KR102226439B1

KR102226439B1 - 코르너스 오블롱가 추출물을 이용한 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR102226439B1
Application number: KR1020180051119A
Authority: KR
Inventors: 강재신; 전미정; 니니쵸; 윈나이토; 전성호; 이상희; 김영동; 임순성; 이정태
Original assignee: 대한민국(환경부 국립생물자원관장); 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2021-03-12
Also published as: KR20190127052A

Abstract

본 발명은, LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 농도 의존적으로 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 발현을 억제하고, 염증매개인자인 iNOS와 mPGES-1의 발현을 억제하며, 이들 염증성 사이토카인 등의 발현을 유도하는 전사인자인 NF-kB의 활성화를 억제하는 활성을 가진, 코르너스 오블롱가 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 개시한다.

Description

코르너스 오블롱가 추출물을 이용한 항염증용 조성물{Composition for Anti-inflammation Using Cornus oblonga}

본 발명은 코르너스 오블롱가(Cornus oblonga) 추출물을 이용한 항염증용 조성물에 관한 것이다.

염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 박테리아, 곰팡이, 바이러스에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 병리적 상태에 대응하여 나타나는 국소적인 생체의 방어 반응이다. 염증은 손상된 조직과 이동하는 세포(migrating cells)로부터 생산되는 다양한 염증 매개 인자에 의하여 촉발된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다. 정상적인 경우에 생체는 염증 반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다.

최근 분자생물학의 발달로 분자적 수준에서 염증 반응에 대한 많은 연구가 이루어져 있다.

염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하지만, 특히 대식세포(Macrophage)는 화학적 자극 등에 의하여 산화질소(NO)와 여러 염증성 사이토카인을 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Ito T., et al., Curr Drug Traget Inflamm Allergy, 2(3):257-265, 2003). 산화질소는 산화질소의 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)의 작용에 의하여 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 합성되는데, NOS는 몇 가지 이소 형태가 존재한다. 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관 내피계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에서 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 일산화질소(NO)는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 수행한다. 이에 반하여 어떤 자극에 의하여 그 발현이 유도되는 iNOS(induced NOS)는 NO를 과다 생성하며, iNOS에 의해 과다 생성된 산화질소는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입힘으로써 염증과 암을 포함한 다양한 병리적 과정에 관여한다(Gupta SC et al., Exp Biol Med., 236:658-671, 2011; Riehemann et al., FEBS Lett., 442:89-94, 1999;Stamleret al., Science, 258:1898-1902, 1992).

한편 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG₂와 PGH₂를 합성하며, 이들 화합물로 PGE₂, PGF₂, PGD₂, 프로스타시클린 및 트롬복산A₂(thromboxane A2, TxA2)를 생성하는데, COX에도 2종류의 이소 형태가 존재한다. COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되어 세포 보호 작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 데 반하여, COX-2는 염증 반응 시 신속히 그 발현이 유도되어 PGE₂ 등을 생성함으로써 염증 반응을 일으키는 데 중요한 역할을 수행한다(Weisz A., Biochem. J., 316:209-215, 1996;(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4:387-396, 1995: Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35:27-28, 1996).

NO와 PGs의 과다 생성을 유도하는 iNOS 및 COX-2의 발현은 핵전사인자인 NF-κB에 의해 조절된다. NF-κB는 Rel 유전자계(Rel gene family)의 핵단백질로서, 세포질에서는 I-κB와 결합되어 불활성인 형태로 존재하나, I-κB 키나제(kinase)가 활성화되면 인산화 과정을 통해 I-κB가 떨어져 나가게 됨으로써 활성화된다. p50과 p65의 헤테로이량체(heterodimer)로 구성된 NF-κB는 활성화된 후, 핵으로 이동하여 염증 반응을 유도하는 iNOS 및 COX-2의 유전자 발현을 유도한다(Oh, G. T. et al., Atherosclerosis, 159(1):17-26, 2001).

LPS(lipopolysaccharide)는 세균 내독소로 TLR4(toll-like receptor 4)와 결합함으로써, MyD88(myeloid differentiation factor-88)-의존성 경로와 TRIF(TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β)-의존성 경로를 통해 전사인자인 NF-κB를 활성화시킨다(Cellular signalling 2001, 13(2):85-94; Nitric oxide : biology and chemistry 2010, 23(3):214-219). MyD88-의존성 세포신호 전달 경로의 활성은 ERK(extracellular signal-related kinase)-1/2, p38, JNK(c-jun NH₂-terminal kinase)와 같은 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)와 PI3K/Akt 신호전달 cascade를 따른다(Eur J Pharmacol 2003, 481(2-3):153-158; Nature reviews Immunology 2004, 4(7):499-511). TRIF-의존성 경로의 세포 신호전달은 IRF-3(interferon regulatory factor-3)를 활성화시키고 IFN-β(interferon-beta)의 발현을 유도한다(J Immunol 2001, 167(10):5887-5894). 분비된 IFN-β는 타입 I 인터페론 수용체(type I interferon receptor)에 의해 인식되며 JAK/STAT1(Janus-activated kinase/signal transducer and activator of transcription 1) 신호전달경로를 활성화시켜 iNOS와 같은 유전자의 발현을 촉진한다(Nat Immunol 2002, 3(4):392-398). 또한 LPS 뿐만아니라 INF-γ(interferon-gamma)나 다른 사이토카인에 의해서도 활성화되는 STAT1 과 STAT3는 염증성 신호전달경로에서 중요한 전사인자로 작용한다는 연구가 보고 되었다(Cytokine 2006, 36(5-6):218-228; J Biol Chem 2004, 279(29):30175-30181).

