TWI833339B - 以外多醣治療睡眠障礙之方法 - Google Patents

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TWI833339B
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Abstract

本發明提供一種乳酸菌之外多醣或包含該等外多醣之醫藥組合物之用途，其用於製造用以預防、改善及/或治療有需要之個體之睡眠障礙的藥劑。該醫藥組合物包含有效量之乳酸菌之外多醣(EPS)及視情況選用之可食用載劑或醫藥學上可接受之載劑。

Description

以外多醣治療睡眠障礙之方法
本發明係關於益生菌之應用。特定言之，本發明係關於使用乳酸菌之方法。
益生菌為可向其宿主提供某些有益作用之活微生物。受益於益生菌之較高商業價值，探索益生菌之各種功能的研究在過去十年中已取得顯著進展。最重要的里程碑之一為「精神益生菌」之提出，其進一步將益生菌之功能擴展至行為及心理健康。除發現新應用外，發現許多益生菌功能與無活力細胞相關，其進而引起功能性益生菌效應物之研究激增( Teame T 等人 , 2020. Paraprobiotics and Postbiotics of Probiotic Lactobacilli, Their Positive Effects on the Host and Action Mechanisms: A Review. Front Nutr 7:570344; Lebeer S 等人 , 2018. Identification of probiotic effector molecules: present state and future perspectives. Curr Opin Biotechnol 49:217-223)。
一般而言，由益生菌產生之功能性效應物可分為兩種主要類別：副益生菌及後生元。副益生菌為不活化益生菌細胞或益生菌之細胞組分，其包括胞內蛋白質、細胞壁組分、細胞表面相關分子及外多醣(EPS)。後生元為非細胞組分，其包括分泌性分子及細菌代謝物。在分離分子中，EPS因其多樣的化學特性及其在宿主-微生物相互作用中的作用而尤其值得關注( Lee IC 等人 , Strain-Specific Features of Extracellular Polysaccharides and Their Impact on Lactobacillus plantarum-Host Interactions. Appl Environ Microbiol 82:3959-3970)。
然而，需要開發新的健康應用。
本發明提供一種用於預防、改善及/或治療有需要之個體之睡眠障礙的方法，其包含向個體投與有效量之乳酸菌之外多醣或包含該等外多醣之醫藥組合物。
本發明亦提供一種乳酸菌之外多醣或包含該等外多醣之醫藥組合物之用途，其用於製造用以預防、改善及/或治療有需要之個體之睡眠障礙的藥劑。
本發明提供一種用於改良有需要之個體之睡眠品質之方法，其包含向個體投與有效量之乳酸菌之外多醣或包含該等外多醣之醫藥組合物。
本發明亦提供一種乳酸菌之外多醣或包含該等外多醣之醫藥組合物之用途，其用於製造用以改良有需要之個體之睡眠品質的藥劑。
本發明提供一種用於預防、改善及/或治療有需要之個體之失眠的方法，其包含向個體投與有效量之乳酸菌之外多醣或包含該等外多醣之醫藥組合物。
本發明亦提供一種乳酸菌之外多醣或包含該等外多醣之醫藥組合物之用途，其用於製造用以預防、改善及/或治療有需要之個體之失眠的藥劑。
在本發明之一些實施例中，本文所描述之乳酸菌為乳桿菌屬( Lactobacillusspp)。在本發明之一個實施例中，乳酸菌為醱酵乳桿菌( Lactobacillus fermentum)。醱酵乳桿菌菌株之實例包括但不限於醱酵乳桿菌Lf2、醱酵乳桿菌MTCC 25067或醱酵乳桿菌PS150 (其於2016年6月6日根據布達佩斯條約寄存於德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)且賦予寄存編號DSM 32323)。
如本文中所描述之EPS以各種形式提供。在本發明之一些實施例中，EPS包含於提取物中。 此外，在一個實施例中，EPS藉由包含以下步驟之方法獲得：培養乳酸菌以獲得細菌培養物；及自細菌培養物移除細菌細胞體，以獲得含有EPS之混合物。
在本發明之一些實施例中，該方法進一步包含以下步驟： 用乙醇沈澱該混合物；及 移除乙醇以獲得含有EPS之提取物。
在本發明之一些實施例中，EPS藉由包含以下步驟之方法獲得： 培養乳酸菌以獲得細菌培養物； 自細菌培養物移除細菌細胞體以獲得含有EPS之混合物； 用乙醇沈澱該混合物； 移除乙醇以獲得含有EPS之提取物；及 自提取物獲得分子量在約9 kDa至約2000 kDa範圍內之溶離份。
