KR102554125B1 - 질염 예방 또는 개선 효과를 가지는 락토바실러스 가세리 belg08 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

질염 예방 또는 개선 효과를 가지는 락토바실러스 가세리 belg08 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질염 예방 또는 개선 효과를 가지는 신규 락토바실러스 속 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 신규 락토바실러스 가세리 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 미생물 제제, 질염 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물, 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.

Description

질염 예방 또는 개선 효과를 가지는 락토바실러스 가세리 BELG08 및 이를 포함하는 조성물 {Lactobacillus gasseri BELG08 preventive or ameliorating effect on vaginitis and composition comprising the same}
본 발명은 질염 예방 또는 개선 효과를 가지는 신규 락토바실러스 속 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 신규 락토바실러스 가세리 균주, 이의 배양물 및 이를 포함하는 미생물 제제, 질염 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물, 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
질염(Vaginitis)이란 분비물, 가려움증, 통증 또는 악취를 유발하는 질의 염증반응을 의미하며, 질 내부의 정상적인 미생물 군집에 변화가 있거나 병원성 미생물에 의한 감염이 발생할 때 일어난다. 그 밖에도 질염을 일으키는 간접적인 원인으로는 알레르기, 질 세척, 성행위, 임신, 만성 스트레스, 항생제의 사용, 호르몬 변화 등 여러 요인이 알려져 있다. 질염의 종류에는 세균성 질염(bacterial vaginosis), 칸디다 외음부 질염(Candidasis), 트리코모나스 질염(Trichomonas vaginitis)이 있으며, 이 중 세균성 질염과 칸디다 외음부 질염이 전체 발병률의 70~80%를 차지한다. 특히 세균성 질염은 전 세계적으로 가임기 여성에게 널리 퍼진 생식기 질환이며, 전 세계 여성의 23~29%가 앓고 있다. 이를 치료하기 위해 매년 48억 달러가 사용되고 있지만, 치료법의 한계로 인해 재발률이 높은 실정이다. 현재 질염을 치료하기 위해 메트로니다졸(Metronidazole)과 같은 항생제를 크림 형태로 직접 질 내에 도포하거나 경구 투여하는 방법을 사용하고 있다. 하지만 메트로니다졸과 같은 항생제는 광범위한 작용 범위로 인해 유익한 유산균을 포함한 질 내의 다양한 정상 미생물 군집을 붕괴시킬 수 있으며, 이러한 질 내 정상 미생물 군집의 붕괴는 기회 감염성 병원균에 의한 감염을 가속화시켜 또 다른 감염의 원인이 될 수 있다.
여성의 질 내 미생물 군집은 대다수가 단일 또는 다중의 락토바실러스 속에 의해 지배되며, 이러한 미생물 군집은 5가지 커뮤니티 상태 유형(CST)으로 구분된다. CST I, II, III 및 V는 각각 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners) 및 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenii)에 의해 지배된다. 반면에 CST IV는 가드네렐라, 아토포비움과 같은 혐기성 및 미호기성 박테리아를 특징으로 하는 미생물 군집의 높은 다양성을 나타낸다. CST IV는 다른 유형에 비해 질 내의 pH가 높으며(>4.5) 성병, 골반염, 자궁내막염, 조산 등의 유발 가능성이 높은 것으로 보고되고 있다.
가드네렐라 바지날리스는 세균성 질염을 앓고 있는 환자에게서 가장 흔하게 발견되는 박테리아이며, 세균성 질염의 발병 유무를 결정할 때 높은 민감도를 보여준다. 가드네렐라 바지날리스는 시알리다제(Sialidase) 및 vaginolysin의 생성, 바이오필름(Biofilm) 형성과 같은 병원성 인자 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 시알리다제는 질 내 점막을 구성하고 있는 시알로글라이칸(Sialoglycans)을 시알릭산(Sialic acid) 잔해물로 분해함으로써 질 내 점막의 붕괴를 야기하여 유해균의 침투를 용이하게 한다. Vaginolysin은 기공 형성 단백질(Pore-forming toxin)의 일종으로 세포외 독소로 작용하여 질 상피세포와 같은 대상을 용해시킨다. 또한, 바이오필름의 형성은 질 내 유해균에 대해 숙주의 면역반응, 항생제, 유산(Lactic acid), 과산화수소(H2O2)의 작용을 회피할 수 있는 안전한 서식처를 제공한다. 이는 세균성 질염이 유발 및 재발되는데 핵심적인 역할을 수행한다. 또한, 가드네렐라 바지날리스는 초기 바이오필름 형성에 핵심적인 박테리아이며, 아토포비움 바지내와 같은 혐기성 박테리아의 부착과 생존율 향상에 도움을 준다고 보고되고 있다.
