TWI631947B - 雲芝萃取物，分離生物活性化合物之方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供自雲芝(Coriolus versicolor)分離出9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)之有效及方便的方法。此外，本發明提供雲芝萃取物、自雲芝所分離之生物活性化學成分及9-KODE甲基酯及相關化合物的治療用途。在一較佳實施例中，本發明可用於抑制癌細胞之轉移擴散。

Description

雲芝萃取物，分離生物活性化合物之方法及其用途
本申請案主張2012年4月11日申請之美國臨時申請案系列號61/622,846之利益，其全文係透過引用之方式併入本文。
雲芝(Coriolus versicolor)亦稱為雜色蘑菇(Agaricus versicolor)、雜色牛肝菌(Boletus versicolor)、變色多孔菌(Polyporus versicolor)、彩絨革蓋菌(Polystictus versicolor)、多色茯苓(Poria versicolor)、白腐擔子菌(Trametes versicolor)、雲芝(Yun-Zhi)(中國)、河邊菇(Kawaratake)(日本)及「火雞尾」(北美)，屬於擔子菌綱及多孔菌科。雲芝廣泛地分布於世界，其中在亞洲、歐洲及北美的叢林溫帶區已經識別超過120種不同的品系。
在中國的明朝期間(1368-1644AD)，李時珍首次於本草綱目(Compendium of Materia Medica(Compendium Medica))記載雲芝之醫學價值。根據本草綱目，若定期地食用雲芝可活躍生命能量、保持人體最佳重量、延年益壽及避免不必要的老化。雲芝亦被認為對肝臟及脾臟功能具有保護作用，並已經用於治療多種與肝功能障礙及呼吸道感染有關的症狀。在中國及日本，雲芝係經乾燥、研磨及製成茶。未記載長期使用雲芝具有毒性效果。
據記載，雲芝具有免疫調節、抗腫瘤、抗微生物及抗病毒的效 果。該等藥理效果可藉由諸如多糖雲芝素(polysaccharide Krestin；PSK)之多糖-肽類(polysaccharide-peptides；PSP)廣泛地產生。
儘管雲芝具有經驗用途上的長期歷史，但關於其發揮藥理作用之準確機制所知仍然有限。此外，雲芝之許多生物活性化學成分尚未被鑑定出來。因此需要發展出更有效及方便的萃取方案，以便能放大規模生產雲芝萃取物及鑑別其生物活性化學成分，以用於治療用途上。
本發明提供自雲芝分離9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)之有效及方便的方法。在一個實施例中，該方法包括：獲得雲芝萃取物；及自該雲芝萃取物中分離出9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯。
在一個具體實施例中，自雲芝分離出9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)之方法包括：a)提供足量的雲芝原料；b)在約15℃至約30℃之溫度下，利用極性溶劑萃取雲芝原料以產生雲芝萃取物及殘質，其中步驟b)係進行一次或一次以上；c)回收雲芝萃取物；d)自該雲芝萃取物分離出9-KODE甲基酯。
在一個實施例中，上述方法之步驟b)中所用溶劑為極性溶劑。在一個具體實施例中，該溶劑為乙醇-水混合物。在一個具體實施例中，9-KODE甲基酯係利用高效液體層析法(HPLC)從雲芝中分離出來。
在另一實施例中，本發明提供式I之化合物及其鹽類之治療用 途：
其中為雙鍵或單鍵；R1為H、OH、直鏈或分支鏈C1至C4烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基)或ORa，其中Ra為直鏈或分支鏈C1至C4烷基；及R2為H、O或直鏈或分支鏈C1至C4烷基；及R3為H、OH、O、鹵基、直鏈或分支鏈C1至C4烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基)或ORa，其中Ra為直鏈或分支鏈C1至C4烷基。
在一個實施例中，R2為O，及R1為OH、OCH3或OC2H5。在另一實施例中，R3為O或OH。
在某些具體實施例中，式I化合物為9-KODE甲基酯或9-KODE。
有利地，雲芝萃取物及式I化合物會抑制基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3：MMP3)表現，及可用於抑制癌細胞或腫瘤細胞之生長、侵襲及/或轉移。
本發明進一步提供藉由本萃取方法所產生之雲芝萃取物。亦提供包括治療有效量之該雲芝萃取物、分離自雲芝之生物活性化學成分及/或式I化合物及視需要之醫藥上可接受的載劑之醫藥組合物。
本發明亦提供用於預防、治療或改善其中調節免疫反應為有利的疾病或病症之方法。在一個實施例中，該方法包括對需要該治療之個體投與有效量之包括治療有效量之該雲芝萃取物、分離自雲芝之生物活性化學成分(諸如9-KODE甲基酯)及/或式I化合物之組合物。
在一個實施例中，本發明組合物可用於治療或改善癌症或腫瘤，其包括但不限於腦瘤、鼻咽癌、乳癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、結腸癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、食道癌、膀胱癌，及胃癌(gastric cancer)。在一個具體實施例中，本發明組合物可用於減少或改善腫瘤或癌細胞之轉移或侵襲。
圖1A-C示例性說明雲芝之萃取流程。(A)藉由在EtOH(12倍體積)中萃取雲芝原料，以連續音波處理(sonication)在室溫下處理1小時所獲得雲芝乙醇萃取物。簡而言之，利用連續音波處理，將雲芝原料在12倍體積乙醇中浸軟1小時，將殘質在10倍體積EtOH中浸軟及重複萃取程序兩次。萃取物經收集、組併及真空下蒸發至乾。(B)藉由利用在室溫下之第一溶劑的12xEtOH、在加熱條件下之第二溶劑的10x50% EtOH及在加熱條件下之第三溶劑的10x0.04% NaOH溶液的順序萃取法製備雲芝萃取物。萃取物經收集、組併、濃縮及凍乾。(C)藉由利用作為第一溶劑之10x50% EtOH及作為第二溶劑之10x0.04% NaOH溶液的順序萃取法製備雲芝萃取物。該萃取程序係在加熱條件下進行。萃取物經收集、組併、濃縮及凍乾。
圖2A-C顯示利用如圖1A、1B所示之萃取流程，或藉由將雲芝原料在乙醇中浸軟18小時所製備之雲芝乙醇萃取物的高效液體層析法(HPLC)層析圖。雲芝乙醇萃取物利用具有填裝經ODS結合之矽膠管柱(Lichrospher 100 RP C18,EC 5um)Agilent 1200系列HPLC系統的HPLC進行測試。流率設置在1.0ml/min，及水-乙腈混合物用作移動相。在210、254及280nm下檢測峰值。(A)經連續音波處理，利用乙醇萃取1小時的雲芝萃取物的HPLC層析圖。重複該萃取程序兩次。(B)藉由在乙醇中浸軟18小時所萃取之雲芝萃取物的HPLC層析圖。(C)利用如圖1B所示之萃取流程所萃取的雲芝萃取物的HPLC層析圖。 簡而言之，在室溫下利用乙醇萃取及接著在加熱條件下利用50%乙醇萃取雲芝。
圖3A-B顯示利用如圖1A所示之萃取流程或藉由將雲芝原料在乙醇中浸軟18小時所製備之雲芝乙醇萃取物的氣相色譜法(GC)總離子層析圖。萃取物在70℃與吡啶及衍生劑BSTFA[N,O-雙(三甲基甲矽烷基)三氟乙醯胺]混合2小時。藉由包括HP-5MS管柱(30m x 250um x 0.25um)之氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)分析所得混合物。初始爐溫維持在70℃ 1分鐘，以10℃/min之速率增加至180℃，在180℃維持2分鐘，以10℃/min之速率增加至280℃，及在280℃維持3分鐘。進樣器溫度為275℃。以1ml/min流率之氦氣作為載體氣體。(A)經連續音波處理，利用乙醇萃取1小時的雲芝萃取物的氣相色譜法(GC)總離子層析圖。重複該萃取程序兩次。(B)藉由在乙醇中浸軟18小時所萃取之雲芝萃取物的氣相色譜法(GC)總離子層析圖層析圖。
圖4顯示利用如圖1A所示之萃取流程製備之雲芝乙醇萃取物(MPUB-EtOH)的HPLC層析圖。利用反相管柱(Lichrospher 100 RP C18,EC 5um)，將MPUB-EtOH萃取物進一步分離成5種餾分。流率設置在1.0ml/min，及水-乙腈混合物用作移動相。在210、254及280nm下檢測峰值。
圖5A-B顯示雲芝萃取物(MPUB-EtOH)在經以聚肌胞-聚肌苷酸(polyinosine-polycytidylic acid；poly(I：C))處理之主要人類血液巨噬細胞中增加INFβ產生(A)及減少IL10產生(B)。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。<0.05(＊)或<0.001(＊＊)之p值在統計學上視為顯著的。
圖6A-B顯示雲芝萃取物(MPUB-EtOH)會減少經LPS誘發之TNFα產生。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。<0.05(＊)或<0.001(＊＊)之p值在統計學上視為顯著的。