이처럼 LPS는 전사인자인 NF-κB의 활성화를 통하여 iNOS 및 COX-2의 발현을 유도하여 NO, 염증성 사이토카인, PGE₂ 등 여러 염증 조절 물질을 분비하게 한다(Chen YC, et al, Biochem. Pharmacol., 61:1417-1427, 2001; Dobrovolskaia MA, et al., J Immunol., 170:508-19, 2003; Ji Y, et al., Cell Physiol Biochem., 25:631-640, 2010). NO, TNF-α, IL-6 등의 염증성 사이토카인, PGE₂ 등은 관절염(Jang C. H. et al., Rheumatology, 2006, 45(6):703-710), 섬유근통(Hernandez M. E. et. al., BMC Res. Notes., 2010, 3(1):156), 쇼그렌 증후군(Baturone R. et. al., Scand J Rheumatol., 2009, 38(5):386-389) 등에서 염증 반응의 유도하는 중요한 인자로 보고되어 있다(Jang C. H. et al., Rheumatology, 45(6):703-710, 2006; Hernandez M. E. et. al., BMC Res. Notes., 3(1):156, 2010; Baturone R. et. al., Scand J Rheumatol., 38(5):386-389, 2009).

대식세포와 호중구와 같은 면역세포들이 면역반응을 수행 할 때에는 앞서 언급한 염증성 매개인자, 전염증성 사이토카인 외에 활성산소(reactive oxygen species, ROS)도 같이 생성된다(Kidney international Supplement 2003(84):S22-24). ROS는 대사과정에서 부수적으로 생성되며 이로 인해 생체구성 성분들은 산화적 손상을 받게 되는데, 과도한 ROS생성은 세포 내의 항산화 방어체계를 교란시키며 이는 항산화 효소의 활성을 감소시켜 산화스트레스를 발생시키고 과도한 염증반응을 유발한다(Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2008, 37(1):1-7). 활성산소에는 superoxide(O₂ ^-), singlet oxygen(1/2O₂), hydroxyl radical(OH), hydrogen peroxide(H₂O₂)가 있으며 이들은 모두 반응성이 강한 물질이기 때문에 안정한 물질로 되돌아 가려는 성질이 있다. 따라서 활성산소는 핵산이나 단백질을 산화시켜 구조적 변화를 초래하고, 세포막의 지방산을 산화시켜 과산화 지질을 축적하는데 이는 생체 기능을 저하시켜 암과 노화, 각종 성인병의 원인이 된다(European journal of biochemistry 1974, 47(3):469-474). 위의 내용을 종합적으로 볼 때 과도한 염증 및 비정상적인 염증반응 과 지속적인 산화스트레스는 만성염증으로 진행 될 수 있으며 이로 인해 류마티스 관절염, 천식, 다발성 경화증, 염증성 장질환 과 같은 만성 염증질환으로 진행 될 수 있다(Clinical and Experimental Immunology 1998, 113(2):147-156; In vivo (Athens, Greece) 2007, 21(2):147-161).

현재 항염증제로서 널리 사용되고 있는 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)는 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기한다고 알려져 있다(Rainsford KD., Subcell biochem., 42:3-27, 2007; Guruprasad P. Aithal.,Rheumatology., 7:139-150, 2011; Praveen P. N. Rao et al.,Pharmaceuticals., 3:1530-1549, 2010).

따라서 항염 활성을 가지면서 부작용이 적고 효과가 지속적인 새로운 약물의 개발이 여전히 필요하다고 할 수 있다.

본 발명의 목적은 코르너스 오블롱가 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 코르너스 오블롱가 추출물이, LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 농도 의존적으로 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α)의 발현을 억제하고, 염증매개인자인 iNOS와 mPGES-1의 발현을 억제하며, 이들 염증성 사이토카인 등의 발현을 유도하는 전사인자인 NF-kB의 활성화를 억제할 뿐만 아니라 이러한 NF-kB의 활성화 억제가 TRIF-의존성 신호절달경로의 활성화를 억제함에 의하여 이루어짐 등을 확인함으로써 완성된 것이다.

