KR101069179B1 - 허수테논을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물 - Google Patents

허수테논을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 허수테논을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물의 유효성분인 허수테논은 아토피성 피부염에서 증가되는 호산성백혈구(eosinophil)의 수와 IgE의 수준을 감소시키며, 아토피성 피부염과 관련된 면역 조절 사이토카인인 IL-4, 5 및 13의 수준도 현저히 감소시키는 효능을 갖는다. 또한, 허수테논은 COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키는 효과가 있다. 본 발명의 유효성분인 허수테논은 우수한 아토피성 피부염 개선 및 치료용 약물, 화장품 및 식품으로 개발에 유용하다.
허수테논, 오레고닌, 아토피성 피부염, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, 호산성 백혈구

Description

허수테논을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물{Composition for Treating Atopic Dermatitis Comprising Hirsutenone as an Active Ingredient}
본 발명은 허수테논을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물에 관한 것이다.
허수테논(hirsutenone)은 Alnus 속 식물의 수피로부터 추출되는 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid) 골격을 갖는 화합물 중 하나이다. 1972년 Asakawa는 A. pendula의 꽃으로부터 alnustone을 비롯한 4종의 새로운 형태의 디아릴헵타노이드의 골격을 가진 화합물을 분리하였고, 1973년 Miyake 등은 A. hirsuta의 녹색수피로부터 허수타노놀(hirsutanonol) 및 허수테논(hirsutenone)을 분리하여 보고하였다(Suga, T., Iwata, N. and Asakaw, Y. : Chemical constituents of male flower of Alnus pendula. Bull. Chem. Soc. Jap., 45, 2058-2060, 1972).
한편, 1998년에 Doug 등은 디아릴헵타노이드가 강력한 혈소판 응집억제 작용 을 갖고 있음을 밝혔다(Doug, H., Chen, S. X., Xu, H. X., Kadota, S. and Namba, T. : A new antilplatelet diarylheptanoid from Alpinia blepharocalyx. J. Nat. Prod. 61, 142-144, 1998)
1998년에 Lee 등은 새로운 PKC alpha inhibitor로써 디아릴헵타노이드를 보고하였다(Lee, K. K., Bahler, B. D., Hofmann, G. A., Mattern, M. R., Johnson, R. K. and Kingston, D. G. I. : Isolation and structure elucidation of new PKCα inhibitor from Pinus flexilis. J. Nat. Prod. 61, 1407-1409, 1998)
또한 1999년에 Surh 및 2000년 Ishida 등은 디아릴헵타노이드 화합물의 항-종양 활성이 있음을 보고하였다(Chun, K.-S., Sohn, Y.-S., Kim, H.-S., Kim, O.-H., Park, K.-K., Lee, J.-M., Lee, J., Lee, J.-Y., Moon, A., Lee, S.-S. and Surh, Y.-J. : Antitumor promoting potential of naturally occuring diarylheptanoids structurally related to curcumin, Mutation Research, 428, 49-57, 1999; Ishida, J. Kozuka, M., Wang, H.-K., Konoshima, T., Tokuda, H., Okuda, M., Mou, X. Y., Nishino, H., Sakurai, N., Lee, K.-S. and Nagai, M. : Antitumor-promoting effects of cyclic diarylheptanoids on Epstein-Barr virus activation and two-stage mouse skin carcinogenesis, Cancer Letters, 159, 135-140, 2000).
아토피라는 용어는 어원상 "이상한" 또는 "부적절한"이란 의미를 갖는 용어이다. 아토피성 피부염은 대부분 유아기나 소아 때 발생하여 호전과 악화를 반복하는 비교적 흔한 만성 염증성 피부질환으로, 아토피의 개인 또는 가족력, 심한 가 려움증 및 습진의 3가지 특징으로 진단할 수 있으며 감염, 정신적인 스트레스, 계절과 기후변화, 자극 및 알레르기에 의해 악화될 수 있다.
아토피 피부염의 병인론은 아직 확실히 밝혀 있지 않지만, 현재까지의 연구에 의하면 IgE 항체의 증가에 따른 과감작 반응에 의하거나, 세포매개성 면역기능의 저하로 나타나는 T 림프구의 불균열 분화에 의한 기능적 결여, 피부에 존재하는 아드레날린 수용체의 차단 등이 발병의 원인이라는 설 등이 있다. 따라서, 아토피 피부염은 면역학적인 이상이 관여하는 유전적인 질환으로 생각되고 있다.
