で１時間酸加水分解を行ない、次いで１ＮＮａＯＨで中和した。得られた反応液をゲル濾過（バイオゲルＰ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に付して脱塩し、凍結乾燥を行なうことによりフコイダンオリゴ糖混合物を８９５ｍｇ得た。得られたフコイダンオリゴ糖混合物は、蟻酸で活性化した陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社）を用いるクロマトグラフィーに付した。結果として、オリゴ糖混合物は、水で溶出することで得られた硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（中性・酸性糖画分）２８０ｍｇと、２ＮＨＣｌで溶出することで得られた硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）４２５ｍｇに分離された。

ｃ）化合物（I）および（II）の単離
ｂ）で得られた中性・酸性糖画分１００ｍｇをゲル濾過（バイオゲルＰ−４（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、溶出溶媒：０．２Ｍホウ酸カリウム（Ｋ_２Ｂ_４Ｏ_７）水溶液）に付すことにより、当該画分から分子量３４０の二糖と分子量４８６の三糖が分離された(化合物 I、II)。これらの分子量は、ＦＡＢ−ＭＳにより求めた(図２、３；化合物（I）［Ｍ−Ｈ］⁻：３３９．２、化合物（I）［Ｍ−Ｈ］⁻：４８５．０)。これらの化合物５ｍｇに、水１ｍｌ、ＡＢＥＥ（４−アミノ安息香酸エチル）１.６ｇ、ＮａＢＨ_３ＣＮ（水素化シアノほう素ナトリウム）３５０ｍｇ、メタノール３.５ｍｌ、酢酸４１０μｌを加え、６５℃、４時間撹拌した。反応液をクロロホルムと水で分配することにより蛍光標識化された上記二糖および三糖を約７〜９ｍｇ取得した。これら標識化オリゴ糖について測定した^１Ｈ−ＮＭＲおよび^１３Ｃ−ＮＭＲのチャートを図４〜７に示し、それらを解析した結果を表１、２に示した。これらの結果より、得られた分子量３４０の二糖は式（I）で表されるα−Ｄ−ＧｌｃＡ−(１→２)−Ｌ−Ｆｕｃであり、分子量４８６の三糖は式（II）で表されるα−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃであることが分かった。

ｄ）化合物（III）〜（XI）の製造
次に、硫酸化糖画分をゲル濾過（バイオゲルＰ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に付すことにより脱塩した。得られた硫酸化糖画分１００ｍｇに、水１ｍｌ、ＡＢＥＥ（４−アミノ安息香酸エチル）１．６ｇ、ＮａＢＨ_３ＣＮ（水素化シアノほう素ナトリウム）３５０ｍｇ、メタノール３．５ｍｌ、酢酸４１０μｌを加え、６５℃、４時間撹拌した。得られた生成物を真空で乾燥させ、水とクロロホルムに分配し、水層を逆相カラムで（担体：ＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐＲＰ−８（２５−４０μｍ）（Ｍｅｒｃｋ）、φ１０×２２０ｍｍ；溶媒条件：５％ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ）、８％ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ）、１５％ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ）、２０％ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ））処理することにより蛍光標識化されたオリゴ糖の混合物を得た。得られた蛍光標識化合物をＨＰＬＣ（カラム：ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲ−II、φ１０．０×２５０ｍｍ；溶媒条件：１２．５％ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（５分）、１２．５−２７．５％ＣＨ_３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（５０分）；流速：３ｍｌ／分）でアセトニトリル：０．１％ＴＦＡ水溶液を５〜３０％の濃度勾配で溶出して、分子量が５３９、７１５、８６１、９０３、９５７、９９９であり硫酸基を有する６つの標識化フコイダンオリゴ糖を混合物から分離した（分子量は、ＥＳＩ−ＭＳにより決定した）。得られた標識化オリゴ糖についてＮＭＲスペクトルを測定し、その結果を解析した。標識化オリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲおよび^１３Ｃ−ＮＭＲのチャートを図８〜１９に示し、それらを解析した結果を表３〜８に示す。これら結果から、分子量５３９、７１５、８６１、９０３、９５７、９９９の化合物は、それぞれ、化合物（III）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）の標識体であることが明らかとなった。