전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 코르너스 오블롱가 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서, "코르너스 오블롱가 추출물"이란 추출 대상인 코르너스 오블롱가의 줄기, 잎, 열매, 꽃, 뿌리 등을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매, 특히 60% 내지 90%의 에탄올 수용액으로 추출(침지 또는 증류)하여 얻어진 것을 의미한다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 자가면역에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 염증 반응이 일으키는 병리적 증상으로서 정의될 있다. 이러한 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6 등의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유종, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

본 발명의 항염증용 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 염증성 질환 등의 개선, 치료, 또는 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 항염증용 조성물은 유효성분 이외에, 항염증 효과의 상승·보강을 위하여 또는 항알러지 활성, 피부 보호 활성(자외선에 의한 피부 손상 억제, 피부 보습 등) 등 유사활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물이 포함된다. 예컨대 한국 건강기능식품공전상의 '관절염 개선' 기능성을 가진 MSM(dimethylsulfonylmethane), '관절염 개선' 기능성과 '피부 보습' 기능성을 가진 N-아세틸글루코사민 등과, 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라 '과민 면역반응 완화'로 개별적으로 기능성을 인정받은 Enterococcus faecalis 가열 처리 건조 분말, 구아바 잎 추출물 등의 복합물, 다래 추출물, 소엽 추출물, 피카오프레토 분말 등의 복합물, PLAG(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol) 등과, '과민피부상태 개선'으로 개별적으로 기능성을 인정받은 L. sakei Probio 65, 감마리놀렌산 함유 유지, 과채 유래 유산균인 L.plantarum CJLP133, 프로바이오틱스 ATP 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.

이러한 화합물 또는 천연 추출물은 본 발명의 항염증용 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.

본 발명의 항염증용 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구르트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.

또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다. 본 발명의 조성물이 화장품 조성물로 파악될 경우 그 용도는 염증성 피부 트러블 억제, 염증성 피부 자극 완화 등의 용도로 이해될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우에도 그 화장료 조성물은 그 용도상, 법률상 임의의 제품 구분을 띨 수 있으며, 구체적으로 피부 트러블 개선, 아토피 피부염 개선 등의 용도를 가진 기능성 화장품, 비기능성 일반 화장품 등일 수 있다. 제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등의 제품 형태를 띨 수 있다. 구체적인 제품 형태에 있어서는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형 등일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되는데, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 항염증 활성을 나타내는 그 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 코르너스 오블롱가 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 항염증용 조성물은 염증성 질환의 개선 등의 용도, 염증성 피부 자극의 완화 용도 등으로 식품, 화장품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.

도 1은 Raw264.7 세포증식능 측정 결과이다.
도 2는 LPS로 자극된 대식세포에서 염증성 사이토카인 발현 측정 결과이다
도 3은 LPS로 자극된 대식세포에서 염증매개인자 발현 측정 결과이다.
도 4는 LPS로 자극된 대식세포에서 MPAKs와 AKT 신호전달경로 인산화 측정 결과이다.
도 5는 LPS로 자극된 대식세포에서 NF-kB의 활성 측정 결과이다.
도 6은 LPS로 자극된 대식세포에서 TRIF-의존성 신호전달경로에서 미치는 영향 측정 결과이다.
도 7은 LPS로 자극된 대식세포에서 활성산소(ROS) 생성 등에 미치는 영향 측정 결과이다

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 코르너스 오블롱가 추출물 준비

코르너스 오블롱가(Cornus oblonga)는 미얀마 현지에서 채집하였다. 채집한 코르너스 오블롱가의 건조된 잎(1.2kg)에 70% 에탄올 30L을 가하여 2시간 동안 환류 추출하고, 추출 된 용액을 진공에서 증발시켜 223.2g의 추출물을 얻었다.

< 실험예 > 항염증 활성의 평가

1. 실험 방법

1-1. 재료 및 시약

Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)은 LONZA(Walkersville, MD, USA), fetal bovine serum(FBS)은 Gendepot(katy, Texas, USA), P/S Gibco® Antibiotic-antimycotic은 Gibco(Grand island, NY, USA)에서 구입하였다. MTS solution, Griess reagent는 Promega(Madison, WI, USA), Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS, molecular weight:36,000-50,000)은 MP Bio(Santa Ana, CA, USA), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), Butylated hydroxytoluene (BHT), 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl(DPPH), LPS는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. GAPDH, β-actin, ERK1/2, phospho-ERK1/2, JNK, phosphor-JNK, p38, phospho-p38, AKT, phospho-AKT, STAT1, phospho-STAT1, p65, Lamin B, IκB-α, phospho-IκB-α, COX-2, iNOS antibody는 Cell signaling Technology, Inc.(Denver, CO, USA)에서 구입하였다. Tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin-1β(IL-1β), interleukin-6(IL-6) ELISA kit은 KomaBiotech(Seoul, Korea), Parameter™ Prostaglandin E² Assay는 R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입하였다.

1-2. 세포배양

본 실험에 사용된 세포는 마우스 복강 대식세포인 Raw264.7 세포이다. 세포 배양조건은 10% fetal bovine serum(FBS)과 5% antibiotics(100 U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)배지를 사용하였으며, 37℃에서 5% CO₂가 유지되는 조건에서 배양하였다.

1-3. 세포증식능 분석.