아토피성 피부염의 치료 및 관리를 위해, 대부분의 피부과 진료 시 피부 표면의 수분을 유지시켜주는 보습제와 함께 염증반응을 호전시키기 위한 스테로이드 호르몬 즉, 국소 부신피질호르몬 제제를 동시에 처방하는 하는 것이 일반적이다. 하지만, 국소 부신피질호르몬을 장기간 사용하는 경우, 피부 위축, 혈관 확장, 색소 탈실 및 팽창 선조의 발생 등 다양한 피부 부작용을 야기 시킨다는 문제점이 있다. 따라서, 이러한 부작용을 나타내지 않으면서, 항염증 효능을 보유하는 아토피 치료용 원료나 제약의 개발 필요성이 꾸준히 대두되고 있는 상황이다.
허수테논 화합물이 항암 작용과 항산화 효능을 갖는 다는 것은 공지되어 있으나, 아직까지 아토피성 피부염과 관련하여 생리활성 효과를 나타낸다는 연구 및 보고는 되어 있지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참 조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 천연 추출물로부터 아토피성 피부염 치료 활성을 갖는 물질을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 오리나무 수피 또는 잎의 추출물 중에 포함되어 있는 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid)계 화합물인 허수테논(hirsutenone)이 아토피성 피부염에 관련된 면역 사이토카인의 발현량을 조절할 수 있음을 확인하였고, 이러한 면역 조절 작용을 통해 아토피성 피부염을 완화 또는 치료할 수 있음을 실험적으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 허수테논을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 허수테논의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 아토피성 피부염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 허수테논의 화장품학적 유효량; 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 아토피성 피부염 개선용 화장품학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 허수테논을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 천연 추출물로부터 아토피성 피부염 치료 활성을 갖는 물질을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 오리나무 수피 또는 잎의 추출물 중에 포함되어 있는 디아릴헵타노이드계 화합물인 허수테논이 아토피성 피부염에 관련된 면역 사이토카인의 발현량을 조절할 수 있음을 확인하였고, 이러한 면역 조절 작용을 통해 아토피성 피부염을 완화 또는 치료할 수 있음을 실험적으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 조성물의 유효성분인 허수테논(hirsutenone)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure 112009005357812-pat00001
본 발명 조성물의 유효성분인 허수테논은 천연물, 예를 들어 오리나무(Alnus japonica)의 수피 또는 잎으로부터 추출된 것을 사용할 수 있으나, 화학적으로 합성된 것도 추출된 것과 동일한 효과를 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명에서 오리나무 수피 또는 잎의 추출물은 천연물 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명의 오리나무 수피 추출물을 분리하기 위한 추출 용매로는 추출공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 활성성분 허수테논은 하기 화학식 2의 오레고닌 화합물에서 자일로오스(xylose)를 제거하는 효소반응에 의해 얻을 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112009005357812-pat00002
본 발명 조성물의 유효성분인 허수테논은 아토피성 피부염에서 증가되는 호산성백혈구(eosinophil)의 수와 IgE의 수준을 감소시키며, 아토피성 피부염과 관련된 면역 조절 사이토카인인 IL-4, 5, 13의 수준도 현저히 감소시키는 효능을 갖는다. 또한, 허수테논은 COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키는 효과를 보인다.
본 발명의 조성물은 허수테논의 약제학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성 물의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 유효성분 화합물이 아토피성 피부염 치료 또는 예방 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 화합물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-200 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부외용 제형을 갖는다. 피부외용 제형은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이다.
본 발명의 조성물은 허수테논의 화장품학적 유효량을 포함하는 화장품학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 유효성분 화합물이 아토피성 피부염 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장품학적 조성물은 유효성분 화합물 이외에 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사 지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지 방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품 조성물 특히 기능성 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 허수테논을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 아토피성 피부 염의 개선 또는 완화에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명 아토피성 피부염 개선용 조성물의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(i) 본 발명의 조성물은 공지 화합물 허수테논의 아토피성 피부염의 새로운 개선 용도를 제공한다.
(ii) 본 발명 조성물의 유효성분인 허수테논은 아토피성 피부염에서 증가되는 호산성백혈구(eosinophil)의 수 및 IgE의 수준을 감소시키며, 아토피성 피부염의 병변과 관련된 면역 조절 사이토카인 IL-4, 5, 및 13의 발현량을 현저히 감소시킨다.
(iii) 또한, 본 발명 조성물의 유효성분인 허수테논은 COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키는 효과를 갖는다.
(iv) 본 발명 조성물의 유효성분인 허수테논은 우수한 아토피성 피부염 치료 또는 개선용 약물, 화장품 및 식품으로 개발이 가능하다.
본 발명은 허수테논을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분인 허수테논은 아토피성 피부염에서 증가되는 호산성백혈구(eosinophil)의 수 및 IgE의 수준을 현저히 감소시키며, 아토피성 피부염의 병변과 관련된 면역 조절 사이토카인 IL-4, 5 및 13의 발현량을 감소시키 는 효능을 갖는다. 또한, 허수테논은 COX-2 및 iNOS의 발현을 감소시키는 효과를 갖는다. 본 발명 조성물의 유효성분인 허수테논은 우수한 아토피성 피부염 치료 또는 개선용 약물, 화장품 또는 식품으로 개발이 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
1. 실험재료
오리나무(Alnus japonica) 수피와 잎은 2008년 6월 서울 동작구 수달산에서 채집하여 식물학적 감정을 거친 것을 사용하였다.