確認のため、各オリゴ糖上に結合していたＡＢＥＥを除去し、再生したオリゴ糖の純品を得た。即ち、これら分離した各標識化オリゴ糖１０ｍｇ（１００μｌ）に、過酸化水素、酢酸を各１０μｌ加えて一昼夜放置した後、乾固した。こうして得られた再生オリゴ糖のうち、分子量９０３の化合物から得られたものを^１Ｈ−ＮＭＲ（図２０）、ＴＯＦ−ＭＳ（装置Voyager DE-STR（Applied Biosystems）、Ion mode: negative、Mode of operation： reflector、Accelerating voltage： 20kV、Matrix： 2,5-dihydroxybenzoic acid）（図２１）、ＭＳ／ＭＳ（図２２）で解析したところ、その結果は、確かに式（VII）の構造を示していた。

また、上記方法で分離できなかった分子量４２０、８５８、９００の化合物（それぞれ（IV）、（X）、（XI））に関しては、反応混合物をＦＡＢ−ＭＳ／ＭＳ（装置：HX110A/HX110A(JEOL)、Ion mode：MS, MS/MS(negative)、Xe atom beam：5kV、Ion source accelerating potential：10kV、Collision energy：2keV、Matrix：Glycerol）、およびＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳで分析することによりその存在を確認した。これら未標識化オリゴ糖の分析結果を図２３〜２７に示す。図２３に（IV）のＦＡＢ−ＭＳチャート、図２４にＭＳ／ＭＳチャートを示した。また図２５に（X）および（XI）のＦＡＢ−ＭＳチャートを、図２６、２７にそれぞれのＭＳ／ＭＳチャートを示した。

これらの結果より、分子量３９０の二糖は化学式（III）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ_３ ⁻−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量４２０の二糖は化学式（IV）で表されるα−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量５６６の三糖は化学式（V）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ_３ ⁻−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量７１２の四糖は化学式（VI）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ_３ ⁻−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、そして分子量７５４の四糖は化学式（VII）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ_３ ⁻−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−アセチル−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量８０８の５糖は化学式（VIII）で表される［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）］−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量８５０の５糖は化学式（IX）で表される［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）］−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−４−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量８５８の５糖は化学式（X）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ_３ ⁻−（１→３）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量９００の５糖は化学式（XI）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ_３ ⁻−（１→３）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−アセチル−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃであることが分かった。

オキナワモズク藻体１００ｇに２ＮＨＣｌ（１００ｍｌ）５００〜１０００ｍｌを入れ、１時間、５０〜１００℃で酸加水分解を行った。得られた抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析（脱塩）を行ない凍結乾燥しフコイダン画分を２ｇ得た。得られたフコイダン画分をＡＢＥＥで蛍光標識化したものをＥＳＩ−ＭＳ（４０００ＱＴＲＡＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；分析条件Ｐｏｌａｒｉｔｙ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｉｏｎｍｏｄｅ；ＤｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇＰｏｔｅｎｔｉａｌ：−５０ｖ；Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙ：−１０ｅＶ；Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５５０℃）で分析した結果、図２８で示されるチャートが得られ、式（I）〜（XI）に示されるフコイダンオリゴ糖の存在が確認できた。

免疫機能調節作用の測定（１）
マウス脾細胞に対するＩＦＮ−γ誘導作用
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、雄、日本チャールズリバー株式会社）から脾細胞を分離し、５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製し、２４ｗｅｌｌプレートで培養した。化合物（I）、（II）のフコイダンオリゴ糖を１００μｇ／ｍｌになるように各ｗｅｌｌに添加した。比較対照としてフコースと硫酸化フコース(それぞれＭＷ１６４、２４４)、キシロオリゴ糖（ＸＯＳ）を等量用いた。２４時間培養後、培養上清を回収しＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡ、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて測定した（図２９）。化合物（II）に強いＩＦＮ−γ誘導作用が見られた。