Raw264.7 세포를 5 X 10⁴ cells/well로 96-well culture plate에 분주한 다음, 실시예 시료(12.5, 25, 50, 100, 200μg/ml)과 LPS(100ng/ml)를 처리하여 24시간 배양하였다. 각 well의 상층액을 제거 하고 20% MTS solution(water soluble tetrazolium salts solution)이 첨가된 배지를 넣어준다. 30분 동안 37℃ 환경에서 배양하여 환원 반응을 유도하고 발색정도를 ELISA reader(Thermo scientific, Wilmington, DE, US)를 사용하여 490nm 파장에서 흡광도(obticaldensity;O.D)를 측정하여 얻어진 absorbence 값을 통해 산출하였다. 세포증식능 분석은 세포만 배양한 비처리군의 세포증식능을 100%로 계산하여 실시예 시료 처리군의 상대적인 세포증식능을 계산하였다.

1-4. Nitric oxide(NO) 생성량 분석

Raw264.7 세포를 5 X 10⁴ cells/well로 96-well culture plate에 분주한 다음, 실시예 시료와 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess reagent(Sulfanilamide solution, NED solution)를 이용하여 세포 배양액 상에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로 측정하였다. 각 well의 상층액 50μl 와 sulfanilamide solution 50μl를 혼합하여 10분 동안 빛이 차단된 상온에서 반응 시키고 각 well에 NED solution 50μl씩을 처리하여 다시 빛이 차단된 상온에서 10분간 반응시켰다. 이후 ELISA reader를 사용하여 540nm 파장의 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 세포 배양액 상에 존재하는 NO의 농도를 측정하였다.

1-5.Total RNA 추출 및 cDNA합성

Raw264.7 세포를 8 X 10⁵ cells/ml로 6-well culture plate에 분주하고 overnight 배양하였다. 이 후 실시예 시료를 1시간 동안 전 처리하고 LPS를 처리하여 4시간동안 배양 한 후 TRIzol reagent(Life Technologies Co, Carlsbad, California, USA)를 사용하여 total RNA를 추출하였다.

TRIzol® reagent를 이용한 total RNA추출 과정은 TRIzol reagent 1ml당 0.2ml의 chloroform을 넣고 잘 섞어준 뒤 3분간 상온에서 반응시킨다. 원심분리기(MX300; Tomy Seiko Co., Ltd., Japan)를 이용하여 12,000g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취한 뒤 2-propanol과 1:1로 섞은 뒤 10분간 상온에서 반응시킨다. 이후 12,000g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고 남은 침전물을 차가운 70% EtOH를 이용해 씻고 건조한다. 침전물에 RNase free water를 첨가하여 RNA를 용해시키고 spectrophotometer(Thermo scientific, Wilmington, DE, US)를 사용하여 RNA농도를 측정하였다.

cDNA합성은 cDNA synthesis platinum master mix(Gendepot, katy, Texas, USA)를 사용하였으며 RNA농도를 4.5μg/ml로 맞추어 주고 제공된 master mix의 실험방법을 준수하여 cDNA를 합성하였다.

1-6. End-point PCR 및 Quantitative Real-time PCR 분석

Polymerase chain reaction(PCR)은 accuPower taq PCR premix(Bioneer, Alameda, CA, USA)에 각 smaple과 primer를 넣고 MyGenieTM 32 thermal block(Bioneer, Alameda, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. PCR산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromide(EtBr)로 염색하여 Gel documentation System으로 밴드를 확인하였다. 이때 대조군으로 House keeping gene인 GAPDH를 사용하였다.

Quantitative Real-time PCR은 Accupower 2XGreenStar qPCR Master Mix(Bioneer, Alameda, CA, USA)에 각 sample과 primer를 넣고 Exicycler™ 96 real time quantitative thermal block(Bioneer, Seoul, Korea)을 사용하여 수행하였다. qPCR수행 조건은 pre-denaturation은 95℃에서 10분, denaturation은 95℃에서 15초, annealing/extension은 60℃에서 30초간 반응시키는 2 step방식으로 진행 하였으며, cycle은 45회로 설정하여 수행하였다. 이때 대조군으로는 GAPDH와 PPIA를 사용하였고 실험군의 RQ(relative quantitative)는 2^-△△Ct(RQ)방법으로 계산하였다. 실험에 사용한 primer 정보는 아래 표 1에 나타내었다.

1-6. 단백질 추출 및 Immuno blot 분석

실시예 시료와 LPS를 처리하고 배양한 세포를 수집하여 phosphate buffered saline(PBS)로 2~3회 세척하였다. Cytobuster™ protein extraction reagent (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 첨가하여 상온에서 5분간 lysis시킨 후 16,000g, 4℃에서 5분간 원심분리하여 세포막 성분을 제거하고 단백질 용액을 얻었다. 단백질 정량은 bovine serum albumin(BSA)를 표준화 하였고 Quick Start™ Bradford 1x Dye Reagent(Bio-Rad, Philadelphia, PA, USA)를 사용하여 정량하였다.