圖7顯示雲芝萃取物(MPUB-EtOH)減少經LPS誘發之亞硝酸鹽產生。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。<0.05(＊)之p值在統計學上視為顯著的。
圖8A-C顯示雲芝萃取物(MPUB-EtOH)之抗病毒效果。(A)顯示雲芝萃取物會減少單純疱疹病毒(herpes simplex virus；HSV)病毒滴度。如圖4所示，將雲芝萃取物(MPUB-EtOH)分餾成餾分1至5。由於餾分4至5具有細胞毒性(未顯示數據)，及因此未進一步檢測抗病毒效果。(B)顯示雲芝萃取物(MPUB-EtOH)之餾分1至3會減少HSV病毒滴度。(C)顯示雲芝萃取物(MPUB-EtOH)之餾分3會減少HSV病毒滴度。<0.001(＊＊)之p值在統計學上視為顯著的。
圖9顯示雲芝萃取物(MPUB-EtOH)會減少MMP-3表現。<0.05(＊)之p值在統計學上視為顯著的。
圖10顯示雲芝萃取物(MPUB-EtOH)會減少小鼠HSV感染的嚴重性。
圖11顯示不同批次的50μg/ml之雲芝乙醇萃取物(R08PUB、R09PUB、R10PUB及R11PUB)會抑制經TNF-α誘發之MMP-3 mRNA水平。簡而言之，利用不同批次的雲芝乙醇萃取物預先處理神經膠質母細胞瘤(T98G，腦細胞)細胞18小時，及接著利用重組人類TNF-α(10ng/ml)處理3小時。藉由TaqMan基因表現分析工具(TaqMan Gene Expression Assays)分析MMP-3 mRNA水平。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊P<0.05、＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。(「R08」、「R09」及「R11」表示雲芝之採收年份分別為2008、2009及2011)。
圖12顯示不同批次的50μg/ml之雲芝乙醇萃取物(R08PUB、R09PUB、R10PUB及R11PUB)會抑制經TNF-α誘發之MMP-3蛋白質表現。簡而言之，利用不同批次的雲芝乙醇萃取物預先處理神經膠質 母細胞瘤(T98G，腦細胞)細胞18小時，及接著另外利用重組人類TNF-α(10ng/ml)處理24小時。藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析MMP-3蛋白質表現。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊P<0.05、＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。
圖13顯示分離自雲芝之化合物(亦在文中稱為「Cove-1」)的HPLC層析圖及UV吸光度。藉由利用呈1ml/min之流率之20%至90%的乙腈的梯度洗脫液的反相HPLC純化化合物Cove-1。在約8.5分鐘洗脫之單峰利用在280nm下之光電二極體陣列檢測器進行檢測。化合物Cove-1之UV吸光度在227nm最大，這顯示化合物Cove-1具有共軛羰基。
圖14顯示化合物Cove-1之1H(A)及13C NMR(B)光譜。化合物Cove-1之結構係藉由在用於1H之500MHz及在用於13C NMR之125.765MHz下操作及利用甲醇-d作為溶劑之Bruker 500MHz DRX NMR光譜儀說明。化合物Cove-1之1H NMR光譜在0.9、1.3-1.4、1.45、1.58、2.19、2.25、2.58、3.33、6.12、6.26及7.22下顯示信號。化合物Cove-1之13C NMR光譜在14.5、23.7、25.7、26.3、29.7、30.3、30.3、30.3、32.7、34.3、35.4、41.1、50.0、128.9、130.4、145.5、147.6、178.2及204.1下顯示信號。
圖15顯示化合物Cove-1之化學結構。1H NMR(500MHz)：δ0.9(3H,H-18),1.3-1.4(10H,H-4,5,6,16,17),1.45(2H,H-15),1.58(4H,H-3,7),2.19(2H,H-14),2.25(2H,H-2),2.58(2H,H-8),3.33(3H,CH3OOC),6.12(1H,H-10),6.26(2H,H-12,13),7.22(1H,H-11)。13C NMR(125MHz)：δ14.5(C-18),23.7(C-17),25.7(C-7),26.3(C-3),29.7(C-15),30.3(C-4＊),30.3(C-5＊),30.3(C-6＊),32.7(C-16),34.3(C-14),35.4(C-2),41.1(C-8),50.0(OCH3),128.9(C-10),130.4(C-12),145.5(C-11),147.6(C-13),178.2(C-1)及204.1(C-9)。＊可互換的。結果藉由Dept 135、HSQC及1H-1H COSY確認。化合物Cove-1在m/z 55、67、81、95、151、166、276、308下顯示離子峰值。將光譜數據與在文獻中記載之數據相比，化合物Cove-1經鑑別為9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)。
圖16顯示10、25及50μg/ml之經純化化合物Cove-1會抑制經TNF-α誘發之MMP-3 mRNA水平。簡而言之，利用經純化Cove-1化合物預先處理神經膠質母細胞瘤(T98G，腦細胞)細胞18小時，及接著利用重組人類TNF-α(10ng/ml)處理3小時。藉由TaqMan基因表現分析工具分析MMP-3 mRNA水平。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。
圖17顯示10、25及50μg/ml之經純化化合物Cove-1會抑制經TNF-α誘發之MMP-3蛋白質表現。簡而言之，利用經純化化合物Cove-1預先處理神經膠質母細胞瘤(T98G，腦細胞)細胞18小時，及接著另外利用重組人類TNF-α(10ng/ml)處理24小時。藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析MMP-3蛋白質表現。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊P<0.05或＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。
圖18顯示利用不同批次之50μg/ml之雲芝乙醇萃取物(R08PUB、R09PUB、R10PUB及R11PUB)培養之細胞對T98G細胞之代謝活性方面無顯著差異。歷時48小時之時程進行MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)分析法分析。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。
圖19顯示利用10、25及50μg/ml之經純化化合物(Cove-1)培養之細胞對T98G細胞之代謝活性方面無顯著差異。歷時48小時之時程進行MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)分析。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。結果顯示化合物Cove-1不具有明顯的毒性。
圖20顯示50μg/ml之雲芝乙醇萃取物(R11PUB)會減少T98G細胞侵襲性。利用Matrigel Invasion Chamber研究細胞侵襲性。利用R11PUB處理神經膠質母細胞瘤(T98G，腦細胞)細胞18小時，及該等細胞接著透過基質進行侵襲另外的24小時。藉由在光學顯微鏡下計數而定量侵襲細胞的數目。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。
圖21顯示25及50μg/ml之雲芝乙醇萃取物(R11PUB)會減少細胞侵襲性。利用Matrigel Invasion Chamber研究細胞侵襲性。利用R11PUB處理神經膠質母細胞瘤(T98G)、肺癌(A549)及乳腺癌(MDA-MB-231)細胞18小時，及該等細胞接著透過基質進行侵襲另外的24小時。藉由在光學顯微鏡下計數而定量侵襲細胞的數目。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。
圖22顯示25μg/ml之9-KODE甲基酯(Cove-1)會減少T98G細胞侵襲性。利用Matrigel Invasion Chamber研究細胞侵襲性。利用Cove-1處理神經膠質母細胞瘤(T98G)細胞18小時，及該等細胞接著透過基質進行侵襲另外的24小時。藉由在光學顯微鏡下計數而定量侵襲細胞的數目。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。