2. 기기 및 시약
본 발명의 실험에 사용한 기기 및 시약은 다음의 표 1에 정리하였다.
[표 1] 본 발명의 실험에 사용한 기기 및 시약
Balance Sartorius AC211S (Germany)
Centrifuge Eppendorff 5415D (Germany)
Liquid chromatography
mass spectrometer		 API 3000 triple quadrupole liquid chromatography
mass spectrometry (Canada)
1H-NMR spectrometer Varian Gemini 2000, 300㎒ (USA)
Bruker AMX-500, 500㎒ (Germany)
Solvent: DMSO-d 6 , D2O, Acetone-d 6
Internal standard: TMS
13C-NMR spectrometer Varian Gemini 2000, 75㎒ (USA)
Bruker AMX-500, 125㎒ (Germany)
Solvent : DMSO-d 6 , D2O, Acetone-d 6
Internal standard : TMS
TLC Adsorbent Kieselgel 60 F254 (Merck, Germany)
TLC Solvent(v/v) CHCl3 : MeOH : H2O = 70 : 30 : 4
CHCl3 : MeOH : H2O = 6 : 4 : 1
Benzene : Ethylformate : Formic acid = 1 : 7 : 1
TLC Detection Ethanolic-FeCl3 solution
10％-H2SO4 in ethanol (heating)
UV-lamp (254㎚)
Gels Sephadex LH-20 (25-100㎛, Pharmacia, Sweden)
MCI gel CHP 20P (75-150μ. Mitsubishi. Japan)
3. 추출물의 제조 및 활성성분의 분리
3.1. 오리나무 수피
채취한 직후의 신선한 오리나무 수피(5.15 kg)를 80％ 아세톤으로 실온에서 24 시간 동안 3회 추출하여 여과한 후, 그 추출액을 감압 농축하여 추출물(489.77g)을 얻었다. 이 추출물을 물에 현탁하여 감압 여과한 후 수용성 부분에 대하여 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 실시하였다. 용매는 30％ 메탄올에서부터 메탄올을 10％씩 올려 100％까지 농도를 높였으며, TLC 방법으로 확인하여 총 4개의 서브-분획(sub-fraction)으로 나누었다. 오레고닌 TLC 반응을 나타내고, DPPH 활성이 우수한 분획 2 (Fr. 2)에 대해서는 MCl-gel CHP 20P (0→100% methanol, gradient system) 컬럼 크로마토그래피를 실 시하여 최종 오레고닌(oregonin)(39.99 g)을 획득하였으며, 수율은 0.78％의 수율을 기록하였다.
3.2. 오리나무 잎
채취한 직후의 신선한 오리나무 잎(3 kg)를 80％ 아세톤으로 실온에서 24 시간 동안 3회 추출하여 여과한 후, 그 추출액을 감압 농축하여 추출물(193.59g)을 얻었다. 추출물을 물에 현탁하여 감압 여과한 후 수용성 부분에 대하여 에틸아세테이트 용매분획을 이용하여 TLC 방법으로 확인하여 오레고닌 반응이 나타난 에틸아세테이트 층을(34.06g)을 획득하여, 이 에틸아세테이트 층에 대하여 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 용매는 20％ MeOH에서부터 메탄올을 10％씩 올려 100％ 까지 농도를 높였으며, TLC 방법으로 확인하여 총 5개의 서브 분획으로 나누었다. 오레고닌 TLC 반응을 나타낸 분획 2(Fr. 2)에 대해서는 MCI-gel CHP 20P (0→100% methanol, gradient system) 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 최종 오레고닌 (0.3 g)을 획득하였으며 수율은 0.01％의 수율을 기록하였다.
4. 구조동정
분리한 오레고닌은 갈색의 무정형 분말형태이었다. MS 데이터 및 NMR 데이터는 다음과 같았다.
[α]20 D : -17.5ㅀ(c=1.0, MeOH)
Negative FAB MS : m/z 477 [M-H]-
1H-NMR (300 MHz, Acetone-d6+D2O) : δ 6.74-6.71 (4H in total, H-2',2'',5',5''), 6.53-6.50 (2H in total, m, H-6'',6'), 4.31 (1H, d, J=7.8Hz, xyl-1), 4.14 (1H, m, H-5), 3.86 (1H, dd, J=11.4, 6.1Hz xyl-5e), 3.54 (1H, m, xyl-4), 2.83-2.52 (8H in total, H-1,2,4,7), 1.80-1.76 (2H in total, m, H-6)
13C-NMR (75 MHz, Acetone-d6 + D2O) : 아래 표 1에 기재함.