在本發明之一個實施例中，提取物包含分子量在約30 kDa至約2,000 kDa範圍內之溶離份1，且溶離份1藉由尺寸排阻層析分離。
在本發明之一些實施例中，溶離份1包含分子量為1,446 kDa之主要組分，且在一個實施例中，主要組分占溶離份1之約74%。
在本發明之一些實施例中，溶離份1包含海藻糖、半乳胺糖、葡糖胺、半乳糖、葡萄糖及甘露糖。在一些實施例中，溶離份1進一步包含其他單醣，包括但不限於肌醇及山梨糖醇。在一個實施例中，溶離份1包含約3.7莫耳%至約5.5莫耳%海藻糖、約9.0莫耳%至約13.5莫耳%半乳胺糖、約10.8莫耳%至約16.2莫耳%葡糖胺、約27.8莫耳%至約41.7莫耳%半乳糖、約7.9莫耳%至約11.8莫耳%葡萄糖及約20.9莫耳%至約31.3莫耳%甘露糖，其中溶離份1中單醣之總莫耳百分比為約100莫耳%。
在本發明之另一實施例中，提取物包含分子量在約15 kDa至約750 kDa範圍內之溶離份2，且溶離份2藉由尺寸排阻層析分離。
在本發明之另一實施例中，提取物包含分子量在約9 kDa至約380 kDa範圍內之溶離份3，且溶離份3藉由尺寸排阻層析分離。
如本文中所描述之醫藥組合物之投與途徑可變化。在一個實施例中，組合物經口投與，且該組合物呈適用於經口投與之形式。在另一態樣中，組合物呈固體、半固體、液體或粉末顆粒之形式。
在本發明之一些實施例中，該方法用於減少睡眠潛伏期。
在本發明之一些實施例中，該方法用於減少自睡眠中恢復的時間。
除非另外定義，否則本文所用之所有科學或技術術語具有與一般熟習本發明所屬技術者所理解相同之含義。與本文所描述之方法及材料類似或等效的任何方法及材料可由一般熟習此項技術者理解及使用以實踐本發明。
必須指出，除非上下文另外清楚指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。因此，除非上下文另外要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。
如本文所用，術語「視情況(optional/optionally)」意謂隨後描述之事件或情況可能發生或可能不發生，且該描述包括該事件或情況發生之實例及不發生之實例。舉例而言，片語「視情況包含藥劑」意謂該藥劑可能存在或可能不存在。
通常，範圍在本文中表示為自「約」一個特定值及/或至「約」另一個特定值。當表示此類範圍時，一實施例包括自一個特定值及/或至另一個特定值之範圍。類似地，當值藉由使用詞語「約」表示為近似值時，應理解特定值形成另一實施例。將進一步理解，各範圍之端點相對於另一端點及獨立於另一端點均為重要的。如本文所用，術語「約」係指±20%、較佳±10%且甚至更佳±5%。
術語「及/或」用於指兩種事物或所提及之兩種事物中之任一者。
術語「預防(preventing/prevention)」在此項技術中為公認的，且當與病狀相關使用時，其包括在該病狀發作之前投與藥劑，以相對於未接受該藥劑之個體，降低個體之醫學病狀的頻率或嚴重程度或延遲其症狀發作。
術語「治療(treatment/treating/treat)」通常係指獲得所需的藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分預防疾病、病症或其症狀而言可為預防性的，且就部分或完全治癒疾病、病症及/或歸因於其之症狀而言可為治療性的。本文所用之「治療」涵蓋對哺乳動物(較佳人類)之疾病的任何治療，且包括(1)抑制個體之疾病、病症或其症狀的發展，或(2)緩解或改善個體之疾病、病症或其症狀。
如本文所用，術語「病症」可與「疾病」或「病狀」互換使用。
如本文所用，術語「睡眠障礙」包括熟習此項技術者認可的關於睡眠障礙之病況；例如，此項技術中已知的病況或提出為睡眠障礙或發現為睡眠障礙之病況。睡眠障礙亦出現在患有其他醫學病症、疾病或損傷之個體中，或正在接受其他藥物或醫學治療之個體中，其中個體因此難以入睡及/或保持睡眠，或經歷令人不快的睡眠，例如，個體經歷睡眠剝奪。
如本文所用，「睡眠模式」或「睡眠結構」對於給定個體係指在各睡眠階段(例如，REM、N1、N2及N3，或替代地，REM、階段I、階段II、階段III及階段IV)花費的時間，包括各階段之持續時間相比於其他階段之持續時間的相對比例。特定人群(例如停經後女性)之「正常」睡眠模式或睡眠結構之參數為此項技術中已知的。參見例如Latta等人, 2005, Sleep, 28:1525-1534; Sahlin等人, 2009, Sleep Med., 10:1025-1030。
