KR101910156B1 - 흑무 추출물을 이용한 항염증용 조성물 - Google Patents

흑무 추출물을 이용한 항염증용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101910156B1
KR101910156B1 KR1020170027032A KR20170027032A KR101910156B1 KR 101910156 B1 KR101910156 B1 KR 101910156B1 KR 1020170027032 A KR1020170027032 A KR 1020170027032A KR 20170027032 A KR20170027032 A KR 20170027032A KR 101910156 B1 KR101910156 B1 KR 101910156B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
extract
inflammatory
cells
stat3
Prior art date
Application number
KR1020170027032A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180045770A (ko
Inventor
김기옥
양다운
이승묵
오동관
고창식
홍승현
이용범
송상목
윤선아
이학성
김현규
김성은
진혜주
Original Assignee
재단법인 제주테크노파크
콜마비앤에이치 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 제주테크노파크, 콜마비앤에이치 주식회사 filed Critical 재단법인 제주테크노파크
Publication of KR20180045770A publication Critical patent/KR20180045770A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101910156B1 publication Critical patent/KR101910156B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/31—Brassicaceae or Cruciferae (Mustard family), e.g. broccoli, cabbage or kohlrabi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/21—Plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH

Abstract

본 발명은 흑무 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 개시한다. 상기 흑무 추출물는 LPS(lipopolysacharide)로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 NO, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β), PGE2, COX-2 및 iNOS의 분비 또는 생성을 억제하였으며 STAT3의 인산화를 감소시켰다. 또한 IL-6 로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 JAK2, STAT3의 인산화를 감소시켰다.
따라서 본 발명의 흑무 추출물은 IL-6, JAK2, STAT3 신호전달기작을 억제하여 류마티스 관절염, 피부염 등을 비롯한 염증성 질환의 예방 및 치료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

흑무 추출물을 이용한 항염증용 조성물{Anti-inflammatory Composition Using an Extract of Black Radish}
본 발명은 흑무(Black Radish, Raphanus sativus L. var. niger) 추출물을 이용한 항염증용 조성물에 관한 것이다.
염증은 외부의 물리·화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다. 염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.
염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하지만, 특히 대식세포(Macrophage)는 화학적 자극 등에 의하여 산화질소(NO)와 여러 염증성 사이토카인을 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Ito T., et al., Curr Drug Traget Inflamm Allergy, 2(3):257-265, 2003). 산화질소는 산화질소의 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)의 작용에 의하여 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 합성되는데, NOS는 몇 가지 이소 형태가 존재한다. 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관 내피계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에서 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 일산화질소(NO)는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 수행한다. 이에 반하여 어떤 자극에 의하여 그 발현이 유도되는 iNOS(induced NOS)는 NO를 과다 생성하며, iNOS에 의해 과다 생성된 산화질소는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입힘으로써 염증과 암을 포함한 다양한 병리적 과정에 관여한다(Gupta SC et al., Exp Biol Med., 236:658-671, 2011; Riehemann et al., FEBS Lett., 442:89-94, 1999;Stamleret al., Science, 258:1898-1902, 1992).
시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG2와 PGH2를 합성하며, 이들 화합물로 PGE2, PGF2, PGD2, 프로스타시클린 및 트롬복신A2(thromboxane A2, TxA2)를 만든다. COX의 기능 중 PGH 합성효소의 기능은 PGE2의 합성을 통해 통증과 염증 반응에 관여한다. COX에는 두 가지 아형이 있고 COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되는데 비해, COX-2는 염증성 사이토카인에 의해 신속히 발현이 유도되어 염증 반응에서 중요한 역할을 한다(Weisz A., Biochem. J., 316:209-215, 1996;(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4:387-396, 1995: Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35:27-28, 1996).