本發明提供自雲芝分離出9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)之有效及方便的方法。在一個實施例中，該方法包括：獲得雲芝萃取物；及自該雲芝萃取物分離9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯。在一個具體實施例中，自雲芝分離9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)之方法包括： a)提供足量的雲芝原料；b)在約15℃至約30℃之溫度下，利用極性溶劑萃取雲芝原料以產生雲芝萃取物及殘質，其中該步驟b)進行一次或一次以上；c)回收雲芝萃取物；d)自該雲芝萃取物分離9-KODE甲基酯。
在一個實施例中，上述方法之步驟b)中所用溶劑為極性溶劑。在一個具體實施例中，溶劑為乙醇-水混合物。在一個具體實施例中，9-KODE甲基酯係利用高效液體層析法(HPLC)分離自雲芝。
本發明亦提供製備雲芝萃取物之有效及方便的方法。在一個較佳實施例中，雲芝萃取物係在室溫下，利用作為溶劑之水、乙醇或乙醇-水之混合物所製備的。在一個實施例中，可進一步蒸發雲芝萃取物以產生固體或半固體組合物。
本發明進一步提供藉由該萃取法所產生之雲芝萃取物。亦提供包括治療有效量之該雲芝萃取物、分離自雲芝之生物活性化學成分(諸如9-KODE甲基酯)及/或式I化合物及視需要之醫藥上可接受的載劑的治療或醫藥組合物。本發明亦提供用於預防、治療或改善其中調節免疫反應為有利的疾病或病症的方法。在一個實施例中，該方法包括對需要該治療之個體投與有效量之包括雲芝萃取物及本發明化合物及組合物的組合物。
具體而言，本發明組合物可用於治療或改善疾病或病症，其中刺激IFNβ產生及/或減少TNF-α、IL10，及/或MMP-3產生是有利的。
在一個較佳實施例中，本發明可用於治療多形性膠質母細胞瘤及/或鼻咽癌。在另一實施例中，本發明可用於治療細菌、病毒及/或微生物感染。在某些實施例中，本發明可用於治療包括但不限於水痘-帶狀皰疹病毒、巨大細胞病毒，及皰疹病毒8型感染之感染，其等為癌症或免疫受損患者中常見的病毒感染。
雲芝萃取物及分離之化學成分
本發明一個態樣係提供製備雲芝萃取物之方法。該等方法亦可用於自雲芝分離生物活性化學成分。亦提供根據本發明製備之雲芝萃取物，以及自雲芝分離之化合物及生物活性化學成分。
此外，本發明提供一種自雲芝分離9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)之方法。在一個實施例中，該方法包括：獲得雲芝萃取物；及自該雲芝萃取物分離9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯。
在一個較佳實施例中，本發明提供一種製備雲芝萃取物及/或自雲芝分離生物活性化學成分(諸如9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯)之方法，其包括如下步驟、主要由該等步驟組成或由該等步驟組成：a)提供足量的雲芝原料；b)在約15℃至約30℃之溫度下，利用溶劑萃取雲芝原料以產生雲芝萃取物及殘質，其中該步驟b)進行一次或一次以上；c)回收雲芝萃取物；及視需要地，d)自該雲芝萃取物分離生物活性化學成分。
在一個實施例中，上述方法之步驟b)中所用溶劑為極性溶劑。有利地，在約15℃至約30℃之溫度下利用極性溶劑可幫助萃取一或多種具有抗癌及/或抗病毒效果之生物活性、小分子化學成分。
在一個實施例中，分離自雲芝之生物活性化學成分為9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯。在一個實施例中，雲芝萃取物包括9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯。較佳而言，雲芝原料係經乾燥並研磨成粉末。雲芝萃取物較佳地係包括生物活性化學成分，其包含諸如多糖雲芝素(PSK)之多糖-肽類(PSP)。較佳地，該等原料為雲 芝子實體。
在某些實施例中，用於製備雲芝之適宜溶劑包括但不限於醇類(例如，C1-C8醇類(例如甲醇、乙醇、丙醇及丁醇；C1-C8烷基多元醇)；C1-C8酮類(例如丙酮)或烷基酮類；氯仿；乙酸；水；及無機酸類(諸如氫氯酸)。
在一個實施例中，本發明係利用比例介於1：5及1：20之間(及較佳地約1：10、1：12或1：15之間)的雲芝與溶劑(體積比)。在一個較佳實施例中，該萃取程序係利用作為溶劑之水、醇(例如乙醇)或醇-水(例如乙醇-水)混合物。醇-水(例如乙醇-水)混合物可包括約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之醇(例如乙醇)。
在一具體實施例中，該溶劑為包括12倍體積之95%乙醇的水-乙醇混合物。較佳地，步驟(b)之萃取程序係在室溫下進行。步驟(b)亦可在略低於或高於室溫下進行。在一個實施例中，步驟(b)係在約15℃至約30℃、約18℃至約28℃、約20℃至約28℃或約22℃至約26℃之溫度下進行。在一具體實施例中，步驟(b)係在約25℃下進行。
在一個實施例中，在步驟(b)之萃取程序期間，雲芝原料較佳係在室溫或低於室溫下於冷溶劑中浸軟。在一個實施例中，在步驟(b)之萃取程序之前及/或期間，不論是溶劑或雲芝原料均未烹煮或加熱至高於50℃或高於45℃之溫度。
在一個實施例中，將雲芝原料與溶劑混合至少約15分鐘以萃取生物活性化學成分。較佳地，萃取時間係至少約20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、4小時或5小時。
較佳地，步驟(b)之萃取作用是以連續音波處理進行。在某些情況下，音波處理是一種可改進從乾燥藥效物質萃取化合物之效率及縮 短萃取時間的方法。此改善的基本機制是強化物質轉移及使溶劑更容易接觸到藥效物質。因此，音波處理相對於常規萃取技術，是一種迅速、不貴且有效的替代方法，且在一些情形下甚至優於超臨界流體及微波輔助萃取法。
在該等較佳實施例中，於步驟(b)期間，利用連續音波處理將雲芝原料與溶劑混合至少約5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、4小時或5小時。然而，本發明人已經發現，在某些情形中，音波處理可能無法改進可輕易地從粗藥效物質滲出至溶劑中的某些化學成分的萃取產率。在該等情形下，該萃取程序較佳地不以音波處理進行或利用極低程度的音波處理進行。
雲芝萃取物可藉由(例如)能夠促進固相(例如殘質)從包含溶劑萃取物之液相的分離技術(諸如離心)加以回收。可藉由(例如)過濾以除去殘質而收集萃取物。在一個實施例中，該雲芝萃取物可進一步蒸發以產生固體或半固體組合物。在另一實施例中，該雲芝萃取物可進行濃縮及/或純化。
該雲芝萃取物及/或生物活性化學成分可經由單一萃取法或順序萃取法獲得。在一個實施例中，在回收第一萃取物之後，可將殘質再次溶解於相同溶劑以進一步萃取。在另一實施例中，該雲芝萃取物及/或生物活性化學成分可經由順序萃取法，藉由每次利用不同的溶劑萃取溶劑-萃取物或殘質，以萃取所需生物活性化學成分而獲得。
在一個實施例中，本發明萃取法在步驟(a)-(b)之後，進一步包括利用溶劑在加熱條件(諸如在約60℃或更高之溫度下)下萃取雲芝殘質，以產生第二雲芝萃取物及第二殘質，並視需要自該雲芝萃取物分離生物活性化學成分之步驟、主要由該步驟組成或由該步驟組成。在一個具體實施例中，一極性溶劑係用於在加熱條件下萃取雲芝殘質。
在另一實施例中，本發明萃取法在步驟(a)-(b)之後，進一步包括利用鹼性水溶液(諸如NaOH及KOH)在加熱條件(諸如在約60℃或更高之溫度下)下萃取雲芝殘質，以產生第二雲芝萃取物及第二殘質，並視需要自該雲芝萃取物分離生物活性化學成分之步驟、主要由該步驟組成或由該步驟組成。在一個實施例中，該鹼性水溶液具有0.1N之當量濃度或小於0.1N之任何數值，諸如0.05N、0.02N、0.01N或0.001N。
在一個具體實施例中，本發明萃取法包括：a)提供足量的雲芝原料；b)在約15℃至約30℃之溫度下，利用第一溶劑萃取該雲芝原料以產生第一雲芝萃取物及第一殘質；c)在加熱條件(諸如在約60℃或更高之溫度下)下，利用第二溶劑萃取該第一殘質，以產生第二雲芝萃取物及第二殘質；及d)在加熱條件(諸如在約60℃或更高之溫度下)下，利用鹼性溶液萃取該第二殘質，以產生第三雲芝萃取物及第三殘質；e)回收雲芝萃取物；及視需要地f)自該雲芝萃取物分離生物活性化學成分。
在一個具體實施例中，第一及第二溶劑為極性溶劑。
在另一具體實施例中，本發明萃取法包括：a)提供足量的雲芝原料；b)在加熱條件(諸如在約60℃或更高之溫度下)下，利用一極性溶劑萃取該雲芝原料，以產生第一雲芝萃取物及第一殘質；及c)加熱條件(諸如在約60℃或更高之溫度下)下，利用鹼性溶液(諸如NaOH及KOH)在萃取該第一殘質，以產生第二雲芝萃取物及第二殘質；d)萃取該等雲芝萃取物；及視需要地 e)自雲芝萃取物分離生物活性化學成分。
在一個實施例中，本發明萃取法包括如下步驟、主要由該等步驟組成或由該等步驟組成：a)提供足量的雲芝原料；b)利用一極性溶劑萃取該雲芝原料以產生雲芝萃取物及殘質，及回收該雲芝萃取物，其中該步驟b)進行一次或一次以上；c)利用鹼性水溶液萃取獲自步驟b)之殘質以產生含水萃取物，及回收該含水萃取物，其中該步驟c)進行一次或一次以上；d)組併獲自步驟b)及c)之一或多種萃取物以產生雲芝萃取物；及視需要地e)自該雲芝萃取物分離生物活性化學成分。