如本文所用，術語「個體」為可受益於投與如本文所揭示之化合物或組合物的任何動物。在一些實施例中，個體為哺乳動物，例如人類、靈長類動物、犬、貓、馬、牛、豬、嚙齒動物，諸如大鼠或小鼠。通常，哺乳動物為人類。
術語「益生菌」在目前先進技術中公認為一種微生物，當足量投與時．其賦予宿主健康益處。益生菌微生物必須滿足與缺乏毒性、活力、黏著性及有益作用相關的若干要求。此等益生菌特徵與菌株有關，甚至在同一物種之細菌之間亦如此。
如本文所提供之術語「有效量」之活性成分意謂足夠量的成分以提供對所需功能之所需調節。如下文將指出，所要求之精確量將隨各個體而變化，取決於個體之疾病狀態、身體條件、年齡、性別、物種及體重、組合物之具體特性及配方等。可調節給藥方案以誘發最優治療反應。舉例而言，可每天投與若干分次劑量，或可如治療情況之緊急程度所指示按比例減少劑量。因此，不可能指定精確的「有效量」。然而，一般熟習此項技術者僅使用常規實驗便可判定適當有效量。
術語「外多醣」係指由微生物分泌之高分子量多醣。
術語「可食用載劑」係指適用於與個體之組織接觸之化合物、材料、組合物及/或劑型。各載劑必須在與調配物之其他成分相容的意義上亦為「可接受」。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係指在合理醫學判斷範圍內，適用於與個體(人類或非人類動物)之組織接觸，無過度毒性、刺激、過敏反應或其它問題或併發症，與合理益處/風險比相稱的化合物、材料、組合物及/或劑型。各載劑、賦形劑等必須在與調配物之其他成分相容的意義上亦為「可接受」。適合的載劑、賦形劑等可見於標準醫藥學文本中。
如本文所用，術語「乳酸菌」係指醱酵糖同時產生酸(包括乳酸作為主要產生酸)之革蘭氏陽性微需氧或厭氧細菌。
各種EPS之高度多樣化的化學組成產生極佳且有用的工業應用，亦即乳化劑、食品添加劑、抗氧化劑、低溫保護劑及甚至奈米粒子穩定劑( Wang J, Salem DR, Sani RK. 2019. Extremophilic exopolysaccharides: A review and new perspectives on engineering strategies and applications. Carbohydr Polym 205:8-26; Zhou Y, Cui Y 及 Qu X. 2019. Exopolysaccharides of lactic acid bacteria: Structure, bioactivity and associations: A review. Carbohydr Polym 207:317-332)。此外，EPS在生物醫學應用中亦具有潛力。一個標誌性實例為鼠李糖乳桿菌( Lactobacillus rhamnose) GG之EPS，其可抑制脂肪生成( Zhang Z 等人 , 2019. Ability of prebiotic polysaccharides to activate a HIF1 α -antimicrobial peptide axis determines liver injury risk in zebrafish. Commun Biol 2:274)。
因此，本發明提供一種用於預防、改善及/或治療有需要之個體之睡眠障礙(諸如失眠)、改良其睡眠品質的方法，其包含向個體投與有效量之乳酸菌之外多醣或包含該等外多醣之醫藥組合物。
本發明亦提供一種乳酸菌之外多醣或包含該等外多醣之醫藥組合物之用途，其用於製造用以預防、改善及/或治療有需要之個體之睡眠障礙(諸如失眠)及/或改良其睡眠品質之藥劑。
最常見的乳酸菌發現於「乳桿菌目( Lactobacillales)」，包括乳球菌( Lactococcus) (乳球菌屬)、鏈球菌( Streptococcus) (鏈球菌屬)、乳桿菌( Lactobacillus) (乳桿菌屬)、白念珠球菌( Leuconostoc) (白念珠球菌屬)、小球菌( Pediococcus) (小球菌屬)及腸球菌( Enterococcus) (腸球菌屬)。另外，屬於嚴格厭氧細菌雙岐桿菌( Bifidobacterium) (亦即，雙岐桿菌屬)組的乳酸產生菌通常包括於乳酸菌組中。
作為研究最充分的益生菌屬，乳桿菌屬為分離生物活性EPS之主要對象。作為各種醱酵食品中之常見物種，醱酵乳桿菌以其黏稠的質地及產生EPS的能力而聞名，使其成為發現新穎EPS的理想來源。廣泛研究EPS產生菌株(諸如醱酵乳桿菌Lf2及醱酵乳桿菌MTCC 25067)之化學結構、遺傳學、流變學特性及EPS之產生。更重要的是，愈來愈多的證據(尚初步)將醱酵乳桿菌菌株之益生菌功能與EPS聯繫起來。特定言之，乳酸菌為醱酵乳桿菌PS150。醱酵乳桿菌PS150揭示於WO2018129722A1中，且已根據布達佩斯條約寄存於德國微生物菌種保藏中心，寄存編號為DSM 32323。