LPS(lipopolysaccharide) 등의 세균 내독소는 TLR4(toll-like receptor 4)와의 결합함으로써 전사인자인 NF-κB를 활성화시키며, iNOS 및 COX-2의 발현을 유도하여 NO, 염증성 사이토카인, PGE2 등 여러 염증 조절 물질을 분비하게 한다(Chen YC, et al, Biochem. Pharmacol., 61:1417-1427, 2001; Dobrovolskaia MA, et al., J Immunol., 170:508-19, 2003; Ji Y, et al., Cell Physiol Biochem., 25:631-640, 2010). NO, TNF-α, IL-6 등의 염증성 사이토카인, PGE2 등은 관절염(Jang C. H. et al., Rheumatology, 2006, 45(6):703-710), 섬유근통(Hernandez M. E. et. al., BMC Res. Notes., 2010, 3(1):156), 쇼그렌 증후군(Baturone R. et. al., Scand J Rheumatol., 2009, 38(5):386-389) 등에서 염증 반응의 유도하는 중요한 인자로 보고되어 있다(Jang C. H. et al., Rheumatology, 45(6):703-710, 2006; Hernandez M. E. et. al., BMC Res. Notes., 3(1):156, 2010; Baturone R. et. al., Scand J Rheumatol., 38(5):386-389, 2009).
IL-6은 염증성 사이토카인으로서 Innate immune system에서 중요한 역할을 수행하며 성인질환인 암(cancer), 동백경화, 지방간(fatty liver disease), 비알콜성지방간 질환(nonalcohol fatty liver disease), 신경질환(neuropathological diseases), 관절염(rheumatoid arthritis; RA), 자가면역질환(autoimmune disorders)등 다양한 질환과의 연관성이 연구되고 있다. 주로 간조직의 모노사이트 (monocyte)와 같은 마크로파아지(macrophase), 쿠퍼세포(kuuper cell), 마이크로글리아(microglia) 등에서 염증신호가 오면 TNF-α IL-6, IL-1β 등이 분비된다. 이들은 NF-kB (nuclear factor κ-light-chain-enhancer of activated B cells)와 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)에 의해 활성화되어 COX-2, iNOS 등을 촉진하고 염증을 활성화시킨다. 특히 IL-6는 IL-6 수용체(IL6 receptor)를 통하여 JAK kinase를 활성화시키고, 활성화된 JAK는 불활성화 상태의 STAT3를 phosphorylated STAT3 (p-STAT3)로 전환시킨다. p-STAT3는 핵으로 translocation하여 IL-6, IL-1β, TNF-α, COX-2, iNOS등 염증성 인자들을 활성화시켜 질환을 악화시키게 된다. 최근 STAT3 신호전달을 억제하는 천연물에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, Vingtdeux V 등(2011)은 포도에 함유된 resveratrol(trans-3,4′,5-trihydroxystilbene)이 STAT3의 활성을 억제하고 AMPK를 활성화시키는 것을 세포수준에서 연구하여 보고하였다. 또한 Wung 등(2005)은 resveratrol을 이용하여 STAT3 활성 억제 및 IL-6 신호전달 억제를 통한 항염 기작을 발표 하였다. 최근 류마티스관절염 치료제로 사용되는 약물인 오라노핀(Auranofin)의 항염증작용, 면역억제제, 항암제 연구가 활발하게 연구가 진행 되고 있으며 주요 메카니즘은 STAT3 저해작용으로 밝혀지고 있다(kim et al., 2007, 2013).
이처럼, NO, PGE2, 염증성 사이토카인 등의 억제제나 iNOS 억제제, COX-2 억제제 및 STAT3 억제제는 염증질환 치료제로서 활용될 수 있다.
본 발명은 NO 생성 억제, PGE2의 생성 억제, 염증성 사이토카인의 생성 억제 및 STAT3(IL-6/JAK2/STAT3)의 인산화 억제 활성을 가지는 흑무 추출물을 개시하였다.