在某些實施例中，加熱條件下用於萃取雲芝之極性溶劑包括C1-C8醇(例如甲醇、乙醇、丙醇及丁醇)。在一具體實施例中，加熱條件下用於萃取雲芝之極性溶劑為乙醇或乙醇-水混合物。在一具體實施例中，加熱條件下用於萃取雲芝之極性溶劑非為水。
根據本發明，加熱可在高於60℃、高於65℃、高於70℃、高於75℃、高於80℃、高於85℃、高於90℃、高於95℃或高於100℃之溫度下進行。
圖1A-C說明本發明萃取法之較佳實施例。
有利地，利用作為溶劑之鹼性溶液可幫助包括多糖-肽類(PSP)(諸如多糖雲芝素(PSK))之具生物活性、大分子化學成分的萃取作用。
在另一實施例中，該雲芝粗萃取物可分餾或分開以產生一或多種包含所需生物活性化學成分的餾分。在一個實施例中，該雲芝粗萃取物進行利用水-乙腈作為移動相之HPLC。在某些實施例中，水-乙腈係以介於1：100至100：1之水：乙腈之任何範圍內而存在，包括但不 限於5：95、10：90、20：80、30：70、40：60、50：50、60：40、70：30、80：20、90：10，及95：5之水：乙腈。在一具體實施例中，該雲芝粗萃取物進行利用表1闡明之洗脫參數的HPLC，從而產生圖4所示之5種餾分。
在另一實施例中，該方法包括利用HPLC及/或氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)之組合針對雲芝萃取物產生化學物分布。在一個實施例中，該方法包括：將萃取物進行HPLC分析、洗脫萃取物，及根據HPLC針對雲芝萃取物產生化學物分布。在另一實施例中，該方法包括：將萃取物進行氣相色譜質譜聯用儀分析及針對該萃取物產生層析/光譜分布。
本發明進一步提供藉由該萃取法所產生之雲芝萃取物。在一個具體實施例中，該雲芝萃取物具有如圖2A、2B、2C所示之高效液體層析(HPLC)分布或如圖4所示之任何一種餾分1至5；及/或如圖3A或3B所示之氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)分布。
文中所用之術語「主要由...組成」將本發明之範圍限制在明確步驟及該等並不會實質影響本發明之基礎及新穎特徵，換言之是指不會影響用於製備雲芝萃取物及/或自雲芝分離生物活性化學成分的方法。例如，使用「主要由...組成」係指用於製備雲芝萃取物之方法不包含萃取或接觸雲芝之任何未明確的步驟，例如利用未明確的溶劑(等)萃取或接觸雲芝，或在不同於明確條件之條件(例如溫度)下萃取雲芝的額外步驟。而且，使用「主要由...組成」係指該方法可包括不會實質影響自雲芝進行之生物活性化學成分之萃取，包括收集或回收該雲芝萃取物；濃縮該雲芝萃取物；將多種雲芝萃取物組併成單一組合物；將該雲芝萃取物凍乾或乾燥成固體或半固體組合物；將該雲芝萃取物調配成諸如溶液、懸浮液、錠劑、膠囊、顆粒、粉末、湯藥，及酊劑之醫藥組合物；將該雲芝萃取物與醫藥上可接受的載劑、賦形 劑、調味劑、緩衝劑，及/或乳化劑混合；及包裝該雲芝萃取物。
化合物
在另一態樣中，本發明係關於9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)及相關化合物。在一個實施例中，根據本發明之有用化合物具有如式I所示的化學結構：
其中為雙鍵或單鍵；R1為H、OH、直鏈或分支鏈C1至C4烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基)或ORa，其中Ra為直鏈或分支鏈C1至C4烷基；及R2為H、O或直鏈或分支鏈C1至C4烷基；及R3為H、OH、O、鹵基、直鏈或分支鏈C1至C4烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基)或ORa，其中Ra為直鏈或分支鏈C1至C4烷基。
在一個實施例中，R2為O，及R1為OH、OCH3或OC2H5。在另一實施例中，R3為O或OH。
在一個實施例中，式I中之烷基可經取代或未經取代。
文中所用之術語「烷基」係指包含碳及氫之線性或分支鏈飽和單價基團。烷基之代表性實例包括但不限於甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、異丁基，及第三丁基。
術語「鹵基」意指氟、氯、溴及碘。
術語「羥基」意指基團-OH。
文中所用之術語「經取代」係指化合物或化學基團之至少一個 氫原子被另一化學基團替代。取代基之非限制性實例為文中揭示之示例性化合物及實施例中可見之彼等，以及鹵素；烷基；烯基；炔基；羥基；烷氧基；胺基；鹵代烷基(例如，三氟甲基)；及-COOH。除非另有說明，文中揭示之所有化學基團可經取代。例如，文中所述之「經取代」烷基、烯基或炔基是指經另一化學基團諸如烴基、鹵基、烷氧基，及-COOH取代之基團。經取代烷基包括但不限於鹵代烷基、羥基烷基、羰基烷基，及胺基烷基。
在一個實施例中，根據本發明之有用的式I化合物為9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)，其具有下列結構：
在另一實施例中，根據本發明之有用的式I化合物為9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸(9-KODE)。
在某些實施例中，本發明係關於以式I表示之經分離化合物或實質純化的化合物之用途。文中所用之術語「實質純化的」係指高於99%的純度。
有利地，式I化合物會抑制TNF-α誘發之基質金屬蛋白酶3(MMP3)表現及可用於抑制癌細胞或腫瘤細胞之生長、侵襲及/或轉移。
本發明化合物可分離自植物或可利用技術中已知的方法合成。參見Kuklev等人(1997)及Andreou等人(2009)。
文中所用之「經分離」係指業已從其中其本質上存在之任何環境中移除之化合物。例如，經分離化合物並非指當時其存在於可分離化合物之植物中之該化合物。在較佳實施例中，本發明化合物具有至少75%純度，較佳係至少90%純度，更佳係大於95%純度，及最佳係大於99%純度(實質純化的)。
本發明進一步包括式(I)化合物的立體異構體。術語「立體異構體」涵蓋文中揭示之所有對映異構體/立體異構體純化的及對映異構體/立體異構富集的化合物。
在一個實施例中，本發明係關於式(I)化合物的對映異構體形式。本發明化合物的對映異構體形式實質上不互相含有彼此(即，呈現過量之對映異構體)。換言之，化合物之「R」形式實質上不含有化合物之「S」形式，及因此呈現超過「S」形式含量之對映異構體。相反地，化合物之「S」形式實質上不含有化合物之「R」形式，及因此呈現超過「R」形式含量之對映異構體。在本發明一個實施例中，對映異構體化合物為超量至少約80%之對映異構體。在一個較佳實施例中，化合物為超量至少約90%之對映異構體。在一個更佳實施例中，化合物為超量至少約95%之對映異構體。在一個尤其更佳的實施例中，化合物為超量至少約97.5%之對映異構體。在一個最佳實施例中，化合物為超量至少約99%之對映異構體。
用於調節免疫反應及癌症治療之用途
本發明另一態樣提供雲芝萃取物、分離自雲芝之生物活性成分(例如，9-KODE甲基酯)及/或式I化合物及其鹽類之治療用途，以及用於調節免疫反應及癌症治療之包括一或多種上述成分之治療組合物。
有利地，本發明雲芝萃取物及式I化合物刺激保護性免疫反應同時會抑制可導致疾病之不需要的免疫反應。例如，該雲芝萃取物及式I化合物可修復或改進因投與(例如)抗癌劑所產生之受損免疫系統功能。
在另一實施例中，該雲芝萃取物及式I化合物可刺激防衛病毒、細菌及/或微生物感染之保護性免疫反應。
此外，本發明雲芝萃取物及式I化合物可抑制不需要的免疫反應，諸如產生TNF-α及其引發產生金屬蛋白酶，該等會被某些癌細胞 利用而加速轉移作用。
具體言之，本發明人現發現，本發明雲芝萃取物及式I化合物減少產生TNF-α，TNF-α是針對病原性感染及腫瘤發生之急性階段的免疫反應中起關鍵作用的早期炎症介體。TNF-α亦引發基質金屬蛋白酶(MMP)及MMP族成員之產生，其等會降解細胞外基質蛋白質。然而，某些腫瘤細胞(諸如神經膠母細胞瘤、鼻咽癌、乳癌、肺癌、前列腺癌，及結腸癌)已經針對TNF-α之細胞毒性效應發展出抗性。結果是該等腫瘤細胞會利用由TNF-α引發之MMP侵襲鄰近組織以及位於身體遠端部位之器官。
有利地，本發明雲芝萃取物及式I化合物抑制腫瘤細胞中之TNF-α產生，及因此尤其可用於預防或減少對TNF-α具有抗性之惡性腫瘤細胞(諸如神經膠母細胞瘤、鼻咽癌、乳癌、肺癌、前列腺癌細胞，及結腸癌)之轉移擴散。
此外，本發明人現發現，雲芝會減少產生IL-10，IL-10是一種可下調節前發炎性細胞激素表現之抗炎性細胞激素。本發明人還發現，雲芝會增加IFN-β的產生，IFN-β會刺激針對病原侵襲之急性階段的免疫反應。
在一個實施例中，本發明提供一種預防、治療或改善其中調節免疫反應為有利的疾病或病症的方法。該方法包括對需要該治療之個體投與有效量之包括本發明雲芝萃取物、分離自雲芝之生物活性成分(例如，9-KODE甲基酯)及/或式I化合物之組合物。
具體言之，本發明組合物可用於治療或改善疾病或病症，其中IFNβ產生之刺激作用及/或TNF-α、MMP3，及/或IL-10之產生或水平的減少是有利的。