醱酵乳桿菌PS150 (PS150)具有如SEQ ID NO: 1至3中所示之核酸序列中之任一者。SEQ ID NO: 1至3之序列列於如下。
編號 基因描述 基因序列
1 推定的糖基轉移酶EpsJ atgaggaacaatcaaagtaacacgccgctaatttcagtgattattcctgcatataaagtcgaaaaatacttagcgttttgtgttgaatcagttgttgcacaaactttaactggttatgaagtgattattgtcgatgatggctcaccagataatactggagagatcacggatcacttagcgcaacaatatgaagcggttaaggtgattcatcaagaaaacgcaggagttagtaccgcacggaatacggggattgacaacgctcaagggaaatatattacttttattgatggtgatgattttatcgctccgacttttctggagtatatggttaatatggtagagaaaacccattcggatttcggactggctctagattgttttacgaagaatgatgagaaacctttggatcaaactgaagataaagtgtatgctccagaaaaggcggtaagtttgttgctatccccacgtgtaattgttggctgttag (SEQ ID NO:1)
2. 推定的糖基轉移酶EpsF atgaatgatgttccatcaccgtactatgatgaaattatagaacggggttcaaaaatattcattctgccgccaataaataacgtttaccatcattatcaggaatgcaaaaagatattacgagatggggattacgatgttgtttgtgataacaacttgattaaatccatcccaatgatgcttgctgctaagaaatgtggagttcctgtacggattttgcatagtcacaacacgaaattaagcacaatcatcaagaaggaatggattacgaagctcctattgccattattgaaaagggaaattacagattattgtgcatgcggccaactagctggggaagcactatttgggaaagctaagtttacggttattccaaatgtaatctcaccagaaacgaacacctttgataaagtcaagagagataaaatcagaaaagagcttggcgttgacgataaggttgttgtagggactgttggtcggacatctatacaaaaaaacccttatttcgcaattgatgtaattgagaaggtacaccaaagtaatcctagtattgtttattggtggattggtagtggtgaactagatgatcaactgagagcgtacgtagaaaagaaggggttaggtaaggttgtatctttcctaggaagtagggatgatgttcaagatctttaccaggcaatggatgtattctttttaccctcgctttttgaaggtttaccactaactggagttgaagctcaagcaatggggttaccgtcgattttatcagctagcgttacagatagattggtatataccgatctggtaaagtacgtatcgttggatgaacctatcgaagaatgggaaaaagcttttaaaaaagcgatcgaacggattccacaaaggagggcatatacagaagaacttaagcagagcgtttattcagctgaagatgcgggaaagaatatgacaaagatttacgaggatcttctcgcctcaaaattgcggtaa (SEQ ID NO:2)
3 推定的糖基轉移酶EpsF atgattcggatattacaattaccaaacactatttctcgagaaaatggtcgcatgtcagtaattatgagtatatataggcacatagatagaaccaagattcagtttgattttgcggtatctgagtctagtggcgatacttatcttgatgaaattaaaaagcttggaggcaaggtatttgtgattccatctggcgaggtttcctacaaaagtgttgtcaagatggttaatatgctccttaagaaaagagagtattcatttatacattatcacgcaatctcaatttggggagttgctctaaacgttgcacatcggcatggtgtaaagataatcacacacagtcatgcaacatattttagcgatggatttatgaagtcaattcgaaatcgaatcttttctctaaatataaagttatattcagataagttggcagctgtttccccagaagcgggtagaactttatttggaaaacaacaatatatatatataccaaatgtaattaattataaaaaatatactttctcgcgtaataatagagaaaaaattcgtcggcaatataacattgatgatggtgactttgtcgttggtcatgtaggacgtctgtcaaaacaaaaaaaccatcaatttctgatcagagcctttagtctattacatgcatcggcggaaaagtacaaattaatgctcgtgggtagtggaccactcgaaaatgatctgaggacacttgtaagtcaactgaatattgaaaggtcagttatttttgttggtgcaaagcaagatgtaactgcgttttattcagcatttgacttgttctggttaccttccttgtatgagggattgcctacggttggattggaagcgcaggctaacggtctttcaatcattgcaagtgatcgtatttcacctgagctagccattgaaaatgttattttttctccaattaggcataaaagcgatttacaaaaatggtgtcatatcactctggagcgagattggcctcgctctacagatgtcatgcggacgattgaacatagtcggtataattatcaacatgtcttagatcaatggaaaagcctatatgatatgaagtaa (SEQ ID NO:3)
通常，外多醣包含單醣之聚合物。然而，一些外多醣亦包含非碳水化合物取代基(諸如乙酸鹽、丙酮酸鹽、丁二酸鹽及磷酸鹽)。根據單醣組成，EPS可分為同多醣及雜多醣。同多醣由單一類型之單醣構築之重複單元構成。然而，雜多醣之重複單元包含多種類型之單醣。除單醣組成外，包括重複單元數目、糖苷鍵類型、分支鏈、硫酸化及磷酸化之因素可在不同生物體產生之EPS中變化。
如本文中所描述，EPS之干預可減少睡眠潛伏期，儘管治療後睡眠持續時間不受影響。另一方面，EPS治療使恢復時間顯著減少。此等結果顯示EPS足以產生催眠效果。
如本文中所描述之EPS可以純化、半純化或未純化形式提供。在一些實施例中，如本文中所描述之EPS為半純化的且包含於提取物中。提取物可藉由包含以下步驟之方法製備： 培養乳酸菌以獲得細菌培養物；及 自細菌培養物移除細菌細胞體以獲得混合物。
另外，用於製備提取物之方法進一步包含以下步驟： 用乙醇沈澱該混合物；及 移除乙醇以獲得含有EPS之提取物。
此外，用於製備提取物之方法進一步包含自提取物獲得分子量在約9 kDa至約2,000 kDa範圍內之溶離份的步驟。
此外，如本文中所描述之含有EPS之提取物可進一步分離若干溶離份。分離方式可為尺寸排阻層析。提取物包含一些溶離份。該等溶離份中之一者為分子量在約30 kDa至約2,000 kDa範圍內之溶離份1，且溶離份1藉由尺寸排阻層析分離；該等溶離份中之一者為分子量在約15 kDa至約750 kDa範圍內之溶離份2，且溶離份2藉由尺寸排阻層析分離；該等溶離份中之一者為分子量在約9 kDa至約380 kDa範圍內之溶離份3，且溶離份3藉由尺寸排阻層析分離。
術語「尺寸排阻層析」意謂使用多孔層析材料分離分子之方法。尺寸排阻層析可由單一步驟中使用之一或多種不同類型的多孔層析材料或多個獨立步驟中使用之一或多種不同類型的多孔層析材料組成。
在本發明之一些實施例中，溶離份1包含分子量為約1,446 kDa之主要組分。使用帶有脈衝安培偵測器(PAD)之高效能陰離子交換管柱層析系統(HPAEC)，使用金工作電極及陰離子交換管柱(Carbopac™ PA-10，4.6×250 mm) (Dionex™ BioLC)進一步分析溶離份1中之內含物，溶離份1包含約3.7莫耳%至約5.5莫耳%海藻糖、約9.0莫耳%至約13.5莫耳%半乳胺糖、約10.8莫耳%至約16.2莫耳%葡糖胺、約27.8莫耳%至約41.7莫耳%半乳糖、約7.9莫耳%至約11.8莫耳%葡萄糖及約20.9莫耳%至約31.3莫耳%甘露糖，其中溶離份1中單醣之總莫耳百分比為100莫耳%。定量分析顯示，半乳糖及甘露糖在溶離份1中最充足。
需要改良之睡眠結構或睡眠品質的個體可表現出在一或多個參數上偏離「正常」睡眠模式的睡眠模式，可遭受睡眠模式紊亂或處於睡眠模式紊亂之風險中，或可被診斷為睡眠障礙。在具體實施例中，個體有入睡問題。
在判定藥物或治療方案是否達成睡眠結構或睡眠品質改良時，可考慮多種不同參數。舉例而言，喚醒時間減少、慢波(SW)及/或快速動眼(REM)睡眠增加、睡眠維持增加、睡眠效率增加、睡眠潛伏期減少及/或睡眠期間SW及REM階段之分佈的正常化中之一或多者可視為睡眠品質或睡眠結構的改良。吾人可判定睡眠品質改良之方法為此項技術中已知的且在實例中加以說明。為個體提供此等參數中之任何一或多者改良的藥物或治療方案將視為已改良該個體之睡眠品質或睡眠結構。