한편, 분리한 허수테논의 13C-NMR 데이터는 아래 표 1에 기재한 바와 같았다.
[표 1] : 오레고닌 및 허수테논의 13C-NMR 데이터
Carbon number Oregonin Hirsutenone
heptane moiety
C-1
C-2
C-3
C-4
C-5
C-6
C-7
29.7
46.1
210.6
48.2
76.1
38.3
31.4
29.9
42.0
210.3
131.1
147.5
34.8
34.0
Diphenyl moiety
C-1'
C-1''
C-2'
C-2''
C-3'
C-3''
C-4'
C-4''
C-5'
C-5''
C-6'
C-6''
133.9
134.9
116.1
116.2
145.9
145.9
144.0
144.3
116.4
116.5
120.5
120.4
133.4
133.7
115.9
116.0
145.6
145.6
143.8
143.9
116.1
116.1
120.3
120.2
Sugar moiety
C-1
C-2
C-3
C-4
C-5
C-6		 104.0
74.6
77.5
70.8
66.6
(xyl)
* 75MHz (Acetone-d 6 + D2O)
도 2a 및 도 2b에는 오레고닌 및 허수테논의 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼 데이터를 나타내었다. 오레고닌 및 허수테논의 NMR 데이터와 MS 데이터가 문헌과 일치하였으므로 최종 구조 동정하였다.
5. 오레고닌의 효소 분해에 의한 허수테논의 제조
오리나무 수피 또는 잎으로부터 얻은 추출물에 포함된 생리활성 물질의 대부분은 배당체 형태인 오레고닌이었으며, 비배당체인 허수테논 및 허수테노놀은 매우 적은 양으로 포함되어 있었다. 배당체인 오레고닌을 효소를 이용하여 분해하여 비배당체인 허수테논 및 허수테노놀을 대량으로 얻었다. 사용한 효소는 Pectinex 5XL, Fungamyl AX, Pectinex AFP L4 (노보자임 社) 이었다. 효소분해의 구체적인 과정 및 방법은 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다. 효소 분해를 실시한 결과 배당체 오레고닌에서 비당체인 허수타노놀(hirsutanonol)과 허수테논(hirsutenone) 화합물이 동시에 얻어졌다. Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(60％ MeOH Isocratic)를 실시하여 두 가지 비-배당체 화합물 허수타노놀과 허수테논을 각각 분리하였다.
효소분해 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1] 효소분해 결과
Figure 112009005357812-pat00003
6. 허수테논 포함 제형의 제조
6.1. HPLC 분석 조건 및 검량선의 작성
오리나무 추출물로부터 분리 정제한 허수테논(hirsutenone)을 메탄올에 용해시켜 스탁용액(stock solution)(100 ㎍/㎖)을 조제하고, 이를 희석하여 1, 5, 10, 25, 50 ㎍/㎖의 농도의 표준용액을 조제하였다. 이동상은 아세토니트릴과 증류수의 혼합액 (70 : 30 v/v)을 사용하였으며, 검출파장은 280 nm, 주입용량은 20 ㎕, 유속은 1 ㎖/min으로 하였다. 이 조건에서 허수테논의 보유시간(retention time)은 3 분이었다. HPLC 분석을 통해, 각 농도와 피크영역(peak area)를 바탕으로 검량선을 작성하였으며, 농도범위 1-50 ㎍/㎖에서 양호한 직선성(R2 = 0.999)을 나타내었다. 허수테논의 HPLC 분석 결과는 도 4에 나타내었다.
6.2. 허수테논 주사 제형의 제조
주사(injection)를 통한 허수테논의 효능 평가 시험을 위해 0.1, 1.0％(w/v) 허수테논을 포함하는 수성 주사제를 하기 표 2의 조성에 따라 제조하였다. 허수테논10, 100 mg을 각각 칭량하여 10％ 에탄올 함유 주사용 멸균 증류수에 각각 용해시켰다. 이어서 NaOH 용액을 소량 가하여 pH를 6.5-7.4 사이로 보정하고 주사용 멸균 증류수를 가하여 10으로 제조하였다. 약물의 함량은 HPLC 분석법을 통해 확인하였다.
[표 2] 허수테논 주사제형의 조성
성분 함유량(％)
허수테논 0.1-1.0
NaOH q.s.
에탄올 10
주사용수 q.s.
전체 100
6.3. 허수테논 연고 제형의 제조
허수테논의 함량은 1 ％(w/w)로 고정하였다. O/W 크림 연고는 다음의 방법으로 제조하였다. O/W 크림의 조성은 표 3의 성분비율로 제조하였다. 폴리글리세릴-3-메틸글루코오스디스테아레이트, 스테아린산, 세탄올 및 유동 파라핀 및 허수테논을 조성에 따라 첨가하고, 65℃ 에서 가온하여 유상을 제조한 후, 글리세린, 정제수를 완전히 용해시켜 수상을 제조하였다. 같은 온도에서 유상을 수상에 가하고 균질기(homogenizer)를 사용하여 수 분간 유화시킨 후 냉각하여 O/W 크림을 제조하였다.