文中所用之術語「個體」敘述一種包括諸如靈長類哺乳動物之生物，可向其提供利用根據本發明之組合物的治療。受益於本發明揭 示之治療法的哺乳動物種類包括但不限於猿、黑猩猩、紅毛猩猩、人類、猴子；馴化動物(諸如狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞)；及其他動物(諸如小鼠、大鼠、天竺鼠，及倉鼠)。
在一個實施例中，該個體係經診斷患有可根據本發明治療之病症。在某些實施例中，需要治療之個體係經診斷患有癌症或腫瘤，其包括但不限於多形性膠質母細胞瘤、腦瘤、鼻咽癌、乳癌、白血病、淋巴瘤、結腸癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、食管癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌，及胃癌(gastric cancer)。在一個實施例中，需要治療之個體患有轉移性癌症。在一個實施例中，需要治療之個體患有病毒、細菌及/或微生物感染。
在一個實施例中，本發明包括診斷個體是否患有可根據本發明治療之病症的步驟。
在某些實施例中，本發明化合物及組合物可用於治療良性及/或惡性腫瘤。
文中所用之術語「治療」或其任何語法變化(例如醫治、處理及治療等)包括但不限於改善或紓緩疾病或病症之症狀、減少、壓制、抑制、減輕或影響病症之進展、嚴重性及/或範圍。
文中所用之術語「預防」或其任何語法變化(例如避免、防止及預防等)包括但不限於延遲症狀之發作、預防疾病之復發、增加症狀發作的潛伏期或其組合。文中所用之預防未要求完全消除症狀。
文中所用之術語「有效量」係指能夠治療或改善疾病或病症或另外能夠產生意欲治療效果的含量。在某些實施例中，有效量能夠至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%減少TNF-α、MMP3，及/或IL-10之產生或水平。在某些實施例中，有效量能夠至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或100%增加IFNβ水平或產生。
在一個實施例中，本發明化合物及組合物可用於治療或改善癌症或腫瘤，該等包括但不限於多形性膠質母細胞瘤、腦瘤、鼻咽癌、乳癌、白血病、淋巴瘤、結腸癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、食管癌、膀胱癌，及胃癌(gastric cancer)。在一個實施例中，本發明可用於預防或減少腫瘤細胞(特別是對TNF-α之細胞毒性效應具抗性之彼等腫瘤細胞)的轉移擴散。在一個具體實施例中，本發明可用於治療多形性膠質母細胞瘤、乳癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌及/或鼻咽癌。在另一具體實施例中，本發明可用於預防或減少多形性膠質母細胞瘤、乳癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌，及/或鼻咽癌之轉移擴散。
在一個實施例中，本發明可用於加強免疫系統及/或修復或改進免疫系統功能。在一個具體實施例中，本發明組合物可用於治療或改善化療及/或輻射療法之免疫抑制性效果。在一個實施例中，在投與化療劑之前、期間及/或之後投與本發明組合物以抵抗化療劑對免疫系統的削弱作用。
此外，本發明組合物可用於預防、治療或改善細菌、病毒、真菌、原生蟲及/或其他微生物或病原性感染。有利地，本發明組合物會針對病原性感染作出反應而調節及/或加強免疫系統功能。
在一個實施例中，本發明組合物可用於治療或改善病毒感染，諸如，由人類免疫缺乏症病毒(HIV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純疱疹病毒(HSV)、水痘-帶狀皰疹病毒(皮蛇(shingles))、疱疹病毒-8、巨大細胞病毒、人類T淋巴細胞病毒1型(HTLV-1)、牛白血病病毒(BLV)、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)，及冠狀病毒引起的感染。
在某些實施例中，本發明組合物可用於治療或改善包括但不限於由念珠菌屬(Candida)及曲黴菌屬(Aspergillus species)引起的真菌性 感染；包括但不限於由分枝菌(mycobacteria)(諸如結核分枝桿菌(M.tuberculosis))、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、李斯特菌及亞馬遜利什曼原蟲(L.amazonensis)引起的細菌性感染；及包括但不限於由肺孢菌屬(Pneumocystis)及弓形蟲屬(Toxoplasma species)引起的原生蟲性感染。
在一個實施例中，本發明組合物可用於治療肝功能障礙、呼吸道感染及支氣管炎。
治療組合物及調配物
本發明提供包括治療有效量之雲芝萃取物、生物活性化學成分及/或本發明化合物及視需要之醫藥上可接受的載劑的治療或醫藥組合物。本發明亦提供包括根據本發明分離自雲芝之生物活性化合物或化學成分的治療或醫藥組合物。本發明亦包括含有本發明雲芝萃取物之飲食補充品及健康食品或飲用調配物。
術語「載劑」係指與化合物一起投與的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。該等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油類，包括彼等石油諸如礦物油、植物油(諸如花生油、大豆油)及芝麻油、動物油或合成來源的油脂。鹽水溶液及葡萄糖水溶液及甘油溶液亦可作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。
適宜的醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、粉、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、乾燥脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。若需要，治療組合物亦可包含少量潤濕或乳化劑或pH緩衝劑。該等組合物可採取溶液、懸浮液、乳液、錠劑、膠囊、顆粒、粉末、持續釋放調配物等的形式。可利用傳統的黏合劑及載劑諸如甘油三酯調配組合物。適宜的醫藥載劑的實例敘述於E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。該等組合物包含治療有效量之治療組合物以及適宜量 的載劑，以提供適合投與至患者之形式。調配物應適合與投與模式。
本發明治療或醫藥組合物可調配成中性或鹽形式。醫藥上可接受的鹽包括但不限於利用鹽酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵等形成的鹽類。
本發明亦提供包括經以本發明醫藥組合物之一或多種成分(例如化合物、載劑)填充的一或多個容器之醫藥包裝或套組。
本發明組合物亦可按照傳統中醫實踐調配。在治療特定疾病、病症或異常中有效的調配物的組成及劑量取決於藉由標準臨床技術診斷之疾病、病症或異常的性質。
處方含量之傳統中藥可輕易地製成適合投與至人類或動物的任何形式的藥物。適宜的形式包括例如酊劑、湯藥，及乾燥萃取物。該等可經口服用、透過靜脈注射或黏膜方式施用。活性成分亦可調配成膠囊、粉末、顆粒、片劑、栓劑、口服液、巴氏殺菌胃腸懸浮液注射液、小量或或大量注射液、冷凍粉末注射液、巴氏殺菌粉末注射液及類似物。所有上述方法為熟習此項技術者知曉、在書籍中有述及中醫醫師常用。
酊劑係藉由將粗醫學物質(例如藥草及蕈類植物)懸浮於醇(諸如酒或烈酒)溶液中而製備。在一段時期的懸浮之後，可例如每日兩或三次、每次一茶匙投與該液體(醇溶液)。
萃取物為粗醫學物質之基本成分的濃縮製劑。一般而言，基本成分係藉由將粗醫學物質(藥草及蕈類植物)懸浮於適當選擇的溶劑(一般而言水、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、異丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其他有機溶劑)中，而從粗醫學物質萃取出來。可藉由浸軟、滲濾、重滲濾、逆流萃取、渦輪萃取，或藉由二氧化碳超臨界(溫度/壓力)萃取進一步促進萃取過程。在過濾除去藥草殘渣之後，可進一步蒸發萃取溶液及因而濃縮產生不含酒精萃取物(extractum spissum) 及/或藉由噴霧乾燥、真空爐乾燥、流體床乾燥或冷凍乾燥，最終產生乾燥萃取物(extractum siccum)。可將不含酒精萃取物或乾燥萃取物進一步溶於適宜的液體中而成用於投與之所需濃度或加工處理成諸如藥片、膠囊、注射劑等的形式。
投與途徑
本發明化合物及組合物可投與至由標準途徑可治療的個體，該等標準途徑包括經口、吸入或腸胃外投與，其包括靜脈內、皮下、局部、透皮、皮內、透粘膜、腹膜內、肌內、囊內、眶內、心內、經氣管、皮下、表皮下、動脈內、包囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射、輸注，及電穿孔法，以及以意欲(臨時地或永久地)插入至個體之任何醫學裝置或物件之組份而共同投與。在一個較佳實施例中，可藉由經口投與方式投與個體本發明化合物及組合物。