本發明之組合物可呈適合於投與、尤其經口投與之任何形式。此包括例如固體、半固體、液體及粉末。
本發明之組合物之實例為營養組合物，其包括食品，尤其乳製品。
組合物可為例如膠囊、錠劑、飲料、散劑或乳製品。較佳地，本發明組合物為營養品或醫藥產品、營養補充劑或醫療食品。
本發明之營養組合物亦包括食品補充劑及功能性食品。「食品補充劑」指示由通常用於食物中之化合物製成，但呈錠劑、散劑、膠囊、飲劑或任何其他通常與食物無關之形式且對人體健康具有有益作用的產品。「功能性食品」為一種亦對人體健康具有有益作用的食物。特定言之，食品補充劑及功能性食品可對疾病產生生理作用——保護性或治療性。
若根據本發明之組合物為膳食補充劑，則其可按原樣投與，可與適合的可飲用液體，諸如水、酸乳、牛奶或果汁混合，或可與固體或液體食品混合。在此情形下，膳食補充劑可呈錠劑、丸劑、膠囊、口含錠、顆粒、散劑、懸浮液、藥囊、片劑、糖劑、條劑、糖漿之形式及相應投與形式，通常呈單位劑量形式。較佳地，包含本發明之組合物的膳食補充劑以錠劑、口含錠、膠囊或散劑形式投與，以製備膳食補充劑之習知製程製造。
本文所描述之組合物可為醫藥學上可接受之組合物，其可包括一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑、黏合劑、稀釋劑或其類似物。本發明之組合物可經調配以用於各種投與途徑，例如經口投與。其亦可與諸如一些囊封技術中之遞送運載體組合提供。
對於經口投與，散劑、懸浮液、顆粒、錠劑、丸劑、膠囊、凝膠膠囊及囊片作為固體劑型係可接受的。此等可藉由例如使本文所揭示之一或多種化合物與至少一種添加劑(諸如澱粉或另一種添加劑)混合來製備。適合的添加劑為蔗糖、乳糖、纖維素糖、甘露糖醇、麥芽糖醇、葡聚糖、澱粉、瓊脂、海藻酸鹽、幾丁質、殼聚糖、果膠、黃蓍膠、阿拉伯膠、明膠、膠原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯。視情況，口服劑型可含有其他成分以輔助投與，諸如惰性稀釋劑、或潤滑劑(諸如硬脂酸鎂)、或防腐劑(諸如對羥基苯甲酸酯或山梨酸)、或抗氧化劑(諸如抗壞血酸、生育酚或半胱胺酸)、崩解劑、黏合劑、增稠劑、緩衝劑、甜味劑、調味劑或芳香劑。錠劑及丸劑可用此項技術中已知的適合的包衣材料進一步處理。
用於經口投與之液體劑型可呈醫藥學上可接受之乳液、糖漿、酏劑、懸浮液及溶液形式，其可含有惰性稀釋劑，諸如水。醫藥調配物及組合物可使用無菌液體，諸如但不限於油、水、乙醇及此等之組合，製備為液體懸浮液或溶液。可添加醫藥學上適合之界面活性劑、懸浮劑、乳化劑用於經口或非經腸投與。
應瞭解，若在本文中引用任何先前技術出版物，則此類引用不構成承認該出版物形成此項技術中之公共常識之一部分。
儘管出於清楚理解之目的已藉助於說明及實例詳細地提供了揭示內容，但對於熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本發明之精神或範圍的情況下實施各種改變及修改。因此，前述描述及實例不應視為限制性的。 實例
含有外多醣之粗提取物的純化
細菌菌株醱酵乳桿菌PS150在德曼、羅戈薩及夏普培養液(MRS；Criterion, Hardy diagnostics, Santa Maria, CA, USA)中在37℃下厭氧培養18小時。隔夜培養物在80℃下加熱1小時，且使用7,000 x g離心30分鐘移除細菌細胞體。多醣組分隨後在4℃下使用3X體積之無水乙醇沈澱24小時。隨後在7,000 x g下收集沈澱物30分鐘且藉由70%乙醇洗滌。藉由蒸發移除殘餘乙醇，隨後將含EPS之提取物溶解於ddH 2O中且儲存於-30℃直至使用。
尺寸排阻管柱層析
簡言之，將40 mg凍乾EPS溶解於3 mL含有150 mM NaCl及10 mM NaH 2PO 4之緩衝液(pH 6.8)中且施用於Fractogel™ BioSec管柱(102×1.5 cm) (Merck, N.J., U.S.A.)。隨後，收集2.8 mL/管且藉由苯酚硫酸法分析己醣( DuBois DuBois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A. 及 Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Anal Chem 28: 350-356 et al., 1956)。在488 nm波長下進行分光光度分析。
外多醣分子量之估計