락토바실러스 속은 질 내의 혐기성 환경에서 성장하며 유산, 과산화수소, 박테리오신(Bacteriocin)과 같은 다양한 항균 화합물을 생성하여 건강한 질 내 미생물 군집 형성에 기여하고, 외부로부터 유입되는 유해균의 침입과 정착을 예방한다. 락토바실러스 속은 질 내부의 pH 값을 4.5 미만으로 유지하는 L-유산(L-lactic acid) 및 D-유산(D-lactic acid)의 주요한 공급원이며, 질 상피 세포에 부착할 수 있어 결합 부위에 대해 다른 유해균과 경쟁하여 감염을 예방할 수 있다.
일반적으로 락토바실러스 속은 외부로부터 질 내 환경을 보호하는 역할을 수행하지만, 락토바실러스 이너스는 질 내 미생물 군집의 불균형과 밀접한 관련이 있다. 락토바실러스 이너스는 질 내 환경에서 흔하게 발견되는 종이지만, 다른 락토바실러스 종과 달리 세균성 질염과 관련된 유해균과 공존할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 락토바실러스 이너스는 D-유산 또는 과산화수소를 생성하지 못하며, 가드네렐라 바지날리스가 생산하는 독소인 vaginolysin과 유사한 계열의 inerolysin을 생산하는 것으로 알려진 유일한 락토바실러스 종이다. 실제로 락토바실러스 이너스가 우점하고 있는 질 내 미생물 군집은 세균성 질염으로의 전환이 빈번하게 관찰되고 있다. 따라서 락토바실러스 이너스는 락토바실러스 속에 속하는 종임에도 불구하고 질 내 환경에 대한 보호적인 기능보다는 세균성 질염의 유발 위험을 증가시키는 잠재적인 유해균으로 간주할 수 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 세균성 질염 및 칸디다 외음부 질염과 같은 질환에 예방과 치료에 있어서 안전하고 효과적인 균주에 대한 연구가 필요한 실정이다.
한국 등록특허 제1750468호 (2017.06.19 공고)
본 발명의 목적은 앞서 언급한 종래기술의 문제점을 인식하고, 신규 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 균주 또는 이의 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 미생물 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 질염 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 질염 예방, 개선 또는 치료용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 수탁번호 KCTC 15054BP의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BELG08 균주 또는 이의 배양물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 질염 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 질 내 유해균에 대한 항균효과가 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 균주에 대한 항균 효과가 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae) 균주에 대한 항균 효과가 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners) 균주에 대한 항균 효과가 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주에 대한 항균 효과가 우수하다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 질 내 산성도를 낮게 유지하여 건강한 질 내 환경 조성에 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 자가응집성 및 질 내 부착능이 우수하며, 이에 따라 장기적으로 질 내 환경 개선에 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 상기 균주는 바이오필름 형성능이 우수하여 질 내 유해균이 질 내에 정착하는 것을 방지한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 상기 균주는 항염 효능이 우수하여 질 내 유해균에 의한 염증 반응을 방지한다.
본 발명의 일측면에 따른 균주, 배양물 및 이를 포함하는 조성물은 상기 균주는 소취능이 우수하여 질 내 악취를 유발을 방지한다.
도 1은 신규 Lactobacillus gasseri BELG08 균주(KCTC 15054BP)의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2은 신규 Lactobacillus gasseri BELG08 균주(KCTC 15054BP)의 당 이용성 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 1차 선별된 11균주의 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 균주에 대한 항균활성을, 3b는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주에 대한 항균활성을, 3c는 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae) 균주에 대한 항균활성을, 3d는 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners) 균주에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 4은 1차 선별된 11균주의 자가응집성 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 1차 선별된 11균주의 바이오필름 형성능 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 집락 형성 단위 측정을 통한 2차 선별된 3균주의 질 내 부착능 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 인간단핵구 THP-1 세포를 이용해 질 내 부착능이 가장 우수한 Lactobacillus gasseri BELG08 균주의 TNF-α 분비량 나타낸 그래프이다.