在治療特定疾病、病症或異常中有效之本發明治療或醫藥組合物的含量取決於投與途徑，及該疾病、病症或異常之嚴重性，及應根據醫師之判斷及每位患者的情況而定。一般而言，劑量介於約0.001mg/kg至約3g/kg之範圍內。
例如，適宜的單位劑量可介於約0.01至約500mg、約0.01至約400mg、約0.01至約300mg、約0.01至約200mg、約0.01至約100mg、約0.01至約50mg、約0.01至約30mg、約0.01至約20mg、約0.01至約10mg、約0.01至約5mg、約0.01至約3mg、約0.01至約1mg或約0.01至約0.5mg之間。一日可投與該單位劑量一次以上，例如一日兩或三次。
與載劑物質組併以產生單一劑型的活性成分的含量取決於待治療之病症及患者的類型。一般而言，治療組合物包含約5%至約95%之活性成分(重量比)。更具體而言，治療組合物約20%至約80%(重量比)或約30%至約70%(重量比)之活性成分。
一旦患者之病症出現改進，視需要投與維持劑量。接著，可隨症狀的作用將投與劑量或頻率減少至維持改進狀況的水平。當症狀已經减輕至所滿意的水平時，應停止治療。然而，遇到任何復發的疾病症狀，患者在長期基礎上可要求臨時的治療。
此外，可選擇性地採用體外分析以幫助確定最佳的劑量範圍。 調配物中所用精確劑量亦取決於投與途徑，及該疾病、病症或異常之嚴重性，及應根據醫師之判斷及每位患者的情況而定。有效劑量可以源自體外或動物模式測試系統之劑量-反應曲線而外推求得。
物質及方法
生物分析之細胞培養
檢驗雲芝萃取物對免疫系統的作用之生物分析法係使用主要人類血液巨噬細胞及人類白血病單核細胞淋巴瘤細胞(U937)。藉由Ficoll-Paque離心，自健康供體之血液樣本(Hong Kong Red Cross Blood Transfusion Service)中分離出血液單核細胞及藉由之前所述之黏附法(Yang等人(2009)；Cheng等人(2009))進行純化。
簡而言之，血液樣本在3000rpm下離心15分鐘，並分開成血漿及細胞層。以1：1之比例，利用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)稀釋該細胞層。將該等經稀釋細胞緩慢地蓋在Ficoll(GE Healthcare)上並在2300rpm下離心20分鐘以從紅細胞分離出單核細胞。移除單核細胞層及利用RPMI 1640培養基(Gibco)洗滌直到上清液澄清。
細胞沉澱塊再次懸浮於補充有5%自體血漿、1%青黴素及鏈黴素(Gibco)之RPMI 1640中。將懸浮液倒入於培養皿上及在37℃培養1小時以讓單核細胞黏附。在利用RPMI 1640洗滌及隔夜培養之後，藉由包含5mM EDTA之冷RPMI 1640將黏附之單核細胞分開。
將該等單核細胞以0.5×106細胞/孔之密度接種於24孔組織培養板上及利用補充有5%自體血漿、1%青黴素及鏈黴素之RPMI 1640進行 培養。如之前報告中所述之方式，體外培養14日之後可獲得經分化之巨噬細胞(Yang等人(2009)；Lee等人(2009))。
獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)之小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)及人類神經母細胞瘤(SKNSH)維持在培養狀態中，以分別用於氮氧化物分析及單純疱疹病毒感染分析。
用於mRNA分析之實時逆轉錄-聚合酶鏈反應
根據製造商說明書，利用TRIzol試劑(Invitrogen)進行總RNA提取。利用DNA酶處理總RNA及接著利用寡聚(dT)引物之Superscript II逆轉錄酶(Invitrogen)進行逆轉錄作用。如之前報告中所述之方式，利用TaqMan基因表現分析工具(Applied Biosystems)分析細胞激素之mRNA水平(Yang等人(2009)；Cheng等人(2009)；Law等人(2009)；Lee等人(2009))。
用於細胞激素分析之酶聯免疫吸附分析
利用商業購得之分析套組(R&D Systems)，藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)測量細胞培養上清液中之細胞激素的蛋白質水平(Yang等人(2009)；Cheng等人(2009)；Law等人(2009)；Lee等人(2009))。各樣本以重複兩次進行分析。
雲芝乙醇(EtOH)萃取物的製法
雲芝藥草之有藥效樣本係獲自PuraPharm International(Hong Kong,China)。將四批次之雲芝(R08PUB、R09PUB、R10PUB及R11PUB)分別地於12倍體積的95% EtOH中浸軟及接著利用連續音波處理萃取1小時，或在室溫下浸軟24小時。重複萃取程序兩次。將該等萃取物組併並在真空下蒸發至乾。
自R10PUB分離及鑑定化合物Cove-1
利用Sep-Pak C18管柱(Waters,Ireland)分離R10PUB。利用下列溶劑體系洗脫管柱：ACN/H2O(5：95)、ACN/H2O(10：90)、 ACN/H2O(15：85)、ACN/H2O(30：70)、ACN/H2O(50：50)及ACN(100%)。利用生物分析導向之分餾方案，利用Sep-Pak C18管柱進一步分離經以100% ACN洗脫之活性餾分(R10PUB-S6)。利用下列溶劑體系洗脫管柱：ACN/H2O(50：50)、ACN/H2O(60：40)、ACN/H2O(70：30)、ACN/H2O(80：20)、ACN/H2O(90：10)及ACN(100%)。利用裝配反相5μm C18 Eclipse(4.6×250mm)管柱之HPLC純化經以80% ACN洗脫之所得生物活性餾分(R10PUB-S6-4)。利用呈1.0ml/min之流率之20% ACN至90% ACN之梯度洗脫液洗脫化合物及在室溫下進行所有測量。利用設定在210,254，及280nm下之快速掃描光電二極體分析檢測器之Agilent 1200系列完成峰值檢測。藉由利用HPLC重複純化過程，獲得具有超過95%之純度的純化合物(化合物Cove-1)(3.3mg)。
分子結構之結構說明
在Bruker 500MHz DRX NMR光譜分析儀中獲得1D[1H(500MHz)、13C(125MHz)及Dept 135°]及2D(1H-1H COSY及HSQC)。化學位移係參考用於甲醇-d之溶液之內標物(CH3)4Si(0ppm)。在裝配HP-5MS管柱(30m x 250μm x 0.25μm)之Agilent GC-質譜儀(GC：Agilent,7890A,MS：Agilent,5975C)中進行EI-MS。注射1毫升樣本。氦係以1ml/min之流率用作載體氣體。爐溫在70℃開始，歷時1分鐘，及接著以10℃/min之速率增加至280℃及維持3分鐘。介面溫度為250℃，離子源溫度為230℃，及在200eV下進行電子衝擊離子化(EI)。在50-350原子質量單位(amu)之範圍內，歷時25分鐘之運行時間分析質譜。G1701EA chemstation(Agilent,Santa Clara,CA)用於進行MS數據分析。
用於mRNA分析之實時逆轉錄-聚合酶鏈反應
預先利用不同批次之雲芝乙醇萃取物或純化化合物處理多形性 膠質母細胞瘤(T98G，腦細胞)細胞18小時，及接著利用重組人類TNF-α(10ng/ml)再處理3小時。根據製造商說明書，利用TRIzol試劑(Invitrogen)進行總RNA提取。總RNA藉由利用寡聚(dT)引物之Superscript II逆轉錄酶(Invitrogen)進行逆轉錄。藉由TaqMan基因表現分析工具(Applied Biosystems)分析MMP-3 mRNA水平。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊P<0.05或＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。
用於MMP-3分析之酶聯免疫吸附分析
預先利用不同批次之雲芝乙醇萃取物處理T98G細胞18小時，及接著利用重組人類TNF-α(10ng/ml)再處理24小時。利用商業購得之分析套組(R&D Systems)，藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)測量細胞培養上清液中之MMP-3的蛋白質水平。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊P<0.05或＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。
MTT分析
利用不同批次之雲芝乙醇萃取物或經純化化合物處理T98G細胞48小時。處理之後，將MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)(Sigma)添加至呈1mg/ml之最終濃度的培養基中及接著在37℃培養2小時。接著將形成之MTT甲臢溶於200μl異丙醇中及利用96孔微板讀取器，在570nm下測量上清液之吸光度。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。