藉由尺寸排阻管柱收集的含醣管分成三種溶離份。使用與折射率偵測器聯用之凝膠滲透層析進一步分離各溶離份以估計分子量。使用分子量為670.0×10 3、69.8×10 3、40.0×10 3、10.5×10 3及0.18×10 3Da之可靠標準品(葡聚糖系列，Sigma-Aldrich Co.)構築校準曲線。
單醣組成分析
使用帶有脈衝安培偵測器(PAD)之高效能陰離子交換管柱層析系統(HPAEC)，使用金工作電極及陰離子交換管柱(Carbopac™ PA-10，4.6×250 mm) (Dionex™ BioLC)分析EPS之單醣組成。EPS (1 mg)用1.95 N三氟乙酸在80℃下酸水解6小時，蒸發以移除殘餘TFA，且溶解於Milli-Q水中。在HPAEC分析之前，水相經由0.22 μm過濾器過濾。採用環境溫度下之等度NaOH (18 mM)作為溶離劑。流動速率為1.0 mL/min。十個單醣標準品，包括肌醇、山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、半乳胺糖、葡糖胺、半乳糖、葡萄糖、甘露糖及果糖，購自Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)。在PRIME DAK系統(HPLC Technology, Ltd. UK)上收集且整合資料。
動物
雄性C57BL/6J小鼠(6週齡)購自國家實驗動物中心(臺灣臺北)。小鼠圈養於國立陽明大學之實驗動物中心。將房間保持在恆定溫度(22±1℃)及濕度(55-65%)下，亮/暗循環為12 hr。用標準飲食及滅菌水隨意餵養小鼠。
戊巴比妥誘導之睡眠測試
為了對含有EPS之粗提取物進行功能驗證，C57BL/6J小鼠經口投與PBS、MRS培養液及EPS (0.4 mg/天) 13天。在第14天，在注射戊巴比妥(50 mg/kg)之前30分鐘向小鼠投與PBS、DIPH (20 mg/kg)、MRS培養液或EPS。在注射之後，藉由上下翻轉來測試小鼠之翻正反射。戊巴比妥注射與翻正反射消失之間的時間定義為睡眠潛伏期。將恢復翻正反射所需的時間定義為睡眠時間，而翻正動作與自主運動之間所花費的時間定義為恢復時間。
戊巴比妥誘導之睡眠測試之時間線展示於圖1中。
實例 1 PS150 EPS 之精細份化及表徵
為了研究EPS之組成，吾等進行尺寸排阻層析以進行分級分離(圖2A)。EPS分離成三種細分溶離份，即溶離份1、溶離份2及溶離份3。隨後，吾等使用凝膠滲透層析系統分析三種溶離份之均質性。有趣的是，溶離份1係由分子量為1,446 kDa之主要組分(74%)構成(圖2B)。與溶離份1之高純度相比，溶離份2及溶離份3之層析圖顯示混雜的分子量分佈及較高背景雜訊(圖2C及圖2D)。因此，吾等推測溶離份2及溶離份3兩者為各種分子之混合物，而溶離份1為經純化EPS。
接下來，進行單醣組成分析以進一步表徵三種溶離份之化學特性(圖3A至圖3D)。結果顯示，溶離份1為主要由六種不同單醣構成之多醣：海藻糖、半乳胺糖、葡糖胺、半乳糖、葡萄糖及甘露糖。定量分析顯示，半乳糖及甘露糖為溶離份1中最豐富的組分(表1)。溶離份2及溶離份3之背景雜訊持續存在於吾等之單醣分析中(圖3C及3D)，且單醣組成之定量分析亦展示於表1中。總之，吾等得出結論，EPS之主要組分為由六種單醣構成之雜多醣，且此EPS分子可為介導PS150之催眠作用的活性組分。 表 1. 經純化溶離份之單醣組成。
單醣 中性糖 (μmol/g 多醣)
溶離份1 溶離份2 溶離份3
肌醇 1.28 ± 0.01 6.13 ± 0.04 10.48 ± 0.15
山梨糖醇 3.50 ± 0.08 5.65 ± 0.06 7.87 ± 0.01
海藻糖 49.94 ± 1.07 3.27 ± 0.02 7.96 ± 0.06
半乳胺糖 122.26 ± 0.41 12.24 ± 0.03 5.68 ± 0.42
葡糖胺 146.39 ± 0.50 31.47 ± 0.42 17.35 ± 0.21
半乳糖 377.08 ± 2.17 31.45 ± 0.36 12.80 ± 0.21
葡萄糖 106.77 ± 0.41 52.14 ± 0.04 21.12 ± 0.02
甘露糖 283.11 ± 0.51 52.95 ± 0.38 38.11 ± 0.27
實例 2 含有 EPS 之粗提取物足以用於催眠功能
為了證明吾等之假設，即PS150之EPS為催眠功能之活性效應物，吾等自PS150之用過的培養基沈澱EPS。粗提取物中碳水化合物內含物之最終產量為約0.4 mg/ml液體培養物。隨後在注射戊巴比妥之小鼠模型中測試粗提取物之催眠活性，如 戊巴比妥誘導之睡眠測試中所描述。結果顯示，來自PS150用過的培養基之含有EPS之提取物的干預可減少睡眠潛伏期(圖4A)，儘管在治療後睡眠持續時間不受影響(圖4B)。另一方面，EPS治療使恢復時間顯著減少(圖4C)。