본 발명의 목적은 흑무 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 흑무 추출물이 LPS(lipopolysacharide)로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 NO, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6 및 IL-1β), PGE2, COX-2 및 iNOS의 생성을 억제하고 STAT3의 인산화를 억제하였으며 IL-6 로 자극된 마우스 대식세포주에서 JAK2 및 STAT3의 인산화 억제 활성을 나타내는 것을 확인함으로써 완성된 것이다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 흑무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물로 파악할 수 있다.
본 명세서에서, "흑무 추출물”이란 추출 대상인 흑무의 줄기, 잎, 열매, 꽃, 뿌리 등을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.
본 명세서에서 "유효성분”이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서, "항염증”은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선(증상의 경감), 그러한 질환의 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다.
또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환”이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 자가면역에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 염증 반응이 일으키는 병리적 증상으로서 정의될 있다. 이러한 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6 등의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.
본 발명의 항염증용 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 염증성 질환의 개선 활성 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량”이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 염증성 질환의 개선 효과 등 의도한 의료적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 항염증 조성물은 유효성분 이외에, 항염증 효과의 상승·보강을 위하여 또는 항알러지 활성, 피부 보호 활성(자외선에 의한 피부 손상 억제, 피부 보습 등) 등 유사활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전”), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격”임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법”임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 "건강기능식품에관한법률”임)에 따라 개별적으로 기능성을 인정받은 화합물 또는 추출물이 포함된다. 예컨대 한국 건강기능식품공전상의 ‘관절염 개선’ 기능성을 가진 MSM(dimethylsulfonylmethane), '관절염 개선' 기능성과 '피부 보습' 기능성을 가진 N-아세틸글루코사민, ‘관절염 개선’ 기능성을 가진 글루코사민 등과, 한국 "건강기능식품에관한법률”에 따라 '관절염 개선' 기능성으로 개별적으로 인정받은 CMO 함유 FAC(Fatty acid Complex), 가시오갈피 등의 복합추출물, 강황 추출물, 닭가슴 연골 분말, 로즈힙 분말, 보스웰리아 추출물, 비즈왁스알코올, 전칠삼 추출물 등의 복합물, 지방산 복합물, 차조기 등의 복합 추출물, 초록입홍합 추출 오일, 호프 추출물, 황금 추출물 등의 복합물 등과, 그리고 ‘과민 면역반응 완화’ 기능성으로 개별적으로 인정받은 Enterococcus faecalis 가열 처리 건조 분말, 구아바 잎 추출물 등의 복합물, 다래 추출물, 소엽 추출물, 피카오프레토 분말 등의 복합물, PLAG(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol) 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이다.
이러한 화합물 또는 천연 추출물은 본 발명의 항염증 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.
본 발명의 항염증 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구르트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.
또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 "건강기능식품에관한법률”에 따른 건강기능식품이거나, 한국 "식품위생법”의 식품공전(식약처 고시, 식품의 기준 및 규격)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 "식품위생법”임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 “식품첨가물 기준 및 규격”)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.
감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것 모두 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.
그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는” 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약제학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명의 항염증용 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다. 본 발명의 항염증용 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우, 그 용도는 염증성 피부 자극의 완화로 이해될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 항염증 활성을 나타내는 그 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 행하여지는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 흑무 추출물를 이용한 항염증용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 항염증용 조성물은 염증성 질환의 개선 등의 용도, 염증성 피부 자극의 완화 용도 등으로 식품, 화장품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.
[도 1]은 흑무 추출물이 LPS로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 NO 생성을 억제하는 활성과 세포 독성 여부를 보여주는 결과이다(BRE:흑무추출물).
[도 2] 및 [도 3]은 흑무 추출물이 LPS로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6 및 IL-1β)과 PGE2의 생성을 억제하는 활성을 보여주는 결과이다.
[도 4]는 흑무 추출물이 LPS로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells) 에서 염증성 사이토카인(IL-6)과 iNOS 발현을 억제하는 활성을 보여주는 결과이다.