Immuno blot분석은 25μg의 단백질을 10% mini gel Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 단백질을 크기별로 분리하고, Trans-Blot® SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell(Bio-Rad, Philadelphia, PA, USA)를 이용하여 polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)으로 transfer하였다. Membrane blocking은 TBST(0.1% Tween20 + TBS)에 5% skim milk를 포함한 blocking buffer를 사용해 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1차 항체(primary antibody)(GAPDH, β-actin, ERK1/2, phospho-ERK1/2, JNK, phosphor-JNK, p38, phospho-p38, AKT, phospho-AKT, STAT1, phospho-STAT1, p65, Lamin B, IκB-α, phospho-IκB-α, COX-2, iNOS)를 TBST용액에 1:1000으로 희석하여 membrane에 처리하고 overnight동안 4℃에서 반응시킨 후 TBST용액으로 10분간 3회 washing하였다. 2차 항체(secondary antibody)는 horse radish peroxidase(HRP)가 결합된 anti-mouse, rabbit 혹은 goat IgG를 1:3000으로 희석하여 membrane에 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 다시 3회 이상 washing한 후 ECL kit(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 membrane에 처리하고 Chemiluminescence(SUPERNOVA 1800; busan, Korea)를 이용하여 단백질의 양을 밴드로 정량하였다.

1-7. Nuclear/Cytosol Fraction

Raw264.7 세포를 1 X 10⁶ cells/ml로 10cm culture plate에 분주하고 overnight 배양하였다. 이 후 실시예 시료를 1시간 동안 전 처리하고 LPS를 처리하여 1시간 동안 배양한 후 세포를 수집하여 PBS로 2~3회 세척하였다. Buffer A(10mM HEPES pH7.9, 10mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5mM PMSF)에 protease inhibitor cocktail(cOmplete™; Merck Millipore, Darmstadt, Germany)을 첨가한 후 수집한 세포에 처리하고 10분간 ice에서 반응시켰다. 이후 10% NP-40를 처리하고 11,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하여 상층액(cytoplasmic fraction)만을 취하여 보관하였다. 남아있는 pellets에 buffer A를 처리한 후 11,000rpm, 4℃로 원심분리 하고 상층액은 제거하였다. 이후 buffer B(20mM HEPES pH7.9, 0.4M NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF + protease inhibitor cocktail)를 처리하고 10분간 vortexing 후 13,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상층액(nuclear fraction)을 취하였다.

1-8. Enzyme-linked immuno specific assay(ELISA)

Raw264.7 세포를 6 X 10⁵ cells/ml로 6-well culture plate에 분주하고 overnight 배양하였다. 이 후 실시예 시료를 1시간 동안 전 처리하고 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양한 후 상층액을 수집하고, 상층액 내 IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE₂분비량을 측정하였다.

ELISA 분석은 IL-1β, IL-6, TNF-α pink-ONE ELISA complete Kit(KomaBiotech, Seoul, Korea)와 Parameter^TM Prostaglandin E² Assay(R&D Systems, Minneapolis, MN), Myeloperoxidase Mouse ELISA Kit(Abcam, Cambridge, MA, USA)를 사용하였으며, 제공된 실험방법을 준수하여 사용하였다.

1-9. 세포내 reactive oxygen species(ROS) 변화 분석

Raw264.7 세포에 실시예 시료를 1시간 동안 전 처리하고 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배지 제거 후 PBS로 1회 washing하고 최종농도가 10μM이 되도록 DCF-DA를 PBS에 희석하여 culture plate에 처리하고 37°C, 5% CO₂배양기에서 30분간 배양하였다. 세포를 PBS로 부드럽게 washing하고 수집하여 유세포 분석기(FACSCanto; BD, NJ, USA)를 이용하여 ROS 변화량을 측정하였다.

1-10. DPPH 라디컬 소거능 분석

DPPH 라디컬 소거 활성 분석을 위해 실시예 시룔르 1.95 - 1000μg/ml의 최종 농도가 되도록 메탄올에 녹이고, 1.5mM DPPH(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액을 에탄올에 희석하여 517nm파장에서 흡광도가 1.000 값이 나오게 한다. 각 농도별 실시예 시료 100μl와 희석시킨 DPPH 용액 900μl를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디컬 소거 활성은 실시예 시료 처리군과 비 처리군 사이의 흡광도 차이를 백분율로 구하고, IC₅₀값으로 결과를 산출하였다.

1-11. ABTS 라디컬 소거능 분석

ABTS 라디컬 소거 활성 분석을 위해 7mM ABTS(Sigma, St. Louis, MO, USA)와 2.45mM potassium persulfate를 1:1 비율로 혼합한 다음 차광한 상태로 실온에서 24시간 반응시켜 라디컬을 형성하게 하였다. ABTS 용액은 실험 직전에 734nm 파장에서 흡광도 값이 1.000이 되도록 메탄올로 희석하여 사용하였다. 실시예 시료의 최종농도가 15.63 - 1000μg/ml이 되도록 메탄올에 녹이고, 각 농도별 실시예 시료 100μl와 준비해둔 ABTS용액 900μl를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 732nm파장에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디컬 소거 활성은 실시예 시료 처리군과 비 처리군 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내고, IC₅₀값으로 결과를 산출하였다.