[표 3] 허수테논 O/W 크림 제형의 조성
성분(Ingredients) 함량(Formulation)(％)
Polyglyceryl-3 methylglucose distearate 3
Stearic acid 5
Cetyl alcohol 2
Mineral oil 7
Glycerin 10
Water 73
7. 아토피성 피부염 동물 모델
7.1. 진드기 패치(mite patch)
허수테논의 아토피성 피부염 치료 활성을 실험적으로 확인하기 위해 마우스에 진드기 패치를 부착하여 아토피성 피부염을 일으킨 후 이를 실험동물 모델로 사용하였다. 인간에게서 아토피성 피부염 유발 물질인 진드기 유래성분을 갖는 패치를 5 주령의 마우스에 적용하였다. 구체적으로는 등 부분의 털을 제거한 후 진드기 패치를 부착하였다. 2 주간 적용한 후에 아토피성 피부염과 유사한 피부 손상을 관찰하였다. 18 주 후에 약물을 적용하면서 진드기 패치를 제거하였다.
7.2. NC / Nga 마우스
허수테논의 아토피성 피부염 치료 활성을 실험적으로 확인하기 위해 당업계에 공지된 아토피성 피부염 동물 모델인 NC/Nga 마우스(Vestergaard C, Yoneyama H, Murai M, Nakamura K, Tamaki K, Terashima Y, Imai T, Yoshie O, Irimura T, Mizutani H and Matsushima K. Overproduction of Th2-specific chemokines in NC / Nga mice exhibiting atopic dermatitis-like lesions, J Clin Invest 104(8),1097-105; 1999)를 사용하였다. 또한 NC/Nga 마우스 이외에 BABL/c 마우스도 동물모델로 사용하였다.
8. 호산성 백혈구 계수(Eosinophil Count)
모세관 튜브(Capillary tube)에 마우스 혈액을 채취하고, 마우스 전혈 30 ㎕에 식염수(saline) 150 ㎕를 첨가하여 6배 희석하였다. Sysmex XE-2100 hematology analyzer를 이용하여 호산성백혈구(eosinophil)를 계수하였다. 호산성백혈구의 산출은 말초혈액 도말 슬라이드를 제작하고, Wright-Giemsa 염색을 한 후 200개의 백혈구를 감별 계산하여 행하였다.
9. ELISA 측정
혈청은 대동맥의 혈액을 채취하여 준비하였다. 림피구(lymphocyte)는 비장(spleen)으로부터 채취한 후 배양하였다. 간략하게 설명하면, 비장을 적출하여 분쇄한 후 메쉬(mesh)를 통과시켜 단일 세포로 분리하였다. 적혈구 용해 완충액(RBC lysis buffer)를 첨가하여 적혈구를 용해시킨 후 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 1 X 106 세포를 RPMI 배지(1 ㎖) 에서 24 웰 플레이트에서 배양하였다. 3일 후에 배양된 세포를 포함하는 배지를 사용하여 실험을 진행하였다.
10. Real-time PCR
Real-time PCR 실험에 사용된 프라이머는 다음과 같다.
프라이머 서 열
MBD-1 (362bp) 5'-ACA TAA AGG ACG AGC GAT GG-3' (sense)
5'-TGC AGA TGG GGT GTC ATA GA-3' (anti-sense)
MBD-2 (199bp) 5'-GCC ATG AGG ACT CTC TGC TC-3' (sense)
5'-AGG GGT TCT TCT CTG GGA AA-3 (anti-sense)
MBD-3 (169bp) 5'-TCA GAT TGG CAG TTG TGG AG-3' (sense)
5'-GCT AGG GAG CAC TTG TTT GC-3' (anti-sense)
iNOS (203bp) 5'-CTG ATG CCT CTT CCA GGT GT-3' (sense)
5'-GAG GGA GCC CTT TCT GAA TC-3' (anti-sense)
COX-2 (593bp) 5'-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3' (sense)
5'-GGT GCT GCT TGT TAG GAG GTC AAG TAA AGG GC-3' (anti-sense)
GAPDH (598bp) 5'-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3' (sense)
5'-CCC TGT TGC TGT AGC CGT AT-3' (anti-sense)
총 RNA(total RNA)는 다음의 단계를 통해 제조하였다. 조직에 TRIZol 시약 1㎖을 처리하고 클로로포름(Chloroform) 200㎕를 넣고 4ㅀC에서 15 분간 12,000 rpm에서 원심분리(centrifugation) 한 후, 상층액을 새로운 튜브에 넣고 1/2의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후 4ㅀC에서 15분간 12,000rpm에서 다시 원심분리하였다. 이어서, 상층액을 버린후 분리한 총 RNA에 DEPC water을 첨가하였다.