[도 5]는 흑무 추출물이 LPS로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 iNOS와 COX-2 생성을 억제하는 활성을 나타내는 결과이다.
[도 6]은 흑무 추출물이 LPS로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 STAT3 인산화를 억제하는 활성을 나타내는 결과이다.
[도 7]는 흑무 추출물이 IL-6로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 STAT3 인산화를 억제하는 활성을 나타내는 결과이다.
[도 8]은 흑무 추출물이 IL-6로 자극된 마우스 대식세포주(RAW 264.7 cells)에서 JAK2 인산화를 억제하는 활성을 나타내는 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예> 흑무 추출물 제조
제주특별자치도 서귀포시 성산읍 지역에서 2016년 2월에 수확한 제주산 흑무 뿌리를 담수로 3회 이상 세척하여 냉풍건조를 시킨 후 분쇄하였다. 분쇄된 시료 300g을 80% 메탄올 6L에 24시간 동안 침지·교반한 후, 한 시간 동안 초음파 추출을 실시하였다. 그 후 상층액을 취하고 남아있는 잔사에 대해 위와 동일한 방법으로 추출한 후, 이들을 혼합하고 여과지(Whatman No. 2)로 여과하여 40℃, 90 rpm 속도에서 감압회전농축기(Heidolph, LABOROTA)로 농축시킨 후 농축된 고형물을 얻었다. 그 후 다시 정제수에 10%(w/w)함량이 되도록 용해하고, 이를 동결 건조시켜 분말상의 추출물을 제작하였다. 이 추출물 60g을 300mL의 증류수에 용해하여 HP-20 칼럼에 충진시킨 다음 증류수 10L를 칼럼에 로딩 후 증류수는 버리고, 다시 50% 에탄올 4L를 로딩하였다. 로딩시킨 50% 에탄올 층은 농축수기에 받아 90 rpm 속도에서 감압회전농축기(Heidolph, LABOROTA)로 농축시킨 후 농축된 고형물을 정제수에 10%(w/w)함량이 되도록 용해하고, 이를 동결 건조시켜 분말상의 추출물 1.08g 을 제작하였다.
<실험예> 항염증 활성 실험
1. 실험방법
항염증 활성은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 생쥐(murine) 대식세포주인 RAW 264.7 세포와 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/mL), 및 streptomycin (100 ㎍/mL)이 포함된Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GIBCO Inc.)를 사용하였다. 세포들은 37℃ 에서 95% air, 5% CO2가습 공기 조건 하 포화 상태 (subconfluence)에서 배양하며, 3일마다 계대 배양하였다.
배양된 RAW 264.7 세포를 이용하여 Nitric oxide (NO) assay법을 활용하여 NO 생성 정도를 측정하였다. 구체적으로 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1×105 cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 농도별 실시예의 시료와 LPS(1 ㎍/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 1 % (w/v)(sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid)을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100㎕와 Griess 시약 100㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO2)를 standard로 비교하여 정량하였다.
세포독성은 LDH (lactate dehydrogenase) assay으로 측정하였는데, 구체적으로 RAW 264.7 세포 (1×105 cells/mL)를 DMEM 배지에 농도별 실시예의 시료와 LPS(1 ㎍/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정하였으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50㎕와 reconstituted substrate mix를 50㎕를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50㎕의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
Prostaglandin E2(PGE2) 생성 억제 효능 평가는 RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1×105 cells/mL로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양 하고, 이후 배지를 제거하고 농도별 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시 함유한 새로운 배지를 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 PGE2를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 분)하여 상층액을 얻었다. PGE2의 측정은 PGE ELISA kit(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.
염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6) 생성 억제 효능 평가는 RAW 264.7 세포(1×105 cells/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 세포수를 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이 후 배지를 제거하고 RAW 264.7 세포는 농도별 실시예의 시료 50㎕와 450㎕의 LPS(1 ㎍/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하였고 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24 시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 분)하여 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokines 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 -20℃ 이하에 보관하였다. Pro-inflammatory cytokines 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.