도 8은 한국표준시험연구원에서 KS I 2218 검지방법을 이용한 Lactobacillus gasseri BELG08 균주의 Trimetylamine (TMA)와 Ammonia에 대한 소취 시험성적서이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서 다음의 신규 균주 또는 이의 배양물을 제공한다 : 수탁번호 KCTC 15054BP의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BELG08 균주 또는 이의 배양물.
본 발명에 따른 균주는 각각 한국생명공학연구원에 2022년 08월 18일로 수탁하였다. 수탁번호 KCTC 15054BP의 락토바실러스 가세리 균주는 BELG08로 기재되어 있다.
수탁번호 KCTC 15054BP의 락토바실러스 가세리 BELG08 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 포함한다.
[서열번호 1]
ATTTGGTGCTTGCACCACATGAAACTAGATACAAGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGACTGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGGATAACAACACTAGACGCATGTCTAGAGTTTAAAAGATGGTTCTGCTATCACTCTTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTTAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAGTGCAAACCTAAGAGATTAGGAGTTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAACCTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTGAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGTAGAGTCTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGATAACCTTTA
상기 균주는 질내 유해균에 대한 항균 활성, 유산 생성능, 질내 부착능, 항염, 바이오필름 형성능 또는 소취능을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
세균성 질염 및 칸디다 외음부 질염 유발균에 대한 우수한 항균활성, 유산 생성능, 질 내 부착능, 바이오필름 형성능, 항염 효능 및 소취능을 가지는 바, 세균성 질염 및 칸디다 외음부 질염 예방, 개선, 또는 치료 효과를 제공할 수 있다.
상기 질내 유해균은 세균 및 진균을 포함한다. 상기 질내 유해균은 예를 들어, 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 균주, 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae) 균주, 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners) 균주 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 "배양물"은 상기 균주를 배양 배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미할 수 있다. 상기 배양물은 균주를 포함하거나, 포함하지 않는 무세포 상등액일 수 있다. 상기 배양물은 제형이 액체 또는 고체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양물의 다양한 형태 예를 들어, 배양물의 농축액, 건조물 또는 추출물이 포함될 수 있다.
상기 추출물은 물, 유기용매 등을 이용하여 추출할 수 있으며, 예를 들면, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합 용매 등을 이용하여 추출할 수 있다.
상기 배양물의 다양한 형태 예를 들어, 배양물의 농축액, 건조물 또는 추출물이 포함될 수 있다.
상기 균주는 예를 들어 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 질염 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 질염 또는 질염 관련 질환, 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. "치료 또는 개선"은 질염 또는 질염 관련 질환, 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/ 또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 개선적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다. 상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토오스, 글루코오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 생약 추출물 또는 생약 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 오염물질에 의해 유발되는 질환의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 피부 외용제 조성물에 배합되는 일반적인 성분들, 예를 들면 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 또는 향료 등과 적절히 배합하여 사용할 수 있다. 상기 피부 외용제는 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다. 본 명세서에 개시된 유효성분 외에 함유할 수 있는 액체 성분에는 특별한 제한점이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올 등이 있다. 상기의 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성향미제(예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 명세서에 개시된 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 일 측면에서 약 5 내지 12 g일 수 있다. 상기 식품 조성물은 일 측면에서 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그 염, 알긴산 및 그 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하고, 건강기능식품은 질염의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 낙농제품, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다.
이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 포함할 수 있다.
"의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함될 수 있다.
의약외품으로 사용하는 경우 상기 균주 또는 이의 배양물을 사용하거나, 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 락토바실러스 가세리 BELG08 균주의 분리
한국 여성에게 맞는 신규 균주를 선발하기 위해 건강한 여성 성인의 분변 및 모유를 시료로 사용하였다. 시료 1g을 인산완충생리식염수(Phosphate-buffer saline, PBS)에 10배 연속 희석한 후 희석액 0.1mL를 MRS 평판배지(Difco, MI, USA) 및 mucin(Sigma Aldrich, USA)을 함유한 MRS 평판배지에 도말하여 혐기조건에서 3일간 배양하였다. 형성된 단일 집락을 MRS 평판배지에서 순수 분리 유무를 확인하였으며, 계통학적 및 생화학적 분석을 통한 균주 동정을 진행하였다.