cDNA는 다음의 단계를 거쳐 제조하였다. 제조한 총 RNA를 DEPC-DW 30 ㎕에 용해시키고 3 ㎍의 총 세포 RNA를, 1 ㎕의 역전사효소(reverse transcriptase), 2 ㎕의 10X 완충액, 2 ㎕의 10mM dNTP (dNTP mix), 1 ㎕의 oligo dT primer, 0.5 ㎕의 RNase 억제제, 4 ㎕의 25 mM MgCl2를 포함하는 20 ㎕ 부피의 반응혼합액에서 역전사 반응을 수행하였다.
제조한 cDNA 각 2 ㎕를 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 반응은 59ㅀC에서 1분을 행하고, 94ㅀC에서 1분의 45 사이클 행한 후, 최종 연장(extension)단계는 72ㅀC에서 1 분간 행하였다.
11. 웨스턴 블로팅 (Western Blotting)
피부세포를 포함하는 피부 조직을 용해시키고 이를 원심분리기를 이용하여 원심분리한 후 상등액을 취하여 이에 대해 15％ SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 행하였다. COX-2 및 iNOS를 분석하기 위해, 젤 전기영동상에서 분리된 단백질들을 니트로셀룰로오스막으로 이동시켰고 1차 항체 (1:1000 in BSA, rabbit polyclonal anti-COX-2 antibody, rabbit polyclonal iNOS antibody; Chemicon, CA, USA) 및 2차 항체 (1:2000 in BSA, anti-goat IgG, anti-rabbit IgG; Chemicon, CA, USA)와 순차적으로 반응시켰다.
실험결과
1. 동물모델에서의 아토피성 피부염의 육안 평가
아토피성 피부염에 대한 허수테논의 치료 효능을 조사하기 위해, 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스 동물모델에 허수테논을 4주 동안 주사 투여 또는 피부 도포를 행한 후에, 아토피성 피부염 발생 부위의 외관을 육안 관찰에 의해 피부염의 호전여부를 평가하였다. 허수테논의 투여 및 도포한 그룹에서 허수테논 비-투여 음성대조군과 비교하여 아토피성 피부염이 현저히 호전되는 결과를 얻었다.
구체적으로, 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 주사제 형태로 허수테논 0.1 및 1％ 투여한 경우(도 5b 및 도 5c)가 음성대조군인 PBS를 주사한 경우(도 5a)에 비해 아토피성 피부염이 현저히 향상되는 결과를 확인하였다. 도 5d는 양성대조군 덱사메타손(dexamethasone)을 투여한 결과이다. 또한, 연고제 형태로 허수테논 1％를 피부에 도포한 경우(도 5f)가 활성성분 없는 도포제 형태의 음성대조군의 경우(도 5e)에 비해 아토피성 피부염이 현저히 개선되는 결과를 얻었다. 도 5g는 양성대조군 프란콜(plancol)을 도포한 결과이다.
또한, 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스 동물 모델에 주사제 형태로 허수테논 0.1％ 및 1％ 투여한 경우(도 6b 및 도 6c)가 음성대조군인 PBS를 주사한 경우(도 6a)에 비해 아토피성 피부염이 현저히 향상되는 결과를 확인하였다. 도 6d는 양성대조군 덱사메타손(dexamethasone)을 투여한 결과이다. 또한, 도포제 형태로 허수테논 1％를 피부에 도포한 경우(도 6f)가 활성성분 없는 도포제 형태의 음성대조군 도포의 경우(도 6e)에 비해 아토피성 피부염이 현저히 개선되는 결과를 얻었다. 도 6g는 양성대조군 프란콜(plancol)을 도포한 결과이다.
2. 호산성백혈구의 수 측정
아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 NC/Nga 마우스에 허수테논을 4주 동안 투여 또는 피부에 도포하고, 투여 또는 도포 전 및 후의 마우스로부터 혈액을 채취하여 호산성백혈구(eosinophile)의 수를 측정하였다. 허수테논 투여 또는 도포 전에 비하여, 투여 또는 도포 후에 호산성 백혈구의 수가 급격히 줄어든 것을 확인하였다(도 7a 및 도 7b 참조). 또한, 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에서도 유사한 결과를 얻었다(도 7c 및 도 7d 참조).
3. IgE 수준 측정
아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 NC/Nga 마우스에 허수테논을 4주 동안 투여 및 피부에 도포한 후, 투여 또는 도포 전 및 후의 마우스로부터 혈액을 채취하여 IgE의 수준을 측정하였다. IgE의 수준이 허수테논을 투여 또는 도포한 후에 급격히 감소함을 알 수 있었다(도 8a). 아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 BALB/c 마우스에서도 동일한 결과를 얻었다(도 8b).