RAW 264.7 세포에서 IL-6 및 iNOS 발현양을 확인하기 위해 세포(4.5×105 cells/mL)를 6 well plate 에 접종하고 18시간 배양하였다. 흑무 추출물을 처리한 이후 LPS(1 ㎍/mL)를 처리하여 8시간 반응한 뒤, 세포를 튜브에 모아 원심분리 하여 배지를 제거하고, PBS로 세척한 후, NucleoSpin® RNA kit(Macherey-nagel GmbH & Co. KG, Duren, Germany)를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA의 농도와 순도는 Ultrospec 2100 pro UV/Visible Sepctrophotometer(Amersham biosciences, United Kingdom)으로 측정하였고, TOYOBO ReverTra Ace kit(TOYOBO CO., Osaka, Japan,) 를 사용하여 cDNA를 합성하였다. IL-6, iNOS의 발현 정도는 Oligo DT(Bioneer, Daejeon, Korea)와 5X HOT FIREPOL EVAGREEN QPCR SUPERMIX (Solis Biodyne, Tartu, Estonia)를 사용해 실시간 유전자정량 분석기계(LineGene K plus, FQD-48A, Bioer Technology, China)를 통해 측정하였다.
실시간 유전자정량분석에 사용된 프라이며 서열
타겟 유전자 프라이머 서열
IL-6(Forward) 5'-ACGGCCTTCCCTACTTC-3'
IL-6(Reverse) 5'-TTCCACGATTTCCCAGA-3'
iNOS(Forward) 5'-AACATCAGGTCGGCCATCACT-3'
iNOS(Reverse) 5'-CAGAGGCAGCACATCAAAGC-3'
beta-actin(Forward) 5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’
beta-actin(Reverse) 5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’
iNOS 및 COX-2 생성 억제와 JAK2 인산화 및 STAT3 인산화 억제 효능 평가를 위하여 western-blotting을 수행하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 2~3회 phosphate buffered saline (PBS)로 세척 한 후 세포 용해 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF, 1mM dithiothreitol, 1mM phenyl methyl sulfonyl fluoride, 25 ug/mL aprotinin, 25 ug/mL leupeptin]를 첨가하여 30분간 4℃에서 용해시킨 후 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin(BSA)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit(Bio-Rad)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정량하였다. 구체적으로 분리된 단백질 20~30㎍를 8~12% mini gel SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (BIO-RAD, Richmond, CA, USA)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS(0.1% Tween 20 + TBS) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2(BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)를 TTBS 용액(5% skim milk)에서 1:1000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)과 3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
Starvation한 세포에서 IL-6 생성 억제 효능 평가를 보기위해 세포를 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양 한 뒤, 무혈청 배지에 14시간 배양하였다. 추출물을 처리하고 난 뒤, IL-6(10 ng/ml)를 30분 처리하고, 세포를 수집하였다. Western blotting 은 위와 동일한 방법으로 수행하였으며, JAK 인산화, STAT3 인산화의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-rabbit JAK2, STAT3, p-JAK2, p-STAT3(Cell signaling, Massachusetts, USA)를 TTBS 용액(5% skim milk)에서 1:2000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG(Cell signaling, Massachusetts, USA)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)과 3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
2. 실험 결과
NO 생성 억제 활성과 세포독성 여부에 대한 결과를 [도 1]에 나타내었다. [도 1]을 참조할 때 실시예의 추출물은 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하고, 특별히 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있다.
염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6 및 IL-1β)과 PGE2 의 생성 억제 활성에 대한 결과를 [도 2] 및 [도 3]에 나타내었다. 실시예의 추출물은 농도 의존적으로 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6 및 IL-1β)과 PGE2 의 생성을 억제함을 알 수 있다.