실시예 2. 락토바실러스 가세리 BELG08 균주의 동정
1) 계통학적 분석
균주의 동정을 위해 Bionics (Seoul, Korea)에 16S rRNA 염기서열 분석을 의뢰하였다. 균주의 순수배양액 1mL에서 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA를 주형으로 16S rRNA 유전자 영역을 27F(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC A-3'), 1492R(5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') primer로 PCR을 수행하여 DNA 염기서열 분석을 진행하였다. 염기서열 분석 결과와 R 소프트웨어의 SangeranalyseR 프로그램을 사용하여 신뢰할 수 있는 수준의 염기서열을 획득했다. 분석하여 얻은 염기 서열은 EzBioCloud((http://www.ezbiocloud.net)의 16S rRNA 데이터베이스에 등록된 다른 표준 균주와의 상동성을 비교하였다. 염기서열 분석 결과 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 신규 균주는 Lactobacillus gasseri ATCC 33323T와 99.93%의 상동성을 나타내었다. Mega X program을 이용하여 락토바실러스 종간의 진화적 거리를 분석하고 계통도를 얻었다 (도 1).
2) 생화학적 분석
선별된 균주의 당 이용성을 분석하기 위해 API 50 CH kit(BioMerieux, Lyon, France)를 사용하여 49개의 탄소원에 대한 이용성을 확인하였다. MRS 한천배지에서 배양된 균주의 집락을 2 MacFarland의 탁도로 조절하여 현탁액을 제조하였다. 탁도를 조절한 API 50 CHL medium을 API 50CH 스트립 튜브에 120㎕씩 분주하고 큐플에 미네랄 오일(mineral oil)을 2 방울씩 첨가하여 37℃에서 24 시간 및 48 시간 동안 배양하여 당 이용 패턴을 확인하였다. 동정 결과는 API web 프로그램()을 사용하여 확인하였다. 동정결과, 도 2에 표시된 바와 같이 락토바실러스 가세리와 99.9% 로 동일함을 나타내었다.
이에 본 발명자는 상기 균주를 신규한 락토바실러스 가세리 균주로 동정하였고, Lactobacillus gasseri BELG08로 명명하여 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2022년 08월 18일자로 기탁하였다 (기탁번호 KCTC 15054BP).
실험예 1. 락토바실러스 가세리 BELG08의 유산 생산능
본 발명의 락토바실러스 가세리 BELG08(Lactobacillus gasseri BELG08)의 무세포 상등액에 있어, 유산 생성능과 pH를 측정하였다.
1) 유산균 배양
여성의 분변, 모유로부터 분리한 여성유래 49균주와 상용 균주의 단일집락은 MRS 액체배지에 접종하여 37℃, 24시간 배양하였다.
2) 유산 생성능 및 pH 측정
유산균들의 유산 생성능을 알아보기 위해 먼저 L-유산만 생산 가능한 균총의 culture pH와, D-유산과 L-유산 둘다 생산 가능한 균총의 culture pH가 유사하고 상호관계에 있다는 논문을 근거로 실험을 디자인하였다. 24시간 배양된 배양액을 원심분리(3,600rpm, 15분)하여 무세포 상등액을 획득한 뒤, 0.22μm syringe filter를 이용해 여과했다. 여과된 무세포 상등액은 Cedex Bio HT Analyzer(Roche, swiss)를 사용하여 L-lactate를 측정하였다. 이후 pH 측정기(CAS, Republic of Korea)를 이용하여 무세포 상등액의 pH를 측정하였다. 오직 L-유산만 생산 가능한 균주의 pH와 L-유산의 생산량을 구하여 전체 유산 생산량과 D-유산의 생산량을 계산했다. pH와 전체 유산 생산량은 y=4152e-1.431x 식에서 유효 pH 3.7-6.2 범위내에서 R2=0.9934로 유의하게 계산됐다.
실험예 2. 락토바실러스 가세리 BELG08의 질 내 병원균에 대한 항균효과 (O.D)
본 발명의 락토바실러스 가세리 BELG08(Lactobacillus gasseri BELG08)의 무세포 상등액에 있어, 질염 유발 미생물에 대한 항균 활성을 흡광도로 측정하였다.