2. 실험 결과

2-1. 세포증식능 측정 결과

실시예 시료의 항염증 활성을 측정하기에 앞서 Raw264.7 세포증식능에 미치는 영향을 MTT assay를 통해 조사하였다. 실시예 시료를 12.5, 25, 50, 100, 200, 400μg/ml의 농도로 LPS와 함께 처리하고 24시간 경과 후 세포증식능을 측정을 하였다. 시료를 처리하지 않은 대조군(cell control)의 생존률을 100%로 하였을 때, LPS 처리군과 실시예 시료 12.5, 25, 50, 100, 200μg/ml을 함께 처리한 실험군에서는 세포독성을 나타내지 않았고, 400μg/ml처리군의 증식능은 73.2 ± 1.3%로 대조군에 비해 27%의 세포 독성을 보였다(도 1). 따라서 이후의 실험은 세포독성이 나타나지 않는 농도(12.5, 25, 50, 100μg/ml)에서 진행하였다.

2-2. LPS로 자극된 대식세포에서 염증성 사이토카인 발현 측정 결과

활성화 된 대식세포에서 실시예 시료가 가지는 항염증 효과를 분석하기 위해 LPS에 의해 자극된 Raw264.7 대식세포에서 실시예 시료를 처리하여 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현양과 생성량을 측정하였다.

실시예 시료가 활성화된 대식세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현 정도에 미치는 영향을 end-point PCR을 통해 측정한 결과, LPS 처리군에 비해 실시예 시료 처리군의 염증성 사이토카인 발현 수준이 농도의존적 으로 감소하는 양상을 확인할 수 있었고, 특히 100μg/mL 처리군에서는 염증성 사이토카인 발현이 현저히 감소 하였다(도 2의 A).

이를 qRT-PCR을 통해 염증성 사이토카인의 mRNA발현을 정량한 결과, LPS처리군을 100%로 하였을 때 IL-1β의 발현은 실시예 시료 12.5, 25, 50, 100μg/mL 농도에서 각각 51.9±4.7%(p<0.05), 54.4±3.17%(p<0.05), 45.1±1.3%(p<0.01), 3.78±0.1%(p<0.01)로 발현이 현저히 감소하였으며, IL-6의 발현은 각각 83±5%, 81.1±3.1%, 48.3±1.6%(p<0.05), 3.9±0.1%(p<0.05)로 특히 실시예 시료 50μg/mL농도에서부터 LPS 처리군이 비해 절반이상의 발현량 감소를 나타냈다(Figure.2(B)). TNF-α의 발현량은 실시예 시료 50, 100μg/mL농도에서 각각 63.2±5.4%, 23.4±2.4%(p<0.01)로 발현이 감소되었다(도 2의 B).

실시예 시료가 활성화된 대식세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성에 미치는 영향을 ELISA를 통해 측정한 결과, IL-1β는 LPS 처리군에서 364.7±6.1pg/mL의 생성을 나타냈고 실시예 시료 처리에 의해 12.5μg/mL농도에서 84.8±9.0pg/mL(p<0.001), 25μg/mL농도에서 58.0±13.5pg/mL(p<0.01), 50μg/mL농도에서 28.0±9.2pg/mL(p<0.001), 100μg/mL농도에서 7.1±5.3pg/mL(p<0.001)의 생성을 나타내어 농도의존적인 감소를 보였으며, 전 구간에서 LPS 처리군에 비해 통계적으로 유의한 감소를 보였다. IL-6는 LPS 처리군에서 1903.9±32.5pg/mL의 생성을 나타냈고 실시예 시료 처리에 의해 12.5μg/mL농도에서 1708.7±95.0pg/mL, 25μg/mL농도에서 1525.0±47.2pg/mL(p<0.01), 50μg/mL농도에서 992.2±49.2pg/mL(p<0.01), 100μg/mL농도에서 442.4±12.7pg/mL(p<0.001)의 생성을 나타내어 농도의존적인 감소를 보였으며 12.5, 25, 50, 100μg/mL의 농도에서 통계적으로 유의한 감소를 보였다. 그러나 TNF-α의 경우 활성화된 대식세포에서 실시예 시료 처리에 의한 감소 효과를 나타내지 않았다(도 2의 C).

2-3. LPS로 자극된 대식세포에서 염증매개인자 발현 측정 결과

활성화 된 대식세포에서 실시예 시료가 가지는 항염증 효과를 분석하기 위해 LPS에 의해 자극된 Raw264.7 대식세포에서 실시예 시료를 처리하여 염증매개인자 합성효소인 iNOS와 COX-2, mPGES-1의 mRNA 발현량과 세포 내 iNOS와 COX-2 단백질 발현량을 측정하고 실제로 이들 효소에 의해 생성되는 염증매개인자인 NO와 PGE₂의 생성량의 확인을 통해 실시예 시료가 염증매개인자 생성에 주는 영향을 확인하였다.