4. 인터루킨(interleukin, IL)-4, IL-5, IL-13의 수준 측정
아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 NC/Nga 마우스에 허수테논을 4 주간 투여 또는 피부 도포한 후, 마우스로부터 피부 및 비장을 채취하여 피부 및 비장세포(splenocyte)에서의 IL-4, IL-5 및 IL-13의 수준을 ELISA를 통해 측정하였다. 허수테논을 투여 또는 도포한 그룹에서, IL-4, IL-5, 및 IL-13의 수준이 음성대조 군에 비해 현저히 감소되었다(도 9a, 도 9b, 도 9c 참조).
아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 BALB/c 마우스에서도 동일한 결과를 얻었다(도 9d, 도 9e, 도 9f 참조).
IL-4는 활성화된 B 세포 및 T 세포의 증식을 촉진하며 초기(naive) T 세포(CD4+ T 세포)의 Th2 세포로의 분화를 촉진하는 작용을 한다. 아토피성 피부염 환자에서 IL-4 수준은 증가하는데, 본 발명의 허수테논은 IL-4 수준을 감소시킴으로써 알러지(allergy) 반응을 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있다.
IL-5는 B 세포의 성장을 자극하여 면역글로블린의 분비를 촉진하는 작용을 하며, 호산성백혈구의 활성화에 핵심 매개자로 역할하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 허수테논은 IL-5 수준을 감소시킴으로써 아토피성 피부염 환자에서 높게 나타나는 호산성백혈구의 수를 감소시킬 수 있는 효과를 가짐을 확인하였다. I
IL-13은 다양한 세포 타입에서 분비되며 특히 T 헬퍼 타입 2 (Th2) 세포에서 주로 분비되며, 알러지성 염증 질환에서 중요한 매개자로 작용한다. 본 발명의 허수테논은 IL-13 수준을 감소시킴으로써 아토피성 피부염과 같은 알러지성 염증 질환의 치료 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
5. Real time PCR에 의한 COX-2 및 iNOS 수준 측정
아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 NC/Nga 마우스에 허수테논을 4주 동안 투여 또는 피부 도포한 후, 마우스 피부 세포를 채취하여 COX-2 및 iNOS의 발현 수준을 Real time PCR을 이용하여 측정함으로써 면역반응 조절 효능을 확인하였다. COX(cyclooxygenase)는 프로스타노이드(prostanoid)라고 불리는 생물학적 매개물질의 형성에 관여하는 효소이다. COX-1은 신체의 항상성을 유지하는 기능을 갖는 반면, COX-2는 면역반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase)는 미생물 침입에 대한 최초의 면역반응에 중요한 역할을 하는 대식세포(macrophage)를 조절하는 NO(nitrix oxide)를 생성하는 효소이다.
실험 결과 허수테논을 투여 또는 피부 도포한 마우스의 경우 COX-2 및 iNOS의 발현이 현저히 감소하였음을 확인하였다(도 10a 및 도 10b). 아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 BALB/c 마우스에서도 동일한 결과를 얻었다(도 10c 및 도 10d).
6. 웨스턴 블로팅에 의한 COX-2 및 iNOS 수준 측정
아토피성 피부염을 발생시킨 동물모델 NC/Nga 마우스에 허수테논을 4주 동안 투여 또는 피부 도포한 후의 마우스 피부 세포를 채취하여 COX-2 및 iNOS의 발현 수준을 웨스턴 블로팅(western blotting)을 이용하여 측정하였다. Real time PCR 에 의한 측정결과와 동일하게, 허수테논을 투여 및 피부 도포한 NC/Nga 마우스에서 COX-2 및 iNOS의 발현이 감소하였음을 확인하였다(도 11a 및 도 11b).
아토피성 피부염을 유발시킨 동물모델 BALB/c 마우스에서도 동일한 결과를 얻었다(도 11c 및 도 11d).
상기 실험결과에 의하면 본 발명의 허수테논은 아토피성 피부염과 관련된 면 역반응의 조절을 통해 아토피성 피부염을 개선 또는 치료할 수 있는 능력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1a은 오리나무(Alnus japonica)의 수피로부터 오레고닌(oregonin)을 추출하여 분리 정제하는 과정을 도시한 도면이다.
도 1b은 오리나무(Alnus japonica)의 잎으로부터 오레고닌을 추출하여 분리 정제하는 과정을 도시한 도면이다.
도 2a는 오리나무로부터 추출 분리 정제한 오레고닌의 1H-NMR 측정 결과 및 오레고닌의 13C-NMR 측정 결과이다.
도 2b는 오리나무로부터 추출 분리 정제한 허수테논의 1H-NMR 측정 결과 및 허수테논의 13C-NMR 측정 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 오레고닌을 효소로 분해하여 허수테논과 허수타노놀을 얻는 과정을 보여주는 도면이다.