1) 유산균 배양
여성의 분변, 모유로부터 분리한 여성유래 49균주와 상용 균주의 단일집락은 MRS 액체배지에 접종하여 37℃, 20시간 배양하였다.
2) 병원성균 배양
본 실험에서 사용된 칸디다 알비칸스(Candida albicans SC5314) 균주는 한국미생물보존센터에서 분양 받아 Yeast malt(YM) 배지에서 25℃, 48시간 호기 배양하여 사용하였다. 본 실험에서 사용된 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis KCTC5096T) 균주, 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae KCTC15240 T) 균주, 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners KCTC15516T) 균주는 한국생명공학연구원에서 분양 받아 피브린이 제거된 5% 양 혈청을 함유한 Columbia blood(MB cell, Republic of Korea) 배지에서 37℃, 24-48시간 혐기 배양하여 사용하였다.
3) 항균 활성
유산균을 배양한 후 원심분리하여 무세포 상등액을 획득한 뒤, 0.22μm syringe filter를 이용해 여과했다. 병원성 균은 0.9% saline 용액에 1 x 106-7 CFU/mL 수준으로 희석하였다. 칸디다 알비칸스 균주는 상등액과 배양액 비율을 1:2, 최종 농도를 103 CFU/mL로 접종하여 25°C에서 48시간, 가드네렐라 바지날리스, 아토포비움 바지내 및 락토바실러스 이너스는 상등액과 배양액의 비율을 1:4, 최종 농도를 106 CFU/mL가 되도록 접종하여 37°C에서 24-48시간 배양하였다. 배양액은 Microplate Reader를 이용하여 O.D600에서 측정하여 각 유산균 균주들의 항균력을 나타내었다.
4) 우수 균주 1차 선별
여성의 분변, 모유로부터 분리한 여성유래 49균주와 상용 균주 중 질 내 유해균에 대해 흡광도 측정을 통한 항균활성 및 유산 생산능(15g/L 이상)이 우수한 여성유래 11균주를 1차 선별하였다.
실험예 3. 락토바실러스 가세리 BELG08의 질 내 병원균에 대한 항균효과 (CFU)
본 발명의 락토바실러스 가세리 BELG08(Lactobacillus gasseri BELG08)의 무세포 상등액에 있어, 질염 유발 미생물에 대한 항균 활성을 집락 형성 단위로 평가하였다.
1) 유산균 배양
1차 선별된 여성유래 11균주와 상용 균주의 단일집락은 MRS 액체배지에 접종하여 37℃, 20시간 배양하였다.
2) 병원성균 배양
칸디다 알비칸스 균주는 Yeast malt (YM) 배지에서 25℃, 48시간 호기 배양하여 사용하였다. 가드네렐라 바지날리스 균주, 아토포비움 바지내 균주, 락토바실러스 이너스 균주는 피브린이 제거된 5% 양 혈액을 함유한 Columbia blood (MB cell, Korea) 배지에서 37℃, 24-48시간 혐기 배양하여 사용하였다.
3) 항균 활성
유산균을 배양한 후 원심분리한 뒤, 0.22μm syringe filter를 이용해 무세포 상등액을 획득하였다. 질 내 유해균은 0.9% saline 용액에 1 x 106-7 CFU/mL 수준으로 희석하였다. 칸디다 알비칸스 균주는 상등액과 배양액 비율을 1:2, 최종 농도 103 CFU/mL로 접종하여 25°C에서 48시간, 가드네렐라 바지날리스, 아토포비움 바지내 및 락토바실러스 이너스는 상등액과 배양액 비율을 1:4, 최종 농도를 106 CFU/mL가 되도록 접종하여 37°C에서 24-48시간 배양하였다. 다음 실험 배양액을 연속희석법과 피브린이 제거된 5% 양 혈청을 함유한 Columbia blood(MB cell, Republic of Korea) 배지를 사용하여 집락 형성 단위(CFU)를 측정하였다. 집락 형성 단위 측정을 위해 혐기 자 (Anaerobic jar, BioMed)에서 배양을 진행하였다. 1차 선별된 11균주의 항균활성 결과는 도 3에 나타냈다.