실시예 시료가 활성화된 대식세포에서 염증매개인자 합성효소인 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 정도에 미치는 영향을 end-point PCR을 통해 측정한 결과, LPS처리군에 비해 실시예 시료 처리군에서의 COX-2 mRNA의 발현은 크게 영향 받지 않았으나, iNOS와 mPGES-1 mRNA의 발현은 실시예 시료의 처리에 따른 농도의존적인 감소를 보였다(도 3의 A).

이를 qRT-PCR을 통해 염증매개인자 합성효소의 mRNA 발현을 정량한 결과, LPS 처리군을 100%로 하였을 때 iNOS의 발현은 실시예 시료 12.5, 25, 50, 100μg/mL농도에서 각각 101.9±5.6%, 61.4±2.3%, 18.5±0.7%(p<0.05), 6.4±0.5%(p<0.05)로 실시예 시료 25μg/mL 농도 이후의 발현량은 농도의존적인 감소량을 보였고 특히 50, 100μg/mL 농도에서의 발현량은 통계적으로 유의하게 감소하였다(도 3의 B). mPGES-1의 발현은 각각 71.1±4.2%, 50.9±2.3%(p<0.05), 16.1±0.2%(p<0.01), 11.5±0.7%(p<0.05)로 농도의존적인 감소를 보였으며 특히 실시예 시료 25μg/mL농도부터 발현량은 통계적으로 유의하게 감소하였다(도 3의 B).

실시예 시료가 활성화된 대식세포에서 NO와 PGE₂의 생성에 미치는 영향을 NO assay와 ELISA를 통해 측정한 결과, NO 생성량은 LPS 처리군에서 41.0±0.3μM의 생성을 나타냈고 실시예 시료 처리에 의해 12.5μg/mL 농도에서 37.5±0.1μM(p<0.05), 25μg/mL농도에서 34.8±0.4μM(p<0.05), 50μg/mL 농도에서 26.8±0.8μM(p<0.01), 100μg/mL농도에서 16.2±0.2μM(p<0.001)로 농도의존적인 감소를 보였고 모두 LPS 그룹에 비해 통계적으로 유의한 감소를 보였다(도 3의 C). PGE₂생성량은 LPS 처리군에서 2455.5±11.2pg/mL의 생성을 나타냈고 실시예 시료 처리에 의해 12.5μg/mL농도에서 2217.0±22.3pg/mL, 25μg/m 농도에서 2144.4±29.5pg/mL, 50μg/mL 농도에서 1824.4±41.8pg/mL, 100μg/mL농도에서 845.2±22.0pg/mL로 역시 농도의존적인 감소를 보였고 모든 농도에서 LPS 그룹에 비해 통계적으로 유의한 감소를 보였다(도 3의 C).

활성화된 대식세포 내에서 발현되며 염증매개인자를 합성하는 효소단백질인 iNOS와 COX-2의 발현수준에 실시예 시료가 미치는 영향을 확인하기 위해 iNOS, COX-2 antibody를 사용하여immuonoblotting을 수행하였다. 그 결과 COX-2의 단백질 발현은 mRNA발현과 마찬가지로 실시예 시료 처리에 따른 큰 변화가 보이지 않았지만, iNOS의 단백질 발현은 실시예 시료 처리에 의해 농도의존적인 발현 감소를 보였다(도 3의 D).

2-4. LPS로 자극된 대식세포에서 MPAKs와 AKT 신호전달경로 인산화 측정 결과

활성화된 대식세포에서 MAPKs(JNK, p38, ERK1/2)와 AKT 신호전달 경로의 인산화에 실시예 시료의 영향을 분석하기 위하여 JNK, p38, ERK1/2, AKT에 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 immunoblotting을 수행하였다. 그 결과 LPS에 의해 인산화된 JNK, p38, ERK1/2는 실시예 시료에 의해 인산화가 억제 되지 않았으며, AKT의 인산화 또한 억제 되지 않았다(도 4). 이러한 결과는 실시예 시료가 MAPKs의 인산화에 의해 활성화되는 전사인자인 AP-1이나, PI3K/AKT-의존성 NF-kB신호전달경로의 억제에 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다.

2-5. LPS로 자극된 대식세포에서 NF-kB의 활성 측정 결과

실시예 시료가 활성화된 대식세포에서 유도된 염증성 사이토카인 및 염증매개인자의 생성을 억제하는 기전을 확인하기 위해 NF-kB의 활성화 정도를 분석하였다. NF-kB는 IkB-α와 복합체를 이루고 있을 때에는 핵 안으로 translocation 되지 못하기 때문에 전사 인자로서 작용을 할 수 없지만, IkB-α가 인산화되어 분해되면 핵 안으로 translocation되어 염증성사이토카인 및 염증매개인자 유전자의 프로모터에 존재하는 NF-kB element에 결합해 전사를 활성화 시킨다(La Clinica terapeutica 2001, 152(4):249-253). 따라서 IkB-α의 인산화 및 NF-kB의 subunit인 p65의 translocation에 실시예 시료가 미치는 영향을 확인하기 위해 이들과 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 immunoblotting을 수행하였다.