腫瘤細胞侵襲分析
利用BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber(BD Biosciences)研究細胞侵襲性。將懸浮於包含1% FBS、1%青黴素-鏈黴素及1%丙酮酸鈉之MEM的T98G細胞隔夜接種於每一個室之凝膠頂部。將碳酸氫鹽基培養基加入板之底部孔內。培養之後，利用雲芝乙醇萃取物/Cove-1處理細胞18小時。然後，將各室轉移至每孔包含補充有10% FBS之MEM的新板中。另外容許細胞在37℃透過基質侵襲24小時。在侵襲分析之後，將室之底表面上的侵襲細胞與100%甲醇混合2分鐘，及利用結晶紫著色。藉由在光學顯微鏡下計數而定量侵襲細胞的數目。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。
實例
以下為說明實踐本發明之實例。該等實例不應視為限制。除非另有說明，所有溶劑混合物比例係按體積計算。
實例1-雲芝萃取物之製法
本實例說明製備雲芝萃取物之較佳萃取方案。
圖1A說明該萃取方案之一個實施例。簡而言之，雲芝原料在12倍體積EtOH中浸軟，利用連續音波處理在室溫下萃取1小時，並進行離心以產生乙醇萃取物及殘質。如圖1A所示，將殘質在10倍體積EtOH中浸軟及重複萃取程序兩次。萃取物經收集、組併及在真空下蒸發至乾，以產生包括雲芝乙醇萃取物的顆粒。
在一個實施例中，將雲芝原料在乙醇中浸軟達18小時，並進行離心以產生乙醇萃取物及殘質。
在一個實施例中，milli-Q水用作製備雲芝之水萃取物之溶劑。簡而言之，將雲芝原料在15倍體積milli-Q水中浸軟，利用連續音波處理在室溫下萃取30分鐘，並進行離心以產生水萃取物及殘質。將殘質再次溶於10倍體積水及重複萃取程序兩次。水萃取物經收集、組併及在真空下蒸發至乾以產生包括雲芝水萃取物的顆粒。
為了促進包括多糖-肽類(PSP)諸如PSK之生物活性大分子及其他生物活性小分子的萃取，利用鹼性溶液(例如，NaOH、KOH)進一步萃取雲芝原料或雲芝殘質。
圖1B顯示萃取方案之另一實施例。簡而言之，將雲芝原料在12
圖1B顯示萃取方案之另一實施例。簡而言之，將雲芝原料在12倍體積乙醇中浸軟，利用連續音波處理在室溫下處理1小時。離心之後，獲得第一萃取物及第一殘質。重複該程序兩次。在室溫下，將該第一殘質在10倍體積50%之乙醇中浸軟2小時。接著，另外烹煮經乙醇浸軟之殘質2小時。藉由過濾從上清液分離不溶物質，以產生第二殘質及第二萃取物。將該第二殘質加入10x0.04% NaOH及烹煮6小時。藉由過濾從上清液分離出不溶物質，以產生第三殘質及第三萃取物。該等萃取物經收集、組併及凍乾。
圖1C顯示萃取方案之另一實施例。簡而言之，在室溫下，將雲芝原料在10倍50%之乙醇中浸軟2小時。另外將經乙醇浸軟之雲芝原料烹煮2小時。藉由過濾從上清液分離不溶物質，以產生第一殘質及第一萃取物。將該第一殘質加入10x0.04% NaOH及另外烹煮6小時。藉由過濾從上清液分離不溶物質，以產生第二殘質及第二萃取物。該等萃取物經收集、組併及凍乾。
實例2-雲芝萃取物之高效液體層析法分析
本實例藉由高效液體層析法(HPLC)分析雲芝萃取物之化學指紋。利用如圖1A、1B說明之萃取方案，或藉由將雲芝原料在乙醇中浸軟18小時而獲得雲芝萃取物。
簡而言之，100ug/uL EtOH萃取物利用裝配PDA檢測器(G1315C)及自動配樣器(G1367C)之Agilent 1200系列HPLC系統(Binary Pump SL,G1312B)，進行高效液體層析法(HPLC)分析。層析管柱(4.6×250mm)填裝經ODS結合之矽膠(Lichrospher 100 RP C18,EC 5um)，及在分離期間，管柱溫度維持在室溫。
將5微升雲芝萃取物注入HPLC系統。利用在1.0ml/min之流率下之作為移動相的水及乙腈進行HPLC。如表1闡明之方式採用梯度洗脫 法。利用設定在210、254，及280nm下之快速掃描光電二極體分析檢測器之Agilent 1200系列完成峰值檢測。圖2A-C顯示按照HPLC之雲芝乙醇萃取物的化學物分布。
實例3-雲芝萃取物之氣相色譜質譜聯用儀分析
本該實例進一步藉由氣相色譜質譜聯用儀(GC-MS)分析雲芝萃取物之化學指紋。利用圖1A闡明之萃取方案或藉由將雲芝原料在乙醇中浸軟18小時而獲得雲芝萃取物。
將雲芝萃取物進行甲矽烷化，然後藉由GC-MS分析。簡而言之，將100ul含於乙腈之萃取物(30ug/μL)轉移至1ml反應小瓶(Alltech)中，然後添加50ul吡啶及50ul衍生劑BSTFA[N,O-雙(三甲基甲矽烷基)三氟乙醯胺]，其可與大範圍的極性化合物反應，因此以-Si(CH3)3基團替代極性化合物之不穩定氫原子。在70℃培養2小時之後，混合物可進行GC-MS分析。
藉由利用(GC：Agilent,7890A；MS：Agilent,5975C)及HP-5MS管柱(30m x 250um x 0.25um)之GC-MS分析混合物。具有1：50之分流比的氦作為載體氣體，及將1ul具有1ml/min之流率的氦注入管柱中。初始爐溫為70℃，其維持1分鐘，以10℃/min之速率增加至180℃，在 180℃維持2分鐘，以10℃/min之速率增加至280℃，及在280℃維持3分鐘。進樣器溫度為275℃；介面溫度為250℃，離子源溫度為230℃，及在200eV下進行電子衝擊離子化(EI)。在50-700原子質量單位(amu)之範圍內，歷時22分鐘之運行時間分析質譜，及利用Agilent G1701EA chemstation處理數據。圖3顯示按照GC-MS分析之雲芝乙醇萃取物的層析分布。
實例4-雲芝萃取物之分餾
利用圖1A闡明之萃取方案獲得之雲芝乙醇萃取物(MPUB-EtOH)進一步利用裝配1525二元HPLC泵、2998光電二極體陣列檢測器及Waters餾分收集器III之Waters製備型液體層析系統分離成5種餾分(圖4)。利用反相管柱(Lichrospher 100 RP C18,EC 5um)進行分餾，及檢測波長設置在210,254及280nm。由具有1ml/min之流率的兩種溶劑(A)水及(B)乙腈組成的梯度方案如下：0-16分鐘、10-90% B；16-18分鐘、90% B及18-22分鐘、10% B。
實例5-雲芝萃取物對細胞激素產生之效果
為研究雲芝萃取物(MPUB-EtOH)對IFNβ及IL-10產生之效果，利用50ug/ml MPUB-EtOH預先處理主要人類血液巨噬細胞18小時。接著利用聚肌胞-聚肌苷酸(聚I：C)(50ug/ml)處理細胞3小時。藉由TaqMan基因表現分析工具分析IFNβ mRNA及IL-10 mRNA水平。如圖5A-B所示，雲芝萃取物會增加IFNβ產生及抑制IL-10產生。
為研究雲芝萃取物(MPUB-EtOH)對經LPS引發之TNFα產生之效果，利用呈不同濃度(1、10及50ug/ml)之MPUB-EtOH預先處理主要人類血液巨噬細胞18小時。接著利用脂多糖(LPS)(1ng/ml)處理細胞3及24小時。分別藉由TaqMan基因表現分析工具及酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析TNFα mRNA水平及蛋白質水平。如圖6A-B所示，雲芝萃取物會以劑量依賴性方式減少TNFα產生。
為研究雲芝萃取物(MPUB-EtOH)對經LPS引發之亞硝酸鹽產生之效果，利用呈不同濃度(20,50及100ug/ml)之MPUB-EtOH預先處理小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)24小時。接著利用LPS(100ng/ml)處理細胞18小時，及藉由Griess Reagent測量亞硝酸鹽濃度(uM)。如圖7所示，雲芝萃取物會以劑量依賴性方式抑制亞硝酸鹽產生。
實例6-雲芝萃取物之抗病毒效果的測定
為研究雲芝萃取物之抗病毒效果，利用10ug/ml MPUB-EtOH預先處理人類神經元細胞(SKNSH)18小時。保留培養上清液供後續的培養。接著利用0.01之m.o.i.(感染複數)之單純疱疹病毒(HSV)感染1小時。病毒感染之後，利用PBS洗滌細胞兩次及另外利用保留之培養上清液培養18小時。收集培養上清液以測定病毒滴度，其係在感染T98G(人類多形性膠質母細胞瘤系)細胞期間，藉由滴定組織培養感染劑量50(TCID50)而測量的。
如實例4中所述之方式，進一步將MPUB-EtOH分餾成5種餾分。 利用MPUB-EtOH-1、-2及-3預先處理SKNSH細胞，及按照如上所述之方式以HSV病毒感染。測量培養上清液之病毒滴度(TCID50)。MPUB-EtOH-4及-5對細胞具有細胞毒性(未顯示數據)，及因此不進一步研究抗病毒效果。所有示於圖8A及8C的數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。<0.001之p值(＊＊)在統計學上視為顯著的。
如圖8所示，雲芝萃取物會顯著地降低培養上清液中之病毒滴度，其中餾分3顯示具有最有效之抗病毒效果(圖8B及8C)。
實例7-雲芝萃取物對MMP-3表現之效果