도 3a에 나타난 바와 같이 BELG08 균주는 가드네렐라 바지날리스에 대해 5.7의 Log CFU/mL 감소율을 나타냈다. 이는 0.4의 Log CFU/mL 감소율을 보인 Lactobacillus gasseri CP-LG-01 (이하, CP-LG-01)보다 높은 항균력을 보였다.
도 3b에 나타난 바와 같이, BELG08 균주는 칸디다 알비칸스에 대해 70.1%의 항균력을 보였다. 이는 53.7%의 항균력을 보인 CP-LG-01보다 높은 항균력을 보였다.
도 3c에 나타난 바와 같이, BELG08균주는 아토포비움 바지내에 대해 7.9의 Log CFU/mL 감소율을 보였다. 이는 7.9의 Log CFU/mL 감소율을 보인 CP-LG-01와 동등한 항균력을 보였다.
도 3d에 나타난 바와 같이, BELG08 균주는 락토바실러스 이너스에 대해 76.2%의 항균력을 보였다. 이는 42.6%의 Log CFU/mL의 항균력을 보인 CP-LG-01보다 높은 항균력을 보였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 항균활성 결과, 신규 Lactobacillus gasseri BELG08는 분리된 균주 중에서 가드네렐라 바지날리스 (Gardnella vaginalis), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 아토포비움 바지내 (Atopobium vaginae), 락토바실러스 이너스 (Lactobacillus iners)에 대해 항균 활성이 가장 우수하였다.
특히, 가드네렐라 바지날리스, 아토포비움 바지내에 대해 높은 항균 활성이 보고된 동일속 동일종의 Lactobacillus gasseri CP-LG-01 보다 Lactobacillus gasseri BELG08의 항균력이 더 높았으며 칸디다 알비칸스, 락토바실러스 이너스에 대해서도 Lactobacillus gasseri CP-LG-01보다 높은 항균 활성이 확인되었다.
실험예 4. 락토바실러스 가세리 BELG08의 자가응집성
본 발명의 락토바실러스 가세리 BELR47(Lactobacillus gasseri BELG08)의 균주 특성에 있어 세포 부착능과 관련된 특성을 확인하였다.
1) 유산균 배양
항균활성 및 유산 생성능이 우수한 여성 유래 11균주와 상용 균주의 단일 집락은 MRS 액체배지에 접종 후 37℃, 20시간 배양하였다. 이후 배양액은 원심분리기(3,600 rpm, 15 min)를 이용하여 상등액을 제거하고, 인산완충생리식염수를 이용하여 2번 세척하였다.
2) 자가응집성 (Auto-aggregation)
자가응집성은 균주가 질 내 환경에서 세포에 빠르게 가라앉을 수 있는 특성으로 균주가 질 내에 정착하는데 도움을 준다. 자가응집성 실험을 보기 위한 적정 O.D는 논문을 참고하여 O.D600에서 0.55-0.60으로 적정하였다. 적정된 O.D를 A0로 두고, 37°C에서 각 3시간 또는 24시간 배양된 상층액의 O.D를 측정하였다 (At). 자가응집성 계산식은 다음과 같다.
Auto-aggregation (%) = (1-At/A0) x 100
1차 선별된 11균주와 상용 균주의 자가응집성 결과는 도 4에 나타냈다.
실험예 5. 락토바실러스 가세리 BELG08의 바이오필름 형성능
바이오필름 형성능은 균주가 세포 외벽에 정착을 원활하게 하고, 유해균의 바이오필름을 밀어내며 우점할 수 있도록 도움을 준다. 질 내 미생물 군집이 안정적으로 유지될 수 있도록 도와주는 바이오필름을 측정했다.
1) 유산균 배양
유산 생성능 및 항균활성이 우수한 여성유래 11균주와 상용 균주의 단일 집락은 MRS 액체배지에 접종 후 37℃, 20시간 배양하였다. 이후 배양액은 원심분리기(3,600 rpm, 15 min)를 이용하여 상등액을 제거하고, 인산완충생리식염수를 이용하여 2번 세척하였다.
2) 바이오필름 형성능
바이오필름 형성능 실험을 보기 위한 적정 O.D는 논문을 참고하여 O.D600에서 0.55-0.60으로 적정하였다. 희석된 균주들은 MRS-tween80 배지가 들어간 96-well microplate에서 72시간 배양하였다. 배양 후 상층 배양액을 제거하여 인산완충생리식염수를 이용하여 2번 세척하였다. 이후 60°C 오븐에서 1시간동안 고정했고 0.1% crystal violet으로 30분간 염색하였다. 염색된 바이오필름은 인산완충생리식염수로 한 번 세척했고 96%에탄올로 탈염색 진행한 후 새로운 96-well microplate로 옮겨 O.D 570nm에서 측정하였다. 선별된 11균주와 상용 균주의 바이오필름 형성능 결과는 도 5에 나타냈다.
선별된 11균주에 대한 바이오필름 형성능 결과를 토대로 유해균의 바이오 필름을 밀어내며 우점할 수 있는 기능성에 대한 데이터를 확보하였다. Lactobacillus gasseri BELG08은 동일속 동일종의 11균주 및 Lactobacillus gasseri CP-LG-01보다 바이오필름 형성능이 우수하거나 비등하였다.
1차 선별된 락토바실러스 가세리 11균주에 대해 유산 생성능과 항균 활성, 자가응집성, 바이오필름 형성능 결과를 토대로 2차로 3균주를 선별하였다.
[표 1]
Figure 112022111936582-pat00001
실험예 6. 락토바실러스 가세리 BELG08의 질 내 부착능
실제 질 내에 부착정도를 가늠하기 위해 자궁경부암 세포(HeLa cells)에 대한 세포 부착능을 평가하였다.
1) 자궁경부암 세포주 배양
세포부착능을 실험하기 위해 American Type Culture Collection (ATCC)에서 HeLa CCL-2를 분양 받았다. HeLa CCL-2 세포는 소태아혈청이 첨가된 EMEM(ATCC) 배지에 배양하였다. 세포는 5% CO2가 공급되는 37°C 배양기에서 배양하였다.
2) 유산균 배양
2차로 선별된 3균주의 단일 집락은 MRS 액체배지에 접종 후 37°C에서 20시간 배양하였다.
3) 세포 부착능
20시간 배양된 유산균 배양액은 원심분리기(3,600 rpm, 15 min)를 이용하여 상등액을 제거하고 인산완충생리식염수를 이용하여 두 번 세척하였다. 접종 균수는 1x108 CFU/well이 되도록 적정하였다. 세포 부착능 실험은 자궁경부암 세포를 5x105 cells/well의 농도로 6-well plate에 접종했다. 24시간 배양 후 단일 세포층 (Mono-layer)이 형성되면 준비된 균주를 접종하여 5% CO2가 공급되는 37°C 배양기에서 1시간동안 함께 배양하였다. 이후 상층액을 흡입기로 제거한 뒤, 인산완충생리식염수로 세척하여 0.25% trypsin-EDTA 150㎕로 부착된 균주를 탈착하였다. 인산완충생리식염수를 850㎕ 추가로 분주하여 균주를 회수하여 회수된 균주의 CFU/mL를 측정하였다. 집락 형성 단위 측정을 통해 선별된 3균주의 질 내 부착능 결과는 도 6에 나타냈다.
2차로 선별된 3균주에 대한 질 내 부착능 결과를 토대로 유산균이 질 내에 정착할 수 있는 기능성에 대한 데이터를 확보하였다. Lactobacillus gasseri BELG08에서 16.2%의 질 내 부착능이 관찰되었으며, 이는 동일속 동일종의 분리 균주 중에서 질 내 부착능이 가장 우수하였다.
유산 생성능, 질염 유발 유해균주에 대한 항균활성, 바이오필름 형성능, 질 내 부착능 실험 결과를 토대로 다기능 질 건강 유산균으로써 Lactobacillus gasseri BELG08 균주를 최종적으로 선별하였다.
실험예 7. 락토바실러스 가세리 BELG08의 항염 효과
질 내 염증의 예방 또는 개선을 위한 균주의 항염 효과를 인간단핵구 THP-1 세포 내 TNF-a 감소 능력을 평가하였다.
1) 세포주 배양
American Type Culture Collection (ATCC)에서 인간단핵구 THP-1 세포를 분양 받았다. THP-1 세포는 소태아혈청이 첨가된 RPMI(ATCC) 배지에 배양했다. 세포는 5% CO2가 공급되는 37°C 배양기에서 배양하였다.
2) 유산균 배양
다기능 질 건강 유산균 BELG08균주의 단일 집락은 MRS 액체배지에 접종 후 37°C에서 20시간 배양하였다.
3) 항염 효과 확인
분리된 균의 항염 효과를 측정하기 위해 Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay(ELISA) kit를 이용하여 실험을 수행하였다. 인간단핵구 THP-1 세포는 10% 우태아형청(FBS), penicillin(100 IU/mL), streptomycin(100 mg/mL)이 첨가된 RMPI 배지에 배양하였다. 96 well plate에 5 x 105 cells/mL 농도로 인간단핵구 THP-1 세포를 분주하였다. 각 균주는 5 x 105 CFU/mL 의 농도가 되도록 인간단핵구 THP-1 세포 위에 접종하고 lipopolysaccharide(LPS) (1 mg/mL) 1ul 처리한 뒤, 5% CO2 존재 하에 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 well에서 조심스럽게 배지를 수거, 원심분리 한 후 상등액을 취한 다음 상등액에 포함된 TNF-a 양을 ELISA Kit (Mabtech, USA)를 사용하여 측정하였다. 음성 대조군으로는 균주 미처리군, 양성 대조군으로는 LPS (Lipopolysaccharide, Sigma)를 각각 1 mg /mL의 농도로 처리한 샘플을 사용하였다. 실험 결과는 표준편차(SD)와 함께 도 7에 나타냈다.
도 7에 나타난 바와 같이 BELG08균주는 전염증성 사이토카인 TNF-α의 분비를 2,782 pg/mL에서 1,376 pg/mL로 유의미하게 감소시켰다.
해당 데이터를 통해 선별된 BELG08균주의 질 내에 염증 완화 효능에 대한 데이터를 확보하였다.
실험예 8. 락토바실러스 가세리 BELG08의 소취능
질 분비물은 질에 있는 땀샘, 바르톨린샘 등 분비샘의 분비액과 질내 세균의 분비물, 노화로 인한 질벽 상피세포, 점액 등으로 이루어져 있다. 질염이 생긴 경우 생선 비린내를 띄게 되는데, 이 생선 비린내에 대표적 성분이 Trimethylamine (TMA)과 Ammonia이다. 실제 질내 분비물에 의한 냄새를 제거하는 기능성을 알아보기 위해 Trimethylamine (TMA)와 Ammonia에 대해 소취능을 평가하였다.
1) 유산균 배양
소취능을 실험하기 위해 항균활성과 부착능이 우수한 Lactobacillus gasseri BELG08 균주의 단일집락은MRS 액체 배지에 접종 후 37°C에서 20시간 배양하였다.
2) 삼자기관 테스트 진행
정확한 측정을 위해 삼자기관인 한국표준시험연구원 (KSTR)에 BELG08의 소취 시험을 의뢰하였다. 표준 시험방법인 KS I 2218 시험법으로 진행하였고, 이 시험법은 검지관식 가스측정기 평라를 진행하였으며, 2L 챔버에 시료와 가스 100 ppm을 넣은 뒤 30, 60, 90, 120분에 걸쳐 소취율을 측정한다. BELG08은 암모니아 초기농도 (100 mg/kg) 대비 시험 후 농도 (0 mg/kg)로 감소율 99.9%의 소취능을 보였으며, Trimethylamine 초기농도 (28 mg/kg) 대비 시험 후 농도 (0 mg/kg)로 99.9%의 소취능을 보였고 해당 시험성적서는 도 8에 나타내었다.
이에, 본원발명의 발명자들은 신규로 분리 및 동정된 Lactobacillus gasseri BELG08 균주가 세균성 질염 및 칸디다성 질염을 효과적으로 억제하고, 염증을 억제하는 효과를 가짐으로써 질염 예방 또는 개선에 유용하며 질염으로 인한 악취에 대한 소취능을 확인하였다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC 15054BP
수탁일자 : 220818

Claims (10)

  1. 수탁번호 KCTC 15054BP의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) BELG08 균주.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 서열을 포함하는 16S rRNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 질내 유해균에 대한 항균 활성, 유산 생성능, 자가응집성, 질내 부착능, 항염, 바이오필름 형성능 또는 소취능을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 질내 유해균은 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 균주, 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae) 균주, 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners) 균주 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주인 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 질염 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 질염 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는 질염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  10. 삭제
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