그 결과 LPS 처리군은 비 처리군에 비해 p65가 핵 안으로 translocation되는 정도가 유의적으로 증가하였고 세포질에 존재하는 p65는 LPS 처리군이 비 처리군에 비해 줄었다(도 5). 또한 IkB-α 인산화도 LPS 처리군이 비 처리군에 비해 유의적으로 증가 하였다. 그러나 실시예 시료의 처리로 인해 농도의존적으로 p65가 핵 안으로 translocation되는 양이 줄었고 IkB-α의 인산화 또한 농도의존적으로 감소하였다(도 5). 결과적으로 실시예 시료가 NF-kB의 활성을 억제한다는 것을 확인 할 수 있었다.

2-6. LPS로 자극된 대식세포에서 TRIF-의존성 신호전달경로에서 미치는 영향 측정 결과

LPS에 의해 대식세포가 활성화 되면 TRIF-의존성 신호전달경로에 의해 IRF-3 및 IFN-β의 발현이 증가된다(Nat Immunol 2002, 3(4):392-398). 분비된 IFN-β 는 Type I IFN 수용체와 결합하여 JAK/STAT1 신호전달 경로의 활성화를 가지고 오며 iNOS와 같은 inducible genes의 발현을 증가시킨다(J Leukoc Biol 2001, 69(4):598-604). 또한 STAT이 전자인자로서 작용하는 지역에는 IL-6와 IL-β의 프로모터 지역이 포함되어있다(Molecular pharmacology 2006, 69(3):1041-1047). 따라서 실시예 시료가 활성화된 대식세포에서 TRIF-의존성 신호전달경로 미치는 영향을 확인하기 위해 IFN-β mRNA의 발현수준과 STAT1의 인산화 수준을 측정하였다.

그 결과 IFN-β mRNA의 발현은 LPS 처리군이 비 처리군에 비해 유의적인 증가를 보였고, 실시예 시료의 처리로 인해 발현이 감소하였으며, 특히 실시예 시료 100μg/mL 농도에서는 확연한 IFN-β의 발현 감소를 나타냈다(도 6의 A). 또한 STAT1의 인산화도 LPS 처리군이 비 처리군에 비해 유의적인 증가를 보였으며 실시예 시료 100μg/mL 농도에서 확연한 STAT1의 인산화 감소가 나타났다(도 6의 B).

2-7. LPS로 자극된 대식세포에서 활성산소(ROS) 생성 등에 미치는 영향 측정 결과

대식세포, 호중구와 같은 여러 면역세포들이 면역반응을 수행할 때는 활성산소도 같이 생성된다. 활성산소는 산소 프리라디칼과 이들로부터 유래되는 산소화합물을 의미한다. 활성산소는 산화스트레스를 유발 할 수 있으며 노화 및 각종 질병의 원인이 된다고 알려져 있다. 따라서 실시예 시료의 ROS 생성 억제 및 ABTS 라디칼 소거활성, DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다.

그 결과, 실시예 시료의 활성산소 생성 억제 효과는 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 활성산소의 생성이 56.9%(도 7의 A)로 LPS 비 처리군 9.57%(도 7의 B)에 비해 유의적인 증가를 보였으며, 실시예 시료 100μg/mL 농도에서의 활성산소 생성은 24.3%(도 7의 C))로 LPS 처리군에 비해 약 2.2배 감소효과를 보였다.

ABTS 라디칼 소거활성과 DPPH 라디칼 소거활성은 기존에 항산화 능력이 잘 알려진 아스코르브산과 비교하였다. 실시예 시료의 ABTS 라디칼 소거활성의 IC₅₀값은 3.454±0.232μg/mL이었고 아스코르브산의 ABTS 라디칼 소거활성의 IC₅₀ 값은 2.399±0.046μg/mL로 양성대조군과 비교했을 때 비슷한 수준의 효과를 나타냈다(도 7의 D). DPPH 라디칼 소거활성 또한 아스코르브산과 비교가 이루어졌으며 실시예 시료와 아스코르브산의 DPPH 라디칼 소거활성의 IC₅₀ 값은 각각 6.557±0.158μg/mL, 3.551±0.066 μg/mL로 나타났다(도 7의 E).

Claims

코르너스 오블롱가 잎의 물과 에탄올 혼합용매 추출물을 유효성분으로 하는 항염증용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 70% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
코르너스 오블롱가 잎의 물과 에탄올 혼합용매 추출물을 유효성분으로 하는 염증 반응 억제용 식품 조성물.
제4항에 있어서,
상기 추출물은 70% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
코르너스 오블롱가 잎의 물과 에탄올 혼합용매 추출물을 유효성분으로 하는 염증성 피부 자극 완화용 화장료 조성물.