Quantitative PCR(실시간 유전자정량 분석기계)을 이용하여 염증인자인 IL-6와 iNOS mRNA 발현 억제에 대한 결과를 [도4-A] 및 [도4-B]에 나타내었다. 실시예의 추출물은 농도 의존적으로 IL-6와 iNOS mRNA 발현을 억제하는 것을 확인하였다.
COX-2 및 iNOS 생성 억제 활성에 대한 결과를 [도 5]에 나타내었다. 여기서도 실시예의 추출물이 농도 의존적으로 이들 단백질의 생성을 억제함을 보여준다.
RAW264.7 세포에 염증인자인 LPS(1 ㎍/mL) 처리 후 STAT3 인산화(활성화)를 억제함을 [도 6]에 나타내었다. 실시예의 추출물이 농도 의존적으로 STAT3 인산화를 억제함을 보여준다.
RAW 264.7 세포에 IL-6(10 ng/ml) 처리 후 30분이 경과하였을 때 STAT3 인산화가 가장 활발하게 일어났으며 그 결과를 [도 7-A] 및 [도 7-B]에 나타내었다. 실시예의 흑무 추출물을 처리하였을 때, IL-6에 의해 유도된 STAT3 인산화를 억제하는 결과가 나타났다. 해당 결과는 [도 7-C] 및 [도 7-D]에 나타내었다.
또한 RAW 264.7 세포에 IL-6(10 ng/ml) 처리 후 30분이 경과하였을 때 JAK2 인산화가 가장 활발하게 일어난다는 결과를 [도 8-A] 및 [도 8-B]에 나타내었다. 실시예의 흑무 추출물이 IL-6에 의해 유도된 JAK2 활성(인산화)을 억제하였다. 해당 결과는 [도 8-C] 및 [도 8-D]에 나타내었다.

Claims (7)

  1. 흑무 뿌리 분쇄물을 80% 메탄올로 추출하여 얻어진 고형상의 추출물을 증류수에 용해하고 흡착수지 HP-20에 흡착시킨 후 증류수로 용출시킨 다음 50% 에탄올로 용출시켜 얻어진 50% 에탄올 용출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 고형상의 추출물은 흑무 뿌리 분쇄물을 80% 메탄올에 24시간 동안 침지하고 교반한 후, 한 시간 동안 초음파 추출을 실시하고 그 후 추출 용매를 제거하여 얻어진 고형물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항염증은 JAK2 및 STAT3의 활성화 억제 기전에 의한 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
  5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
  6. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
  7. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
KR1020170027032A 2016-10-26 2017-03-02 흑무 추출물을 이용한 항염증용 조성물 KR101910156B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20160140144 2016-10-26
KR1020160140144 2016-10-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180045770A KR20180045770A (ko) 2018-05-04
KR101910156B1 true KR101910156B1 (ko) 2018-10-19

Family

ID=62023926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170027032A KR101910156B1 (ko) 2016-10-26 2017-03-02 흑무 추출물을 이용한 항염증용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101910156B1 (ko)
WO (1) WO2018080208A1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200050032A (ko) 2018-10-31 2020-05-11 대구한의대학교산학협력단 발효용담 추출물, 국화 추출물 및 박하 추출물을 함유하는 항염증용 조성물
KR102123565B1 (ko) 2019-02-12 2020-06-16 제주대학교 산학협력단 해조류 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물
KR20200098370A (ko) 2019-02-12 2020-08-20 제주대학교 산학협력단 콜레르파 라세모사 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물
KR20210050085A (ko) 2019-10-28 2021-05-07 재단법인 제주테크노파크 돌외 및 검정무의 혼합추출물을 포함하는 약학 조성물

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102002284B1 (ko) * 2018-05-31 2019-07-23 콜마비앤에이치 주식회사 제주도산 흑무 유산균 발효물을 포함하는 간 기능 개선용 조성물 및 제주도산 흑무 유산균 발효물을 제조하는 방법
KR102131076B1 (ko) 2018-10-26 2020-07-07 재단법인 제주테크노파크 십자과 식물 추출물과 Cu(II) 금속화합물과의 복합체를 유효성분으로 함유한 약학적 조성물
KR102515226B1 (ko) * 2019-10-28 2023-03-29 재단법인 제주테크노파크 풋귤 및 검정무의 혼합발효물을 포함하는 약학 조성물

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI1906772T1 (sl) * 2005-05-12 2015-11-30 Estrella Maarud Holding As Obdelava krompirja
US8080265B2 (en) * 2009-02-20 2011-12-20 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Compositions and methods for treating signs of skin aging
US20120308620A1 (en) * 2009-11-18 2012-12-06 Atheronova Operations, Inc. Topical cosmetic preparation containing elastogenesis inducing substances associated with a systemic absorption retardant

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Res Pharm Sci. vol.10, no.5, pp.429-435 (2015.).