儘管已結合上述特定實施例描述本發明，但其許多替代方案及其修改及變化對於一般熟習此項技術者而言將為顯而易見的。所有此等替代方案、修改及變化被視為屬於本發明之範圍內。
圖1顯示戊巴比妥誘導之睡眠測試之時間線。PBS：磷酸鹽緩衝鹽水。該組用作正常對照。DIPH：苯海拉明鹽酸鹽，一種眾所周知的用作睡眠助劑之抗組織胺藥物。將DIPH溶解於PBS (20 mg/mL)中。該組用作陽性對照。MRS: 德曼(De Man)、羅戈薩(Rogosa)及夏普(Sharpe)培養液。未醱酵的MRS培養液用作陰性對照。
圖2A至圖2D顯示含有PS150外多醣之粗提取物之尺寸排阻層析的結果。圖2A顯示含有PS150外多醣之粗提取物之精細份化。根據細分溶離份之滯留體積，將細分溶離份分為三組(溶離份1、溶離份2及溶離份3)。各細分溶離份之碳水化合物含量使用苯酚-硫磺法與葡萄糖參考物進行量化。圖2B顯示溶離份1之分子量分佈。圖2C顯示溶離份2之分子量分佈。圖2D顯示溶離份3之分子量分佈。
圖3A至圖3D顯示PS150外多醣之單醣組成分析。圖3A顯示單醣標準。圖3B顯示溶離份1之單醣組成。圖3C顯示溶離份2之單醣組成。圖3D顯示溶離份3之單醣組成。將樣品水解成單醣且使用與脈衝安培偵測器聯用之高效能陰離子交換層析進行分析。
圖4A顯示實例2中睡眠潛伏期之結果。圖4B顯示實例2中睡眠持續時間之結果。圖4C顯示實例2中恢復時間之結果。資料以平均值 ± SEM表示。根據單因素方差分析及Tukey HSD事後檢驗，不同上標字母(a, b)在p ＜ 0.05時顯著不同。
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Figure 111132114-A0305-02-0022-2
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Claims (15)

  1. 一種乳酸菌之外多醣(EPS)或包含該等外多醣之醫藥組合物之用途，其用於製造用以預防、改善及/或治療有需要之個體之睡眠障礙及/或改良其睡眠品質的藥劑，其中該乳酸菌為醱酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)。
  2. 如請求項1之用途，其中該睡眠障礙為失眠。
  3. 如請求項1之用途，其中該乳酸菌為醱酵乳桿菌PS150。
  4. 如請求項1之用途，其中該等EPS係包含於提取物中，該提取物藉由包含以下步驟之方法製備：培養乳酸菌以獲得細菌培養物；及自細菌培養物移除細菌細胞體。
  5. 如請求項1之用途，其中該等EPS係藉由包含以下步驟之方法獲得：培養該乳酸菌以獲得細菌培養物；自該細菌培養物移除細菌細胞體以獲得含有該等EPS之混合物；用乙醇沈澱該混合物；及移除乙醇以獲得含有該等EPS之提取物。
  6. 如請求項1之用途，其中該等EPS係藉由包含以下步驟之方法獲得：培養該乳酸菌以獲得細菌培養物；自該細菌培養物移除細菌細胞體以獲得含有該等EPS之混合物；用乙醇沈澱該混合物；移除乙醇以獲得含有該等EPS之提取物；及自該提取物獲得分子量在9kDa至2,000kDa範圍內之溶離份。
  7. 如請求項5或6之用途，其中該提取物包含分子量在30kDa至2,000kDa範圍內之溶離份1，且該溶離份1係藉由尺寸排阻層析分離。
  8. 如請求項7之用途，其中該溶離份1包含分子量為1,446kDa之主要組分。
  9. 如請求項7之用途，其中該溶離份1包含海藻糖、半乳胺糖、葡糖胺、半乳糖、葡萄糖及甘露糖。
  10. 如請求項7之用途，其中該溶離份1包含3.7莫耳%至5.5莫耳%海藻糖、9.0莫耳%至13.5莫耳%半乳胺糖、10.8莫耳%至16.2莫耳%葡糖胺、27.8莫耳%至41.7莫耳%半乳糖、7.9莫耳%至11.8莫耳%葡萄糖及20.9莫耳%至31.3莫耳%甘露糖，其中該溶離份1中單醣之總莫耳百分比為100莫耳%。
  11. 如請求項5或6之用途，其中該提取物包含平均分子量在15kDa至750kDa範圍內之溶離份2，且該溶離份2係藉由尺寸排阻層析分離。
  12. 如請求項5或6之用途，其中該提取物包含平均分子量在9kDa至380kDa範圍內之溶離份3，且該溶離份係3藉由尺寸排阻層析分離。
  13. 如請求項1之用途，其中該醫藥組合物呈適用於經口投與之形式。
  14. 如請求項1之用途，其中該醫藥組合物呈固體、半固體、液體或粉末顆粒之形式。
  15. 如請求項1之用途，其中該用途係進一步用於製造用以減少睡眠潛伏期及/或減少自睡眠中恢復的時間的藥劑。
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