さらに、オリゴ糖を添加して３０分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭＡＢＰ-１００２８）（死菌）を０．１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加して上記と同様の操作も行った。化合物（I）に関しては、それを乳酸菌と併用すると著しく強いＩＦＮ−γ誘導能が得られた。この作用は、化合物（I）と乳酸菌をそれぞれ単独で用いて得られた結果（図２９中、左から２番目および右から３番目）から予測できない程強く、両者を組み合わせて用いることにより相乗的効果が生じることを裏付けている。構成成分のフコースや硫酸化フコースにはこのような活性が無く、プレバイオティクスとして広く使われているキシロオリゴ糖にもこのような作用が無かった。

したがって、化合物（I）、化合物（II）のフコイダンオリゴ糖には脾細胞を活性化させる機能があり、生体の免疫機能を調節できる。
また、同様に調製した脾細胞に、化合物（I）〜（VII）の化合物を任意に３種類均等に混合したものを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３０分後に乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭＡＢＰ-１００２８）（死菌）を０．１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加した。２４時間培養後、培養上清を回収しＩＦＮ−γの産生量を測定した（図３０）。図に示すとおり、（V）、（VI）および（VII）の混合物、（I）、（V）および（VI）の混合物、および（I）、（V）および（VII）の混合物を用いると、高いＩＦＮ−γ産生量が観測された。したがって、化合物（I）〜（XI）が混在していている場合でも乳酸菌と併用することで免疫機能調節活性が上昇することがわかった。

免疫機能調節作用の測定（２）
マウス由来樹状細胞に対する、ＩＬ−１０および１２誘導作用、樹状細胞成熟作用およびＣＴＬ活性増強作用
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢、雄、日本ＳＬＣ株式会社）の大腿骨から骨髄細胞を分離し、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、１０％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、２０ｎｇ／ｍｌＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁し、２４ｗｅｌｌプレートで培養した。培養開始３、５日目に培地交換を行ない、付着性の未成熟樹状細胞を得た。得られた樹状細胞に、化合物（I）、（II）、（III）、（V）、（VI）、および（VII）をそれぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度で加えた（前処理）。２日間培養後、培養上清と細胞を回収した。また、前処理３０分後に、乳酸菌（Lactobacillus pentosus；ＦＥＲＭＡＢＰ-１００２８）（死菌））を０．１μｇ／ｍｌずつ各ｗｅｌｌに添加して上記と同様の操作を行なった。

回収した培養上清はＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１２とＩＬ−１０を測定した。結果をそれぞれ図３１、３２に示した。化合物（II）、（III）、および（VI）は、単独でＩＬ−１２誘導能を示した。化合物（I）は、それを乳酸菌と併用することで相乗的にＩＬ−１２を誘導した（図３１）。また、化合物（II）、（III）および（V）は乳酸菌と併用することでＩＬ−１０を誘導した（図３２）。これらのことにより、本発明で見つかったフコイダンオリゴ糖には生体の免疫系を正にも負にも調節（低下した免疫を活性化し、または過剰な免疫反応を抑制する）する機能があることが分かった。キシロオリゴ糖には、このような作用は認められなかった。

回収した細胞の表面の成熟化マーカーであるＣＤ８６の陽性率をフローサイトメトリー（ＥＰＩＣＳＸＬ、ベックマンコールター株式会社製）を用いて解析した。その結果、フコイダンオリゴ糖には単独で樹状細胞を成熟化させる作用があることが確認できた（図３３）。

さらに、回収した細胞をカウントし、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製後、１ｍｌの細胞懸濁液中にマイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ）を処理し、３７℃で３０分間反応させた。反応終了後、ＰＢＳの洗浄によりマイトマイシンＣを除去し、常法により調製したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞（５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１ｍｌ添加し、４日間混合培養した。培養後細胞を回収し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのアロ抗原を持つＰ−８１５細胞（５０００ｃｅｌｌｓ／１００μｌ）をターゲットにし、Ｅ：Ｔ比４０：１および８０：１の割合で４時間反応させ、殺傷されたＰ−８１５の数をフローサイトメトリーでカウントすることによりＣＴＬ活性を求めた（図３４）。化合物（II）、（VI）、（VII）は単独でＣＴＬ活性を高める作用があることを確認した。また、化合物（III）、（V）、（VI）、（VII）は乳酸菌と併用することでＣＴＬ活性が増強されることも分かった。

沖縄モズクから熱水抽出により得られるフコイダンの糖組成分析を示すＨＰＬＣチャートである。式（I）で表される分子量３４０のフコイダンオリゴ糖のＭＳスペクトルを示す図である。式（II）で表される分子量４８６のフコイダンオリゴ糖のＭＳスペクトルを示す図である。式（I）の化合物に対応する標識化オリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（I）の化合物に対応する標識化オリゴ糖の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（II）の化合物に対応する標識化オリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（II）の化合物に対応する標識化オリゴ糖の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（III）の化合物に対応する分子量５３９の標識化オリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（III）の化合物に対応する分子量５３９の標識化オリゴ糖の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（V）の化合物に対応する分子量７１５の標識化オリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（V）の化合物に対応する分子量７１５の標識化オリゴ糖の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（VI）の化合物に対応する分子量８６１の標識化オリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（VI）の化合物に対応する分子量８６１の標識化オリゴ糖の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（VII）の化合物に対応する分子量９０３の標識化オリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（VII）の化合物に対応する分子量９０３の標識化オリゴ糖の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（VIII）の化合物に対応する分子量９５７の標識化オリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（VIII）の化合物に対応する分子量９５７の標識化オリゴ糖の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（IX）の化合物に対応する分子量９９９の標識化オリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（IX）の化合物に対応する分子量９９９の標識化オリゴ糖の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖のＴＯＦ-ＭＳスペクトルを示す図である。式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖を再生した後のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。式（IV）で表される分子量４２０のフコイダンオリゴ糖のＦＡＢ-ＭＳスペクトルを示す図である。式（IV）で表される分子量４２０のフコイダンオリゴ糖のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。式（X）で表される分子量８５８および式（XI）で表される分子量９００のフコイダンオリゴ糖のＦＡＢ-ＭＳスペクトルを示す図である。式（X）で表される分子量８５８のフコイダンオリゴ糖のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。式（XI）で表される分子量９００のフコイダンオリゴ糖のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。沖縄モズクを加水分解後、ＡＢＥＥで蛍光標識化したＥＳＩ−ＭＳのチャートを示す図である。フコイダンオリゴ糖の脾細胞に対するＩＦＮ−γ誘導効果を示す図である。複数のフコイダンオリゴ糖の脾細胞に対するＩＦＮ−γ誘導効果を示す図である。フコイダンオリゴ糖の樹状細胞に対するＩＬ−１２誘導効果を示す図である。フコイダンオリゴ糖の樹状細胞に対するＩＬ−１０誘導効果を示す図である。フコイダンオリゴ糖による樹状細胞の成熟化効果を示す図である。フコイダンオリゴ糖のＣＴＬ活性誘導効果を示す図である。

Claims

下記構造式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）、または（XI）で示される化合物。
請求項１記載の式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含む免疫機能調節剤。
請求項１記載の式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を添加した飲食品。
請求項１記載の式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含有し、免疫機能調節作用を有する旨の表示を付した飲食品。
請求項１記載の式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含む医薬組成物。
請求項１記載の式（I）〜（XI）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含む化粧品。