本實例顯示雲芝萃取物會降低MMP-3表現(圖9)。簡而言之，利用呈不同濃度(1、10及50ug/ml)之MPUB-EtOH預先處理多形性膠質母細胞瘤(T98G，腦細胞)細胞18小時，及接著利用重組人類TNFα(10ng/ml)處理3小時。藉由TaqMan基因表現分析工具分析MMP- 3 mRNA水平。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。<0.05之p值(＊)在統計學上視為顯著的。
實例8-雲芝萃取物在體內之抗病毒效果的測定
為研究雲芝萃取物在體內之抗病毒效果，利用二甲基亞碸(DMSO)(用於MPUB-EtOH之溶劑)或MPUB-EtOH(250mg/kg)，以24小時間隔，歷時7日，每日一次腹膜內投與(ip)至3週大的雄性BALB/c小鼠(15隻小鼠/組)。
簡而言之，在實驗當天利用1 x 105 TCID50/ml ip接種HSV而感染小鼠。在感染之後1小時，以24小時間隔，歷時5日，每日一次ip投與DMSO、MPUB-EtOH或阿昔洛韋(Acyclovir)(10mg/kg)。每日檢查小鼠及藉由基於下列得分系統之後肢麻痹法測量疾病嚴重性：0，無麻痹；1，後肢移動明顯困難；2，一個後肢不完全麻痹；3，一個後肢完全麻痹；4，兩個後肢不完全麻痹；5，兩個後肢完全麻痹。如圖10所示，與經DMSO處理之對照組相比，雲芝萃取物(MPUB-EtOH)會顯著降低小鼠中之HSV感染的嚴重性。雲芝萃取物之抗病毒效果可與阿昔洛韋之彼等相比。
實例9-雲芝萃取物及9-KODE甲基酯對MMP-3表現之效果
本實例顯示雲芝乙醇萃取物及9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)會抑制TNF-α引發之基質金屬蛋白酶3(MMP3)表現，及可用於抑制或減少腫瘤轉移。
如圖11及12所示，雲芝(PUB)萃取物會調節TNF-α引發之MMP3表現以及人類膠質瘤T98G細胞之轉移。不同批次的雲芝乙醇萃取物(R08PUB、R09PUB、R10PUB及R11PUB)會抑制TNF-α引發之MMP-3 mRNA及蛋白質表現(圖11及12)。具體而言，50μg/ml之R11PUB乙醇萃取物會降低T98G細胞侵襲性(圖20)。
9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯；亦在文 中稱為「Cove-1」)係分離自雲芝(圖13-15)。如圖16及17所示，9-KODE甲基酯會調節TNF-α引發之基質金屬蛋白酶3表現及人類膠質瘤T98G細胞之轉移。具體而言，10、25及50μg/ml之9-KODE甲基酯會抑制TNF-α引發之MMP-3 mRNA及蛋白質表現(圖16及17)。
此外，結果顯示不同批次的雲芝乙醇萃取物或9-KODE甲基酯幾乎不具有細胞毒性效果(圖18及19)。
實例10-雲芝萃取物及9-KODE甲基酯對減少癌細胞之侵襲性的效果
本實例顯示雲芝乙醇萃取物(R11PUB)係以劑量依賴性方式減少包括T98G細胞、A549細胞，及MDA-MB-231細胞之癌細胞的侵襲性(圖21)。
具體而言，利用Matrigel Invasion Chamber研究雲芝對癌細胞侵襲性的效果。利用一個批次之雲芝乙醇萃取物(R11PUB)處理多形性膠質母細胞瘤(T98G)、肺癌(A549)，及乳腺癌(MDA-MB-231)細胞18小時，及接著另外容許細胞透過基質侵襲24小時。藉由在光學顯微鏡下計數而定量侵襲細胞的數目。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。如圖21所示，25及50μg/ml雲芝乙醇萃取物(R11PUB)會減少細胞侵襲性。
此外，9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯；文中亦稱為「Cove-1」)(25μg/ml)會顯著減少T98G之侵襲性(圖22)。
具體而言，利用Matrigel Invasion Chamber研究9-KODE甲基酯對細胞侵襲性的效果。利用9-KODE甲基酯處理多形性膠質母細胞瘤(T98G)細胞18小時，及接著另外容許細胞透過基質侵襲24小時。藉由在光學顯微鏡下計數而定量侵襲細胞的數目。所有數據係按照至少3個獨立實驗的平均值±SD繪圖。＊＊P<0.01在統計學上視為顯著的。如圖22所示，25μg/ml之9-KODE甲基酯減少T98G細胞侵襲性。
文中援引之包括公開案、專利申請案及專利之所有參考內容係藉由引用之方式併入本文，如同各參考內容單獨地及明確地表明藉由引用之方式併入及在文中以其全文闡明般。
除非文中另有說明或語境清楚地表明相反，在敘述本發明之範圍中所用之術語「一」及「該」及相似的引用語應理解為涵蓋單數及複數。
除非文中另有說明，文中敘述之數值範圍僅是想作為對介於該範圍之各單一數值的各別引用的快捷方法，及如果各別數值是引用於本文中，則各單一數值係併入至該說明書中。除非另有說明，文中提供的所有精確數值為相應近似值的代表(例如，就特定因素或測量而提供之所有精確的示例性數值可視為亦提供相應的近似測量值，若適宜，可藉由「約」修飾)。
除非另有說明，文中提供使用之任何及所有實例，或示例性語言(例如「諸如」)僅是想更好地說明本發明，並非限制本發明之範圍。除非明確表述，該說明書中之語言不應視為表達成任何成分對實踐本發明是必要的。
除非另有說明或語境表明相反，文中參考某一成分或多種成分而使用諸如「包括」、「具有」或「包含」之本發明任何態樣或實施例的敘述意欲提供對由特定組份或多種組份組成、「主要由其組成」或「實質上包括」其的本發明的相似態樣或實施例的支持(例如，除非另有說明或語境清楚地表明相反，文中所述之包括特定組分之組合物應理解為亦敘述一種由該組分組成之組合物)。
應理解，文中所述之實例及實施例僅出於說明之目的，而熟習此項技術者可建議對其作出各種修改或改變，並可併入該申請案之實質及範圍之內。
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Claims (17)

  1. 一種獲得經分離9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯(9-KODE甲基酯)之方法，其包括步驟：a)提供足量的雲芝原料；及b)在約15℃至約30℃之溫度下，利用醇或醇-水混合物之極性溶劑萃取雲芝原料，以產生雲芝醇萃取物及殘質，及回收該雲芝醇萃取物；及c)自該雲芝醇萃取物分離9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯其中該步驟b)進行一次或一次以上。
  2. 如請求項1之方法，其中該極性溶劑為乙醇或水-乙醇混合物。
  3. 一種用於治療癌症或腫瘤之具有由式I表示之化學結構的化合物或其鹽之醫藥組合物，
    Figure TWI631947B_C0001
    其中為雙鍵或單鍵；R1為H、直鏈或分支鏈C1至C4烷基或ORa，其中Ra為直鏈或分支鏈C1至C4烷基；及R2為H、O或直鏈或分支鏈C1至C4烷基；及R3為H、O、鹵基、直鏈或分支鏈C1至C4烷基或ORa，其中Ra為直鏈或分支鏈C1至C4烷基，其中該癌症或腫瘤係選自由腦癌或腫瘤、鼻咽癌、乳癌或腫瘤、肺癌或腫瘤、白血病、淋巴瘤、結腸癌或腫瘤、肝癌或腫瘤、胃癌(stomach cancer)或腫瘤、食管癌或腫瘤、膀胱癌或腫瘤，及胃癌(gastric cancer)或腫瘤組成之群。
  4. 如請求項3之醫藥組合物，其中R1為OCH3或OC2H5。
  5. 如請求項3之醫藥組合物，其中R2為O。
  6. 如請求項3之醫藥組合物，其中R3為O或OH。
  7. 如請求項3之醫藥組合物，其為9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯。
  8. 如請求項3之醫藥組合物，其進一步包括醫藥上可接受之載劑。
  9. 一種式I化合物或其鹽之用途，其係製備用於治療患有癌症或腫瘤之個體之藥物，
    Figure TWI631947B_C0003
    其中為雙鍵或單鍵；R1為H、直鏈或分支鏈C1至C4烷基或ORa，其中Ra為直鏈或分支鏈C1至C4烷基；及R2為H、O或直鏈或分支鏈C1至C4烷基；及R3為H、O、鹵基、直鏈或分支鏈C1至C4烷基或ORa，其中Ra為直鏈或分支鏈C1至C4烷基。
  10. 如請求項9之用途，其中該化合物為9-側氧基-10E,12E-十八碳二烯酸甲基酯。
  11. 如請求項9之用途，其中該個體為人。
  12. 如請求項9之用途，其中該個體患有轉移癌，且該藥物係用於減少癌轉移。
  13. 如請求項9之用途，其中該癌症或腫瘤係選自由腦癌或腫瘤、鼻咽癌、乳癌或腫瘤、肺癌或腫瘤、白血病、淋巴瘤、結腸癌或腫瘤、肝癌或腫瘤、胃癌(stomach cancer)或腫瘤、食管癌或腫瘤、膀胱癌或腫瘤，及胃癌(gastric cancer)或腫瘤組成之群。
  14. 如請求項9之用途，其中該個體患有腦癌或腫瘤，且該藥物係用於治療腦癌或腫瘤。
  15. 如請求項9之用途，其中該個體患有乳癌或腫瘤，且該藥物係用於治療乳癌或腫瘤。
  16. 如請求項9之用途，其中該個體患有肺癌或腫瘤，且該藥物係用於治療肺癌或腫瘤。
  17. 如請求項9之用途，其中該藥物係用於抑制MMP3之表現。
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