도 3c는 오레고닌의 효소 분해물로부터 허수테논 및 허수타노놀을 분리하는 과정을 보여주는 도면이다.
도 4는 허수테논의 HPLC 분석 결과이다.
도 5a는 음성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 PBS를 주사제 형태로 투여한 후에 피부염 치료 효능을 관찰한 사진이다.
도 5b는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 허수테논 0.1％ 주사제를 투여한 후에 아토피성 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 5c는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 허수테논 1％를 주사제 형태로 투여한 후에 아토피성 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 5d는 양성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 덱사메타손(dexamethasone)를 주사제 형태로 투여한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 5e는 음성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 활성성분 없는 도포제(baseline)를 도포한 후 아토피성 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 5f는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 1％ 허수테논을 도포제 형태로 도포한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 5g는 양성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 프란콜(plancol)을 도포제 형태로 도포한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 6a는 음성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 PBS를 주사제 형태로 투여한 후에 피부염 치료 효능을 관찰한 사진이다.
도 6b는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 0.1％ 허수테논 주사제를 투여한 후에 아토피성 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 6c는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 1％ 허수테논 주사제를 투여한 후에 아토피성 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 6d는 양성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 덱사메타손(dexamethasone)를 주사제 형태로 투여한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 6e는 음성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 활성성분 없는 도포제(baseline)를 도포한 후 아토피성 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 6f는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 1％ 허수테논을 도포제 형태로 도포한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 6g는 양성대조군으로서 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 프란콜(plancol)을 도포제 형태로 도포한 후에 피부염 치료 효능을 검사한 사진이다.
도 7a 및 도 7b는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％, 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스로부터 혈액을 채취하여 호산성 백혈구(eosinophile)의 비율 및 개수를 측정한 결과이다.
도 7c 및 도 7d는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손 및 프란콜, 실험군으로 0.1％, 1％ 허수테논을 주사제 및 도포제의 형태로 투여 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스로부터 혈액을 채취하여 호산성 백혈구(eosinophile)의 비율 및 개수를 측정한 결과이다.
도 8a는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％, 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스로부터 혈액을 채취하여 IgE의 수준을 측정한 결과이다.
도 8b는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％, 1％ 허수테논을 주사제 및 도포제의 형태로 투여 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스로부터 혈액을 채취하여 IgE의 수준을 측정한 결과이다.
도 9a는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스의 피부와 림프구에서 IL-4의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 9b는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스의 피부와 림프구에서 IL-5의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 9c는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스의 피부와 림프구에서 IL-13의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 9d는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스의 피부와 림프구에서 IL-4의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 9e는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여전 및 투여 후의 마우스의 피부와 림프구에서 IL-5의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 9f는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스의 피부와 림프구에서 IL-13의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 10a는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스에서 COX-2의 mRNA 수준을 Real-time PCR로 측정한 결과이다.
도 10b는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스에서 iNOS의 mRNA 수준을 Real-time PCR로 측정한 결과이다.
도 10c는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스에서 COX-2의 mRNA 수준을 Real-time PCR로 측정한 결과이다.
도 10d는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스에서 iNOS의 mRNA 수준을 Real-time PCR로 측정한 결과이다.
도 11a는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스에서 COX-2의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 11b는 아토피성 피부염을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스에서 iNOS의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 11c는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스에서 COX-2의 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 11d는 아토피성 피부염을 유발시킨 BALB/c 마우스에 음성대조군 물질로 PBS 및 활성성분 없는 도포제, 양성대조군 물질로 덱사메타손(dexamethasone, DEX) 및 프란콜(plancol, PLA), 실험군으로 0.1％ 또는 1％ 허수테논(Hir)을 주사제 및 도포제의 형태로 투여한 후, 투여 전 및 투여 후의 마우스에서 iNOS의 mRNA 수준을 ELISA로 측정한 결과이다.

Claims (9)

  1. (a) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 화학식 1의 화합물은 호산성백혈구(eosinophil) 수의 감소; 또는 IgE 수준의 감소; 또는 사이토카인 IL-4, IL-5 또는 IL-13의 수준의 감소 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112011016159110-pat00004
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 피부 외용 제형은 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 삭제
  5. (a) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 화장품학적 유효량; 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 화학식 1의 화합물은 호산성백혈구(eosinophil) 수의 감소; 또는 IgE 수준의 감소; 또는 사이토카인 IL-4, IL-5 또는 IL-13의 수준의 감소 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 개선용 화장품학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112011016159110-pat00005
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장품학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하며, 화학식 1의 화합물은 호산성백혈구(eosinophil) 수의 감소; 또는 IgE 수준의 감소; 또는 사이토카인 IL-4, IL-5 또는 IL-13의 수준의 감소 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 개선용 기능성 식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112011016159110-pat00006
  9. 삭제
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