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200050032A (ko) 2018-10-31 2020-05-11 대구한의대학교산학협력단 발효용담 추출물, 국화 추출물 및 박하 추출물을 함유하는 항염증용 조성물
KR102123565B1 (ko) 2019-02-12 2020-06-16 제주대학교 산학협력단 해조류 효소 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물
KR20200098370A (ko) 2019-02-12 2020-08-20 제주대학교 산학협력단 콜레르파 라세모사 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물
KR20210050085A (ko) 2019-10-28 2021-05-07 재단법인 제주테크노파크 돌외 및 검정무의 혼합추출물을 포함하는 약학 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018080208A1 (ko) 2018-05-03
KR20180045770A (ko) 2018-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101910156B1 (ko) 흑무 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR101966294B1 (ko) 감태 추출물과 괭생이모자반 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR101962266B1 (ko) 순비기나무 정유 추출물을 이용한 항염증 또는 항균용 조성물
KR101869353B1 (ko) 눈개승마 추출물에서 분리된 신규 화합물 및 이를 이용한 항염증 조성물
KR101735784B1 (ko) 트리고노스테몬 레이디오이데스 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR101982657B1 (ko) 테트라세라 로우레이리 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR102337965B1 (ko) 레몬 과피 추출물과 고삼 뿌리 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR101925724B1 (ko) 큰고랭이 추출물을 이용한 항염증 조성물
KR102119421B1 (ko) 개오동나무 추출물을 이용한 항알러지용 조성물
KR20190036974A (ko) 며느리배꼽 추출물을 이용한 항염증 및 항알러지 조성물
KR102076176B1 (ko) 진세노사이드 화합물 k와 금은화 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR102191165B1 (ko) 무 뿌리 추출물 등을 이용한 항염증용 조성물
KR20190065029A (ko) 쇼레아 록스부르그히이 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR102119307B1 (ko) 버드나무속 식물 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR102010691B1 (ko) 프라톨을 이용한 항염증용 조성물
KR101900480B1 (ko) 물여뀌 추출물을 이용한 항산화용 조성물
KR20180050970A (ko) 테트라세라 로우레이리 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR101935471B1 (ko) 괭생이모자반 효소 처리물을 이용한 항염증용 조성물
KR102254895B1 (ko) 곱슬사초 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR102369909B1 (ko) 범꼬리 추출물을 이용한 항알러지용 조성물
KR102070655B1 (ko) 물옥잠 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR20180028288A (ko) 신규 미세조류 시조카이트리움 속 pb-31 균주 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR102226439B1 (ko) 코르너스 오블롱가 추출물을 이용한 항염증용 조성물
KR20170119196A (ko) 트리불러스아미드 d를 이용한 항염증용 조성물
KR101857350B1 (ko) 신규 미리세틴 유도체 및 이를 이용한 항염증용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant