KR20210128429A - 다중-락토바실러스 조성물 및 여성의 질 건강에 대한 그의 적용 - Google Patents
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Abstract
다중-락토바실러스 조성물. 상기 다중-락토바실러스 조성물은 중국에서 건강한 여성의 질로부터 분리 및 선택된 우세한 균주이다. 상기 다중-락토바실러스 조성물은 다음의 활성 성분들 중 적어도 3 종을 포함한다: 락토바실러스 존소니이, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 크리스파투스, 및 락토바실러스 젠세니이.
Description
본 발명은 미생물의 분야, 특히 다중-락토바실러스 조성물 및 여성의 질 건강에 대한 그의 적용에 관한 것이다.
[Journal of Practical Obstetrics and Gynecology]에 의해 공개된 [Research Progress and Clinical Significance of Vaginal Microecology], [Chinese Journal of Microecology]에 의해 공개된 [Advances in Research on Survival State of Lactobacillus in Vaginal Microecology] 및 다른 연구 보고서에 따르면, 인간의 질에는 300 종 이상의 공생 미생물이 있다. 이들은 서로 상호-제한(inter-restrict) 및 상호-전환(inter-convert)시켜 동적 균형을 형성한다. 따라서, 다양한 종류의 질염이 질 미세생태계 환경에서의 불균형에 의해 초래된다.
출산 연령의 건강한 여성의 질은 우세한 균총(flora)으로서 락토바실러스를 갖는 미세-환경이다. 락토바실러스는 질 상피 세포 내부의 글리코겐에 의해 성장하고 H2O2, 락트산 및 박테리오신(bacteriocin)을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 질의 상피에 경쟁적으로 부착하여 결합 부위를 점유하고 질내 영양분을 소화시킬 수 있으며, 이로 인해 질 내를 지배하고 다른 병원성 박테리아 및 혐기성생물(anaerobe)의 과도한 증식을 억제한다. 지난 수 십년에 걸친 연구는 락토바실러스가 인간의 질에서 매우 다양하고, 상이한 락토바실러스가 질의 미세환경에서 상승 작용을 하며, 락토바실러스가 상이한 도메인(domain) 및 개체군(population)에서 다름을 발견하였다. 거시적 관점에서, 상이한 인종 유래의 건강한 여성의 질 내의 우세한 박테리아는 현저하게 다르다(연구에 따르면, 80%-90%의 아시아인 및 백인 인종은 우세한 박테리아로서 락토바실러스를 갖지만, 흑인 및 스페인 여성의 60% 미만이 우세한 박테리아로서 락토바실러스를 갖는다). 미시적 관점에서, 상이한 개인 간에 우세한 락토바실러스에 있어서 개인차가 있다. 현재, 20 종 이상의 락토바실러스가 질 미세환경으로부터 분리되어 있다. 북미에서 여성의 질 생태계 균총은 5가지 타입으로 나누어질 수 있다. 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 이너스(Lactobacillaus iners), 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii) 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)를 포함하는 4 종의 우세한 박테리아가 있다. 다섯번째는 다른 락토바실러스 및 혐기성생물이다. 중국에서 건강한 여성의 질 내의 가장 공통의 우세한 락토바실러스는 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 젠세니이, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 락토바실러스 이너스를 포함한다.
임의의 환경 인자 또는 외부의 개입이 질 미세생태계의 균형을 파괴할 때, 질 미세생태계 환경은 취약한 상태로 접어들 것이고, 따라서 병원성 박테리아의 재생산 또는 침입에 대해 저항하기 쉽지 않게 되어 다양한 종류의 질염을 초래한다. 박테리아성 질증(bacterial vaginosis)(이하, "BV"로 나타냄)은 15%-52%의 감염률을 갖는 흔한 부인과 질환이다. 이것은 가드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis) 및 다른 혐기성생물이 과도하게 재생산되어 락토바실러스를 치환함으로써 유발되는 질 미생물불균형(dysbacteriosis)에 대한 임상 증후군인 질 감염성 질환이다. BV가 조직학적 융모양막염, 양수 감염, 제왕절개후 자궁내막염 및 다른 불량한 임신 징후 및 임신 합병증을 초래하는 위험 인자임이 보고되어 있다.
임상 치료 방법의 경우, BV는 메트로니다졸 또는 클린다마이신으로 처리된다. 메트로니다졸은 전구약물(prodrug)이며, 다시 말해, 혐기성 환경에서 메트로니다졸의 니트릴은 박테리아 세포내 효소적 환원을 통해 아미노로 환원되어 항생제를 활성 형태로 전환시키고, 이후 DNA에 공유적으로 결합해 그 나선 구조를 손상시키고 단일 및 이중 가닥을 파괴하며, 이로 인해 DNA, 분해 및 병원체 죽음을 실현한다; 그리고, 클린다마이신은 박테리아 리보솜 상의 50S 리보솜 서브유닛(subunit)에 결합하여 펩티드 사슬의 연장을 방지할 수 있고, 따라서 박테리아 세포의 단백질 합성을 억제하고 박테리아 죽음을 유발한다. 항생제 치료법은 그 효과가 신속하지만, 다음을 포함하는 2가지 상당한 결점을 갖는다: (1) 미세환경 내의 모든 항생제 민감성 미생물에 대한 억제 효과를 가져서, 치료시 질 미세생태계가 병원성 박테리아의 침입에 대한 건강한 균형 상태로 복원되지 않는다면, 억제된 또는 죽은 병원성 미생물 및 외래 병원성 미생물이 다시 재생산되어 질염의 재발 또는 새로운 질염을 초래한다. (2) 미생물의 약물 저항성 및 질 미세생태계 환경의 균형에 대한 항생제의 실패에 의해 난치성 BV가 초래될 것이다. 따라서, 항생제 치료법은 그 효과가 신속하지만, 재발률은 3개월 내에 최대 30%까지 높다.
질 미세생태계 불균형에 대한 치료는 멸균, 점성 막 및 질 미세생태계 균형의 복원을 포함한다. 멸균은 질염을 치료하기 위한, 다시 말해 과도하게 증식된 호기성생물(aerobe) 및 혐기성생물, 분아포자 또는 균사, 및 트리코모나드(trichomonad)를 포함하는 병원성 미생물을 억제 또는 죽이는 첫번째 단계이다. 병원성 미생물이 억제 또는 죽은 후, 질염을 치료하기 위한 최종 목표는 질 점막의 면역 복구 및 우세한 락토바실러스의 복원이다. 이때, 질 점막의 회복 또는 우세한 락토바실러스의 복원이 영향을 받는다면, 질내 물리화학적 환경은 정상으로 복원되지 않고, 억제된 또는 외래의 병원성 미생물은 다시 재생산되거나 심지어 질염의 재발 또는 새로운 질염을 초래할 것이다. 프로바이오틱스(probiotics)는 질에서 질 상피 수용체를 신속하게 점유하여 질을 보호할 수 있고, 이로 인해 질이 정상 미세환경으로 복원되고 질염의 재발을 감소시키는 것을 촉진한다. 따라서, 프로바이오틱 미세생태계는 현재의 기술 수단의 관점으로부터 BV를 치료하기 위한 최적의 방법이다.
2가지 종류의 질 미세생태계만이 중국에서 시판되고 있다. 첫번째 제품은 시안 증호 바이올로지 제약 주식회사(Xi'an Zhenghao Biology Pharmacy Limited Company)에 의해 생산되는 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis)를 포함하는 상업적으로 이용가능한 약물이며, 상기 박테리아는 질의 우세한 종은 아니고, 또한 상기 종의 박테리아는 조건적으로 병원성이다; 그리고, 다른 제품은 이너 몽골리아 수앙치 제약 주식회사(Inner Mongolia Shuangqi Pharmaceutical Co., Ltd.)에 의해 생산되는 한 락토바실러스 - 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii)를 포함하는 상업적으로 이용가능한 약물(상표명: "Wanze Shuangqi")이며, 상기 박테리아는 중국에서 여성의 질 내의 우세한 종에 속하지는 않는다. 따라서, 우세한 락토바실러스 균주(strain)에 의해 제조된 질 미세생태계로 BV를 치료하는 것이 보다 유리하다.
중국 특허 문헌 CN102851248A는 박테리아성 질증을 예방 및 치유하기 위한 락토바실러스 젠세니이를 개시하며, 여기서 상기 락토바실러스 젠세니이는 중국에서 건강한 여성 신체의 질로부터 분리된 우세한 락토바실러스이다. 중국 특허 문헌 CN 107794236A는 락토바실러스 크리스파투스 및 그의 적용을 개시하며, 여기서 상기 락토바실러스 크리스파투스는 BV를 치료하기 위해 중국에서 건강한 여성의 질로부터 분리된 우세한 락토바실러스이다. 중국 특허 문헌 CN 108004187A는 질의 정균적(bacteriostatic) 약물을 제조하기 위한 락토바실러스 가세리 및 그의 적용을 개시하며, 여기서 상기 락토바실러스 가세리는 중국에서 건강한 여성의 질로부터 분리된 우세한 락토바실러스이다. 앞서 나열된 3개의 중국 특허 문헌 이외에도, 중국에서 건강한 여성의 질로부터 분리된 우세한 락토바실러스 및 BV를 치료하기 위한 그의 적용에 관한 많은 유사한 관련 특허 문헌이 있다. 이들 모두는 중국에서 건강한 여성의 질로부터 스크리닝된 단일 락토바실러스로 BV를 치료하는 것이다.
인간의 질 내에 다양하고 풍부한 락토바실러스가 있으므로, 상이한 락토바실러스는 상이한 프로바이오틱 능력을 보이고, 질 미세환경에서 상승 작용을 한다. 또한, 개인차의 경우, 상이한 여성의 질 내의 우세한 균주는 조금 상이하다. 따라서, 다양한 락토바실러스 및 상이한 종의 프로바이오틱 능력을 종합적으로 고려하면서 질의 락토바실러스 프로바이오틱스를 고려하는 것이 필요하다. 이것은 BV가 넓은 치료 범위의 BV에 대한 단일 균주를 이용하는 것이 아니라 우세한 락토바실러스를 혼합함으로써 제조된 질 미세생태계로 치료되어야 함을 보여준다.
본 발명은 종래 기술의 문제점과 관련하여 중국에서 여성의 질 내의 우세한 균주에 속하는 다중-락토바실러스 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 상기 균주들은 길항작용(antagonism)이 없이 상호공생적(mutualistic)이며, 단일 우세한 균주보다 더 강한 프로바이오틱 능력을 생산하기 위한 상승 효과를 갖는다. 또한, 다중-락토바실러스는 박테리아성 질증(BV)의 치료에 보다 널리 사용된다.
본 발명에 의해 제공되는 다중-락토바실러스 조성물은 중국에서 건강한 여성의 질로부터 분리 및 스크리닝된 우세한 균주이다. 구체적으로, 상기 다중-락토바실러스 조성물은 적어도 다음의 활성 성분 중 3 종을 포함한다:
락토바실러스 존소니이, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이.
특히 상기 락토바실러스 존소니이는 락토바실러스 존소니이 Ljohn-1(기탁 번호: CCTCC 번호 2019426)이고; 상기 락토바실러스 가세리는 락토바실러스 가세리 Lgass-17(기탁 번호: CCTCC 번호 2019430)이고; 상기 락토바실러스 람노서스는 락토바실러스 람노서스 Lrham-6(기탁 번호: CCTCC 번호 2019428)이고; 상기 락토바실러스 크리스파투스는 락토바실러스 크리스파투스 Lcris-2(기탁 번호: CCTCC 번호 2019427)이고; 및 상기 락토바실러스 젠세니이는 락토바실러스 젠세니이 Ljen-10(기탁 번호: CCTCC 번호 2019429)임은 강조할 만하다. 전술한 다양한 락토바실러스는 중국에서 건강한 여성의 질로부터 스크리닝 및 분리되었고, 6월 4일에 CCTCC(China Center for Type Culture Collection)에 균주로서 보존되었다.
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| Ljohn-l.genomic.fasta | 락토바실러스 존소니이 | GCA_001270785.1_ASM127078vl_genomic.fna.gz | 95.3079 |
| Ljohn-l.genomic.fasta | 락토바실러스 존소니이 | GCA_001572665.l_ASM157266vl_genomic.fna.gz | 95.1633 |
| Ljohn-l.genomic.fasta | 락토바실러스 존소니이 | GCA_002803395.l_ASM280339vl_genomic.fna.gz | 95.0963 |
EzBiocloud에 업로드된 후, 락토바실러스 젠세니이 Ljen-10의 완전한 게놈 서열을 표 4에 나타낸 것과 같은 평균 뉴클레오티드 동일성(ANI) 비를 수득하기 위해 연관될 수 있는 동종의 모든 완전한 게놈 서열과 비교하여, 이것이 새로운 락토바실러스 균주임을 규정한다.
| 순차적 문헌의 이름 | 참조 문헌의 종 | 참조 문헌의 이름 | ANI (%) |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_002848045.1_ASM284804vl_genomic.fna.gz | 88.9784 |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_000155915.2_Lacto_젠세니이_1153_v2_genomic.fna.gz | 88.7036 |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_001936235.1_ASM193623vl_genomic.fna.gz | 88.6759 |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_002863405.1_ASM286340vl_genomic.fna.gz | 88.6432 |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_000466805.1_ASM46680vl_genomic.fna.gz | 88.5848 |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_000162335.1_ASM16233vl_genomic.fna.gz | 88.5791 |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_000175035.1_ASM17503vl_genomic.fna.gz | 88.5055 |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_001436455.1_ASM143645vl_genomic.fna.gz | 88.4346 |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_001012665.1_IM18-lvl_genomic.fna.gz | 88.4042 |
| Ljen-l0.genomic.fasta | 락토바실러스 젠세니이 | GCA_001012685.1_IM18-3vl_genomic.fna.gz | 88.3924 |
EzBiocloud에 업로드된 후, 락토바실러스 크리스파투스 Lcris-2의 완전한 게놈 서열을 표 5에 나타낸 것과 같은 평균 뉴클레오티드 동일성(ANI) 비를 수득하기 위해 연관될 수 있는 동종의 모든 완전한 게놈 서열과 비교하여, 이것이 새로운 락토바실러스 균주임을 규정한다.
| 순차적 문헌의 이름 | 참조 문헌의 종 | 참조 문헌의 이름 | ANI (%) |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_002861765.l_ASM286176vl_genomic.fna.gz | 99.3638 |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_001546015.l_ASM154601vl_genomic.fna.gz | 99.2264 |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_000176975.2_ASM17697v2_genomic.fna.gz | 99.2008 |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_001546025.l_ASM154602vl_genomic.fna.gz | 99.1693 |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_001541585.l_ASM154158vl_genomic.fna.gz | 99.0587 |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_001541515.l_ASM154151vl_genomic.fna.gz | 99.0447 |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_000301135.1_Lact_cris_FB077-07_Vl_genomic.fna.gz | 99.0328 |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_002861775.1_ASM286177vl_genomic.fna.gz | 99.0016 |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_000466885.2_ASM46688v2_genomic.fna.gz | 98.9705 |
| Lcris-2.genomic.fasta | 락토바실러스 크리스파투스 | GCA_000301115.1_Lact_cris_FB049-03_Vl_genomic.fna.gz | 98.9698 |
상기 다중-락토바실러스 조성물의 생균 수(viable count)는 105∼1011 CFU/g이고, 각각의 단일 박테리아의 함량은 105 CFU/g 이상이다. 본 발명에 따르면, 활성 성분으로서 상기 다중-락토바실러스 조성물을 갖는 세균학적 제조물은 현탁액 또는 동결건조된 박테리아 분말일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 다중-락토바실러스 조성물은 박테리아성 질증(BV)의 병원성 박테리아를 예방 또는 치료하기 위한 약물 또는 건강 관리 제품의 제조물에 적용된다.
본 발명에 따르면, 상기 다중-락토바실러스 조성물은 외음부를 위한 세정(sanitary) 물품, 예컨대 세정 냅킨, 탐폰 또는 외음부를 위한 건강 관리 용액의 제조에 적용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 다중-락토바실러스 조성물은 질의 균총의 균형을 조정하기 위한 약물 또는 건강 관리 제품의 제조에 적용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 다중-락토바실러스 조성물은 질의 상피 세포의 부착 기능을 갖는 약물 또는 건강 관리 제품의 제조에 적용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 다중-락토바실러스 조성물은 병원성 박테리아를 예방 및 치료하기 위한 약물, 건강 관리 제품 및 식품 첨가물의 제조에 적용될 수 있으며, 상기 병원성 박테리아는 가드네렐라 바기날리스, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 파리티피(Salmonella paratyphi) B 및 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae) 중 임의의 하나 이상을 비제한적으로 포함한다.
상기 다중-락토바실러스 조성물은 또한 제왕 절개에 의해 분만된 유아를 위한 외부 관리 제품의 제조에도 적용될 수 있다. 제왕 절개에 의해 분만된 유아는 여성의 질을 통해 태어나지 않기 때문에 출생 동안에 외인성 프로바이오틱스를 얻지 못할 것이다. 이러한 이유로 인해, 여성의 질로부터 스크리닝된 프로바이오틱스는 유아의 신체를 바르고 세척하기 위한 외부 관리 제품 내로 제조될 수 있다.
종래 기술과 비교하여, 본 발명은 다음의 유익한 효과를 갖는다:
건강한 여성의 질 내에 콜로니(colony)화된 락토바실러스의 다양한 균주를 가지며, 상이하거나 동일한 종의 상이한 균주는 상이한 프로바이오틱 능력을 갖는다. 따라서, 다양한 락토바실러스, 락트산 및 과산화수소 생산 능력, 병원성 박테리아의 억제 및 질 세포에 대한 부착을 종합적으로 고려하면서 질의 락토바실러스 프로바이오틱스를 고려하는 것이 필요하다. 질의 미생물불균형을 갖는 가능한 많은 여성을 포괄하는 한편 상이한 병원성 박테리아를 억제하는 능력을 강화하기 위하여, 본 발명자는 중국에서 건강한 여성으로부터 분리 및 스크리닝된 다양한 균주로부터 적절한 균주를 위한 합리적인 상용성(compatibility)을 수행할 것이고, 상기 분리 및 스크리닝된 락토바실러스를 3 종 이상의 락토바실러스 조합 제형에 의해 BV를 예방 및 치료하기 위해 사용할 것이다. 실험적 확인을 통해, 상기 다중-락토바실러스 조성물은 더 나은 프로바이오틱 능력을 갖고, 중국에서 여성의 질 내의 우수한 균주에 속한다. 따라서, 상기 다중-락토바실러스 조성물은 중국 여성의 질 질환을 치료 및 예방하는데 더 나은 효과를 가질 것이고, 또한 넓은 취급 범위를 가질 것으로 예상된다.
도 1은 단일 박테리아 및 조합 박테리아의 과산화수소 생산 능력의 순위를 비교한 도표이다.
도 2는 단일 박테리아 및 조합 박테리아의 락트산 생산 능력을 비교한 도표이다.
도 3은 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 가드네렐라 바기날리스에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 4는 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 Hela 세포에 대한 부착을 비교한 도표이다.
도 5는 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 스타필로코커스 아우레우스에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 6은 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 에세리키아 콜라이에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 7은 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 슈도모나스 애루기노사에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 8은 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 시겔라 디센테리애에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 9는 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 살모넬라 파리티피 B에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 10은 다중-락토바실러스 내의 모든 단일 박테리아 간의 견고한 공생 효과의 테스트 도표 1이다.
도 11은 다중-락토바실러스 내의 모든 단일 박테리아 간의 브로스(broth)의 공생 효과의 테스트 도표 2이다.
도 2는 단일 박테리아 및 조합 박테리아의 락트산 생산 능력을 비교한 도표이다.
도 3은 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 가드네렐라 바기날리스에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 4는 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 Hela 세포에 대한 부착을 비교한 도표이다.
도 5는 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 스타필로코커스 아우레우스에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 6은 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 에세리키아 콜라이에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 7은 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 슈도모나스 애루기노사에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 8은 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 시겔라 디센테리애에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 9는 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 살모넬라 파리티피 B에 대한 억제를 비교한 도표이다.
도 10은 다중-락토바실러스 내의 모든 단일 박테리아 간의 견고한 공생 효과의 테스트 도표 1이다.
도 11은 다중-락토바실러스 내의 모든 단일 박테리아 간의 브로스(broth)의 공생 효과의 테스트 도표 2이다.
다음의 문단들은 본 발명의 특정 실행예를 상세히 기술할 것이며, 본 발명의 실행예는 다음의 구현예들을 비제한적으로 포함한다. 과도한 불필요한 상세를 방지하기 위하여, 공개된 구조 또는 기능은 다음의 구현예에서 상세히 기술되지 않을 것이다. 달리 정의하지 않는 한, 다음의 구현예에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 보통 인식되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다음의 구현예에서 사용되는 모든 시약 소모품은 달리 특정하지 않는 한 보통의 생화학 시약이다.
락토바실러스 존소니이 Ljohn-1, 락토바실러스 가세리 Lgass-17, 락토바실러스 크리스파투스 Lcris-2, 락토바실러스 젠세니이 Ljen-10, 및 락토바실러스 람노서스 Lrham-6을 스크리닝 및 분리하기 위한 방법은 다음과 같다:
20-40세 여성의 질 분비 샘플을 수집하고, 질 면봉으로 중국에서 물리적 검사를 통과한다; 2 ㎖의 멸균 혐기성 PBS 버퍼 용액을 상기 면봉을 갖는 혐기성 튜브 내로 채우고, 완전히 교반하여 균일하게 혼합하고, 스톡(stock) 용액으로서 10회 연속 구배(gradient)로 희석한다; 100 ㎕의 10,000 배로 희석된 액체를 MRS 고체 배지에 코팅하고, 37℃에서 혐기성 인큐베이터에서 배양하고, 48시간 동안 배양한 후 단일 콜로니의 의심나는 락토바실러스를 선택하여 MRS 브로스 배지에서 24시간 동안 배양하고, 계속적 배양을 위해 배양시 수득된 박테리아 용액의 한 부분을 계속적으로 전달하고, 박테리아 용액의 다른 부분으로부터 박테리아 DNA를 추출한다; 그리고, 박테리아 16S rRNA 유전자 증폭 및 시퀀싱(sequencing)을 수행함으로써 총 1,336 종의 락토바실러스를 수득하고, 시퀀싱 결과에 대해 BLAST 비교를 수행한 후, 분석하고, 비교 결과에 따른 종을 각각 기탁한다. 전술한 해당 락토바실러스는 전술한 보존된 1,336 종의 락토바실러스에 대한 저-pH 성장 내성(tolerance) 테스트, 16S rRNA 유전자형(genotype) 스크리닝, 가드네렐라 바기날리스의 억제에 대한 테스트, 락트산 생산 테스트, 과산화수소 생산 테스트 및 Hela 세포에 대한 부착에 대한 테스트를 스크리닝함으로서 스크리닝된다.
본 발명에 의해 제공된 락토바실러스를 스크리닝하기 위한 방법은 다음의 단계를 포함한다:
1. 저-pH 성장 내성 테스트
1.1 활성화: 기탁된 락토바실러스를 6.5의 pH 값을 갖는 MRS 브로스에서 활성화시키고, 37℃에서 밤새 배양한다;
1.2 전달: 활성화된 박테리아 용액을 4-5의 pH 값을 갖는 MRS 브로스로 전달하고, 매 2-3시간마다 OD600 값을 측정한다;
1.3 OD 600 값의 비교: 신속하게 증식할 수 있거나 높은 OD600 값을 갖는 상이한 샘플로부터 균주를 스크리닝한다.
2. 16S rRNA 유전자형 스크리닝
동일한 샘플로부터 분리된 동일한 종의 락토바실러스가 상이한 16S rRNA 서열을 갖는다면, 그 유전자형이 상이함을 보이고, 그 생리학적 특성도 또한 상이할 수 있다. 따라서, 16S rRNA 유전자형 스크리닝은 저-pH 배양 활성의 비교에 의해 스크리닝된 락토바실러스에 대해 수행된다.
3. 가드네렐라 바기날리스의 억제에 대한 테스트
락토바실러스가 활성화된 후, 0.1 ㎖의 박테리아 용액을 취해 MRS 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 6 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 플레이트로부터 꺼내고, 6 ㎜의 내경을 갖는 펀처(puncher)를 이용해 아가 배지에 구멍을 뚫어 박테리아 케이크를 수득한다; 그리고, 가드네렐라 바기날리스가 활성화 및 전달된 후, 가드네렐라 용액을 혐기성 멸균 PBS 버퍼 용액으로 10회 연속 구배에 의해100배로 희석하고, 0.5 ㎖의 10-1 및 10-2 희석액을 각각 취하여 5% 말 혈청을 함유하는 5.25 ㎖의 BHI 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 9 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 락토바실러스 케이크를 BHI 아가 표면에 가볍게 두고, 2개씩 병렬인 형태로 각각의 플레이트 상에 4개의 케이크를 대칭적으로 두고, 혐기성 밀봉 병(pot) 내에 두고, 애너로팩(anaeropack)을 첨가하고, 플레이트를 앞으로 두고 48시간 동안 배양하고, 버니어 캘리퍼(vernier caliper)로 억제 구역의 크기를 측정한다.
4. 락트산 생산 테스트
락토바실러스가 활성화된 후, 2개씩 병렬인 형태로 MRS 브로스 배지에 전달하고, 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 0.5-5.0의 pH 값을 갖는 테스트 용지에 의해 결정하고, 48시간 배양 후 락토바실러스 용액의 pH 값을 결정하고, 다음의 2가지 조건에 의해 액체 크로마토그래피를 위한 균주를 선택한다: 조건 1, 액체 크로마토그래피는 2.5의 pH 값을 갖는 균주에 대해 수행한다; 조건 2, 낮은 pH 값을 갖는 균주는 액체 크로마토그래피를 위한 동일한 종의 락토바실러스로부터 선택한다; 액체 크로마토그래피 후, 샘플을 결정하고, 상등액을 5회 희석하고, 전처리를 위해 진한 황산을 첨가하고, 샘플링 전에 0.22 ㎛ 바늘 필터로 여과한다. 관련 액체 크로마토그래피 파라미터는 다음과 같다:
기기의 모델: Agilent, 분석 액체 크로마토그래프 1200
크로마토그래피 컬럼의 모델: Bio-Rad, Aminex HPX-87H
이동 상: 0.005 M H2SO4, 0.6 ㎖/분의 속도
검출기 및 검출 파장: DAD, 207 nm; RID, 차등 굴절 신호
샘플의 양: 20 ㎕.
5. 과산화수소 생산 능력
락토바실러스가 활성화된 후, 피펫기(pipettor)를 이용해 2 ㎕의 박테리아 용액을 흡인하여 0.25 ㎎/㎖의 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 용액 및 0.01 ㎎/㎖의 양고추냉이 퍼옥사이드를 함유하는 MRS 아가 내로 넣고, 2개의 병렬 플레이트를 각각 24시간, 48시간 및 72시간의 관찰 시점에 제공하고, 상기 플레이트를 동일한 관찰 시점에 동일한 혐기성 밀봉 병 내에 두고, 애너로팩 내로 두고, 37℃에서 배양하고, 해당 배양 시간이 끝난 후 해당 플레이트로부터 꺼내어 공기에 노출하고, 30분에 발색 반응을 관찰하고, 기록을 위해 사진을 찍는다; 양성 대조군으로 락토바실러스 델브루에키이를 취하고, 락토바실러스 델브루에키이에 의해 생산된 청색보다 더 진한 곳에 4점, 락토바실러스 델브루에키이에 의해 생산된 청색과 등가인 곳에 3점, 락토바실러스 델브루에키이에 의해 생산된 청색보다 연한 곳에 2점, 매우 연한 청색(약한 발색 반응)인 곳에 1점, 및 변색되지 않은 곳에 0점을 표시한다.
6. Hela 세포에 대한 부착에 대한 테스트
락토바실러스가 활성화된 후, 락토바실러스 바디를 2회 원심분리로 세척하고, PBS로 재현탁한다; 100 ㎕의 락토바실러스 현탁액을 Hela 세포를 함유하는 96-웰 세포 배양 플레이트 내로 흡인한다; 37℃에서 30분 동안 인큐베이션을 유지한다; 멸균 PBS로 2회 세척하여 비-부착 락토바실러스를 세척해 버린다; 25 ㎕의 판크레아틴 용액을 모든 웰에 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에 두어 세포를 소화시킨다; Hela 세포가 소화되고 볼(ball)로 변한 후, 75 ㎕의 완전 배지를 각각의 웰 내로 첨가하고, 반복적으로 불고 균일하게 두드린다; 완전한 소화 후 20 ㎕의 박테리아 현탁액을 흡인하고, 멸균 PBS로 10회 연속 구배에 의해 희석하고, 부어넣음-공정 계수 실험을 위한 적절한 희석 구배를 선택하고, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 계수한다.
상기 성분들 및 제조 방법 및 다음의 박테리아 배지는 다음과 같다:
MRS 브로스의 제조: 52.0 g의 MRS 완제품의 배지 분말을 칭량하고, 1 L의 증류수에 용해한다; 가열 및 끓이고, 실온으로 냉각한 후 0.55 g의 시스테인 히드로클로라이드를 첨가하고, 교반해 용해한 후 6.5의 pH 값으로 조정한다; 정량 디스펜서를 설치하고, N2를 공급하고,끓을 때까지 가열하고, 마이크로-끓는 상태에서 20분 동안 끓이고,냉각 후 10 ㎖의 혐기성 튜브 내로 채우고, 118℃의 고온에서 20분 동안 습열 멸균을 수행하고, 이후의 사용을 위해 빛이 없는 그늘에서 보관한다.
MRS 고체 배지의 제조: 52.0 g의 MRS 완제품의 배지 분말 및 15.0 g의 아가 분말을 칭량하고, 1 L의 증류수에 용해하고, 끓을 때까지 가열하고, 끓인 후 0.55 g의 시스테인 히드로클로라이드를 첨가하여 pH 값을 6.5로 조정하고, 118℃의 고온에서 20분 동안 습열 멸균을 수행하고, 이후의 사용을 위해 빛이 없는 그늘에서 보관한다.
반-정량적 과산화수소 배지의 제조: 52.0 g의 MRS 완제품의 배지 분말 및 15.0 g의 아가 분말을 칭량하고, 1 L의 증류수에 용해하고, pH 값을 6.5로 조정하고, 118℃의 고온에서 20분 동안 습열 멸균을 수행하고, 멸균 후 30분 동안 50℃의 항온 수조(water bath) 주전자 내에 두어 단열하고, TMB(TMB의 최종 농도는 0.25 ㎎/㎖) 및 HRP(HRP의 최종 농도는 0.01 ㎎/㎖)를 첨가해 균일하게 혼합한다; 냉각 및 응고 후, 배양물 이름 및 제조일을 표시하고, 이후의 사용을 위해 4℃ 냉장고에 둔다.
혐기성 PBS의 제조: 0.27 g의 제1인산칼륨, 1.42 g의 제2인산나트륨, 8 g의 염화나트륨 및 0.2 g의 염화칼륨을 칭량하고, 1 L의 증류수에 용해하고, 끓을 때까지 가열하고, 실온으로 냉각 후 0.55 g의 시스테인 히드로클로라이드를 첨가하고, 교반 및 용해 후 pH 값을 6.5로 조정하고, 정량 디스펜서를 설치하고 N2를 공급하며, 끓을 때까지 가열하고, 마이크로-끓는 상태에서 30분 동안 끓이고, 냉각 후 10 ㎖의 혐기성 튜브에 채우고, 121℃의 고온에서 30분 동안 습열 멸균을 수행하고, 이후의 사용을 위해 빛이 없는 그늘에서 보관한다.
혐기성 BHI 액체 배지의 제조: 37.0 g의 BHI 완제품의 배지 분말을 칭량하고, 1 L의 증류수에 용해하고, 끓을 때까지 가열하고, 실온으로 냉각 후 0.55 g의 시스테인 히드로클로라이드를 첨가하고, 교반 및 용해 후 pH 값을 6.5로 조정하고, 정량 디스펜서를 설치하고 N2를 공급하며, 끓을 때까지 가열하고, 미세-끓음 상태에서 20분 동안 끓이고, 냉각 및 충진 과정에 N2 및 CO2(1:1의 비)를 공급하고, 냉각 후 10 ㎖의 혐기성 튜브에 채우고, 118℃의 고온에서 20분 동안 습열 멸균을 수행하고, 이후의 사용을 위해 빛이 없는 그늘에서 보관한다.
혐기성 BHI 반-고체 배지의 제조: 37.0 g의 BHI 완제품의 배지 분말을 칭량하고, 1 L의 증류수에 용해한다; 끓을 때까지 가열하고, 실온으로 냉각 후 6 g의 아가 분말 및 0.55 g의 시스테인 히드로클로라이드을 첨가하고, 교반 및 용해 후 pH 값을 6.5로 조정하고, 정량 디스펜서를 설치하고 N2를 공급하며, 끓을 때까지 가열하고, 미세-끓음 상태에서 20분 동안 끓이고, 냉각 및 충진 과정에 N2 및 CO2(1:1의 비)를 공급하고, 제시간에 10 ㎖의 혐기성 튜브에 채우고, 118℃의 고온에서 20분 동안 습열 멸균을 수행하고, 빛이 없는 그늘에서 보관한다.
영양분 브로스 액체 배지의 제조: 10 g의 펩톤, 3 g의 소고기 분말, 5 g의 염화나트륨을 칭량하고, 1 L의 증류수에 용해하고, pH 값을 7.2로 조정하고, 끓을 때까지 가열하고, 실온으로 냉각 후 각각 10 ㎖씩 분배한다; 121℃의 고온에서 15분 동안 습열 멸균을 수행하고, 빛이 없는 그늘에서 보관한다.
영양분 브로스 고체 배지의 제조: 10 g의 펩톤, 3 g의 소고기 분말, 5 g의 염화나트륨 및 6 g의 아가 분말을 칭량하고, 1 L의 증류수에 용해하고, pH를 7.2로 조정하고, 약간 냉각하고, 제시간에 10 ㎖의 혐기성 튜브에 채운다; 121℃의 고온에서 15분 동안 습열 멸균을 수행하고, 빛이 없는 그늘에서 보관한다.
편리한 기술을 위하여, 다음의 락토바실러스 존소니이 Ljohn-1(기탁 번호: CCTCC 번호2019426)은 이하 "A"로 나타낸다; 락토바실러스 크리스파투스 Lcris-2(기탁 번호: CCTCC 번호2019427)는 이하 "B"로 나타낸다; 락토바실러스 람노서스 Lrham-6(기탁 번호: CCTCC 번호2019428)은 이하 "C"로 나타낸다; 락토바실러스 젠세니이 Ljen-10(기탁 번호: CCTCC 번호2019429)은 이하 "D"로 나타낸다; 락토바실러스 가세리 Lgass-17(기탁 번호: CCTCC 번호2019430)은 이하 "E"로 나타낸다.
구현예 1: 단일 및 조합 락토바실러스의 락트산 생산 능력의 비교.
단일 락토바실러스: 락토바실러스가 활성화된 후, 2개씩 병렬인 형태로 MRS 브로스 배지로 전달하고, 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 0.5-5.0의 pH 값을 갖는 테스트 용지에 의해 결정하고, 48시간의 배양 후 락토바실러스 용액의 pH 값을 기록하고, 균주에 대한 액체 크로마토그래피를 수행하고, 상등액을 5회 희석하고, 전처리를 위해 진한 황산을 첨가하고, 샘플링 전에 0.22 ㎛ 주사기-구동 필터로 여과한다.
조합 락토바실러스: 락토바실러스가 활성화 및 전달된 후, 3개씩 병렬인 형태로 혼합 배양을 위해 3 종 이상의 균주를 선택하고, 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 원심분리하고, 상등액을 5 회 희석하고, 전처리를 위해 진한 황산을 첨가하고, 샘플링 전에 0.22 ㎛ 주사기-구동 필터로 여과한다. 관련 액체 크로마토그래피 파라미터는 다음과 같다:
기기의 모델: Agilent, 분석 액체 크로마토그래프 1200
크로마토그래피 컬럼의 모델: Bio-Rad, Aminex HPX-87H
이동 상: 0.005M H2SO4, 0.6 ㎖/분의 속도
검출기 및 검출 파장: DAD, 207nm; RID, 차등 굴절 신호
샘플의 양: 20 ㎕.
구현예 2: 단일 및 조합 락토바실러스의 과산화수소 생산 능력의 비교.
단일 락토바실러스: 락토바실러스가 활성화된 후, 피펫기를 이용해 2 ㎕의 박테리아 용액을 흡인하여 0.25 ㎎/㎖의 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 용액 및 0.01 ㎎/㎖의 양고추냉이 퍼옥사이드를 함유하는 MRS 아가 내로 넣고, 2개의 병렬 플레이트를 각각 24시간, 48시간 및 72시간의 관찰 시점에 제공하고, 상기 플레이트를 동일한 관찰 시점에 동일한 혐기성 밀봉 병 내에 두고, 37℃에서 배양하고, 해당 배양 시간이 끝난 후 해당 플레이트로부터 꺼내어 공기에 노출하고, 30분에 발색 반응을 관찰하고, 기록을 위해 사진을 찍는다: 양성 대조군으로 락토바실러스 델브루에키이를 취하고, 락토바실러스 델브루에키이에 의해 생산된 청색보다 더 진한 곳에 4점, 락토바실러스 델브루에키이에 의해 생산된 청색과 등가인 곳에 3점, 락토바실러스 델브루에키이에 의해 생산된 청색보다 연한 곳에 2점, 매우 연한 청색(약한 발색 반응)인 곳에 1점, 및 변색되지 않은 곳에 0점을 표시한다.
조합 락토바실러스: 락토바실러스가 활성화 및 전달된 후, 혼합을 위한 3 종 이상의 균주를 선택하고, 피펫기를 이용해 2 ㎕의 박테리아 용액을 흡인하여 TMB 및 HRP를 함유하는 MRS 아가 내로 넣고, 37℃에서 배양하고, 해당 배양 시간이 끝난 후 해당 플레이트로부터 꺼내어 공기에 노출하고, 30분에 발색 반응을 관찰하고, 기록을 위해 사진을 찍는다: 양성 대조군으로 락토바실러스 델브루에키이를 취하고, 락토바실러스 델브루에키이에 의해 생산된 청색보다 더 진한 곳에 4점, 락토바실러스 델브루에키이에 의해 생산된 청색과 등가인 곳에 3점, 락토바실러스 델브루에키이에 의해 생산된 청색보다 연한 곳에 2점, 매우 연한 청색(약한 발색 반응)인 곳에 1점, 및 변색되지 않은 곳에 0점을 표시한다.
구현예 3: 단일 및 조합 락토바실러스의 가드네렐라 바기날리스의 억제의 비교.
단일 락토바실러스: 락토바실러스가 활성화된 후, 0.1 ㎖의 박테리아 용액의 취해 MRS 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 6 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 플레이트로부터 꺼내고, 6 ㎜의 내경을 갖는 펀처를 이용해 아가 배지에 구멍을 뚫어 박테리아 케이크를 수득한다; 가드네렐라 바기날리스가 활성화 및 전달된 후, 가드네렐라 용액을 혐기성 멸균 PBS 버퍼 용액으로 10회 연속 구배에 의해100배로 희석하고, 0.5 ㎖의 10-1 및 10-2 희석액을 각각 취하여 5% 말 혈청을 함유하는 5.25 ㎖의 BHI 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 9 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 락토바실러스 케이크를 BHI 아가 표면에 가볍게 두고, 2개씩 병렬인 형태로 각각의 플레이트 상에 4개의 박테리아 케이크를 대칭적으로 두고, 혐기성 밀봉 병 내에 두고, 애너로팩을 첨가하고, 플레이트를 앞으로 두고 48시간 동안 배양하고, 버니어 캘리퍼로 억제 구역의 크기를 측정한다.
조합 락토바실러스: 락토바실러스가 활성화 및 전달된 후, 혼합을 위한 3 종 이상의 균주를 선택하고, 0.1 ㎖의 박테리아 용액의 취해 MRS 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 6 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 플레이트로부터 꺼내고, 6 ㎜의 내경을 갖는 펀처를 이용해 아가 배지에 구멍을 뚫어 박테리아 케이크를 수득한다; 가드네렐라 바기날리스가 활성화 및 전달된 후, 가드네렐라 용액을 혐기성 멸균 PBS 버퍼 용액으로 10회 연속 구배에 의해100배로 희석하고, 0.5 ㎖의 10-1 및 10-2 희석액을 각각 취하여 5% 말 혈청을 함유하는 5.25 ㎖의 BHI 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 9 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 락토바실러스 케이크를 BHI 아가 표면에 가볍게 두고, 2개씩 병렬인 형태로 각각의 플레이트 상에 4개의 박테리아 케이크를 대칭적으로 두고, 혐기성 밀봉 병 내에 두고, 애너로팩을 첨가하고, 플레이트를 앞으로 두고 48시간 동안 배양하고, 버니어 캘리퍼로 억제 구역의 크기를 측정한다.
구현예 4: 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 Hela 세포에 대한 부착의 비교.
단일 박테리아: 락토바실러스가 활성화된 후, 락토바실러스 바디를 2회 원심분리로 세척하고, PBS로 재현탁한다; 100 ㎕의 락토바실러스 현탁액을 Hela 세포를 함유하는 96-웰 세포 배양 플레이트 내로 흡인하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션을 유지하고, 30분 후 멸균 PBS로 2회 세척하여 비-부착 락토바실러스를 세척해 버린다; 25 ㎕의 판크레아틴 용액을 Hela 세포를 함유하는 96-웰 세포 배양 플레이트의 모든 웰에 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에 두어 세포를 소화시킨다; Hela 세포가 소화되고 볼로 변한 후, 75 ㎕의 완전 배지를 각각의 웰 내로 첨가하고, 반복적으로 불고 균일하게 두드린다; 완전한 소화 후 20 ㎕의 박테리아 현탁액을 흡인하고, 멸균 PBS로 10회 연속 구배에 의해 희석하고, 부어넣음-공정 계수 실험을 위한 적절한 희석 구배를 선택하고, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 계수한다.
조합 박테리아: 락토바실러스가 활성화 및 전달된 후, 박테리아 바디를 2회 원심분리로 세척하고, PBS로 재현탁하고, 균일하게 혼합하기 위한 3 종 이상 균주의 박테리아 용액을 선택하고, 100 ㎕의 락토바실러스 현탁액을 Hela 세포를 함유하는 96-웰 세포 배양 플레이트 내로 흡인하고, 37℃에서 30분 및 4시간 동안 인큐베이션을 유지하고, 30분 및 4시간에 멸균 PBS로 2회 세척하여 비-부착 락토바실러스를 세척해 버린다; 해당 인큐베이션 시간이 끝난 후, 25 ㎕의 판크레아틴 용액을 Hela 세포를 함유하는 96-웰 세포 배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에 두어 세포를 소화시킨다; Hela 세포가 소화되고 볼로 변한 후, 75 ㎕의 완전 배지를 각각의 웰 내로 첨가하고, 반복적으로 불고 균일하게 두드린다; 완전한 소화 후 20 ㎕의 박테리아 현탁액을 흡인하고, 멸균 PBS로 10회 연속 구배에 의해 희석하고, 부어넣음-공정 계수 실험을 위한 10-4 희석 구배를 선택하고, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 계수한다.
구현예 5: 단일 박테리아 및 조합 박테리아에 의한 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 애루기노사, 에세리키아 콜라이, 살모넬라 파리티피 B 및 시겔라 디센테리애에 대한 억제의 비교.
단일 락토바실러스: 락토바실러스가 활성화된 후, 0.1 ㎖의 박테리아 용액을 취해 MRS 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 6 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 플레이트로부터 꺼내고, 6 ㎜의 내경을 갖는 펀처를 이용해 아가 배지에 구멍을 뚫어 박테리아 케이크를 수득한다; 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 애루기노사, 에세리키아 콜라이, 살모넬라 파리티피 B 및 시겔라 디센테리애가 활성화 및 전달된 후, 병원성 박테리아 용액을 0.9% 정상 식염수(NS)로 10회 연속 구배에 의해100배로 희석하고, 0.5 ㎖의 10-1 및 10-2 희석액을 각각 취하여 5 ㎖의 영양분 아가 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 9 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 락토바실러스 케이크를 영양분 아가 표면에 가볍게 두고, 2개씩 병렬인 형태로 각각의 플레이트 상에 4개의 케이크를 대칭적으로 두고, 밀봉 병 내에 두고, 플레이트를 앞으로 두고 24시간 동안 배양하고, 버니어 캘리퍼로 억제 구역의 크기를 측정한다.
조합 박테리아: 살모넬라 파리티피 B 및 시겔라 디센테리애에 대한 억제
락토바실러스가 활성화 및 전달된 후, 혼합을 위한 3 종 이상의 균주를 선택하고, 0.1 ㎖의 박테리아 용액을 취해 MRS 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 6 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 37℃에서 48시간 동안 배양하고, 플레이트로부터 꺼내고, 6 ㎜의 내경을 갖는 펀처를 이용해 아가 배지에 구멍을 뚫어 박테리아 케이크를 수득한다; 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 애루기노사, 에세리키아 콜라이, 살모넬라 파리티피 B 및 시겔라 디센테리애가 활성화 및 전달된 후, 병원성 박테리아 용액을 0.9% 정상 식염수(NS)로 10회 연속 구배에 의해100배로 희석하고, 0.5 ㎖의 10-1 및 10-2 희석액을 각각 취하여 5 ㎖의 영양분 아가 고체 배지와 균일하게 혼합하고, 9 ㎝ 플레이트 내로 붓고, 완전한 응고 후 락토바실러스 케이크를 영양분 아가 표면에 가볍게 두고, 2개씩 병렬인 형태로 각각의 플레이트 상에 4개의 케이크를 대칭적으로 두고, 밀봉 병 내에 두고, 플레이트를 앞으로 두고 24시간 동안 배양하고, 버니어 캘리퍼로 억제 구역의 크기를 측정한다.
전술한 구현예 1 내지 구현예 5에서의 비교 실험에 따라, 비교 결과는 아래의 표 6에 나타나 있다:
| 미생물 설명 |
미생물 조성물 (문자 앞의 수는 문자에 해당하는 단일 균주의 함량 비를 나타냄) |
가드네렐라의 억제 구역의 직경 (㎜) |
과산화수소 능력의 등급 | 락트산의 함량 (㎎/L) |
단일 세포의 부착 수 | 스타필로코커스 아우레우스의 억제 구역의 직경 (㎜) |
에세리키아 콜라이의 억제 구역의 직경 (㎜) |
시겔라 디센테리애의 억제 구역의 직경 (㎜) |
슈도모나스 애루기노사의 억제 구역의 직경 (㎜) |
살모넬라 파리티피 B의 억제 구역의 직경 (㎜) |
| DS | 락토바실러스 델브루에키이 | 14.29 | 3 | 12964.12 | 7.7 | 11.28 | 9.32 | 11.93 | 13.09 | 12.00 |
| A | A | 17.77 | 1 | 16064.53 | 5.95 | 12.39 | 9.65 | 12.41 | 13.28 | 12.45 |
| B | B | 10.19 | 1 | 16098.44 | 13.2 | 12.61 | 10.51 | 12.41 | 13.74 | 12.01 |
| C | C | 14.71 | 0 | 18001.19 | 8.3 | 13.09 | 11.26 | 12.85 | 14.46 | 11.01 |
| D | D | 15.06 | 4 | 14258.47 | 27.15 | 9.61 | 7.30 | 12.26 | 12.92 | 11.78 |
| E | E | 16.63 | 1 | 14219.11 | 17.8 | 12.61 | 9.29 | 10.98 | 12.00 | 11.52 |
| 1 | 1A+1B+1D | 19.87 | 4 | 15117.36 | 8.91 | 12.99 | 10.83 | 13.29 | 14.76 | 13.65 |
| 2 | 1A+1B+1C | 19.50 | 0 | 17555.32 | 7.5 | 13.47 | 12.26 | 13.58 | 15.84 | 14.52 |
| 3 | 1A+1B+1E | 19.65 | 0 | 13703.73 | 1.64 | 12.68 | 11.94 | 15.83 | 15.76 | 13.75 |
| 4 | 1B+1C+1D | 19.65 | 4 | 17224.19 | 18.83 | 14.16 | 12.40 | 13.55 | 14.34 | 14.47 |
| 5 | 1B+1D+1E | 19.81 | 4 | 15562.84 | 7.5 | 13.05 | 9.55 | 12.24 | 14.49 | 13.40 |
| 6 | 1B+1C+1E | 19.34 | 0 | 17479.38 | 34.67 | 13.35 | 10.17 | 13.85 | 15.30 | 12.58 |
| 7 | 1A+1C+1D | 19.16 | 4 | 16974.68 | 49.68 | 13.03 | 9.33 | 16.37 | 15.28 | 13.66 |
| 8 | 1A+1C+1E | 19.31 | 0 | 17012.27 | 8.75 | 13.53 | 10.52 | 15.72 | 15.59 | 12.54 |
| 9 | 1A+1D+1E | 19.42 | 4 | 16769.17 | 19.14 | 13.03 | 10.85 | 14.75 | 15.48 | 13.64 |
| 10 | 1C+1D+1E | 19.58 | 4 | 16794.06 | 43.5 | 12.78 | 11.20 | 13.67 | 15.28 | 12.74 |
| 11 | 1A+1B+1C+1D | 19.50 | 4 | 17203.57 | 12.67 | 12.59 | 10.61 | 13.49 | 14.75 | 12.55 |
| 12 | 1A+1B+1C+1E | 19.35 | 0 | 17023.87 | 13.58 | 13.62 | 11.50 | 15.58 | 15.59 | 13.40 |
| 13 | 1A+1B+1D+1E | 19.50 | 4 | 13091.07 | 20.08 | 14.18 | 11.68 | 15.23 | 15.62 | 14.25 |
| 14 | 1B+1C+1D+1E | 19.46 | 4 | 16653.29 | 14.42 | 12.06 | 10.81 | 13.59 | 14.63 | 12.36 |
| 15 | 1A+1C+1D+1E | 19.13 | 4 | 13642.85 | 36.42 | 12.17 | 10.61 | 13.73 | 15.01 | 12.59 |
| 16 | 1A+1B+1C+1D+1E | 19.11 | 4 | 16618.79 | 12.17 | 12.84 | 11.13 | 13.94 | 14.82 | 12.96 |
구현예 6: 다중-락토바실러스 내의 모든 군주 간의 길항작용 및 공생 효과에 대한 테스트.결정되어야 하는 균주 중 1 종을 사용하여 배지 플레이트 상에 직선을 그리고, 결정되어야 하는 균주 중 2 종을 결정되어야 하는 균주 중 1종의 양측에 가로로 접종하고, 교차 방식으로 18-24시간 동안 배양하고, 교차점의 정균 폭을 결정한다.
상기 테스트를 통해, 모든 균주 간의 길항작용 및 공생 효과의 결과(정균 반경: ㎜)는 표 7에 나타나 있다:
| A | B | C | D | E | |
| A | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| B | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| C | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| D | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| E | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
결정되어야 하는 단일 균주를 MRS 브로스에 접종하고, 37℃에서 8시간 동안 배양하고, 접종 전에 상기 단일 균주를 10회 연속 구배에 의해 적절한 구배로 희석하고, 매 구배시에 3개씩 병렬인 방식으로 접종 전에 박테리아 용액의 농도를 계수하고, 플레이트를 혐기성 밀봉 병 내에 두고, 애너로팩을 넣고, 37℃에서 48시간 동안 배양한다; 혼합 후, 결정되어야 하는 균주를 MRS 브로스에 접종하고, 여기서 혼합된 박테리아 내의 각각의 박테리아의 접종 농도는 단일 균주의 접종 농도와 동일하며, 37℃에서 8시간 동안 배양한다; 약 8시간 동안 배양한 후, 상기 단일 및 혼합 박테리아 MRS 브로스를 10회 연속 구배에 의해 적절한 구배로 희석하고, 매 구배시에 3 개씩 병렬인 방식으로 코팅 및 계수하고, 플레이트를 혐기성 밀봉 병 내에 두고, 애너로팩을 넣고, 37℃에서 48시간 동안 배양한다; 플레이트를 혐기적으로 48시간 동안 배양한 후, 단일 박테리아 플레이트에 대한 접종 전후에 박테리아 콜로니를 계산하고, 상기 단일 박테리아의 증폭 배수를 분석한다; 한편, 혼합 박테리아 플레이트 상의 균총에 대한 질량 스펙트럼 확인을 수행하고, 질량 스펙트럼을 통해 종을 결정하여 혼합 박테리아 내의 단일 박테리아의 증폭 배수를 분석하고, 상기 테스트를 통해 균주들 간에 억제는 없지만 함께 성장할 수 있음을 입증한다: 브로스 공동-배양 증폭 데이터에 대해서는 표 8 참조.
| 균주 번호 | 혼합 배양 질량 스펙트럼에 의해 계산된 증폭 배수 - 병렬 1 | 혼합 배양 질량 스펙트럼에 의해 계산된 증폭 배수 - 병렬 2 | 단일 박테리아 배양에 의해 계산된 증폭 배수 |
| A | 14.73 | 10.85 | 17.17 |
| B | 9.74 | 12.82 | 17.57 |
| C | 85.08 | 81.73 | 92.15 |
| D | 38.22 | 51.4 | 29.06 |
| E | 75.19 | 71.3 | 103.69 |
본 발명은 전술한 구현예에 따라 잘 실행될 수 있다. 동일한 기술적 문제를 해결하기 위하여, 상기 적용된 기술적 용액은 일부 사소한 변형 또는 개선이 본 발명에 대해 행해진다 하더라도 전술한 구조 디자인의 전제 하에 본 발명의 것과 본질적으로 동일해서, 상기 기술적 용액이 본 발명의 보호 범위 내에 속해야 함을 유의해야 한다.
<110> SICHUAN ANAEROBIC BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
<120> MULTI-LACTOBACILLUS COMPOSITION AND APPLICATION THEREOF TO
VAGINAL HEALTH OF FEMALES
<130> 2021-FPA-0821
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> Lactobacillus sp.
<400> 1
gctcgctccc taaagggtta cgccaccggc ttcgggtgtt acaaactctc atggtgtgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc gcgattacta 120
gcgattccga cttcgtgtag gcgagttgca gcctacagtc cgaactgaga atggctttaa 180
gagattagct tgacctcgcg gtctcgcaac tcgttgtacc atccattgta gcacgtgtgt 240
agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300
ccggcagtct tactagagtg cccaactaaa tgctggcaac tagtcataag ggttgcgctc 360
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 420
cattttgccc ccgaagggga aacctgatct ctcaggtgat caaaagatgt caagacctgg 480
taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540
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<212> DNA
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<400> 4
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tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggaatgc ttaatgcgtt 600
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actaccaggg tatctaatcc tgttcgctac ccatgctttc gagcctcagc gtcagttaca 720
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acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc agtttccgat gcacttcctc 840
ggttaagccg agggctttca catcagactt aaaaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 900
ataaatccgg ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960
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aggcacgccg ccagcggtca t 1461
<210> 5
<211> 1425
<212> DNA
<213> Lactobacillus crispatus
<400> 5
cttccgaagg ttaggccacc ggctttgggc attgcagact cccatggtgt gacgggcggt 60
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tcattaccga agtaaatctg ttattccgct cgctcgactg cagtt 1425
Claims (8)
- 락토바실러스 존소니이, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 크리스파투스 및 락토바실러스 젠세니이 중 적어도 3 종의 활성 성분을 포함하는 다중-락토바실러스 조성물로서,
상기 락토바실러스 존소니이는 락토바실러스 존소니이 CCTCC 번호2019426이고; 상기 락토바실러스 가세리는 락토바실러스 가세리 CCTCC 번호2019430이고; 상기 락토바실러스 람노서스는 락토바실러스 람노서스 CCTCC 번호2019428이고; 상기 락토바실러스 크리스파투스는 락토바실러스 크리스파투스 CCTCC 번호2019427이고; 및 상기 락토바실러스 젠세니이는 락토바실러스 젠세니이 CCTCC 번호2019429인 다중-락토바실러스 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 조성물의 생균 수는 105∼1011 CFU/g이고, 각각의 단일 박테리아의 함량은 105 CFU/g 이상인 다중-락토바실러스 조성물. - 청구항 2에 따른 다중-락토바실러스 조성물의 발효 브로스.
- 박테리아성 질증(BV)의 병원성 박테리아를 예방 또는 치료하기 위한 약물 또는 건강 관리 제품의 제조에 있어서의 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 다중-락토바실러스 조성물 또는 청구항 3에 따른 발효 브로스의 적용.
- 외음부에 대한 세정 물품의 제조에 있어서의 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 다중-락토바실러스 조성물 또는 청구항 3에 따른 발효 브로스의 적용.
- 질의 균총의 균형을 조정하기 위한 약물 또는 건강 관리 제품의 제조에 있어서의 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 다중-락토바실러스 조성물 또는 청구항 3에 따른 발효 브로스의 적용.
- 병원성 박테리아를 예방 또는 치료하기 위한 약물 또는 건강 관리 제품의 제조에 있어서의 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 다중-락토바실러스 조성물 또는 청구항 3에 따른 발효 브로스의 용도로서,
상기 병원성 박테리아는 가드네렐라 바기날리스, 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 애루기노사, 에세리키아 콜라이, 살모넬라 파리티피 B 및 시겔라 디센테리애 중의 임의의 하나 이상을 비제한적으로 포함하는 용도. - 제왕 절개에 의해 분만된 유아에 대한 외부 관리 제품의 제조에 있어서의 청구항 1 또는 청구항 2에 따른 다중-락토바실러스 조성물 또는 청구항 3에 따른 발효 브로스의 적용.
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